KR102293064B1 - 항-트랜스페린 수용체 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-트랜스페린 수용체 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

항-트랜스페린 수용체 항체 및 사용 방법 {ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 항-트랜스페린 수용체 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
관련 출원
본원은 2013년 5월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 61/825,477을 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
서열 목록은 파일명 "P5641R1-WO_SL.txt", 작성일 2014년 5월 16일, 및 크기 154,599 바이트로 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷 텍스트 파일로서 명세서와 병행 제출되었다. EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
대형 분자 약물의 뇌 침투는 대체로 불투과성인 혈액-뇌 장벽 (BBB)에 의해 심하게 제한된다. 이러한 장애를 극복하기 위한 많은 전략 중에서 뇌 모세관 내피에서 발현된 내인성 수용체의 세포통과수송 트래픽킹 경로를 사용하는 것이 있다. 뇌로 대형 분자의 수용체-매개 전달을 가능하게 하기 위해 이들 수용체에 대해 모노클로날 항체와 같은 재조합 단백질이 설계되어 있다. BBB 수용체에 대해 낮은 친화도를 갖는 항체가 이러한 수용체에 대해 전형적인 높은 친화도 항체와 비교하여 회합된 치료 모이어티/분자의 BBB 수송 및 CNS 체류를 실질적으로 증가시키는 가능성을 제공한다는 것이 발견되면서, 혈액으로의 역 세포통과수송을 최소화하면서 뇌 흡수를 최대화하고, 또한 치료적 투여 후의 축적 정도를 최대화하기 위한 전략이 다루어져 왔다 (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sci. Transl. Med. 25 May 2011: Vol. 3, Issue 84, p. 84ra44). 그러나, 상기 항체는 인간 및 영장류 TfR에 특이적으로 결합하지 않았다.
모노클로날 항체는 신경계 또는 중추 신경계 (CNS) 질환의 치료를 위한 큰 치료 잠재력을 갖지만, 그의 뇌 내로의 통과는 혈액-뇌 장벽 (BBB)에 의해 제한된다. 과거의 연구는 혈류에서 순환하는 IgG의 매우 작은 백분율 (대략 0.1%)이 CNS 내로 BBB를 통과한다는 것을 제시하였고 (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164 (1974)), 여기서 항체의 CNS 농도는 강건한 효과를 허용하기에 불충분할 수 있다. CNS 내로 분포되는 항체의 백분율이 BBB 수용체 (즉, 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체 등)를 연구함으로써 개선될 수 있는 것으로 이전에 발견되었다 (예를 들어, WO9502421 참조). 예를 들어, CNS 내의 1종 이상의 목적하는 항원을 표적화하도록 항-BBB 수용체 항체가 다중특이적으로 제조될 수 있거나, 또는 1종 이상의 이종 분자가 항-BBB 수용체 항체에 커플링될 수 있고; 어떤 경우든, BBB를 가로질러 CNS 내로 치료 분자를 전달하는 것을 항-BBB 수용체 항체가 보조할 수 있다.
그러나, 전통적인 특이적 높은 친화도 항체로 BBB 수용체를 표적화하는 것은 일반적으로 BBB 수송에서의 제한된 증가를 생성하였다. 연구된 항-BBB 항체에서 CNS 내로의 항체 흡수의 규모 및 CNS에서의 분포가 BBB 수용체에 대한 그의 결합 친화도와 역으로 관련된다는 것이 출원인에 의해 추후에 발견되었다. 예를 들어, 치료 용량 수준으로 투여된 트랜스페린 수용체 (TfR)에 대한 낮은 친화도 항체는 보다 높은 친화도의 항-TfR 항체와 비교하여 항-TfR 항체의 BBB 수송 및 CNS 체류를 크게 개선시키고, CNS에서의 치료 농도에 보다 용이하게 도달하는 것을 가능하게 한다 (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011)). 이러한 BBB 수송의 증거는 TfR 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 절단 효소, β-세크레타제 (BACE1) 둘 다에 결합하는 이중특이적 항체를 사용하여 달성되었다. 본 발명의 방법론을 사용하여 조작된 이중특이적 항-TfR/BACE1 항체의 단일 전신 용량은 뇌에서의 유의한 항체 흡수 뿐만 아니라, 단일특이적 항-BACE1 단독과 비교하여 뇌 Aβ1 -40의 극적으로 감소된 수준을 생성하였고, 이는 BBB 침투도가 항-BACE1의 효력에 영향을 미친다는 것을 시사한다. (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra44 (2011)).
그러한 데이터 및 실험은 낮은 친화도 항체 접근법을 사용하여 CNS 내로의 항체의 흡수를 증가시키는 것 이면의 여러 원인 메카니즘을 강조하였다. 첫째로, 높은 친화도 항-BBB 수용체 (BBB-R) 항체 (예를 들어, 상기 문헌 [Atwal et al. 및 Yu et al.]로부터의 항-TfRA)는 뇌 혈관계 내의 BBB-R을 신속하게 포화시킴으로써 뇌 흡수를 제한하고, 따라서 뇌 내로 흡수되는 항체의 총량을 감소시키고 또한 혈관계로의 그의 분포를 제한한다. 놀랍게도, BBB-R에 대한 친화도를 낮추는 것이 뇌 흡수 및 분포를 개선시키고, 혈관계로부터 CNS 내에 분포된 뉴런 및 연관된 신경망으로의 국재화에서 강건한 변경이 관찰된다. 둘째로, BBB-R에 대한 항체의 전체적인 친화도가 낮고, BBB의 CNS 측 상의 항체의 국재 농도가 CNS 구획 내로의 항체의 신속한 분산으로 인해 비-포화이기 때문에, BBB-R에 대한 항체의 보다 낮은 친화도는 막의 CNS 측으로부터 BBB-R을 통해 BBB의 혈관 측으로 되돌아오는 항체의 능력을 손상시키는 것으로 제안된다. 셋째로, 생체내에서 그리고 TfR 시스템에 대해 관찰된 바와 같이, BBB-R에 대한 친화도가 덜한 항체는 BBB-R에 대한 친화도가 더 큰 항체만큼 효율적으로 시스템으로부터 클리어되지 않고, 따라서 보다 높은 친화도의 그의 대응물보다 더 높은 순환 농도로 유지된다. 이는 보다 낮은 친화도 항체의 순환 항체 수준이 보다 높은 친화도 항체보다 더 긴 시간 동안 치료 수준으로 지속되고, 결과적으로 더 긴 시간 동안 뇌에서의 항체의 흡수를 개선시키기 때문에 유리하다. 또한, 혈장 및 뇌 노출 둘 다에서의 이러한 개선은 임상에서 투여 빈도를 감소시킬 수 있고, 이는 환자 순응도 및 편의성 뿐만 아니라 항체 및/또는 그에 커플링된 치료 화합물의 임의의 잠재적인 부작용 또는 오프-표적 효과를 줄이는 것에서 잠재적인 이익을 가질 것이다.
상기 언급된 연구에 기재된 낮은 친화도 BBB-R 항체는 트랜스페린과 TfR 사이의 천연 결합을 방해하는 것을 피하도록, 따라서 잠재적인 철 수송-관련 부작용을 피하도록 선택/조작되었다. 그럼에도 불구하고, 마우스에서 특정의 이들 항체를 투여했을 때, 일부 두드러진 부작용이 관찰되었다. 마우스는 급성 임상 증상의 신속한 개시가 동반된 망상적혈구 집단의 강건한 고갈의 1차 반응을 디스플레이하였다. 마우스는 급성 임상 증상 및 감소된 망상적혈구 수준 둘 다로부터 결국 회복되었지만, 망상적혈구에 대한 이러한 영향을 피하거나 또는 달리 완화시키는 것이 항-TfR 항체가 치료 분자로서 안전하게 사용될 수 있는데 명백하게 바람직하다. 항-TfR 투여에 대한 1차 반응 (강건한 망상적혈구 고갈 및 급성 임상 징후)은 항체의 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성에 의해 대부분 구동되는 한편, 나머지 망상적혈구 고갈 효과는 보체 경로에 의해 매개되는 것으로 발견되었다.
이들 이전 연구는 마우스 TfR에는 특이적으로 결합하지만 영장류 또는 인간 TfR은 특이적으로 인식하지 않는 마우스 항체를 사용하였다. 따라서, 본 발명은 인간에서의 치료적 또는 진단적 사용 이전에 영장류에서의 항체를 사용한 안전성 및 효능 연구를 용이하게 하기 위한, 영장류 및 인간 TfR 둘 다를 특이적으로 인식하는 항체 및 그의 기능적 부분을 제공한다. 본 발명의 항-인간 TfR 항체로 처리된 인간 적모구 세포주 및 1차 골수 세포를 사용한 시험관내 연구는 TfR-양성 적혈구의 강건한 고갈이 마우스에서와 같이 인간/영장류 세포 시스템에서 또한 관찰될 수 있다는 것을 입증하였다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 따라서, 본원은 또한 치료 농도로 투여된 항-인간/영장류 TfR 항체에 의해 제공되는 증진된 BBB 수송, 증가된 CNS 분포 및 CNS 체류를 여전히 가능하게 하는 한편, 항-TfR 투여 시의 TfR-발현 망상적혈구 집단의 원치 않는 감소를 크게 감소시키거나 제거하기 위한 본 발명의 항체에 대한 변형을 제공한다. 1차 및 나머지 망상적혈구 고갈 둘 다에 대한 본 발명의 항-TfR 항체의 관찰되는 효과를 완화시키기 위한 여러 일반적인 접근법이 본원에 제공되고, 이는 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
한 접근법에서, ADCC 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 항-인간/시노 TfR 항체의 이펙터 기능이 감소되거나 제거된다. 또 다른 접근법에서, 항체와 망상적혈구 집단의 상호작용이 이러한 집단에 덜 해롭도록 인간 또는 영장류 TfR에 대한 항-인간/시노 TfR 항체의 친화도가 추가로 줄어든다. 제3 접근법은 혈장 내에 존재하는 항-인간/시노 TfR 항체의 양을 감소시켜 잠재적으로 해로운 농도의 항체에 대한 망상적혈구 집단의 노출을 감소시키는 것에 관한 것이다. 제4 접근법은 항-인간/시노 TfR 항체의 투여에 의한 순환 내 또는 골수 내 망상적혈구 집단의 임의의 잠재적인 고갈을 피하거나, 줄이거나, 또는 완화시키도록 망상적혈구 집단을 보호하고/하거나, 안정화시키고/시키거나, 보충하는 것을 추구한다.
이펙터 기능 감소 또는 제거는, 본원에 기재된 바와 같이, (i) 항체의 야생형 포유동물 글리코실화의 감소 또는 제거에 의해 (예를 들어, 이러한 글리코실화가 발생할 수 없는 환경에서 항체를 생산함으로써, 항체가 글리코실화될 수 없도록 하나 이상의 탄수화물 부착 지점을 돌연변이시킴으로써, 또는 항체가 글리코실화된 후에 항체로부터 하나 이상의 탄수화물을 화학적으로 또는 효소적으로 제거함으로써); (ii) 항-인간/시노 TfR 항체의 Fc 수용체-결합 능력의 감소 또는 제거에 의해 (예를 들어, Fc 영역의 돌연변이에 의해, Fc 영역 내에서의 결실에 의해, 또는 Fc 영역의 제거에 의해); 또는 (iii) 이펙터 기능이 최소이거나 없는 것으로 공지된 항체 이소형 (즉, IgG4를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 사용에 의해 달성될 수 있다.
항체 보체 활성화를 감소시키는 것은, 본원에 기재된 바와 같이, 항-인간/시노 TfR 항체의 C1q 결합 능력의 감소 또는 제거에 의해 (예를 들어, Fc 영역의 돌연변이, Fc 영역 내에서의 결실 또는 Fc 영역의 제거에 의해, 또는 항-인간/시노 TfR 항체의 비-Fc 부분을 변형시킴으로써), 또는 다르게는 보체 시스템의 활성화 또는 활성을 억제함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 보체 경로 활성화 또는 보체 경로 활성 억제제를 공-투여함으로써) 달성될 수 있다.
본원에 예시된 항-인간/시노 TfR 항체와 같이, 항-인간/시노 TfR 항체가 망상적혈구 또는 높은 수준의 TfR을 발현하는 다른 세포 유형 상의 인간 또는 시노 TfR에 결합하는 것이 그의 고갈을 촉발하는 경우에, 항체가 망상적혈구 또는 다른 세포 유형 상의 인간 또는 시노 TfR에 결합하는 것의 감소는 차례로 항체 투여 시에 관찰된 순환 내 또는 골수 내 망상적혈구 또는 다른 세포 유형 고갈의 양을 감소시켜야 한다. 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여, 그리고 실시예에 제시된 바와 같이, 영장류 또는 인간 TfR에 대한 항-인간/시노 TfR 항체의 친화도가 변형될 수 있다.
잠재적으로 해로운 농도의 항체에 대한 망상적혈구 집단의 노출을 감소시키도록 혈장 내에 존재하는 항-인간/시노 TfR 항체의 양을 감소시키는 것이 여러 방식으로 달성될 수 있다. 한 방법은 혈장 내의 최대 농도는 낮아지지만 충분한 혈청 수준이 효능을 위해 유지되면서 여전히 세포-고갈 부작용의 역치 미만이도록, 잠재적으로는 투여 빈도를 또한 증가시키면서, 단순히 투여되는 항체의 양을 감소시키는 것이다. 투여 변형과 조합될 수 있는 또 다른 방법은 pH 7.4의 혈장 내의 세포 표면 TfR에는 본원에 기재된 바와 같은 바람직하게 낮은 친화도로 결합하지만, 엔도솜 구획 내로 내재화 시, 그러한 구획의 상대적으로 더 낮은 pH (pH 5.5-6.0)에서 TfR에 대한 이러한 결합이 급속하게 그리고 유의하게 감소되도록, TfR에 대한 결합이 pH-감수성인 항-TfR 항체를 선택 또는 조작하는 것이다. 이러한 해리는 항원-매개 클리어런스로부터 항체를 보호할 수 있거나, 또는 CNS로 전달되거나 BBB를 가로질러 다시 재순환되는 항체의 양을 증가시킬 수 있고 - 어느 경우든, 투여된 항체 용량을 증가시키지 않으면서 항체의 유효 농도가 이러한 pH 감수성을 포함하지 않는 항-TfR 항체와 비교하여 증가되고, 이는 차례로 보다 낮은 부작용의 위험과 병행되는 보다 낮은 항체의 용량을 잠재적으로 허용한다.
망상적혈구 집단을 보호하고/하거나, 안정화시키고/시키거나, 보충하는 것은 제약상 방법 또는 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 항-인간/시노 TfR 항체에 더하여, 망상적혈구 집단에 대한 항체의 음성 부작용을 완화시키는 적어도 1종의 추가 치료제가 공투여될 수 있다 (동시에 또는 순차적으로). 이러한 치료제의 예는 에리트로포이에틴 (EPO), 철 보충제, 비타민 C, 폴산 및 비타민 B12를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 유사한 세포의 수혈에 의해 적혈구 (즉, 망상적혈구)의 물리적 대체가 또한 가능하고, 이는 혈액형이 유사한 또 다른 개체로부터의 것일 수 있거나 또는 항-인간/시노 TfR 항체가 투여되는 대상체로부터 이전에 추출되었을 수 있다.
통상의 기술자는 상기 방법의 임의의 조합이 (i) 항체 및 임의의 접합된 화합물의 CNS 내로의 수송을 최대화할 영장류 또는 인간 TfR에 대한 바람직하게 낮은 친화도; (ii) 치료 효과를 갖기 위해서는 CNS 내에 존재할 필요가 있는 화합물의 양과 관련이 있기 때문에, 접합된 화합물 (비제한적 예로서, 항-인간/시노 TfR 항체에서의 제2 또는 추가의 항원-결합 특이성 포함)의 그의 CNS 항원에 대한 친화도; (iii) 항-인간/시노 TfR 항체의 클리어런스율; (iv) BBB의 CNS/뇌 측에 대한 접합된 화합물의 방출을 용이하게 하는 낮은 pH에서의 항-TfR/접합된 화합물의 불안정성, 및 (v) 망상적혈구 집단에 대한 영향 사이의 최적의 균형으로 항체 (및/또는 그에 대한 투여 요법)를 조작하는데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
항-TfR 항체 투여의 본원에서 인지되는 망상적혈구-고갈 효과가 망상적혈구의 과다증식이 문제가 되는 임의의 질환 또는 장애의 치료에서 유용할 수 있다는 것이 또한 인식될 것이다. 예를 들어, 선천성 적혈구증가증 또는 신생물성 진성 적혈구증가증에서, 예를 들어 망상적혈구의 과다증식으로 인해 상승된 적혈구 계수는 혈액의 증점 및 병행 생리학적 증상을 야기한다. 항체의 적어도 부분적인 이펙터 기능이 보존되어 있는 본 발명의 항-인간/시노 TfR 항체의 투여는 CNS 내로의 정상적인 트랜스페린 수송에 영향을 미치지 않으면서 미성숙 망상적혈구 집단의 선택적인 제거를 허용할 것이다. 관련 기술분야에서 널리 이해되는 바와 같이, 급성 임상 증상이 최소화될 수 있도록 이러한 항체의 투여가 조절될 수 있다 (즉, 매우 낮은 용량으로 또는 넓게-이격되어 투여함으로써).
항-TfR/BACE1 및 항-TfR/A베타는 각각 알츠하이머병의 치료를 위한 유망하고 신규한 치료 후보이다. 또한, 수용체 매개 수송 (RMT)-기반 이중특이적 표적화 기술은 CNS 질환에 대한 광범위한 잠재적인 치료제에 대한 기회를 제공한다. 본 발명은 망상적혈구의 고갈 없이 치료제의 BBB를 가로지르는 수송 및 CNS 분포를 크게 개선시키는, BBB-침투 치료제를 조작하는 방법을 제공한다.
따라서, 제1 실시양태에서, 본 발명은 인간 트랜스페린 수용체 (TfR) 및 영장류 TfR에 결합하는 단리된 항체이며, 여기서 항체는 TfR에 대한 트랜스페린의 결합은 억제하지 않는 것인 단리된 항체를 제공한다. 한 측면에서, 결합은 특이적 결합이다. 또 다른 측면에서, 항체는 추가로 TfR에 대한 인간 혈색소증 단백질 ("HFE")의 결합을 억제하지 않는다. 한 측면에서, 결합은 특이적 결합이다. 한 측면에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 또 다른 측면에서, 항체는 인간 항체이다. 또 다른 측면에서, 항체는 인간화 항체이다. 또 다른 측면에서, 항체는 키메라 항체이다. 또 다른 측면에서, 항체는 인간 TfR 및 영장류 TfR에 결합하는 항체 단편이다. 또 다른 측면에서, 영장류 TfR은 시노몰구스 원숭이로부터의 것이다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 31, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 36, 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 36, 40 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 42, 43 및 44의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 31, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 46, 48 및 49의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 52, 54 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 52, 58 및 59의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 62, 63 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 52, 65 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 68, 69 및 70의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 73, 75 및 76의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 79, 81 및 82의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 79, 83 및 84의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 87, 89 및 90의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 93, 95 및 96의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 99, 101 및 102의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 127, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 52, 156 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 52, 157 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 155, 54 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 37, 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 32, 40 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 37, 43 및 44의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 47, 48 및 49의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 54 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 58 및 59의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 63 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 65 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 69 및 70의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 74, 75 및 76의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 80, 81 및 82의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 80, 83 및 84의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 88, 89 및 90의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 94, 95 및 96의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 100, 101 및 102의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 156 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 157 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 35, 30 및 36의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 41, 30 및 42의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 45, 30 및 46의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 50, 51 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 56, 57 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 60, 61 및 62의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 60, 64 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 66, 67 및 68의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 71, 72 및 73의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 77, 78 및 79의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 85, 86 및 87의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 97, 98 및 99의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 127의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 50, 51 및 155의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 35, 30 및 36의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 37, 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 35, 30 및 36의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 32, 40 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 41, 30 및 42의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 37, 43 및 44의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 45, 30 및 46의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 47, 48 및 49의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 50, 51 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 54 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 56, 57 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 58 및 59의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 60, 61 및 62의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 63 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 60, 64 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 65 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 66, 67 및 68의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 69 및 70의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 71, 72 및 73의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 74, 75 및 76의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 77, 78 및 79의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 80, 81 및 82의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 77, 78 및 79의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 80, 83 및 84의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 85, 86 및 87의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 88, 89 및 90의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 94, 95 및 96의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 97, 98 및 99의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 100, 101 및 102의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 127의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 50, 51 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 156 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 50, 51 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 157 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 50, 51 및 155의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 54 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 47, 53, 또는 100의 HVR-H1 서열; 서열 48, 69, 101, 156 또는 157의 HVR-H2 서열; 서열 49, 76, 또는 102의 HVR-H3 서열; 서열 45, 66 또는 97의 HVR-L1 서열; 서열 30, 67 또는 98의 HVR-L2 서열; 및 서열 46, 68 또는 102의 HVR-L3 서열로 이루어진 서열 군으로부터 선택된 적어도 1개의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 또는 HVR-L3 서열을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 (a) 서열 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 20, 25, 26, 27, 28, 108, 114, 120, 126, 153 또는 154의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 19, 21, 22, 23, 24, 105, 111, 117, 123 또는 151의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 한 이러한 측면에서, 항체는 서열 4의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 5의 VL 서열 및 서열 8의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 5의 VL 서열 및 서열 9의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 6의 VL 서열 및 서열 10의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 11의 VL 서열 및 서열 15의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 12의 VL 서열 및 서열 16의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 13의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 14의 VL 서열 및 서열 18의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 19의 VL 서열 및 서열 20의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 21의 VL 서열 및 서열 25의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 22의 VL 서열 및 서열 26의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 23의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 24의 VL 서열 및 서열 28의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 105의 VL 서열 및 서열 108의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 111의 VL 서열 및 서열 114의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 117의 VL 서열 및 서열 120의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 123의 VL 서열 및 서열 126의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 105의 VL 서열 및 서열 153의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 105의 VL 서열 및 서열 154의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 151의 VL 서열 및 서열 108의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 (a) 서열 108, (b) 서열 114, (c) 서열 120 또는 (d) 서열 126의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 (a) 서열 105, (b) 서열 111, (c) 서열 117, 또는 (d) 서열 123의 VL 서열을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 항체 7A4, 8A2, 15D2, 10D11, 7B10, 15G11, 16G5, 13C3, 16G4, 16F6, 7G7, 4C2, 1B12, 및 13D4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 7A4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 8A2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15D2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 10D11이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7B10이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16G5이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 13C3이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16G4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7G7이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 4C2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 1B12이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 13D4이다.
임의의 상기의 한 측면에서, 항체는 추가로 친화도 성숙된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v1, 15G11.v2, 15G11.v3, 15G11.v4, 15G11.v5, 7A4.v1; 7A4.v2, 7A4.v3, 7A4.v4, 7A4.v5, 7A4.v6, 7A4.v7, 7A4.v8, 7A4.v9, 7A4.v10, 7A4.v11, 7A4.v12, 7A4.v13, 7A4.v14, 7A4.v15, 7G7.v1, 16F6.v1, 16F6.v2, 16F6.v3, 16F6.v4, 15G11.N52A, 15G11.T53A 및 15G11.W92A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v1이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v3이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v5이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v1이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v3이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v5이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v6이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v7이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v8이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v9이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v10이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v11이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v12이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v13이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v14이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v15이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7G7.v1이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v1이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v3이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.N52A이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.T53A이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.W92A이다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 VH 또는 VL 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 도 4ea 및 4eb의 그 위치에 표시된 아미노산으로 변형된다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 도 3 및 4 및 도 4ea 및 4eb에서 클론 중 어느 하나에 대해 제시된 것 또는 것들 중 1개 이상에 상응하는 서열 또는 1개 이상의 HVR 서열을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 도 3 및 4 및 도 4ea 및 4eb에서 클론 중 어느 하나에 대해 제시된 것에 상응하는 VH 또는 VL 서열을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 도 3 및 4 및 도 4ea 및 4eb에서 클론 중 어느 하나에 대해 제시된 것들 중 1개 이상에 상응하는 1개 이상의 HVR 서열을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 치료 화합물에 커플링된다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 영상화제 또는 표지에 커플링된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 다중특이적 항체이고, 치료 화합물은 임의로 다중특이적 항체의 한 부분을 형성한다. 한 이러한 측면에서, 다중특이적 항체는 TfR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 뇌 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다. 한 이러한 측면에서, 뇌 항원은 베타-세크레타제 1 (BACE1), A베타, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 타우, 아포지단백질 E (ApoE), 알파-시뉴클레인, CD20, 헌팅틴, 프리온 단백질 (PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2 (LRRK2), 파르킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), p75 뉴로트로핀 수용체 (p75NTR), 및 카스파제 6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 이러한 측면에서, 다중특이적 항체는 TfR 및 BACE1 둘 다에 결합한다. 또 다른 이러한 측면에서, 다중특이적 항체는 TfR 및 A베타 둘 다에 결합한다. 또 다른 이러한 측면에서, 치료 화합물은 신경계 장애 약물이다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 것을 포함하고, 임의로 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 임의의 상기 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제를 제공한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 임의의 상기 항체를 제공한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 발명은 신경계 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 임의의 상기 항체의 용도를 제공한다. 한 이러한 측면에서, 신경계 장애는 신경병증 장애, 신경변성 질환, 암, 안구 질환 장애, 발작 장애, 리소솜 축적 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 행동 장애 및 CNS 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 발명은 신경계 장애를 치료하는데 사용하기 위한 임의의 상기 항체를 제공한다. 한 이러한 측면에서, 신경계 장애는 신경병증 장애, 신경변성 질환, 암, 안구 질환 장애, 발작 장애, 리소솜 축적 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 행동 장애 및 CNS 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 발명은 BBB를 가로질러 1종 이상의 화합물을 수송하는데 사용하기 위한 임의의 상기 항체를 제공한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, BBB를 가로질러 1종 이상의 화합물을 수송하기 위한 의약의 제조에서의 임의의 상기 항체의 용도가 제공된다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체가 BBB를 가로질러 그에 커플링된 화합물을 수송하도록 임의의 상기 항체를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 대상체에서 BBB를 가로질러 화합물을 수송하는 방법이 제공된다. 또 다른 이러한 측면에서, BBB는 인간 대상체에 존재한다. 또 다른 이러한 측면에서, 투여 용량 및/또는 빈도는 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절된다. 또 다른 이러한 측면에서, 상기 방법은 적혈구의 고갈에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 화합물에 커플링된 항체는 치료 용량으로 투여된다. 한 이러한 측면에서, 치료 용량은 TfR-포화시키는 것이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 투여는 항체 투여의 급성 임상 증상을 최소화하도록 보정된 용량 및/또는 용량 빈도로 이루어진다.
상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체가 BBB를 가로질러 그에 커플링된 화합물을 수송하도록 임의의 상기 항체를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 대상체의 CNS의 화합물에 대한 노출을 증가시키는 방법이 제공된다. 또 다른 이러한 측면에서, BBB는 인간 대상체에 존재한다. 또 다른 이러한 측면에서, 투여 용량 및/또는 빈도는 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절된다. 또 다른 이러한 측면에서, 상기 방법은 적혈구의 고갈에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 화합물에 커플링된 항체는 치료 용량으로 투여된다. 한 이러한 측면에서, 치료 용량은 TfR-포화시키는 것이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 투여는 항체 투여의 급성 임상 증상을 최소화하도록 보정된 용량 및/또는 용량 빈도로 이루어진다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 화합물의 CNS 내 체류가 증가되도록 임의의 상기 항체를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 대상체에 투여된 화합물의 CNS 내 체류를 증가시키는 방법이 제공된다. 또 다른 이러한 측면에서, BBB는 인간 대상체에 존재한다. 또 다른 이러한 측면에서, 투여 용량 및/또는 빈도는 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절된다. 또 다른 이러한 측면에서, 상기 방법은 적혈구의 고갈에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 화합물에 커플링된 항체는 치료 용량으로 투여된다. 한 이러한 측면에서, 치료 용량은 TfR-포화시키는 것이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 투여는 항체 투여의 급성 임상 증상을 최소화하도록 보정된 용량 및/또는 용량 빈도로 이루어진다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 포유동물을 임의의 상기 항체로 치료하는 것을 포함하는, 포유동물에서 신경계 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 한 이러한 측면에서, 신경계 장애는 신경병증 장애, 신경변성 질환, 암, 안구 질환 장애, 발작 장애, 리소솜 축적 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 행동 장애 및 CNS 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 이러한 측면에서, 신경계 장애는 인간 대상체에 존재한다. 또 다른 이러한 측면에서, 투여 용량 및/또는 빈도는 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절된다. 또 다른 이러한 측면에서, 상기 방법은 적혈구의 고갈에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 화합물에 커플링된 항체는 치료 용량으로 투여된다. 한 이러한 측면에서, 치료 용량은 TfR-포화시키는 것이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 투여는 항체 투여의 급성 임상 증상을 최소화하도록 보정된 용량 및/또는 용량 빈도로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 TfR 및 영장류 TfR에 결합하는 단리된 항체이며, 여기서 항체는 TfR에 대한 트랜스페린의 결합은 억제하지 않고, 여기서 항체의 하나 이상의 특성은 항체로 치료된 대상체 또는 포유동물에서 망상적혈구에 대한 항체의 영향을 감소 또는 제거하고/거나 급성 임상 증상의 중증도 또는 존재를 감소시키도록 변형되어 있는 것인 단리된 항체를 제공한다. 한 측면에서, 결합은 특이적 결합이다. 또 다른 측면에서, 항체는 추가로 TfR에 대한 HFE의 결합을 억제하지 않는다. 한 측면에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 또 다른 측면에서, 항체는 인간 항체이다. 또 다른 측면에서, 항체는 인간화 항체이다. 또 다른 측면에서, 항체는 키메라 항체이다. 또 다른 측면에서, 항체는 인간 TfR 및 영장류 TfR에 결합하는 항체 단편이다. 또 다른 측면에서, 영장류 TfR은 시노몰구스 원숭이로부터의 것이다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 31, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 36, 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 36, 40 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 42, 43 및 44의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 31, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 46, 48 및 49의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 52, 54 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 52, 58 및 59의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 62, 63 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 52, 65 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 68, 69 및 70의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 73, 75 및 76의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 79, 81 및 82의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 79, 83 및 84의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 87, 89 및 90의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 93, 95 및 96의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 99, 101 및 102의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 127, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L3, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 37, 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 32, 40 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 37, 43 및 44의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 47, 48 및 49의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 54 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 58 및 59의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 63 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 65 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 53, 69 및 70의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 74, 75 및 76의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 80, 81 및 82의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 80, 83 및 84의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 88, 89 및 90의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 94, 95 및 96의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 100, 101 및 102의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 35, 30 및 36의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 41, 30 및 42의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 45, 30 및 46의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 50, 51 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 56, 57 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 60, 61 및 62의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 60, 64 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 66, 67 및 68의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 71, 72 및 73의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 77, 78 및 79의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 85, 86 및 87의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 97, 98 및 99의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 127의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 35, 30 및 36의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 37, 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 35, 30 및 36의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 32, 40 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 41, 30 및 42의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 37, 43 및 44의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 45, 30 및 46의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 47, 48 및 49의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 50, 51 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 54 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 56, 57 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 58 및 59의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 60, 61 및 62의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 63 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 60, 64 및 52의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 65 및 55의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 66, 67 및 68의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 53, 69 및 70의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 71, 72 및 73의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 74, 75 및 76의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 77, 78 및 79의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 80, 81 및 82의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 77, 78 및 79의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 80, 83 및 84의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 85, 86 및 87의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 88, 89 및 90의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 94, 95 및 96의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 97, 98 및 99의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 100, 101 및 102의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 서열 29, 30 및 127의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 및 서열 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 서열 47, 53, 또는 100의 HVR-H1 서열; 서열 48, 69, 또는 101의 HVR-H2 서열; 서열 49, 76, 또는 102의 HVR-H3 서열; 서열 45, 66 또는 97의 HVR-L1 서열; 서열 30, 67 또는 98의 HVR-L2 서열; 및 서열 46, 68 또는 102의 HVR-L3 서열로 이루어진 서열 군으로부터 선택된 적어도 1개의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 또는 HVR-L3 서열을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 (a) 서열 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 20, 25, 26, 27, 28, 108, 114, 120 또는 126의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 19, 21, 22, 23, 24, 105, 111, 117 또는 123의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 한 이러한 측면에서, 항체는 서열 4의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 5의 VL 서열 및 서열 8의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 5의 VL 서열 및 서열 9의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 6의 VL 서열 및 서열 10의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 11의 VL 서열 및 서열 15의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 12의 VL 서열 및 서열 16의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 13의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 14의 VL 서열 및 서열 18의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 19의 VL 서열 및 서열 20의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 21의 VL 서열 및 서열 25의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 22의 VL 서열 및 서열 26의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 23의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 24의 VL 서열 및 서열 28의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 105의 VL 서열 및 서열 108의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 111의 VL 서열 및 서열 114의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 117의 VL 서열 및 서열 120의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 서열 123의 VL 서열 및 서열 126의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 (a) 서열 108, (b) 서열 114, (c) 서열 120 또는 (d) 서열 126의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 (a) 서열 105, (b) 서열 111, (c) 서열 117, 또는 (d) 서열 123의 VL 서열을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 항체 7A4, 8A2, 15D2, 10D11, 7B10, 15G11, 16G5, 13C3, 16G4, 16F6, 7G7, 4C2, 1B12, 및 13D4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 7A4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 8A2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15D2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 10D11이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7B10이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16G5이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 13C3이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16G4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7G7이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 4C2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 1B12이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 13D4이다.
임의의 상기의 한 측면에서, 항체는 추가로 친화도 성숙된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v1, 15G11.v2, 15G11.v3, 15G11.v4, 15G11.v5, 7A4.v1; 7A4.v2, 7A4.v3, 7A4.v4, 7A4.v5, 7A4.v6, 7A4.v7, 7A4.v8, 7A4.v9, 7A4.v10, 7A4.v11, 7A4.v12, 7A4.v13, 7A4.v14, 7A4.v15, 7G7.v1, 16F6.v1, 16F6.v2, 16F6.v3 및 16F6.v4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v1이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v3이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.v5이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v1이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v3이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v5이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v6이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v7이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v8이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v9이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v10이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v11이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v12이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v13이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v14이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7A4.v15이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 7G7.v1이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v1이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v2이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v3이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.N52A이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.T53A이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v4이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 15G11.W92A이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 16F6.v4이다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 VH 또는 VL 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 도 4ea 및 4eb의 그 위치에 표시된 아미노산으로 변형된다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 도 3 및 4 및 도 4ea 및 4eb에서 클론 중 어느 하나에 대해 제시된 서열 또는 1개 이상의 HVR 서열에 상응하는 서열 또는 1개 이상의 HVR 서열을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 도 3 및 4 및 도 4ea 및 4eb에서 클론 중 어느 하나에 대해 제시된 VH 또는 VL 서열에 상응하는 VH 또는 VL 서열을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 도 3 및 4 및 도 4ea 및 4eb에서 클론 중 어느 하나에 대해 제시된 1개 이상의 HVR 서열에 상응하는 1개 이상의 HVR 서열을 포함한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체의 하나 이상의 특성은 항체 Fc 영역의 이펙터 기능, 항체의 보체 활성화 기능 및 TfR에 대한 항체의 친화도로부터 선택된다. 한 이러한 측면에서, 특성은 항체 Fc 영역의 이펙터 기능이다. 또 다른 이러한 측면에서, 특성은 항체의 보체 활성화 기능이다. 또 다른 이러한 측면에서, 특성은 TfR에 대한 항체의 친화도이다. 한 이러한 측면에서, 이펙터 기능 또는 보체 활성화 기능은 동일한 이소형의 야생형 항체와 비교하여 감소되거나 제거되어 있다. 한 측면에서, 이펙터 기능은 항체의 글리코실화의 감소, 자연적으로 감소되거나 제거된 이펙터 기능을 갖는 이소형으로의 항체 이소형의 변형, 및 Fc 영역의 변형으로부터 선택된 방법에 의해 감소되거나 제거된다.
한 이러한 측면에서, 이펙터 기능은 항체의 글리코실화의 감소에 의해 감소되거나 제거된다. 한 이러한 측면에서, 항체의 글리코실화는 야생형 글리코실화를 허용하지 않는 환경에서의 항체의 생산; 항체 상에 이미 존재하는 탄수화물 기의 제거; 및 야생형 글리코실화가 발생하지 않도록 하는 항체의 변형으로부터 선택된 방법에 의해 감소된다. 한 이러한 측면에서, 항체의 글리코실화는 야생형 글리코실화를 허용하지 않는 환경에서의 항체의 생산, 예컨대 비-포유동물 세포 생산 시스템에서의 생산에 의해, 또는 항체가 합성적으로 생산된 경우에 감소된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 비-포유동물 세포 생산 시스템에서 생산된다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체는 합성적으로 생산된다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 글리코실화는 야생형 글리코실화가 발생하지 않도록 하는 항체의 변형에 의해 감소되며, 예컨대 여기서 항체의 Fc 영역은 위치 297에서의 야생형 아스파라긴 잔기가 그 위치에서 글리코실화를 방해하는 또 다른 아미노산으로 대체되도록 그 위치에서 돌연변이를 포함한다.
또 다른 이러한 측면에서, 이펙터 기능은 Fc 영역의 적어도 하나의 변형에 의해 감소되거나 제거된다. 한 이러한 측면에서, 이펙터 기능 또는 보체 활성화 기능은 Fc 영역의 모든 또는 부분 결실에 의해, 또는 이펙터 기능 또는 보체 활성화 기능에 적격인 Fc 영역 또는 비-Fc 영역을 포함하지 않도록 항체를 조작하는 것에 의해 감소되거나 제거된다. 또 다른 이러한 측면에서, Fc 영역의 적어도 하나의 변형은 하기로부터 선택된다: 하기 위치: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438, 및 439로부터 선택된 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합을 손상시키는 Fc 영역의 점 돌연변이; 하기 위치: 270, 322, 329, 및 321로부터 선택된 C1q에 대한 결합을 손상시키는 Fc 영역의 점 돌연변이; Fc 영역의 일부 또는 모두의 제거, 및 CH1 도메인의 위치 132에서의 점 돌연변이. 한 이러한 측면에서, 변형은 하기 위치: 270, 322, 329, 및 321로부터 선택된 C1q에 대한 결합을 손상시키는 Fc 영역의 점 돌연변이이다. 또 다른 이러한 측면에서, 변형은 Fc 영역의 일부 또는 모두의 제거이다. 또 다른 이러한 측면에서, 보체-촉발 기능은 Fc 영역의 모든 또는 부분 결실에 의해, 또는 항체가 보체 경로에 관여하는 Fc 영역을 포함하지 않도록 항체를 조작하는 것에 의해 감소되거나 제거된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 Fab 또는 단일쇄 항체로부터 선택된다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 비-Fc 영역은 항체에 의한 보체 경로의 활성화를 감소시키거나 제거하도록 변형된다. 한 이러한 측면에서, 변형은 C3에 대한 결합을 손상시키는 CH1 영역의 점 돌연변이이다. 한 이러한 측면에서, 점 돌연변이는 위치 132에서 이루어진다 (예를 들어, 문헌 [Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 38217-38223] 참조).
한 측면에서, 항체의 반감기는 FcRn 결합 영역에서의 변형에 의해 증가된다. 한 측면에서, 변형은 하기 위치: 251 256, 285, 290, 308, 314, 385, 389, 428, 434, 436, 238, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434로부터 선택된 아미노산에서의 치환이다. 한 측면에서 변형은 하기: M252Y, S254T, T256E, N434A 및 Y436I로부터 선택된 치환이다.
한 측면에서, 항체는 망상적혈구 수준 또는 급성 임상 증상에 대한 영향을 완화시키거나 그의 감소에 기여하는 추가의 화합물과 조합된다. 한 이러한 측면에서, 추가의 화합물은 망상적혈구를 항체-관련 고갈로부터 보호하거나 또는 망상적혈구의 성장, 발달 또는 재건을 지지한다. 또 다른 이러한 측면에서, 추가의 화합물은 에리트로포이에틴 (EPO), 철 보충제, 비타민 C, 폴산 및 비타민 B12로부터 선택되거나, 또는 적혈구 또는 망상적혈구이다.
상기 실시양태의 한 측면에서, TfR에 대한 항체의 친화도는 TfR에 대해 낮춰진 친화도를 갖지 않는 동일한 이소형의 야생형 항체와 비교하여 측정 시 감소된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 TfR에 대해 약 1 pM 내지 약 100 μM의 KD 또는 IC50을 갖는다. 또 다른 측면에서, 항체의 투여 용량 및/또는 빈도는 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절된다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체는 치료 화합물에 커플링된다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체는 영상화제 또는 표지에 커플링된다. 한 이러한 측면에서, 항체는 다중특이적 항체이고, 치료 화합물이 임의로 다중특이적 항체의 한 부분을 형성한다. 한 이러한 측면에서, 다중특이적 항체는 TfR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 뇌 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다. 한 이러한 측면에서, 뇌 항원은 베타 세크레타제 1 (BACE1), A베타, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 타우, 아포지단백질 E (ApoE), 알파-시뉴클레인, CD20, 헌팅틴, 프리온 단백질 (PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2 (LRRK2), 파르킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), p75 뉴로트로핀 수용체 (p75NTR), 및 카스파제 6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 이러한 측면에서, 다중특이적 항체는 TfR 및 BACE1 둘 다에 결합한다. 또 다른 이러한 측면에서, 다중특이적 항체는 TfR 및 A베타 둘 다에 결합한다. 또 다른 이러한 측면에서, 치료 화합물은 신경계 장애 약물이다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 것을 포함하고, 임의로 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 임의의 상기 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제를 제공한다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 임의의 상기 항체를 제공한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 발명은 신경계 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 임의의 상기 항체의 용도를 제공한다. 한 이러한 측면에서, 신경계 장애는 신경병증 장애, 신경변성 질환, 암, 안구 질환 장애, 발작 장애, 리소솜 축적 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 행동 장애 및 CNS 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 발명은 신경계 장애를 치료하는데 사용하기 위한 임의의 상기 항체를 제공한다. 한 이러한 측면에서, 신경계 장애는 신경병증 장애, 신경변성 질환, 암, 안구 질환 장애, 발작 장애, 리소솜 축적 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 행동 장애 및 CNS 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 발명은 BBB를 가로질러 1종 이상의 화합물을 수송하는데 사용하기 위한 임의의 상기 항체를 제공한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, BBB를 가로질러 1종 이상의 화합물을 수송하기 위한 의약의 제조에서의 임의의 상기 항체의 용도가 제공된다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 항체가 BBB를 가로질러 그에 커플링된 화합물을 수송하도록 임의의 상기 항체를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 대상체에서 BBB를 가로질러 화합물을 수송하는 방법이 제공된다. 또 다른 이러한 측면에서, BBB는 인간 대상체에 존재한다. 또 다른 이러한 측면에서, 투여 용량 및/또는 빈도는 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절된다. 또 다른 이러한 측면에서, 상기 방법은 적혈구의 고갈에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 화합물에 커플링된 항체는 치료 용량으로 투여된다. 한 이러한 측면에서, 치료 용량은 TfR-포화시키는 것이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 투여는 항체 투여의 급성 임상 증상을 최소화하도록 보정된 용량 및/또는 용량 빈도로 이루어진다.
상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 항체가 BBB를 가로질러 그에 커플링된 화합물을 수송하도록 임의의 상기 항체를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 대상체의 CNS의 화합물에 대한 노출을 증가시키는 방법이 제공된다. 또 다른 이러한 측면에서, BBB는 인간 대상체에 존재한다. 또 다른 이러한 측면에서, 투여 용량 및/또는 빈도는 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절된다. 또 다른 이러한 측면에서, 상기 방법은 적혈구의 고갈에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 화합물에 커플링된 항체는 치료 용량으로 투여된다. 한 이러한 측면에서, 치료 용량은 TfR-포화시키는 것이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 투여는 항체 투여의 급성 임상 증상을 최소화하도록 보정된 용량 및/또는 용량 빈도로 이루어진다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 화합물의 CNS 내 체류가 증가되도록 임의의 상기 항체를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 대상체에 투여된 화합물의 CNS 내 체류를 증가시키는 방법이 제공된다. 또 다른 이러한 측면에서, BBB는 인간 대상체에 존재한다. 또 다른 이러한 측면에서, 투여 용량 및/또는 빈도는 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절된다. 또 다른 이러한 측면에서, 상기 방법은 적혈구의 고갈에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 화합물에 커플링된 항체는 치료 용량으로 투여된다. 한 이러한 측면에서, 치료 용량은 TfR-포화시키는 것이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 투여는 항체 투여의 급성 임상 증상을 최소화하도록 보정된 용량 및/또는 용량 빈도로 이루어진다.
상기 실시양태의 한 측면에서, 포유동물을 임의의 상기 항체로 치료하는 것을 포함하는, 포유동물에서 신경계 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 한 이러한 측면에서, 신경계 장애는 신경병증 장애, 신경변성 질환, 암, 안구 질환 장애, 발작 장애, 리소솜 축적 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 행동 장애 및 CNS 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 이러한 측면에서, 신경계 장애는 인간 대상체에 존재한다. 또 다른 이러한 측면에서, 투여 용량 및/또는 빈도는 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절된다. 또 다른 이러한 측면에서, 상기 방법은 적혈구의 고갈에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 이러한 측면에서, 화합물에 커플링된 항체는 치료 용량으로 투여된다. 한 이러한 측면에서, 치료 용량은 TfR-포화시키는 것이다. 또 다른 이러한 측면에서, 항체의 투여는 항체 투여의 급성 임상 증상을 최소화하도록 보정된 용량 및/또는 용량 빈도로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 항체 7A4, 8A2, 15D2, 10D11, 7B10, 15G11, 16G5, 13C3, 16G4, 16F6, 7G7, 4C2, 1B12, 13D4, 15G11.v1, 15G11.v2, 15G11.v3, 15G11.v4, 15G11.v5, 7A4.v1; 7A4.v2, 7A4.v3, 7A4.v4, 7A4.v5, 7A4.v6, 7A4.v7, 7A4.v8, 7A4.v9, 7A4.v10, 7A4.v11, 7A4.v12, 7A4.v13, 7A4.v14, 7A4.v15, 7G7.v1, 16F6.v1, 16F6.v2, 16F6.v3, 16F6.v4 15G11.N52A, 15G11.T53A 및 15G11W92A로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 TfR 상의 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 화합물의 클리어런스가 감소되도록 화합물을 TfR에 낮은 친화도로 결합하는 항체에 커플링시키고, 여기서 화합물-커플링된 항체를 대상체에게 투여 시 대상체에서의 적혈구 수준의 감소가 감소되거나 제거되는, 대상체에게 투여된 화합물의 클리어런스를 감소시키는 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 화합물의 약동학 및/또는 약역학이 대상체 내의 CNS에서 효과적이도록 최적화하는 방법이 제공되며, 여기서 화합물은 TfR에 낮은 친화도로 결합하는 항체에 커플링되고, 항체는 화합물에 커플링된 후 TfR에 대한 그의 친화도가 CNS에서의 화합물의 약동학 및/또는 약역학을 최적화하는, BBB를 가로지르는 화합물에 접합된 항체의 수송량을 생성하도록 선택되며, 여기서 대상체에게 화합물-커플링된 항체의 투여 시 대상체 내 적혈구 수준의 감소는 감소되거나 제거된다.
본 발명의 임의의 상기 방법 및 조성물은 서로 및/또는 본원의 명세서에 기재된 본 발명의 추가 측면과 조합될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
도 1은 pdb 파일 3SM9를 기반으로 한, Tf와의 복합체로의 TfR 이량체의 3차원 결정 구조를 도시한다. TfR의 비-Tf-결합 정단 영역을 표지한다.
도 2a-2b는 1 μM 인간 홀로-Tf의 존재 하에 293 세포에서 일시적으로 발현된 인간 및 시노몰구스 TfR에 대한 마우스 하이브리도마 모 클론 상청액 결합의 FACS 분석을 도시한다. 달리 나타내지 않는 한, 각각의 그래프에서 채워진 회색 선은 검출 항체로부터의 배경이고, 중간 회색 선은 인간 TfR의 기저 수준을 내인성으로 발현하는 293 세포에 대한 결합이고, 볼드 흑색 선은 일시적으로 발현된 인간 TfR에 대한 결합을 나타내고, 연한 흑색 선은 일시적으로 발현된 시노 TfR에 대한 결합을 나타낸다.
도 2c는 실시예 1에 기재된 바와 같은 인간/시노몰구스 교차-반응성 항체 경쟁 검정의 결과를 도시한다. 14개의 클론 중 9개가 파지 상에 디스플레이된 정단 결합 항체의 결합을 차단하는 것으로 발견되었다.
도 3aa, 3ab, 3ba, 3bb, 3ca, 3cb, 3da 및 3db는 TfR의 정단 및 비-정단 영역에 결합하는 하이브리도마 클론의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 도시한다. 서열은 에피토프 및 서열 유사성에 의해 부류 I-III (정단 결합제) 및 부류 IV (비-정단 결합제)에 의해 추가로 세분될 수 있다. 카바트(Kabat)에 따른 HVR을 밑줄로 표시한다.
도 4aa, 4ab, 4ba, 4bb, 4ca, 4cb, 4da 및 4db는 (A) 15G11, (B) 7A4/8A2, (C) 7G7 및 (D) 16F6에 대한 인간화 서열의 정렬을 도시한다. 각각의 마우스 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 서열 (제2 라인)은 가장 가까운 인간 배선 또는 컨센서스 가변 도메인 (제1 라인)에 정렬된다. 각각의 항체에 대한 인간화 버전은 아래쪽에 제시된다 (제3 라인). 인간 배선 또는 컨센서스 서열의 차이를 음영으로 표시한다. 인간 프레임워크에 그라프트된 HVR 서열은 박스로 표시한다. 카바트에 따른 CDR 정의를 표시한다.
도 4ea 및 4eb는 부류 I-III 군의 항체에 대한, 친화도 및 결합 특이성이 유지된 FR의 1개 이상의 잔기에서 변형을 갖는 항체의 변이체 형태를 제시한다.
도 5는 6.3 μM 홀로-Tf의 존재 하에 huTfR에 대한 hu7A4.v15, hu15G11.v5 및 hu7G7.v1의 결합을 도시한다. 고정된 huTfR에 대한 항체 결합은 6.3 μM 홀로-Tf의 존재 (개방된 기호 및 점선) 또는 부재 (채워진 기호 및 실선) 하에 제시된다.
도 6a-b는 실시예 1에 기재된 HFE - HuTfR 결합 및 HFE 차단 검정의 결과를 도시한다. 도 6a는 고정된 HFE를 통해 포획된 증가하는 농도의 huTfR에 대한 항체의 결합을 제시한다. 도 6b는 증가하는 농도의 항체의 존재 하에 고정된 HFE에 대한 huTfR의 결합을 제시한다.
도 7a-b는 시노 및 인간 TfR에 대한 15G11.v5 및 7A4.v5 IgG 및 Fab Ala 변이체의 결합 분석을 도시하며, 이는 실시예 2에 기재된 바와 같이 고정된 인간 또는 시노 TfR에 대한, IgG로서 ELISA 결합에 의해 및 IgG 또는 Fab로서 SPR 분석에 의해 평가된 각각의 항체의 CDR-L3 및 CDR-H3에서의 Ala 돌연변이의 친화도에 대한 효과를 입증한다.
도 8a-b 및 도 9a-b는 실시예 4에 기재된 바와 같은, 1차 인간 골수 단핵 세포 또는 인간 적모구 세포주에서 항-인간 TfR ("항-hTFR") 항체의 ADCC 활성에 대한 이펙터 기능 상태의 영향을 평가한 실험의 결과를 도시한다.
도 10은 실시예 5에 기재된 영장류 연구를 위한 투여 및 샘플링 계획을 도시한다.
도 11a-11b는 실시예 5에 기재된 실험의 약동학적 결과, 구체적으로 혈청 (도 11a) 및 CSF (도 11b)에서의, 시노몰구스 원숭이에서 30 mg/kg으로의 단일 IV 볼루스 투여 후의 시간에 대한 개별 및 군 평균 항-TfR1/BACE1, 항-TfR2/BACE1 및 항-gD 혈청 농도를 도시한다.
도 12a-12e는 실시예 5에 기재된 실험의 약동학적 결과, 구체적으로 시노몰구스 원숭이에서 30 mg/kg으로의 단일 IV 볼루스 투여 후의 시간에 대한 개별 및 군 평균 항-TfR1/BACE1, 항-TfR2/BACE1 및 항-gD 혈장 (a) 또는 CSF (b-e) 농도를 도시한다. 상단 패널은 혈장 (도 12a) 및 CSF (도 12b)에서의 A베타1-40 수준을 제시하는 한편, 하단 패널은 시간의 경과에 따른 가용성 APPα 수준 (도 12c), 가용성 APPβ 수준 (도 12d), 및 sAPPβ/sAPPα 비 (도 12e)를 제시한다.
도 13a-13d는 실시예 5에 기재된 연구 동안 수행된 혈액 샘플링의 결과를 도시한다. 각각의 표시된 시점에서, 총 망상적혈구 (도 13a), 적혈구 (도 13b), 헤모글로빈 (도 13d) 및 총 망상적혈구 풀 내 미성숙 망상적혈구의 백분율 (도 13c)을 표준 기술을 사용하여 측정하였다.
도 14는 실시예 6에 기재된 영장류 연구를 위한 투여 및 샘플링 계획을 도시한다.
도 15a-15b는 실시예 6에 기재된 실험의 약동학적 결과 (a) 및 뇌 항체 농도 (b)를 도시한다. 구체적으로, 도 15a는 시노몰구스 원숭이에서 30 mg/kg으로의 단일 IV 볼루스 투여 후의 시간에 대한 CSF 내 sAPPβ/sAPPα의 개별 및 군 평균 항-TfR1/BACE1, 항-TfR2/BACE1, 항-gD, 및 항-BACE1 비를 제시한다. 도 15b는 투여-후 24시간에서의 다양한 뇌 영역에서의 개별 항-TfR1/BACE1, 항-TfR2/BACE1, 항-gD, 및 항-BACE1 항체의 농도를 제시한다.
도 16a-b는 천연 다양성 파지 디스플레이 라이브러리의 나이브 분류로부터 수득된 항-BACE1 클론 YW412.8 및 YW412.8의 친화도-성숙 형태의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 도시한다. 도 16a는 가변 경쇄 (VL) 서열 정렬 (서열 132-137)을 도시한다. 도 16b는 가변 중쇄 (VH) 서열 정렬 (서열 138-139)을 도시한다. 둘 다의 도면에서, 각각의 클론에 대한 HVR 서열은 박스 영역으로 표시하고, 제1 박스는 HVR-L1 (도 16a) 또는 HVR-H1 (도 16b)을 표시하고, 제2 박스는 HVR-L2 (도 16a) 또는 HVR-H2 (도 16b)를 표시하고, 제3 박스는 HVR-L3 (도 16a) 또는 HVR-H3 (도 16b)을 표시한다.
도 17a-b는 합성 다양성 파지 디스플레이 라이브러리의 나이브 분류로부터 수득된 항-BACE1 항체 클론 Fab 12 및 Fab 12의 친화도-성숙 형태의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 도시한다. 도 17a는 경쇄 서열 정렬 (서열 140-143)을 도시한다. 도 17b는 중쇄 서열 정렬 (서열 144)을 도시한다. 둘 다의 도면에서, 각각의 클론에 대한 HVR 서열은 박스 영역으로 표시하고, 제1 박스는 HVR-L1 (도 17a) 또는 HVR-H1 (도 17b)을 표시하고, 제2 박스는 HVR-L2 (도 17a) 또는 HVR-H2 (도 17b)를 표시하고, 제3 박스는 HVR-L3 (도 17a) 또는 HVR-H3 (도 17b)을 표시한다.
도 18a-b는 예시적인 항-A베타 항체의 중쇄 (도 18a; 서열 145) 및 경쇄 (도 18b; 서열 146)를 도시한다.
도 19는 실시예 5에 기재된 바와 같은 항-TfR1/BACE1, 항-Tfr52A/BACE1 및 항-TfR53A/BACE1의 약동학적 특성을 도시한다.
도 20은 실시예 7에 기재된 바와 같은 Fc 이펙터 기능 LALAPG 돌연변이를 갖는 뮤린 IgG2a 항-TfRD/BACE1 및 항-gD 항체의 약동학적 특성을 도시한다.
도 21은 실시예 7에 기재된 바와 같은 Fc 이펙터 기능 LALAPG 돌연변이를 갖는 뮤린 IgG2a 항-TfRD/BACE1 및 항-gD 항체의 50mg/kg 용량의 투여 24시간 후의 마우스 내 총 및 미성숙 망상적혈구 계수를 도시한다.
도 22는 실시예 8에 기재된 바와 같은 인간 트랜스페린 수용체 녹-인 마우스에서 항-TfR52A/BACE1 (N297G), 항-TfR52A/BACE1 (LALAPG), 항-TfR52A/BACE1 (LALAPG/YTE), TfR52A/BACE1 (LALAPG/AI) 항체의 50mg/kg 용량의 투여 24시간 후의 마우스 내 총 망상적혈구 계수를 도시한다.
도 23은 실시예 8에 기재된 바와 같은 1차 인간 골수 단핵 세포 또는 인간 적혈모 세포주에서 항-TfR/gD, 항-TfR/BACE1 (N297G), 항-TfR/BACE1 (LALAPG), 항-TfR/BACE1 (N297G/434A/436I) 및 항-TfR/BACE1 (LALAPG/YTE) 항체의 ADCC 활성에 대한 이펙터 기능 상태의 영향을 평가한 실험의 결과를 도시한다.
도 24는 1511Gv.5 (경쇄 - 서열 105 및 중쇄 - 서열 108) 및 친화도 변이체 15G11.52A (경쇄 - 서열 105 및 중쇄 - 서열 153), 15G11.53A (경쇄 - 서열 105 및 중쇄 - 서열 154) 및 15G11.92A (경쇄 - 서열 151 및 중쇄 - 서열 108)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 도시한다. 카바트에 따른 HVR은 밑줄로 표시한다.
도 25는 실시예 1에 기재된 바와 같은 15G11v.5 및 항-TfRC12 사이의 경쟁 검정을 도시한다.
1. 정의
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD, 이는 Y로부터 X의 오프-레이트 (kd 또는 K오프) 대 Y에 대한 X의 온-레이트 (ka 또는 k온)의 비임)로 나타내어질 수 있다. 1종 이상의 항체의 그의 표적에 대한 친화도에 대한 대용 측정은 항체 표적에 대한 공지된 리간드의 결합을 50%만큼 억제하는데 얼마나 많은 항체가 필요한지의 척도인 그의 반수 최대 억제 농도 (IC50)이다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시양태가 본원에 기재되어 있다. "혈액-뇌 장벽" 또는 "BBB"는 뇌 모세관 내피 형질 막 내의 치밀 접합부에 의해 형성되어, 분자, 심지어 매우 작은 분자 예컨대 요소 (60 달톤)의 뇌 내로의 수송을 제한하는 단단한 장벽을 형성하는, 말초 순환계 및 뇌 및 척수 (즉, CNS) 사이의 생리학적 장벽을 지칭한다. 뇌 내의 혈액-뇌 장벽, 척수 내의 혈액-척수 장벽, 및 망막 내의 혈액-망막 장벽은 CNS 내의 인접 모세관 장벽이며, 본원에서 총괄적으로 혈액-뇌 장벽 또는 BBB로 지칭된다. BBB는 장벽이 모세관 내피 세포보다는 상의 세포로 구성되는 혈액-CSF 장벽 (맥락총)을 또한 포괄한다.
본원에 상호교환가능하게 사용된 용어 "아밀로이드 베타," "베타-아밀로이드," "A베타," "아밀로이드β," 및 "Aβ"는 아밀로이드 전구체 단백질 ("APP")의 β-세크레타제 1 ("BACE1") 절단 시 생산되는 APP의 단편, 뿐만 아니라 Aβ1 -40, 및 Aβ1-42를 포함하나 이에 제한되지는 않는 그의 변형, 단편 및 임의의 기능적 등가물을 지칭한다. Aβ는 단량체 형태로 존재할 뿐만 아니라, 회합되어 올리고머 및 피브릴 구조를 형성하는 것으로 공지되어 있고, 이는 아밀로이드 플라크의 구성성분원으로서 발견될 수 있다. 이러한 Aβ 펩티드의 구조 및 서열은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 이러한 펩티드를 생산하는 방법 또는 뇌 및 다른 조직으로부터 이를 추출하는 방법이 예를 들어 문헌 [Glenner and Wong, Biochem Biophys Res. Comm. 129: 885-890 (1984)]에 기재되어 있다. 또한, Aβ 펩티드는 다양한 형태로 상업적으로 입수가능하기도 하다.
"항-A베타 이뮤노글로불린," "항-A베타 항체," 및 "A베타에 결합하는 항체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 인간 A베타에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 항-A베타 항체의 비제한적 예는 크레네주맙이다. 항-A베타 항체의 다른 비제한적 예는 솔라네주맙, 바피뉴주맙, 간테네루맙, 아두카누맙, 포네주맙 및 하기 공개: WO2000162801, WO2002046237, WO2002003911, WO2003016466, WO2003016467, WO2003077858, WO2004029629, WO2004032868, WO2004032868, WO2004108895, WO2005028511, WO2006039470, WO2006036291, WO2006066089, WO2006066171, WO2006066049, WO2006095041, WO2009027105에 개시되어 있는 임의의 항-A베타 항체이다.
용어 "크레네주맙" 및 "MABT5102A"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, A베타의 단량체, 올리고머, 및 피브릴 형태에 결합하고 CAS 등록 번호 1095207과 연관된 특이적 항-A베타 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체는 도 18a 및 18b에 제시된 서열을 포함한다.
"아포지단백질 E4 양성" 또는 "ApoE4 양성"과 함께 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "아포지단백질 E4 운반체" 또는 "ApoE4 운반체"는 적어도 1개의 아포지단백질 E4 (또는 "ApoE4") 대립유전자를 갖는 개체를 지칭한다. 0개의 ApoE4 대립유전자를 갖는 개체는 본원에서 "ApoE4 음성" 또는 "ApoE4 비-운반체"인 것으로 지칭된다. 또한, 문헌 [Prekumar, et al., 1996, Am. J Pathol. 148:2083-95]을 참조한다.
용어 "뇌 혈관성 부종"은 뇌의 세포내 또는 세포외 공간에의 혈관내 유체 또는 단백질의 과다 축적을 지칭한다. 뇌 혈관성 부종은 FLAIR MRI를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 예를 들어 뇌 MRI에 의해 검출될 수 있고, 무증상일 수 있거나 ("무증상 혈관성 부종") 신경계 증상, 예컨대 착란, 어지럼증, 구토, 및 기면과 연관될 수 있다 ("증후성 혈관성 부종") (문헌 [Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011] 참조).
용어 "뇌 거대출혈"은 두개내 출혈, 또는 뇌내 직경 약 1 cm 초과인 영역의 블리딩을 지칭한다. 뇌 거대출혈은 T2*-가중 GRE MRI를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 예를 들어 뇌 MRI에 의해 검출될 수 있고, 무증상일 수 있거나 ("무증상 거대출혈") 또는 일시적 또는 영구적 초점성 운동 또는 감각 손상, 운동실조, 실어증 및 구음장애와 같은 증상과 연관될 수 있다 ("증후성 거대출혈") (예를 들어, 문헌 [Chalela JA, Gomes J. Expert Rev. Neurother. 2004 4:267, 2004 및 Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011] 참조).
용어 "뇌 미세출혈"은 두개내 출혈, 또는 뇌내 직경 약 1 cm 미만인 영역의 블리딩을 지칭한다. 뇌 미세출혈은 T2*-가중 GRE MRI를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 예를 들어 뇌 MRI에 의해 검출될 수 있고, 무증상일 수 있거나 ("무증상 미세출혈") 또는 일시적 또는 영구적 초점성 운동 또는 감각 손상, 운동실조, 실어증 및 구음장애와 같은 증상과 연관될 수 있다 ("증후성 미세출혈"). 예를 들어, 문헌 [Greenberg, et al., 2009, Lancet Neurol. 8:165-74]을 참조한다.
용어 "구 삼출액"은 뇌의 고랑 또는 구 내 유체의 삼출액을 지칭한다. 구 삼출액은 FLAIR MRI를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 예를 들어 뇌 MRI에 의해 검출될 수 있다. 문헌 [Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011]을 참조한다.
용어 "중추 신경계의 표재성 철침착증"은 뇌의 지주막하 공간 내로의 블리딩 또는 출혈을 지칭하고, T2*-가중 GRE MRI를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 예를 들어 뇌 MRI에 의해 검출될 수 있다. 중추 신경계의 표재성 철침착증을 나타내는 증상은 감각신경성 난청, 소뇌성 운동실조, 및 추체로 징후를 포함한다. 문헌 [Kumara-N, Am J Neuroradiol. 31:5, 2010]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "아밀로이드증"은 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질에 의해 유발되거나 그와 연관된 질환 및 장애 군을 지칭하고, 아밀로이드 플라크에 의한 것을 비롯하여, 단량체, 피브릴, 또는 중합체 상태 또는 3개의 임의의 조합으로의 아밀로이드-유사 단백질의 존재 또는 활성에 의해 유발된 질환 및 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 질환은 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머병 ("AD")과 같은 신경계 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환, 인지 기억 능력 상실을 특징으로 하는 질환 또는 상태, 예컨대 예를 들어 경도 인지 장애 (MCI), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증에 의한 유전성 뇌출혈 (네덜란드 유형), 괌 파킨슨-치매 복합증 및 아밀로이드-유사 단백질을 기반으로 하거나 이와 연관된 다른 질환, 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증, 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증), 봉입체 근염 (IBM), 성인 발병 당뇨병, 내분비 종양 및 노인성 심장 아밀로이드증, 및 베타-아밀로이드 침착으로 인한 황반 변성, 드루젠-관련 시신경병증, 녹내장 및 백내장을 비롯한 다양한 안질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
녹내장은 시신경병증의 특징적 패턴으로 망막 신경절 세포 (RGC)의 상실을 수반하는 시신경의 질환 군이다. RGC는 눈에서 뇌로 시각적 신호를 전송하는 신경 세포이다. 아폽토시스 과정에서 2종의 주요 효소인 카스파제-3 및 카스파제-8은 상기 과정에서 활성화되어 RGC의 아폽토시스를 야기한다. 카스파제-3은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)을 절단하여 A베타를 비롯한 신경독성 단편을 생성한다. APP의 보호 효과 없이, 망막 신경절 세포 층에서의 A베타 축적은 RGC의 사멸 및 비가역적 시력 상실을 야기한다.
녹내장은 종종, 수성 순환의 차단 또는 그의 배액의 결과일 수 있는 증가된 안구압을 동반하나 항상 그렇지는 않다. 상승된 안내압이 녹내장 발생의 유의한 위험 인자이기는 하지만, 녹내장을 유발하는 것으로 결정할 어떠한 안내압의 역치도 정의할 수 없다. 손상은 또한 생체 시신경 섬유에의 불량한 혈액 공급, 신경 구조의 약화, 및/또는 신경 섬유 그 자체의 건강상 문제에 의해 유발될 수 있다. 비치료 녹내장은 시신경의 영구적 손상 및 결과적인 시야 상실로 이어지고, 이는 실명으로 진행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "경도 알츠하이머병" 또는 "경도 AD" (예를 들어, "경도 AD로 진단된 환자")는 MMSE 스코어 20 내지 26을 특징으로 하는 AD의 병기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "경도 내지 중등도 알츠하이머병" 또는 "경도 내지 중등도 AD"는 경도 및 중등도 AD 둘 다를 포괄하고, 이는 MMSE 스코어 18 내지 26을 특징으로 한다.
본원에 사용된 용어 "중등도 알츠하이머병" 또는 "증등도 AD" (예를 들어, "중등도 AD로 진단된 환자")는 MMSE 스코어 18 내지 19를 특징으로 하는 AD의 병기를 지칭한다.
"중추 신경계" 또는 "CNS"는 신체 기능을 제어하는 신경 조직의 복합체를 지칭하고, 뇌 및 척수를 포함한다.
"혈액-뇌 장벽 수용체" (본원에서 "BBB-R"로 약칭됨)는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송할 수 있는, 뇌 내피 세포 상에 발현된 막횡단 수용체 단백질이다. BBB-R의 예는 트랜스페린 수용체 (TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체 (IGF-R), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1 (LRP1) 및 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 (LRP8)이 제한 없이 포함되는 저밀도 지단백질 수용체, 글루코스 수송체 1 (Glut1) 및 헤파린-결합 표피 성장 인자-유사 성장 인자 (HB-EGF)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 BBB-R은 트랜스페린 수용체 (TfR)이다.
본원에 사용된 용어 "트랜스페린 수용체" 또는 "TfR"은, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 TfR을 지칭한다. 상기 용어는 "전장," 비프로세싱 TfR 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 TfR의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한 TfR의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. TfR은 척추동물에서 철 흡수에 관여하는 2개의 디술피드-결합된 서브-유닛 (각각의 겉보기 분자량은 약 90,000)으로 구성된 막횡단 당단백질 (분자량은 약 180,000)이다. 한 실시양태에서, 본원의 TfR은 예를 들어 문헌 [Schneider et al. Nature 311: 675 - 678 (1984)]에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 (서열 1)을 포함하는 인간 TfR ("hTfR")이다. 또 다른 실시양태에서, 본원의 TfR은 진뱅크 참조 AFD18260.1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 (서열 2)을 포함하는 영장류 TfR ("pTfR")이다. 비교를 위해, 마우스 TfR 서열은 진뱅크 참조 AAH54522.1에서 찾아볼 수 있다 (서열 3).
본원에서 사용된 바와 같은 "신경계 장애"는 CNS에 영향을 미치고/미치거나 CNS에 병인이 있는 질환 또는 장애를 지칭한다. 예시적인 CNS 질환 또는 장애는 신경병증, 아밀로이드증, 암, 안구 질환 또는 장애, 바이러스 또는 미생물 감염, 염증, 허혈, 신경변성 질환, 발작, 행동 장애, 및 리소솜 축적 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원의 목적상, CNS는 혈액-망막 장벽에 의해 신체의 나머지로부터 정상적으로 격리되는 눈을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 신경계 장애의 구체적 예는 신경변성 질환 (루이 소체 질환, 회색질척수염후 증후군, 샤이-드래거 증후군, 올리브교뇌소뇌 위축, 파킨슨병, 다계통 위축, 선조체흑질 변성을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 타우병증 (알츠하이머병 및 핵상 마비를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 프리온 질환 (소 해면상 뇌병증, 스크래피, 크로이츠펠트-야콥 증후군, 쿠루병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 질환, 만성 소모성 질환 및 치명적 가족성 불면증을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 연수 마비, 운동 뉴런 질환 및 신경계 이종변성 장애 (카나반병, 헌팅턴병, 뉴런 세로이드-리포푸신증, 알렉산더병, 투렛 증후군, 멘케스 킨키 헤어 증후군, 코케인 증후군, 할러보르덴-스파츠 증후군, 라포라병, 레트 증후군, 간렌즈핵 변성, 레쉬-니한 증후군, 및 운베리히트-룬트보르크 증후군을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 치매 (픽병 및 척수소뇌성 운동실조를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 암 (예를 들어 CNS의 암, 신체의 다른 곳에서의 암으로부터 생성된 뇌 전이 포함)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"신경계 장애 약물"은 하나 이상의 신경계 장애(들)를 치료하는 약물 또는 치료제이다. 본 발명의 신경계 장애 약물은 항체, 펩티드, 단백질, 하나 이상의 CNS 표적(들)의 천연 리간드, 하나 이상의 CNS 표적(들)의 천연 리간드의 변형된 버전, 압타머, 억제 핵산 (즉, 소형 억제 RNA (siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)), 리보자임, 및 소분자, 또는 임의의 상기의 활성 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 본 발명의 신경계 장애 약물이 본원에 기재되어 있고, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 그의 부분, 아밀로이드 베타, 베타-세크레타제, 감마-세크레타제, 타우, 알파-시뉴클레인, 파르킨, 헌팅틴, DR6, 프레세닐린, ApoE, 신경교종 또는 다른 CNS 암 마커, 및 뉴로트로핀과 같으나 이에 제한되지는 않는, CNS 항원 또는 표적 분자 그 자체이거나 또는 이를 특이적으로 인식하고/거나 그에 대해 작용 (즉, 억제, 활성화 또는 검출)하는 항체, 압타머, 단백질, 펩티드, 억제 핵산 및 소분자, 및 임의의 상기의 활성 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 신경계 장애 약물 및 이를 사용하여 치료할 수 있는 장애의 비제한적 예가 하기 표 1에 제공된다:
<표 1> 신경계 장애 약물 및 이를 사용하여 치료할 수 있는 상응하는 장애의 비제한적 예
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"영상화제"는 그의 존재 및/또는 위치가 직접적으로 또는 간접적으로 검출되도록 허용하는 하나 이상의 특성을 갖는 화합물이다. 이러한 영상화제의 예는 검출을 허용하는 표지된 모이어티가 혼입되어 있는 단백질 및 소분자 화합물을 포함한다.
"CNS 항원" 또는 "뇌 항원"은 항체 또는 소분자로 표적화될 수 있는, 뇌를 비롯한 CNS에서 발현되는 항원이다. 이러한 항원의 예는, 제한 없이: 베타-세크레타제 1 (BACE1), 아밀로이드 베타 (A베타), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 타우, 아포지단백질 E4 (ApoE4), 알파-시뉴클레인, CD20, 헌팅틴, 프리온 단백질 (PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2 (LRRK2), 파르킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), p75 뉴로트로핀 수용체 (p75NTR), 인터류킨 6 수용체 (IL6R), TNF 수용체 1 (TNFR1), 인터류킨 1 베타 (IL1β) 및 카스파제 6을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원은 BACE1이다.
본원에 사용된 용어 "BACE1"은, 달리 나타내지 않는 한, 영장류 (예를 들어 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 베타-세크레타제 1 (β-부위 아밀로이드 전구체 단백질 절단 효소 1, 막-회합 아스파르트산 프로테아제 2, 메맙신 2, 아스파르틸 프로테아제 2 또는 Asp2로도 불림)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장" 프로세싱되지 않은 BACE1 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 BACE1을 포괄한다. 상기 용어는 또한 BACE1의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 예시적인 BACE1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Vassar et al., Science 286:735-741 (1999)]에 보고된 바와 같은 인간 BACE1, 이소형 A에 대한 서열이다. 이소형 B, C 및 D를 비롯하여 인간 BACE1의 여러 다른 이소형이 존재한다. 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 [UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817]을 참조한다.
용어 "항-베타-세크레타제 항체", "항-BACE1 항체", "베타-세크레타제에 결합하는 항체" 및 "BACE1에 결합하는 항체"는 항체가 BACE1 표적화에서 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 BACE1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 비관련 비-BACE1 단백질에 대한 항-BACE1 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사선면역검정 (RIA)에 의한 측정 시, BACE1에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, BACE1에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-BACE1 항체는 상이한 종 및 이소형으로부터의 BACE1에서 보존된 BACE1의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-BACE1 항체 YW412.8.31에 의해 결합되는 BACE1 상의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 다른 실시양태에서, BACE1의 촉매 도메인에 위치하는 BACE1 내의 엑소부위에 결합하는 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, BACE1에의 결합에 대해 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Kornacker et al., Biochem. 44:11567-11573 (2005)]에서 식별되는 펩티드 (즉, 펩티드 1, 2, 3, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 2-12, 3-12, 4-12, 5-12, 6-12, 7-12, 8-12, 9-12, 10-12, 4, 5, 6, 5-10, 5-9, 스크램블드, Y5A, P6A, Y7A, F8A, I9A, P10A 및 L11A)와 경쟁하는 항체가 제공된다. 예시적인 BACE1 항체 서열이 도 15a-b 및 도 16a-b에서 도시된다. 본원의 한 예시적인 항체는 항체 YW412.8.31의 가변 도메인을 포함한다 (예를 들어 도 15a-b에서와 같음).
본원의 "천연 서열" 단백질은 단백질의 자연 발생 변이체를 비롯하여 자연에서 발견되는 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 지칭한다. 본원에 사용된 상기 용어는 그의 천연 공급원으로부터 단리되거나 또는 재조합적으로 생산된 바와 같은 단백질을 포함한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Nelson, MAbs (2010) 2(1): 77-83] 참조), Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 및 Fv; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단일쇄 항체 분자, 링커의 존재 또는 부재 하의 (그리고 임의로 탠덤으로의) 경쇄 및/또는 중쇄 항원-결합 도메인의 융합물; 및 항체 단편으로부터 형성된 단일특이적 또는 다중특이적 항원-결합 분자 (Fc 영역이 결여된 다중 가변 도메인으로부터 구축된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고, 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 다양한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 다양한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)] 참조), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 방법 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용함), 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 모두 또는 일부 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다. 본원의 모노클로날 항체의 구체적인 예는 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체 (그의 항원-결합 단편 포함)를 포함한다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린), 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]).
본원의 목적상 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열상 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택 시 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해, 인간화 항체는 인간 항체 (수용자 항체)이고, 여기서 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 그것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역 (FR)은 인간 항체의 그것에 상응한다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-인간 항체의 그것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 상기 언급된 FR 치환(들)을 제외하고 인간 항체의 그것이다. 인간화 항체는 임의로, 전형적으로 인간 항체의 항체 불변 영역인 항체 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다. 추가의 상세사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
본원에서 "인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 사용한 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열 구조와 상응하는 아미노산 서열 구조를 포함하는 항체이다. 이러한 인간 항체는 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 구체적으로 배제한다. 이러한 항체는 면역화 시 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)에 의한 생산 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 번호 5,591,669, 5,589,369 및 5,545,807 참조); 인간 항체 또는 인간 항체 단편을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 선택 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990); Johnson et al., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]; 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905 참조); 시험관내 활성화 B 세포를 통한 생성 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조); 및 인간 항체-생산 하이브리도마로부터의 단리를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 식별되거나 제조될 수 있다.
본원의 "다중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 다중특이적 항체는 TfR 및 뇌 항원 둘 다에 결합할 수 있다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다. 2개, 3개 또는 그 초과 (예를 들어, 4개)의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 고려된다 (예를 들어, 미국 출원 번호 US 2002/0004587 A1 (Miller et al.) 참조). 다중특이적 항체는 전장 항체로서 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
본원의 항체는 항원-결합 또는 생물학적 활성이 변경된 "아미노산 서열 변이체"를 포함한다. 이러한 아미노산 변경의 예는 항원에 대해 증진된 친화도를 갖는 항체 (예를 들어 "친화도 성숙" 항체), 및 존재하는 경우에 예를 들어 변경된 (증가되거나 감소된) 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖는, 변경된 Fc 영역을 갖는 항체 (예를 들어, WO 00/42072 (Presta, L.) 및 WO 99/51642 (Iduosogie et al.) 참조); 및/또는 증가되거나 감소된 혈청 반감기를 갖는 항체 (예를 들어, WO00/42072 (Presta, L.) 참조)를 포함한다.
"친화도 변형된 변이체"는 친화도를 변경 (증가 또는 감소)시키는 모 항체 (예를 들어, 모 키메라, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 치환된 초가변 영역 또는 프레임워크 잔기를 갖는다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방식은 파지 디스플레이를 사용하는 것이다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어 6-7개 부위)를 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환이 생성되도록 돌연변이시킨다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합물로서 사상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 그의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 식별하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 식별할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 그의 표적 사이의 접촉 지점을 식별하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 상술된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 이러한 변이체가 생성되면, 변이체 패널을 스크리닝하고, 변경된 친화도를 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
"pH-감수성 항체 변이체"는 제1 pH에서의 표적 항원에 대한 결합 친화도가 상이한 pH에서의 표적 항원에 대한 것과 상이한 항체 변이체이다. 비제한적 예로서, 본 발명의 항-TfR 항체는 pH 7.4의 혈장에서는 세포 표면 TfR에 바람직하게 낮은 친화도 (본원에 기재된 바와 같음)로 결합하지만, 엔도솜 구획 내로 내재화되면, 상대적으로 더 낮은 pH (pH 5.5-6.0)에서 TfR로부터 신속하게 해리되도록, TfR에 대해 pH-감수성 결합을 갖도록 선택되거나 조작될 수 있으며; 이러한 해리는 항원-매개 클리어런스로부터 항체를 보호할 수 있고, CNS로 전달되거나 또는 BBB를 가로질러 재순환되는 항체의 양을 증가시킬 수 있고 - 어느 경우든, 항체의 유효 농도는 이러한 pH 감수성을 포함하지 않는 항-TfR 항체에 비해 증가된다 (예를 들어, 문헌 [Chaparro-Riggers et al. J. Biol. Chem. 287(14): 11090-11097; Igawa et al., Nature Biotechnol. 28(11): 1203-1208] 참조). 통상의 기술자는 TfR 및 접합된 화합물에 대해 혈청 pH 및 엔도솜 구획 pH에서의 목적하는 친화도의 조합을 용이하게 결정할 수 있다.
본원의 항체는 예를 들어 반감기 또는 안정성을 증가시키기 위해 또는 달리 항체를 개선시키기 위해 "이종 분자"와 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 다양한 비-단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다. 하나 이상의 PEG 분자에 연결된 항체 단편, 예컨대 Fab'는 본 발명의 예시적인 실시양태이다. 또 다른 예에서, 이종 분자는 치료 화합물 또는 가시화제 (즉, 검출가능한 표지)이고, 항체는 이러한 이종 분자를 BBB를 가로질러 수송하는데 사용된다. 이종 분자의 예는 화학적 화합물, 펩티드, 중합체, 지질, 핵산 및 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원의 항체는, 존재하는 경우에, Fc 영역에 부착된 임의의 탄수화물이 존재/부재에서 변형되거나 또는 유형에서 변형되어 변경된 "글리코실화 변이체"일 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 결여된 성숙 탄수화물 구조를 갖는 항체가 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.)에 기재되어 있다. 또한 US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에 양분성 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)를 갖는 항체가 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.) 및 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.)에 언급되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체가 WO 1997/30087 (Patel et al.)에 보고되어 있다. 또한, 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물이 변경된 항체에 관한 WO 1998/58964 (Raju, S.) 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)를 참조한다. 또한, 글리코실화가 변형된 항체를 기재하고 있는 US 2005/0123546 (Umana et al.)을 참조한다. Fc 영역 내의 컨센서스 글리코실화 서열의 돌연변이 (위치 297-299에서 Asn-X-Ser/Thr, 여기서 X는 프롤린일 수 없음), 예를 들어 이러한 서열의 Asn을 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이시키거나, 위치 298에 Pro를 배치하거나, 또는 위치 299를 Ser 또는 Thr 이외의 임의의 아미노산으로 변형시키는 것에 의한 돌연변이는 그러한 위치에서의 글리코실화를 없앨 것이다 (예를 들어, 문헌 [Fares Al-Ejeh et al., Clin. Cancer Res. (2007) 13:5519s-5527s; Imperiali and Shannon, Biochemistry (1991) 30(18): 4374-4380; Katsuri, Biochem J. (1997) 323(Pt 2): 415-419; Shakin-Eshleman et al., J. Biol. Chem. (1996) 271: 6363-6366] 참조).
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고/거나 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 예시적인 HVR은 본원에서 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 발생한 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 발생한 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 발생한 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)를 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
한 실시양태에서, HVR 잔기는 도 3a-d 또는 4a-d, 표 4 또는 표 5 또는 명세서의 다른 부분에서 식별되는 것을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 본원에서 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 FR 잔기는 항체의 안정성을 조절하거나 항체의 1개 이상의 HVR의 3차원 위치설정을 조절하여, 예를 들어 결합을 증진시키기 위해 변형될 수 있다.
"전장 항체"는 항원-결합 가변 영역, 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티 또는 방사성표지)에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VL)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
항체 "이펙터 기능"은 보체 경로 활성화 이외의 면역계 활성화를 생성하는 항체의 생물학적 활성을 지칭한다. 이러한 활성은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에서 주로 발견된다. 항체 이펙터 기능의 예는, 예를 들어 Fc 수용체 결합 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 항체는 본질적으로 이펙터 기능이 결여되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원의 항체는 최소 이펙터 기능을 보유한다. 이펙터 기능을 변형시키거나 제거하는 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이펙터 기능을 담당하는 Fc 영역을 모두 또는 부분을 제거하는 것 (즉, 본원에 기재되어 있고 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, Fab 단편, 단일쇄 항체 등과 같으나 이에 제한되지는 않는 Fc 영역의 모두 또는 부분이 결여된 포맷으로 항체 또는 항체 단편을 사용하는 것); 이펙터 기능을 제거하기 위해 하나 이상의 아미노산 위치에서 Fc 영역을 변형시키는 것 (Fc 결합에 영향을 미침: 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 256, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 311, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 436, 437, 438, 및 439); 및 항체의 글리코실화를 변형시키는 것 (야생형 포유동물 글리코실화를 허용하지 않는 환경에서 항체를 생산하는 것, 이미 글리코실화된 항체로부터 하나 이상의 탄수화물 기를 제거하는 것, 및 하나 이상의 아미노산 위치에서 항체를 변형시켜 그러한 위치에서 글리코실화되는 항체의 능력을 제거하는 것 (N297G 및 N297A 및 D265A를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
항체 "보체 활성화" 기능, 또는 "보체 경로의 활성화"를 가능하게 하거나 촉발하는 항체의 특성은 상호교환가능하게 사용되고, 대상체에서 면역계의 보체 경로에 관여하거나 이를 자극하는 항체의 생물학적 활성을 지칭한다. 이러한 활성은, 예를 들어 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 포함하고, 항체의 Fc 부분 및 비-Fc 부분 둘 다에 의해 매개될 수 있다. 보체 활성화 기능을 변형시키거나 제거하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 보체 활성화를 담당하는 Fc 영역을 모두 또는 부분 제거하는 것 (즉, 본원에 기재되어 있고 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, Fab 단편, 단일쇄 항체 등과 같으나 이에 제한되지는 않는 Fc 영역이 모두 또는 부분 결여된 포맷으로 항체 또는 항체 단편을 사용하는 것, 또는 C1q 결합에 수반되는 것으로 공지되어 있는 위치 270, 322, 329 및 321과 같은, 보체 성분과의 상호작용 또는 보체 성분을 활성화시키는 능력을 제거하거나 줄이도록 하나 이상의 아미노산 위치에서 Fc 영역을 변형시키는 것), 및 보체 활성화를 담당하는 비-Fc 영역의 부분을 변형시키거나 제거하는 것 (즉, 위치 132에서 CH1 영역을 변형시키는 것 (예를 들어, 문헌 [Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 38217-38223)] 참조))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 전장 항체는 상이한 "부류"로 할당될 수 있다. 전장 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 "하위부류" (이소형), 예를 들어 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합 항체"는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포에 의해 발현된 항체 (예를 들어, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 그의 항원-결합 단편)을 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선택되는 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다. 재조합 항체를 생산하기 위한 "숙주 세포"의 예는 (1) 포유동물 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), COS, 골수종 세포 (Y0 및 NS0 세포 포함), 새끼 햄스터 신장 (BHK), Hela 및 Vero 세포; (2) 곤충 세포, 예를 들어 sf9, sf21 및 Tn5; (3) 식물 세포, 예를 들어 니코티아나(Nicotiana) 속에 속하는 식물 (예를 들어, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)); (4) 효모 세포, 예를 들어 사카로미세스(Saccharomyces) 속에 속하는 것 (예를 들어, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)) 또는 아스페르길루스(Aspergillus) 속에 속하는 것 (예를 들어 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger)); (5) 박테리아 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포 등을 포함한다.
본원에 사용된, "특이적으로 결합하는" 또는 "에 특이적으로 결합하다"는 항원에 선택적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 결합 친화도는 일반적으로 표준 검정, 예컨대 스캐차드 분석, 또는 표면 플라즈몬 공명 기술 (예를 들어, 비아코어(BIACORE)® 사용)을 사용하여 결정된다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50% 이상 차단한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 항체 중 하나를 형성하는 항-BACE1 항체는 YW412.8.31이 결합하는 BACE1 에피토프에 결합한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는, 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 본원에 개시되어 있는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 효과적인, 필요한 투여량 및 시간 동안의 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은, EU 인덱스로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
본원에 사용된 용어 "FcRn 수용체" 또는 "FcRn"은 모체 IgG를 인간 또는 영장류 태반, 또는 난황낭 (토끼)을 통해 태아에게, 및 초유로부터 소장을 통해 신생아에게 전달하는데 관여하는 것으로 공지되어 있는 Fc 수용체 ("n"은 네오나탈을 나타냄)를 지칭한다. 또한, FcRn은 IgG 분자에 결합하고 이를 혈청 내로 재순환시킴으로써 일정 혈청 IgG 수준의 유지에 관여하는 것으로 공지되어 있다. "FcRn 결합 영역" 또는 "FcRn 수용체 결합 영역"은 FcRn 수용체와 상호작용하는 항체의 부분을 지칭한다. 항체의 FcRn 결합 영역에서의 특정 변형은 FcRn에 대한 항체 또는 그의 단편의 친화도를 증가시키고, 또한 분자의 생체내 반감기를 증가시킨다. 하기 아미노산 위치 251, 256, 285, 290, 308, 314, 385, 389, 428, 434 및 436 중 하나 이상에서의 아미노산 치환은 항체와 FcRn 수용체의 상호작용을 증가시킨다. 하기 위치에서의 치환도 또한 항체와 FcRn 수용체의 상호작용을 증가시킨다: 238, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예를 들어 (미국 특허 번호 7,371,826)의 치환.
"면역접합체"는 표지 또는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다. 임의로, 이러한 접합은 링커를 통해 이루어진다.
본원에 사용된 "링커"는 항-TfR 항체를 이종 분자에 공유적 또는 비-공유적으로 연결시키는 구조이다. 특정 실시양태에서, 링커는 펩티드이다. 다른 실시양태에서, 링커는 화학적 링커이다.
"표지"는 본원의 항체와 커플링되고 검출 또는 영상화에 사용되는 마커이다. 이러한 표지의 예는 방사성표지, 형광단, 발색단, 또는 친화성 태그를 포함한다. 한 실시양태에서, 표지는 의학적 영상화에 사용되는 방사성표지, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 마찬가지로 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈, 철 등이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 결정 시, 95% 또는 99%를 초과하는 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된 핵산"은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 원래 함유하는 세포에 함유되어 있는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-TfR 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하며, 이는 단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)를 포함한다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 사용과 관련된 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기사항 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는, 이러한 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 지침을 지칭하는데 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서, 최대 퍼센트 서열 동일성이 달성되도록 서열을 정렬시키고 필요한 경우에 갭을 도입한 후의, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 관련 기술분야 기술 범위 내의 다양한 방식, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 통상의 기술자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었고, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우에, 주어진 아미노산 서열 B에의, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에의, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매칭으로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에 B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 인식할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 직전 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
용어 "제약 제제"는 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제제가 투여될 대상체에게 허용가능하게 않게 독성인 추가의 성분은 전혀 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 독성이지 않은, 활성 성분 이외의 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "치료" (및 그의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")은 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 시도의 임상 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리상태의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발을 방지하는 것, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이를 방지하는 것, 질환 진행의 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 발달을 지연시키는데 또는 질환 진행을 느리게 하는데 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
2. 조성물 및 방법
A. 항-TfR 항체 및 그의 접합체의 생산
한 측면에서, 본 발명은 부분적으로, BBB를 가로질러 목적하는 분자를 수송하는데 사용될 수 있는 항-TfR 항체를 기반으로 한다. 특정 실시양태에서, 인간 TfR에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 인간 TfR 및 영장류 TfR 둘 다에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 뇌 및/또는 CNS에 영향을 미치는 질환의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적인 항-TfR 항체
한 측면에서, 본 발명은 TfR에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-TfR 항체는 인간 TfR 및 영장류 TfR 둘 다에 특이적으로 결합한다. 특정의 이러한 실시양태에서, 본 발명의 항-TfR 항체는 TfR에 대한 트랜스페린의 결합을 억제하지 않는다. 특정의 이러한 실시양태에서, 본 발명의 항-TfR 항체는 TfR의 정단 도메인에 결합한다. 다른 특정의 이러한 실시양태에서, 본 발명의 항-TfR 항체는 TfR의 비-정단 도메인에 결합한다. 특정 측면에서, 항-TfR 항체는 BBB를 가로질러 하나 이상의 접합된 영상화 또는 치료 화합물을 수송하는데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3a 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 7A4이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3a 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 8A2이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3a 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 15D2이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3a 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 10D11이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3a 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 7B10이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3b 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 15G11이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3b 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 16G5이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3b 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 13C3이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3b 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 16G4이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 72의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3c 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 16F6이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 80의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 81의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 82의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 79의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3d 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 7G7이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 80의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 83의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 84의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 79의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3d 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 4C2이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 88의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 90의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 85의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 87의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3d 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 1B12이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 95의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 96의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 91의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 92의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 93의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 3d 및 표 3에 제시된 바와 같은 클론 13D4이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 127의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항체는 도 4b 및 표 4에 제시된 바와 같은 클론 7A4.v15이다.
상기 클론은 HVR 내의 서열 유사성에 의해 4개의 상보군에 속한다. 표 3에 제시된 바와 같이, 컨센서스 서열은 각각의 HVR에 대해 제공된 항체 서열로부터 용이하게 유래될 수 있다. 하나의 비제한적 예로서, 부류 I 항체 컨센서스 HVR은 하기와 같다:
HVR-L1: Arg-Ala-Ser-Glu-Ser-Val-Asp-[Ser 또는 Asp]-Tyr-Gly-[Asn 또는 Pro]-Ser-Phe-Met-His (서열 45);
HVR-L2: Arg-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser (서열 30);
HVR-L3: Gln-[Gln 또는 His]-Ser-Asn-Glu-[Ala, Gly 또는 Asp]-Pro-Pro-Thr (서열 46);
HVR-H1: Asp-Tyr-[Ala 또는 Gly]-Met-His (서열 47);
HVR-H2: [Gly 또는 Val]-Ile-Ser-[Thr, Phe 또는 Pro]-Tyr-[Phe 또는 Ser]-Gly-[Arg 또는 Lys]-Thr-Asn-Tyr-[Asn 또는 Ser]-Gln-[Lys 또는 Asn]-Phe-[Lys 또는 Met]-Gly (서열 48);
HVR-H3: Gly-Leu-Ser-Gly-Asn-[Tyr 또는 Phe]-Val-[Met 또는 Val]-Asp-[Tyr 또는 Phe] (서열 49). (표 4 참조). 부류 II 및 IV에 대한 컨센서스 서열이 또한 표 3에 제공되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 66의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 67의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 100의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 101의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 102의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 97의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 98의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 99의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-TfR 항체를 제공한다. 한 측면에서, 항체는 모든 6개의 상기-언급된 HVR 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 임의의 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 상기 기재된 임의의 항체의 HVR-H3 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 상기 기재된 항체 중 어느 하나의 HVR-H3 및 HVR-L3 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 상기 기재된 항체 중 어느 하나의 HVR-H3, HVR-L3 및 HVR-H2 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 상기 기재된 항체 중 어느 하나의 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 임의의 항체의 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 상기 기재된 항체 중 어느 하나의 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) 상기 기재된 항체 중 어느 하나의 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3 서열로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 상기 기재된 항체 중 어느 하나의 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 서열로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-TfR 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-TfR 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-TfR 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 1개 이상의 FR 영역 내에 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 VH 또는 VL을 추가로 포함한다. 본원의 실시예 2에 따라, 본 출원인들은 상기로부터 선택된 특정 항체에 대한 알라닌 스캐닝을 수행하고, 선택된 FR 위치에서의 아미노산 변형에도 불구하고 유사하거나 개선된 결합이 수득되는지 결정하였다. 본원의 도 6a 및 6b 및 실시예 2에 제시된 바와 같이, 항체의 부류 I-III 군의 경우에, FR의 1개 이상의 잔기에서 변형을 갖는 항체의 변이체 형태는 친화도 및 결합 특이성을 보유하였다. 예를 들어, 항체 15G11의 경우에, 경쇄 FR2 내 위치 43 및 48, 중쇄 FR2 내 위치 48 및 중쇄 FR3 내 위치 67, 69, 71 및 73은 도 6a 및 6b에 제시된 바와 같이 변형될 수 있고, 생성된 항체는 인간/영장류 TfR에 대한 특이성 및 강력한 결합 친화도를 여전히 보유하였다. 또 다른 실시예에서, 항체 7A4의 경우에, 경쇄 FR3의 위치 58 및 68, 중쇄 FR1 내 위치 24 및 중쇄 FR3 내 위치 71은 도 6a 및 6b에 제시된 바와 같이 변형될 수 있고, 생성된 항체는 인간/영장류 TfR에 대한 특이성 및 강력한 결합 친화도를 여전히 보유하였다. 제3 예로, 항체 16F6의 경우에, 경쇄 FR2의 위치 43 및 44 및 중쇄 FR3의 위치 71 및 78은 도 6a 및 6b에 제시된 바와 같이 변형될 수 있고, 생성된 항체는 인간/영장류 TfR에 대한 특이성 및 강력한 결합 친화도를 여전히 보유하였다. 또 다른 측면에서, 항-TfR 항체는 서열 7-10, 15-18, 20, 25-28, 108, 114, 120 및 126 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열과 비교하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-TfR 항체는 TfR에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 7-10, 15-18, 20, 25-28, 108, 114, 120 및 126 중 어느 하나에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-TfR 항체는 서열 7-10, 15-18, 20 25-28, 108, 114, 120 및 126 중 어느 하나의 VH 서열 (그러한 서열의 번역-후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 특정한 항체에 대한 VH는 그러한 특정한 항체에 대해 상기 및 표 3 또는 4에 제시된 HVR로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 HVR을 포함한다. 본 발명의 항체에 대한 VH 서열은 본원의 도 3 및 4에 제시된다.
또 다른 측면에서, 서열 4-6, 11-14, 19, 21-24, 105, 111, 117, 및 123 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-TfR 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열과 비교하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-TfR 항체는 TfR에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 4-6, 11-14, 19, 21-24, 105, 111, 117, 및 123 중 어느 하나에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-TfR 항체는 임의의 서열 4-6, 11-14, 19, 21-24, 105, 111, 117, 및 123의 VL 서열 (그러한 서열의 번역-후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, VL은 그러한 특정한 항체에 대해 상기 및 표 4 또는 5에 제시된 HVR로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 HVR을 포함한다. 본 발명의 항체에 대한 VL 서열은 본원의 도 3 및 4에 제시된다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-TfR 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 4 및 7; 5 및 8; 5 및 9; 6 및 10; 4 및 7; 11 및 15; 12 및 16; 13 및 17; 14 및 18; 19 및 20; 21 및 25; 22 및 26; 23 및 27; 24 및 28; 105 및 108; 111 및 114; 117 및 120; 및 123 및 126의 VL 및 VH 서열 (그러한 서열의 번역-후 변형 포함)을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-TfR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 각각 서열 4 및 7; 5 및 8; 5 및 9; 6 및 10; 4 및 7; 11 및 15; 12 및 16; 13 및 17; 14 및 18; 19 및 20; 21 및 25; 22 및 26; 23 및 27; 24 및 28; 105 및 108; 111 및 114; 117 및 120; 또는 123 및 126의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항-TfR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 한 측면에서, 항체는 TfR에의 결합에 대해 부류 I의 임의의 항체 (즉, 클론 7A4, 8A2, 15D2, 10D11, 또는 7B10, 또는 임의의 그러한 항체의 친화도-성숙 버전)와 경쟁한다. 또 다른 측면에서, 항체는 TfR에의 결합에 대해 부류 II의 임의의 항체 (즉, 클론 15G11, 16G5, 13C3 또는 16G, 또는 임의의 그러한 항체의 친화도-성숙 버전)와 경쟁한다. 또 다른 측면에서, 항체는 TfR에의 결합에 대해 클론 16F6 또는 그의 친화도-성숙 버전과 경쟁한다. 또 다른 측면에서, 항체는 TfR에의 결합에 대해 부류 IV의 임의의 항체 (즉, 클론 7G7, 4C2, 1B12 또는 13D4, 또는 그의 친화도-성숙 버전)와 경쟁한다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-TfR 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-TfR 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-TfR 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 "낮은 친화도" 항-TfR 항체는, 이러한 TfR에 대한 낮은 친화도 항체가 개선된 CNS (예를 들어, 뇌) 흡수 및/또는 뇌/CNS에서의 지속을 디스플레이함을 제시하는, 예를 들어 실시예 5에서의 결과 및 문헌 [Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011) 및 Yu et al., Sci. Transl. Med. 25 May 2011: Vol. 3, Issue 84, p. 84ra44]을 기초로 하여 선택된다. 이러한 낮은 친화도 항체를 식별하기 위해, 제한 없이: 스캐차드 검정 및 표면 플라즈몬 공명 기술 (예를 들어 비아코어® 사용)을 비롯하여, 항체 친화도를 측정하기 위한 다양한 검정이 이용가능하다. 본 발명의 한 실시양태에 따르면, 항체는 인간 또는 영장류 TfR에 대해 약 5nM에서, 또는 약 20 nM에서, 또는 약 100 nM에서, 약 50 μM까지, 또는 약 30 μM까지, 또는 약 10 μM까지, 또는 약 1 μM까지, 또는 약 500 nM까지의 친화도를 갖는다. 따라서, 친화도는 예를 들어 스캐차드 분석 또는 비아코어®에 의한 측정 시 약 5 nM 내지 약 50 μM의 범위, 또는 약 20 nM 내지 약 30 μM의 범위, 또는 약 30 nM 내지 약 30 μM의 범위, 또는 약 50 nM 내지 약 1 μM의 범위, 또는 약 100 nM 내지 약 500 nM의 범위일 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체는 경쟁 결합 분석 또는 비아코어®에 의한 측정 시 TfR로부터 1분 미만, 2분 미만, 3분 미만, 4분 미만, 5분 미만, 또는 10분 미만 내지 약 20분, 또는 내지 약 30분의 해리 반감기를 갖는다.
따라서, 본 발명은 TfR에 대한 한 패널의 항체로부터 항체를 선택하는 것을 포함하는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 신경계 장애 약물을 수송하는데 유용한 항체를 제조하는 방법을 제공하며, 이는 그의 TfR에 대한 친화도가 약 5 nM에서, 또는 약 20 nM에서, 또는 약 100 nM에서, 약 50 μM까지, 또는 약 30 μM까지, 또는 약 10 μM까지, 또는 약 1 μM까지, 또는 약 500 mM까지의 범위이기 때문이다. 따라서, 예를 들어 스캐차드 분석 또는 비아코어®에 의해 측정 시, 친화도는 약 5 nM 내지 약 50 μM 범위, 또는 약 20 nM 내지 약 30 μM 범위, 또는 약 30 nM 내지 약 30 μM 범위, 또는 약 50 nM 내지 약 1 μM 범위, 또는 약 100 nM 내지 약 500 nM 범위일 수 있다. 통상의 기술자가 이해할 바와 같이, 이종 분자/화합물을 항체에 접합시키는 것은, 예를 들어 입체 장애로 인해 또는 심지어, 항체가 항체의 원래 표적과 상이한 항원에 결합하는 1개 이상의 아암을 갖는 다중특이적으로 제조된 경우에 1개 결합 아암의 제거로 인해 종종 그의 표적에 대한 항체의 친화도를 감소시킬 것이다. 한 실시양태에서, 항-BACE1에 접합된 TfR에 특이적인 본 발명의 낮은 친화도 항체는 비아코어에 의해 측정 시 TfR에 대한 Kd가 약 30 nM이다. 또 다른 실시양태에서, BACE1에 접합된 TfR에 특이적인 본 발명의 낮은 친화도 항체는 비아코어에 의해 측정 시 TfR에 대한 Kd가 약 600 nM이다. 또 다른 실시양태에서, BACE1에 접합된 TfR에 특이적인 본 발명의 낮은 친화도 항체는 비아코어에 의해 측정 시 TfR에 대한 Kd가 약 20 μM이다. 또 다른 실시양태에서, BACE1에 접합된 TfR에 특이적인 본 발명의 낮은 친화도 항체는 비아코어에 의해 측정 시 TfR에 대한 Kd가 약 30 μM이다.
한 실시양태에서, Kd는 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, RIA는 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단한다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁적 결합 검정에 사용한다.
한 측면에서, RIA는 스캐차드 분석이다. 예를 들어, 락토퍼옥시다제 방법 (Bennett and Horuk, Methods in Enzymology 288 pg.134-148 (1997))을 사용하여 관심 항-TfR 항체를 아이오딘화할 수 있다. 방사성표지된 항-TfR 항체를 NAP-5 칼럼을 사용하여 겔 여과에 의해 유리 125I-Na로부터 정제하고, 그의 비활성을 측정한다. 고정된 농도의 아이오딘화 항체 및 감소되는 농도의 연속 희석된 비표지 항체를 함유하는 50 μL의 경쟁 반응 혼합물을 96-웰 플레이트에 놓는다. 일시적으로 TfR을 발현하는 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 1× 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (제넨테크)로 이루어진 성장 배지에서 37℃에서 5% CO2 하에 배양한다. 시그마(Sigma) 세포 해리 용액을 사용하여 세포를 디쉬로부터 탈착시키고, 결합 완충제 (1% 소 혈청 알부민, 50 mM HEPES, pH 7.2, 및 0.2% 아지드화나트륨 함유 DMEM)로 세척한다. 세척된 세포를 50-μL 경쟁 반응 혼합물을 함유하는 96-웰 플레이트에 0.2 mL의 결합 완충제 중 대략 200,000개 세포의 밀도로 첨가한다. 세포와의 경쟁 반응에서 비표지 항체의 최종 농도는 1000 nM에서 시작하고, 10종의 농도를 위해 1:2 배수 희석에 의해 감소되어 다양화되며, 제로-첨가 완충제-단독 샘플이 포함된다. 각각의 농도의 비표지 항체에 대한 세포와의 경쟁 반응이 삼중으로 검정된다. 세포와의 경쟁 반응물을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 2-시간 인큐베이션 후에, 경쟁 반응물을 필터 플레이트로 옮기고, 결합 완충제로 4회 세척하여, 결합된 아이오딘화 항체로부터 분리시킨다. 필터를 감마 계수기로 계수하고, 문헌 [Munson and Rodbard (1980)]의 피팅 알고리즘을 사용하여 결합 데이터를 평가하여, 항체의 결합 친화도를 결정한다.
본 발명의 조성물을 사용하는 예시적인 비아코어® 분석을 하기와 같이 수행할 수 있다. Kd는 항-인간 Fc 키트 (비아코어 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)를 사용하여 25℃에서 비아코어®-2000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항-인간 Fc 항체를 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.0으로 50 μg/ml로 희석한 후, 5 μl/분의 유량으로 주입하여, 대략 10000 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질이 달성된다. 항체의 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, 단일특이적 또는 다중특이적 항-TfR 항체 변이체를 HBS-P에 약 220 RU에 도달하도록 주입한 후, MuTfR-His의 2-배 연속 희석물 (0.61 nM 내지 157 nM)을 25℃에서 HBS-P에 대략 30 μl/분의 유량으로 주입한다. 회합 및 해리 센소그램을 동시에 피팅함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합률 (k온) 및 해리율 (k오프)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k오프/k온의 비로서 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 항-인간 Fc 키트 (비아코어 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)를 사용하여 25℃에서 비아코어®-2000 장치 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)에 의한 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항-인간 Fc 항체를 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.0으로 50 μg/ml로 희석한 후, 5 μl/분의 유량으로 주입하여, 대략 10000 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질이 달성된다. 항체 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, 항-TfR 항체 변이체를 HBS-P에 약 220 RU에 도달하도록 주입한 후, TfR-His의 2-배 연속 희석물 (0.61 nM 내지 157 nM)을 25℃에서 HBS-P에 대략 30 μl/분의 유량으로 주입한다. 회합 및 해리 센소그램을 동시에 피팅함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합률 (k온) 및 해리율 (k오프)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k오프/k온의 비로서 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다.
주어진 화합물에 대한 IC50을 결정하는 여러 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고; 통상적인 접근법은 본원에 기재된 바와 같은 경쟁 결합 검정을 수행하는 것이다. 일반적으로, 높은 IC50은 더 많은 항체가 공지된 리간드의 결합을 억제하는데 요구되고, 따라서 그러한 리간드에 대한 항체의 친화도가 비교적 낮다는 것을 나타낸다. 반대로, 낮은 IC50은 더 적은 항체가 공지된 리간드의 결합을 억제하는데 요구되고, 따라서 그러한 리간드에 대한 항체의 친화도가 비교적 높다는 것을 나타낸다.
IC50을 측정하기 위한 예시적인 경쟁적 ELISA 검정은 증가되는 농도의 항-TfR 또는 항-TfR/뇌 항원 (즉, 항-TfR/BACE1, 항-TfR/A베타 등) 변이체 항체를 TfR에의 결합에 대해 비오티닐화된 공지된 항-TfR 항체와 경쟁시키는데 사용하는 것이다. 항-TfR 경쟁 ELISA는 PBS 중 정제된 뮤린 TfR 세포외 도메인 2.5 μg/ml로 4℃에서 밤새 코팅시킨 맥시소프(Maxisorp) 플레이트 (넵튠(Neptune), 뉴저지주)에서 수행한다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, PBS 중 슈퍼블록(Superblock) 차단 완충제 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 뉴햄프셔주 허드슨)를 사용하여 차단한다. 각각의 개별 항-TfR 또는 항-TfR/뇌 항원 (즉, 항-TfR/BACE1 또는 항-TfR/A베타) (1:3 연속 희석)의 적정을 비오티닐화된 공지된 항-TfR과 조합하고 (0.5 nM 최종 농도), 1시간 동안 실온에서 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, HRP-스트렙타비딘 (서던 바이오테크(Southern Biotech), 버밍햄)을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 플레이트에 결합된 비오티닐화 항-TfR 항체를 TMB 기질 (바이오FX 래보러토리즈(BioFX Laboratories), 오잉스 밀스)을 사용하여 검출한다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)] 을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 부분 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 부분을 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.( Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 본원의 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어 구세계 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 레서스 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 5,693,780). 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 교체된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; 문헌 [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("재표면화" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-피트" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 챌린지에 반응하여 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 또는 동물의 염색체로 무작위 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 부분을 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 제노마우스(XENOMOUSE)TM 기술을 기재한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HuMab® 기술을 기재한 미국 특허 번호 5,770,429; K-M 마우스® 기술을 기재한 미국 특허 번호 7,041,870, 및 벨로시마우스(VelociMouse)® 기술을 기재한 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 목적하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 높은 친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열을 달성함으로써 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공개는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 TfR에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 TfR의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 TfR을 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
본원의 항체 또는 단편은 또한 TfR 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
본 발명의 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체)를 생성시키는 것에 의해 "커플링"이 달성된다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 TfR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 뇌 항원, 예컨대 베타-세크레타제 1 (BACE1) 또는 A베타, 및 본원에서 개시된 다른 뇌 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
이러한 다중특이적/이중특이적 항체에 의해 결합되는 예시적인 뇌 항원은 BACE1이고, 이에 결합하는 예시적인 항체는 본원의 도 16a-b의 YW412.8.31 항체이다.
또 다른 실시양태에서, 뇌 항원은 A베타이고, 예시적인 이러한 항체는 본원에 명확하게 참조로 포함되는 WO2007068412, WO2008011348, WO20080156622, 및 WO2008156621에 기재되어 있으며, 예시적인 A베타 항체는 각각 도 11a 및 11b의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 MABT5102A 항체를 포함한다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체" 또는 "이중-가변 도메인 이뮤노글로불린" (DVD)을 비롯하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어 US 2006/0025576A1, 및 문헌 [Wu et al. Nature Biotechnology (2007)] 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있으며, 단 최종 구축물은 목적 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 표 2에서 "바람직한 치환"의 표제 하에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 표 2에서 "예시적인 치환"의 표제 하에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 목적 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
<표 2>
Figure 112015123222158-pct00002
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 하나의 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 항원 접촉 잔기에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 수반하며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 HVR 내 항원 접촉 잔기의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항체의 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 목적하는 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 그에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접적 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 바와 같은 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조물)의 합에 대한 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체의 부차적 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 내지 300에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드)을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 공개의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al.), 특히 실시예 11에서), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된, 이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 1개 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체의 생체내 반감기는 중요하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 적용을 위한 바람직한 후보가 되도록 하는, 전부는 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유하는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서, ADCC 활성 결여 가능성이 있음), FcRn 결합 능력은 보유하는 것을 확실하게 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같이 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없으며 따라서 CDC 활성이 결여된 것을 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. 및 M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정을 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체의 비제한적 예는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 1개 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 생성하는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 역할을 하는 네오나탈 Fc 수용체 (FcRn) (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 1개 이상의 치환을 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 비제한적 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 1개 이상에서 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 이를 사용하여 항체를 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 어느 1개 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 1종 초과의 중합체가 부착되는 경우에, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선시킬 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는 재조합 방법 및 조성물을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TfR 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이것으로 형질전환된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같이 항-TfR 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-TfR 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이, 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우에, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참조한다. (또한 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재한 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획 내 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체가 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 식별되었다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합화된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
C. 검정
본원에 제공된 항-TfR 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 식별되거나, 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 스크리닝되거나 특성화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 기타 검정
TfR에 대한 항체의 결합을 결정하기 위해 다양한 기술이 이용가능하다. 한 이러한 검정은 인간 TfR (및 뇌 항원)에 결합하는 능력을 확인하기 위한 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)이다. 이러한 검정에 따르면, 항원 (예를 들어 재조합 TfR)으로 코팅된 플레이트를 항-TfR 항체를 포함하는 샘플과 함께 인큐베이션하고, 관심 항원에 대한 항체의 결합을 결정한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 측면에서, 경쟁 검정은 TfR에의 결합에 대해 본 발명의 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 식별하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 본 발명의 임의의 항체가 결합하는 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프), 보다 구체적으로 본원에 기재된 바와 같은 부류 I, 부류 II, 부류 III 또는 부류 IV의 항체가 특이적으로 결합하는 임의의 에피토프에 결합한다 (예를 들어, 실시예 1 및 표 4 참조). 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 TfR을 TfR에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 본원에 개시된 1종 이상의 항체) 및 TfR에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험될 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 TfR을 제1 표지된 항체는 포함하나 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이션한다. TfR에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후에, 과다 미결합 항체를 제거하고, 고정된 TfR과 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 TfR와 회합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이는 제2 항체가 TfR에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
2. 활성 검정
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 항-TfR 항체를 식별하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어 BBB를 가로질러 뇌 및/또는 CNS 내로 항체와 회합된/그에 접합된 화합물을 수송하는 것을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 1종 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-TfR 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, BBB를 가로질러 신경계 장애 약물, 화학요법제 및/또는 영상화제를 보다 효율적으로 수송하기 위해 본원의 항-TfR 항체는 상기 약물, 화학요법제 및/또는 영상화제와 커플링된다.
공유 접합은 직접적일 수 있거나 또는 링커를 통할 수 있다. 특정 실시양태에서, 직접 접합은 단백질 융합물의 구축에 의한다 (즉, 항-TfR 항체 및 예를 들어 신경계 장애 약물을 코딩하는 2개의 유전자의 유전자 융합 및 단일 단백질로서의 발현에 의함). 특정 실시양태에서, 직접 접합은 항-TfR 항체의 2개의 부분 중 하나 상의 반응성 기와 예를 들어 신경계 약물 상의 상응하는 기 또는 수용자 사이의 공유 결합 형성에 의한다. 특정 실시양태에서, 직접 접합은 접합될 2개의 분자 중 하나가 적절한 조건 하에 접합될 다른 분자에 대한 공유 부착을 형성하는 반응성 기 (비제한적 예로서, 술프히드릴 기 또는 카르복실 기)를 포함하도록 변형되는 것 (즉, 유전자 변형)에 의한다. 한 비제한적 예로서, 목적하는 반응성 기 (즉, 시스테인 잔기)를 갖는 분자 (즉, 아미노산)가 항-TfR 항체 내로 도입될 수 있고, 예를 들어 신경계 약물과 디술피드 결합이 형성될 수 있다. 핵산을 단백질에 공유 접합시키는 방법이 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다 (즉, 광가교, 예를 들어, 문헌 [Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74: 77-95 (2005)] 참조).
비-공유 접합은, 통상의 기술자가 용이하게 이해할 바와 같이, 소수성 결합, 이온 결합, 정전기적 상호작용 등을 비롯한 임의의 비공유 부착 수단에 의할 수 있다.
접합은 또한 다양한 링커를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR 항체 및 신경계 약물은 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 접합될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개의 아미노산으로 구성된 펩티드 링커가 또한 사용될 수 있다. 특정의 이러한 실시양태에서, 아미노산은 20개의 자연-발생 아미노산으로부터 선택된다. 특정의 다른 이러한 실시양태에서, 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신으로부터 아미노산 중 하나 이상이 선택된다. 링커는 뇌로의 전달 시 신경계 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본 발명은 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록포드로부터의) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 가교 시약으로 제조된 접합체를 명백하게 고려하지만, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 약물에 접합되어 있는 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소적 활성 독소 또는 그의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체가 검출을 위해 사용되는 경우에, 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함할 수 있거나, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 마찬가지로 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-TfR 항체는 생물학적 샘플 내의 TfR의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 혈액 (즉, 미성숙 적혈구), CSF, 및 BBB-함유 조직을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-TfR 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 TfR의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-TfR 항체와 항-TfR 항체의 TfR에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것, 및 항-TfR 항체와 TfR 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-TfR 항체는, 예를 들어 TfR이 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항-TfR 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는 TfR이 망상적혈구 내에서 발현된다는 사실로 인해 미성숙 적혈구를 수반하는 장애를 포함하고, 따라서 이는 본 발명의 임의의 항체에 의해 검출될 수 있다. 이러한 장애는 빈혈 및 망상적혈구의 감소된 수준에서 비롯되는 다른 장애, 또는 예를 들어 혈액의 증점 및 병행 생리학적 증상을 야기하는 망상적혈구의 과다증식으로 인해 적혈구 계수를 상승시키는 선천성 다혈구혈증 또는 신생물성 진성 다혈구혈증을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-TfR 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 무손상 항체는 이펙터 기능이 결여되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 무손상 항체는 감소된 이펙터 기능을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 무손상 항체는 감소된 이펙터 기능을 갖도록 조작된다. 한 측면에서, 항체는 Fab이다. 또 다른 측면에서, 항체는 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 1개 이상의 Fc 돌연변이를 갖는다. 또 다른 측면에서, 항체는 예를 들어 정상 인간 글리코실화 효소가 결여된 시스템에서 항체를 생산함으로 인해 변형된 글리코실화를 갖는다. 또 다른 측면에서, Ig 백본은 자연적으로 제한된 이펙터 기능을 보유하거나 또는 어떠한 이펙터 기능도 보유하지 않는 것으로 변형된다.
TfR에 대한 항체의 결합을 결정하기 위해 다양한 기술이 이용가능하다. 한 이러한 검정은 인간 TfR (및 뇌 항원)에 결합하는 능력을 확인하기 위한 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)이다. 이러한 검정에 따르면, 항원 (예를 들어 재조합 TfR)으로 코팅된 플레이트를 항-TfR 항체를 포함하는 샘플과 함께 인큐베이션하고, 관심 항원에 대한 항체의 결합을 결정한다.
전신 투여된 항체의 흡수 및 항체의 다른 생물학적 활성을 평가하기 위한 검정을 실시예에 개시된 바와 같이 또는 관심 항-CNS 항원 항체에 대해 공지된 바와 같이 수행할 수 있다.
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 항-BACE1 항체에 접합된 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 항-TfR 항체를 식별하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어 BACE1 아스파르틸 프로테아제 활성의 억제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 기질 펩티드를 사용하여 균질 시간-분해 형광 HTRF 검정 또는 마이크로유체 모세관 전기영동 (MCE) 검정에 의해, 또는 APP와 같은 BACE1 기질을 발현하는 세포주에서 생체내 평가되는 바와 같은, 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
F. 제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 항-TfR의 제약 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 이러한 항체를 1종 이상의 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원의 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))를 추가로 포함한다. rHuPH20을 비롯한 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 1종 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
또한, 본원의 제제는 치료할 특정한 적응증에 필요한 1종 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 신경병증 장애, 신경변성 질환, 암, 안구 질환 장애, 발작 장애, 리소솜 축적 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 행동 장애 또는 CNS 염증을 치료하기 위한 1종 이상의 활성 성분을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 이러한 의약이 본원에서 하기에 논의된다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술이 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다. 1종 이상의 활성 성분이 본원에 기재된 항-TfR 항체에 커플링된 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20020025313 참조).
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 비제한적 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-TfR 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다. 한 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 항-TfR 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 항체가 BBB를 가로질러 그에 커플링된 치료 화합물을 수송하도록 치료 화합물에 커플링된 항-TfR 항체 (예를 들어, TfR 및 뇌 항원 둘 다에 결합하는 다중특이적 항체)를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 적혈구 집단에 대한 영향을 감소 또는 제거하면서 혈액-뇌 장벽을 가로질러 치료 화합물을 수송하는 방법을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 적혈구 집단에 대한 영향을 감소 또는 제거하면서 항체가 BBB를 가로질러 그에 커플링된 신경계 장애 약물을 수송하도록 뇌 장애 약물에 커플링된 본 발명의 항-TfR 항체 (예를 들어, TfR 및 뇌 항원 둘 다에 결합하는 다중특이적 항체)를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 신경계 장애 약물을 수송하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, BBB는 포유동물 (예를 들어 인간), 예를 들어 제한 없이 알츠하이머병 (AD), 졸중, 치매, 근육 이영양증 (MD), 다발성 경화증 (MS), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 낭성 섬유증, 안젤만 증후군, 리들 증후군, 파킨슨병, 픽병, 파제트병, 암, 외상성 뇌 손상 등을 비롯한 신경계 장애를 갖는 것에 존재한다.
한 실시양태에서, 신경계 장애는 신경병증, 아밀로이드증, 암 (예를 들어 CNS 또는 뇌를 수반함), 안구 질환 또는 장애, 바이러스 또는 미생물 감염, (예를 들어 CNS 또는 뇌의) 염증, 허혈, 신경변성 질환, 발작, 행동 장애, 리소솜 축적 질환 등으로부터 선택된다. 본 발명의 항체는 1종 이상의 회합된 활성 성분/커플링된 치료 화합물을 BBB를 가로질러 CNS/뇌 내로 수송하는 그의 능력으로 인해, 그의 분자적, 세포적, 또는 바이러스적/미생물적 근거를 발견한 이러한 신경계 장애의 치료에 특히 적합하다.
신경병증 장애는 부적절하거나 제어되지 않은 신경 신호전달 또는 그의 결여를 특징으로 하는 신경계의 질환 또는 이상이고, 만성 통증 (침해수용성 통증 포함), 암-관련 통증, 신경병증성 통증 (신경, 척수, 또는 뇌의 이상에 의해 유발되는 통증), 및 심인성 통증 (전적으로 또는 대부분 심리 장애와 관련됨)을 비롯한 신체 조직에 대한 손상에 의해 유발되는 통증, 두통, 편두통, 신경병증, 및 종종 이러한 신경병증 장애에 동반되는 증상 및 증후군 예컨대 현기증 또는 오심을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
신경병증 장애에 대해, 마약성/오피오이드 진통제 (즉, 모르핀, 펜타닐, 히드로코돈, 메페리딘, 메타돈, 옥시모르폰, 펜타조신, 프로폭시펜, 트라마돌, 코데인 및 옥시코돈), 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID) (즉, 이부프로펜, 나프록센, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 인도메타신, 케토롤락, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 옥사프로진, 피록시캄, 술린닥, 및 톨메틴), 코티코스테로이드 (즉, 코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론 및 트리암시놀론), 항-편두통제 (즉, 수마트립틴, 알모트립탄, 프로바트립탄, 수마트립탄, 리자트립탄, 엘레트립탄, 졸미트립탄, 디히드로에르고타민, 엘레트립탄 및 에르고타민), 아세트아미노펜, 살리실레이트 (즉, 아스피린, 콜린 살리실레이트, 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살, 및 살살레이트), 항-경련제 (즉, 카르바마제핀, 클로나제팜, 가바펜틴, 라모트리긴, 프레가발린, 티아가빈, 및 토피라메이트), 마취제 (즉, 이소플루란, 트리클로로에틸렌, 할로탄, 세보플루란, 벤조카인, 클로로프로카인, 코카인, 시클로메티카인, 디메토카인, 프로폭시카인, 프로카인, 노보카인, 프로파라카인, 테트라카인, 아르티카인, 부피바카인, 카르티카인, 신코카인, 에티도카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 피페로카인, 프릴로카인, 로피바카인, 트리메카인, 삭시톡신 및 테트로도톡신), 및 cox-2-억제제 (즉, 셀레콕시브, 로페콕시브, 및 발데콕시브)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 진통제인 신경계 약물이 선택될 수 있다. 현기증 수반 신경병증 장애에 대해, 메클리진, 디펜히드라민, 프로메타진 및 디아제팜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항-현기증제인 신경계 약물이 선택될 수 있다. 오심 수반 신경병증 장애에 대해, 프로메타진, 클로르프로마진, 프로클로르페라진, 트리메토벤즈아미드, 및 메토클로프라미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 항-오심제인 신경계 약물이 선택될 수 있다.
아밀로이드증은 속발성 아밀로이드증, 연령-관련 아밀로이드증, 알츠하이머병 (AD), 경도 인지 장애 (MCI), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증에 의한 유전성 뇌출혈 (네덜란드 유형); 괌 파킨슨-치매 복합증, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 헌팅턴병, 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, 전염성 해면상 뇌병증, HIV-관련 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 봉입체 근염 (IBM), 및 베타-아밀로이드 침착과 관련된 안구 질환 (즉, 황반 변성, 드루젠-관련 시신경병증, 및 백내장)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, CNS 내의 세포외 단백질성 침착과 연관된 질환 및 장애 군이다.
아밀로이드증에 대해, 베타 세크레타제, 타우, 프레세닐린, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 그의 부분, 아밀로이드 베타 펩티드 또는 그의 올리고머 또는 피브릴, 사멸 수용체 6 (DR6), 최종 당화 산물에 대한 수용체 (RAGE), 파르킨, 및 헌팅틴으로부터 선택된 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 결합 분자 (소분자, 펩티드, 압타머, 또는 다른 단백질 결합제를 포함하나 이에 제한되지는 않음); 콜린에스테라제 억제제 (즉, 갈란타민, 도네페질, 리바스티그민 및 타크린); NMDA 수용체 길항제 (즉, 메만틴), 모노아민 고갈제 (즉, 테트라베나진); 에르골로이드 메실레이트; 항콜린성 항파킨슨증 치료제 (즉, 프로시클리딘, 디펜히드라민, 트리헥실페니딜, 벤즈트로핀, 비페리덴 및 트리헥시페니딜); 도파민성 항파킨슨증 치료제 (즉, 엔타카폰, 셀레길린, 프라미펙솔, 브로모크립틴, 로티고틴, 셀레길린, 로피니롤, 라사길린, 아포모르핀, 카르비도파, 레보도파, 페르골리드, 톨카폰 및 아만타딘); 테트라베나진; 항염증제 (비스테로이드성 항염증 약물 (즉, 인도메티신 및 상기 열거된 다른 화합물)을 포함하나 이에 제한되지는 않음); 호르몬 (즉, 에스트로겐, 프로게스테론 및 류프롤리드); 비타민 (즉, 폴레이트 및 니코틴아미드); 디메볼린; 호모타우린 (즉, 3-아미노프로판술폰산; 3APS); 세로토닌 수용체 활성 조절제 (즉, 크살리프로덴); 인터페론, 및 글루코코르티코이드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 신경계 약물이 선택될 수 있다.
CNS의 암은 하나 이상의 CNS 세포 (즉, 신경 세포)의 이상 증식을 특징으로 하고, 신경교종, 다형성 교모세포종, 수막종, 성상세포종, 청신경종, 연골종, 핍지교종, 수모세포종, 신경절교종, 슈반세포종, 신경섬유종, 신경모세포종 및 경막외, 수질내 또는 경막내 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
암에 대해, 화학요법제인 신경계 약물이 선택될 수 있다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 디네미신 A를 비롯한 디네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴), 파클리탁셀의 크레모포르-무함유, 알부민-조작 나노입자 제제인 아브락산(ABRAXANE)™ (아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샴버그), 및 탁소테레(TAXOTERE)® 도세탁셀 (론-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니); 클로란부실; 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®); 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)에 의한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함한다.
화학요법제의 이러한 정의에는 암 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 온몸 치료 형태인 항호르몬제가 또한 포함된다. 이는 호르몬 그 자체일 수 있다. 그 예는, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 에비스타(EVISTA)® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON)® 토레미펜을 비롯한 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM); 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 난소를 억제하거나 또는 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체화 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대 루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 디드로칼(DIDROCAL)® 에티드로네이트, NE-58095, 조메타(ZOMETA)® 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사맥스(FOSAMAX)® 알렌드로네이트, 아레디아(AREDIA)® 파미드로네이트, 스켈리드(SKELID)® 틸루드로네이트, 또는 악토넬(ACTONEL)® 리세드로네이트; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관련된 신호전달 경로 내의 유전자, 예컨대 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R)의 발현을 억제하는 것; 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016으로 또한 공지된, ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
암 치료 또는 예방을 위한 신경계 약물로서 선택될 수 있는 화합물의 또 다른 군은 항암 이뮤노글로불린 (트라스투주맙, 페르투주맙, 베바시주맙, 알렘툭수맙, 세툭시맙, 겜투주맙, 오조가미신, 이브리투모맙 티욱세탄, 파니투무맙 및 리툭시맙을 포함하나 이에 제한되지는 않음)이다. 일부 경우에, 131I 방사성표지를 갖는 토시투모맙, 또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 독성 표지 또는 접합체와 함께 항체가 목적하는 세포 (즉, 암 세포)를 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다.
안구 질환 또는 장애는 본원의 목적상 BBB에 의해 격리된 CNS 기관으로 간주되는 눈의 질환 또는 장애이다. 안구 질환 또는 장애는 공막, 각막, 홍채 및 모양체의 장애 (즉, 공막염, 각막염, 각막 궤양, 각막 찰과상, 설맹, 광각막염, 타이거슨 표재성 점상 각막병증, 각막 신생혈관화, 푸크스 이영양증, 원추각막, 건성 각결막염, 홍채염 및 포도막염), 수정체 장애 (즉, 백내장), 맥락막 및 망막의 장애 (즉, 망막 박리, 망막층간분리, 고혈압성 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 망막병증, 미숙아 망막병증, 연령-관련 황반 변성, 황반 변성 (습성 또는 건성), 망막전막, 색소성 망막염 및 황반 부종), 녹내장, 부유물, 시신경 및 시각 경로의 장애 (즉, 레베르 유전성 시신경병증 및 시신경 유두 드루젠), 안구 근육/양안 운동 조절/굴절의 장애 (즉, 사시, 안근부전마비, 진행성 외안근마비, 내사시, 외사시, 원시, 근시, 난시, 부동시, 노안 및 안근마비), 시각 장애 및 실명 (즉, 약시, 레버 선천성 흑암시, 암점, 색맹, 완전색맹, 야맹증, 실명, 강변 실명증 및 소안염/결손증), 충혈안, 아가일 로버트슨 동공, 각막진균증, 안구건조증 및 무홍채증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
안구 질환 또는 장애에 대해, 항혈관신생 안과용 작용제 (즉, 베바시주맙, 라니비주맙 및 페갑타닙), 안과용 녹내장 작용제 (즉, 카르바콜, 에피네프린, 데메카륨 브로마이드, 아프라클로니딘, 브리모니딘, 브린졸라미드, 레보부놀롤, 티몰롤, 베탁솔롤, 도르졸아미드, 비마토프로스트, 카르테올롤, 메티프라놀롤, 디피베프린, 트라보프로스트 및 라타노프로스트), 탄산 안히드라제 억제제 (즉, 메타졸아미드 및 아세타졸아미드), 안과용 항히스타민제 (즉, 나파졸린, 페닐에프린 및 테트라히드로졸린), 안구 윤활제, 안과용 스테로이드 (즉, 플루오로메톨론, 프레드니솔론, 로테프레드놀, 덱사메타손, 디플루프레드네이트, 리멕솔론, 플루오시놀론, 메드리손 및 트리암시놀론), 안과용 마취제 (즉, 리도카인, 프로파라카인 및 테트라카인), 안과용 항감염제 (즉, 레보플록사신, 가티플록사신, 시프로플록사신, 목시플록사신, 클로람페니콜, 바시트라신/폴리믹신 b, 술프아세트아미드, 토브라마이신, 아지트로마이신, 베시플록사신, 노르플록사신, 술프이속사졸, 겐타미신, 이독수리딘, 에리트로마이신, 나타마이신, 그라미시딘, 네오마이신, 오플록사신, 트리플루리딘, 간시클로비르, 비다라빈), 안과용 항염증제 (즉, 네파페낙, 케토롤락, 플루르비프로펜, 수프로펜, 시클로스포린, 트리암시놀론, 디클로페낙 및 브롬페낙), 및 안과용 항히스타민제 또는 충혈제거제 (즉, 케토티펜, 올로파타딘, 에피나스틴, 나파졸린, 크로몰린, 테트라히드로졸린, 페미로라스트, 베포타스틴, 나파졸린, 페닐에프린, 네도크로밀, 로독사미드, 페닐에프린, 에메다스틴 및 아젤라스틴)인 신경계 약물이 선택될 수 있다.
CNS의 바이러스 또는 미생물 감염은 급성 또는 만성일 수 있는 수막염, 뇌염, 척수염, 혈관염 및 농양을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CNS 병리생리상태를 야기하는 바이러스 (즉, 인플루엔자, HIV, 폴리오바이러스, 풍진), 박테리아 (즉, 네이세리아(Neisseria) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 슈도모나스 종, 프로테우스(Proteus) 종, 이. 콜라이, 에스. 아우레우스(S. aureus), 뉴모코쿠스(Pneumococcus) 종, 메닌고코쿠스(Meningococcus) 종, 헤모필루스(Haemophilus) 종, 및 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)) 및 다른 미생물, 예컨대 진균 (즉, 효모, 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 기생충 (즉, 톡소플라스마 곤디이(toxoplasma gondii)) 또는 아메바에 의한 감염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
바이러스 또는 미생물 질환에 대해, 항바이러스 화합물 (아다만탄 항바이러스제 (즉, 리만타딘 및 아만타딘), 항바이러스 인터페론 (즉, 페그인터페론 알파-2b), 케모카인 수용체 길항제 (즉, 마라비록), 인테그라제 가닥 전달 억제제 (즉, 랄테그라비르), 뉴라미니다제 억제제 (즉, 오셀타미비르 및 자나미비르), 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (즉, 에파비렌즈, 에트라비린, 델라비르딘 및 네비라핀), 뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (테노포비르, 아바카비르, 라미부딘, 지도부딘, 스타부딘, 엔테카비르, 엠트리시타빈, 아데포비르, 잘시타빈, 텔비부딘 및 디다노신), 프로테아제 억제제 (즉, 다루나비르, 아타자나비르, 포삼프레나비르, 티프라나비르, 리토나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 인디나비르 및 사퀴나비르), 퓨린 뉴클레오시드 (즉, 발라시클로비르, 팜시클로비르, 아시클로비르, 리바비린, 간시클로비르, 발간시클로비르 및 시도포비르), 및 다양한 항바이러스제 (즉, 엔푸비르티드, 포스카르넷, 팔리비주맙 및 포미비르센)를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 항생제 (아미노페니실린 (즉, 아목시실린, 암피실린, 옥사실린, 나프실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루콕사실린, 테모실린, 아즐로실린, 카르베니실린, 티카르실린, 메즐로실린, 피페라실린 및 바캄피실린), 세팔로스포린 (즉, 세파졸린, 세팔렉신, 세팔로틴, 세파만돌, 세프트리악손, 세포탁심, 세프포독심, 세프타지딤, 세파드록실, 세프라딘, 로라카르베프, 세포테탄, 세푸록심, 세프프로질, 세파클로르, 및 세폭시틴), 카르바페넴/페넴 (즉, 이미페넴, 메로페넴, 에르타페넴, 파로페넴 및 도리페넴), 모노박탐 (즉, 아즈트레오남, 티게모남, 노르카르디신 A 및 타브톡시닌-베타-락탐, 또 다른 베타-락탐 항생제와 함께 베타-락타마제 억제제 (즉, 클라불란산, 타조박탐 및 술박탐), 아미노글리코시드 (즉, 아미카신, 겐타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 및 파로모마이신), 안사마이신 (즉, 겔다나마이신 및 헤르비마이신), 카르바세펨 (즉, 로라카르베프), 당펩티드 (즉, 테이코플라닌 및 반코마이신), 마크롤리드 (즉, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 트롤레안도마이신, 텔리트로마이신 및 스펙티노마이신), 모노박탐 (즉, 아즈트레오남), 퀴놀론 (즉, 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 그레파플록사신, 스파르플록사신 및 테마플록사신), 술폰아미드 (즉, 마페니드, 술폰아미도크리소이딘, 술프아세트아미드, 술파디아진, 술파메티졸, 술파닐아미드, 술파살라진, 술프이속사졸, 트리메토프림, 트리메토프림 및 술파메톡사졸), 테트라시클린 (즉, 테트라시클린, 데메클로시클린, 독시시클린, 미노시클린 및 옥시테트라시클린), 항신생물성 또는 세포독성 항생제 (즉, 독소루비신, 미톡산트론, 블레오마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 플리카마이신, 미토마이신, 펜토스타틴 및 발루비신) 및 다양한 항박테리아 화합물 (즉, 바시트라신, 콜리스틴 및 폴리믹신 B)를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 항진균제 (즉, 메트로니다졸, 니타족사니드, 티니다졸, 클로로퀸, 아이오도퀴놀 및 파로모마이신), 및 항기생충제 (퀴닌, 클로로퀸, 아모디아퀸, 피리메타민, 술파독신, 프로구아닐, 메플로퀸, 아토바쿠온, 프리마퀸, 아르테메시닌, 할로판트린, 독시시클린, 클린다마이신, 메벤다졸, 피란텔 파모에이트, 티아벤다졸, 디에틸카르바마진, 이베르멕틴, 리팜핀, 암포테리신 B, 멜라르소프롤, 에포르니틴 및 알벤다졸을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신경계 약물이 선택될 수 있다.
CNS의 염증은 물리적 손상 (즉, 사고, 수술, 뇌 외상, 척수 손상, 뇌진탕으로 인함)일 수 있는 CNS에 대한 손상 및 CNS의 하나 이상의 다른 질환 또는 장애 (즉, 농양, 암, 바이러스 또는 미생물 감염)로 인하거나 이와 관련된 손상에 의해 유발되는 염증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
CNS 염증에 대해, 염증 자체를 다루는 것 (즉, 비스테로이드성 항염증제, 예컨대 이부프로펜 또는 나프록센), 또는 염증의 기저 원인을 치료하는 것 (즉, 항바이러스제 또는 항암제)인 신경계 약물이 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 CNS의 허혈은 뇌의 이상 혈류 또는 혈관 행동 또는 그의 원인과 관련된 장애 군을 지칭하고, 초점성 뇌 허혈, 전뇌 허혈, 졸중 (즉, 지주막하 출혈 및 뇌내 출혈), 및 동맥류를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
허혈에 대해, 혈전용해제 (즉, 우로키나제, 알테플라제, 레테플라제 및 테넥테플라제), 혈소판 응집 억제제 (즉, 아스피린, 실로스타졸, 클로피도그렐, 프라수그렐 및 디피리다몰), 스타틴 (즉, 로바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 로수바스타틴, 아토르바스타틴, 심바스타틴, 세리바스타틴 및 피타바스타틴), 및 예를 들어 혈압 의약을 비롯한 혈류 또는 혈관 가요성을 개선시키는 화합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신경계 약물이 선택될 수 있다.
신경변성 질환은 CNS 내의 신경 세포 기능 상실 또는 사멸과 연관된 질환 및 장애 군이고, 부신백질이영양증, 알렉산더병, 알퍼병, 근위축성 측삭 경화증, 모세혈관확장성 운동실조, 배튼병, 코케인 증후군, 피질기저 변성, 아밀로이드증으로 인한 또는 그와 연관된 변성, 프리드라이히 운동실조, 전두측두엽 변성, 케네디병, 다계통 위축, 다발성 경화증, 원발성 측삭 경화증, 진행성 핵상 마비, 척수성 근육 위축, 횡단성 척수염, 레프숨병 및 척수소뇌성 운동실조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
신경변성 질환에 대해, 성장 호르몬 또는 신경영양 인자인 신경계 약물이 선택될 수 있고; 그 예는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀-4/5, 섬유모세포 성장 인자 (FGF)-2 및 다른 FGF, 뉴로트로핀 (NT)-3, 에리트로포이에틴 (EPO), 간세포 성장 인자 (HGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 (TGF)-알파, TGF-베타, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨-1 수용체 길항제 (IL-1ra), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 신경교-유래 신경영양 인자 (GDNF), 뉴르투린, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 헤레귤린, 뉴레귤린, 아르테민, 페르세핀, 인터류킨, 신경교 세포주 유래 신경영양 인자 (GFR), 과립구-콜로니 자극 인자 (CSF), 과립구-대식세포-CSF, 네트린, 카디오트로핀-1, 헷지호그, 백혈병 억제 인자 (LIF), 미드카인, 플레이오트로핀, 골 형태발생 단백질 (BMP), 네트린, 사포신, 세마포린 및 줄기 세포 인자 (SCF)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
CNS의 발작 질환 및 장애는 CNS에서의 부적절하고/거나 비정상적인 전기 전도를 수반하고, 간질 (즉, 결신 발작, 무긴장성 발작, 양성 롤란딕 간질, 소아기 결신, 간대성 발작, 복합 부분 발작, 전두엽 간질, 열성 발작, 영아 연축, 소아 근간대성 간질, 소아 결신 간질, 레녹스-가스토 증후군, 란다우-클레프너 증후군, 드라베 증후군, 오타하라 증후군, 웨스트 증후군, 근간대성 발작, 미토콘드리아 장애, 진행성 간근대성 간질, 심인성 발작, 반사 간질, 라스무센 증후군, 단순 부분 발작, 속발성 전신 발작, 측두엽 간질, 긴장간대성 발작, 긴장성 발작, 정신운동 발작, 변연계 간질, 부분-발병 발작, 전신-발병 발작, 간질 지속상태, 복부 간질, 무운동성 발작, 자율신경성 발작, 광범성 양측성 근간대성경련, 월경성 간질, 적하 발작, 정서적 발작, 초점성 발작, 홍소 발작, 잭슨 발작, 라포라병, 운동 발작, 다초점성 발작, 야간 발작, 감광성 발작, 가성 발작, 감각 발작, 비정형적 발작, 실반 발작, 금단 발작 및 시각 반사 발작)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
발작 장애에 대해, 바르비투레이트 항경련제 (즉, 프리미돈, 메타르비탈, 메포바르비탈, 알로바르비탈, 아모바르비탈, 아프로바르비탈, 알페날, 바르비탈, 브랄로바르비탈 및 페노바르비탈), 벤조디아제핀 항경련제 (즉, 디아제팜, 클로나제팜, 및 로라제팜), 카르바메이트 항경련제 (즉, 펠바메이트), 탄산 안히드라제 억제제 항경련제 (즉, 아세타졸아미드, 토피라메이트 및 조니사미드), 디벤즈아제핀 항경련제 (즉, 루피나미드, 카르바마제핀, 및 옥스카르바제핀), 지방산 유도체 항경련제 (즉, 디발프로엑스 및 발프로산), 감마-아미노부티르산 유사체 (즉, 프레가발린, 가바펜틴 및 비가바트린), 감마-아미노부티르산 재흡수 억제제 (즉, 티아가빈), 감마-아미노부티르산 트랜스아미나제 억제제 (즉, 비가바트린), 히단토인 항경련제 (즉, 페니토인, 에토토인, 포스페니토인 및 메페니토인), 다양한 항경련제 (즉, 라코사미드 및 황산마그네슘), 프로게스틴 (즉, 프로게스테론), 옥사졸리딘디온 항경련제 (즉, 파라메타디온 및 트리메타디온), 피롤리딘 항경련제 (즉, 레베티라세탐), 숙신이미드 항경련제 (즉, 에토숙시미드 및 메트숙시미드), 트리아진 항경련제 (즉, 라모트리진), 및 우레아 항경련제 (즉, 페나세미드 및 페네투리드)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 항경련제 또는 항간질제인 신경계 약물이 선택될 수 있다.
행동 장애는 이환된 대상체의 일부에서의 이상 행동을 특징으로 하는 CNS 장애이고, 수면 장애 (즉, 불면증, 사건수면, 야경증, 일주기 리듬 수면 장애, 및 기면증), 기분 장애 (즉, 우울증, 자살성 우울증, 불안, 만성 정동 장애, 공포증, 공황 발작, 강박 장애, 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD), 주의력 결핍 장애 (ADD), 만성 피로 증후군, 광장공포증, 외상후 스트레스 장애, 양극성 장애), 섭식 장애 (즉, 식욕부진 또는 폭식증), 정신병, 발달 행동 장애 (즉, 자폐증, 레트 증후군, 아스퍼거 증후군), 인격 장애 및 정신병적 장애 (즉, 정신분열증, 망상 장애 등)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
행동 장애에 대해, 비정형 항정신병제 (즉, 리스페리돈, 올란자핀, 아프리피프라졸, 퀘티아핀, 팔리페리돈, 아세나핀, 클로자핀, 일로페리돈 및 지프라시돈), 페노티아진 항정신병제 (즉, 프로클로르페라진, 클로르프로마진, 플루페나진, 페르페나진, 트리플루오페라진, 티오리다진 및 메소리다진), 티오크산텐 (즉, 티오틱센), 다양한 항정신병제 (즉, 피모지드, 리튬, 몰린돈, 할로페리돌 및 록사핀), 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (즉, 시탈로프람, 에스시탈로프람, 파록세틴, 플루옥세틴 및 세르트랄린), 세로토닌-노르에피네프린 재흡수 억제제 (즉, 둘록세틴, 벤라팍신, 데스벤라팍신, 삼환계 항우울제 (즉, 독세핀, 클로미프라민, 아목사핀, 노르트립틸린, 아미트립틸린, 트리미프라민, 이미프라민, 프로트립틸린 및 데시프라민), 테트라시클릭 항우울제 (즉, 미르타자핀 및 마프로틸린), 페닐피페라진 항우울제 (즉, 트라조돈 및 네파조돈), 모노아민 옥시다제 억제제 (즉, 이소카르복스아지드, 페넬진, 셀레길린 및 트라닐시프로민), 벤조디아제핀 (즉, 알프라졸람, 에스타졸람, 플루라제프탐, 클로나제팜, 로라제팜 및 디아제팜), 노르에피네프린-도파민 재흡수 억제제 (즉, 부프로피온), CNS 자극제 (즉, 펜테르민, 디에틸프로피온, 메탐페타민, 덱스트로암페타민, 암페타민, 메틸페니데이트, 덱스메틸페니데이트, 리스덱삼페타민, 모다피닐, 페몰린, 펜디메트라진, 벤즈페타민, 펜디메트라진, 아르모다피닐, 디에틸프로피온, 카페인, 아토목세틴, 독사프람, 및 마진돌), 불안완화제/진정제/수면제 (바르비투레이트 (즉, 세코바르비탈, 페노바르비탈 및 메포바르비탈), 벤조디아제핀 (상기 기재된 바와 같음) 및 다양한 불안완화제/진정제/수면제 (즉, 디펜히드라민, 소듐 옥시베이트, 잘레플론, 히드록시진, 클로랄 수화물, 아올피뎀, 부스피론, 독세핀, 에스조피클론, 라멜테온, 메프로바메이트 및 에트클로르비놀)을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 세크레틴 (예를 들어, 문헌 [Ratliff-Schaub et al. Autism 9: 256-265 (2005)] 참조), 오피오이드 펩티드 (예를 들어, 문헌 [Cowen et al., J. Neurochem. 89:273-285 (2004)] 참조), 및 뉴로펩티드 (예를 들어, 문헌 [Hethwa et al. Am. J. Physiol. 289: E301-305 (2005)] 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 행동-변형 화합물로부터 신경계 약물이 선택될 수 있다.
리소솜 축적 장애는 일부 경우에 CNS와 연관되거나 CNS-특이적 증상을 갖는 대사 장애이고; 이러한 장애는 테이-삭스병, 고셔병, 파브리병, 뮤코폴리사카라이드증 (유형 I, II, III, IV, V, VI 및 VII), 글리코겐 축적 질환, GM1-강글리오시드증, 이염성 백질이영양증, 파버병, 카나반 백질이영양증, 및 신경 세로이드 리포푸신증 유형 1 및 2, 니만-픽병, 폼페병, 및 크라베병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
리소솜 축적 질환에 대해, 질환에서 손상된 효소 자체이거나 또는 달리 그의 활성을 모방하는 신경계 약물이 선택될 수 있다. 리소솜 축적 장애의 치료를 위한 예시적인 재조합 효소는 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0142141에 제시된 것 (즉, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-술파타제, N-술파타제, 알파-N-아세틸글루코사미니다제, N-아세틸-갈락토사민-6-술파타제, 베타-갈락토시다제, 아릴술파타제 B, 베타-글루쿠로니다제, 산 알파-글루코시다제, 글루코세레브로시다제, 알파-갈락토시다제 A, 헥소사미니다제 A, 산 스핑고미엘리나제, 베타-갈락토세레브로시다제, 베타-갈락토시다제, 아릴술파타제 A, 산 세라미다제, 아스파르토아실라제, 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 및 트리펩티딜 아미노 펩티다제 1)을 포함하나 이에 제한되지는 않는이다.
또 다른 실시양태에서, 적혈구의 부적절한 과다생산과 관련되거나 그에 의해 유발되는 질환, 또는 적혈구의 과다생산이 질환의 효과인 것은 적어도 부분적인 이펙터 기능을 보유하는 항-TfR 항체의 본원에서 인식된 망상적혈구-고갈 효과에 의해 예방되거나 치료될 수 있다. 예를 들어, 선천성 또는 신생물성 진성 다혈구혈증에서, 예를 들어 망상적혈구의 과다증식으로 인해 상승된 적혈구 계수는 혈액의 증점 및 병행 생리학적 증상을 야기한다 (d'Onofrio et al., Clin. Lab. Haematol. (1996) Suppl. 1: 29-34). 항체의 적어도 부분적인 이펙터 기능이 보존되어 있는 본 발명의 항-TfR 항체의 투여는 CNS 내로의 정상적인 트랜스페린 수송에 영향을 미치지 않으면서 미성숙 망상적혈구 집단의 선택적인 제거를 허용할 것이다. 관련 기술분야에서 널리 이해되고 있는 바와 같이, 급성 임상 증상이 최소화될 수 있도록 이러한 항체의 투여는 조절될 수 있다 (즉, 매우 낮은 용량으로 또는 넓게 이격되어 투여함으로써).
한 측면에서, 본 발명의 항체는 증상의 발병 전에 신경계 장애를 검출하고/거나 질환 또는 장애의 중증도 또는 지속기간을 평가하기 위해 사용된다. 한 측면에서, 항체는 방사선촬영, 단층촬영 또는 자기 공명 영상화 (MRI)에 의한 영상화를 비롯하여 신경계 장애의 검출 및/또는 영상화를 허용한다.
한 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 낮은 친화도 항-TfR 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 적혈구 (즉, 망상적혈구)를 고갈시키지 않으면서 신경계 질환 또는 장애 (예를 들어, 알츠하이머병)를 치료하는데 사용하기 위한 낮은 친화도 항-TfR 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법에서 사용하기 위한 변형된 낮은 친화도 항-TfR 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 신경계 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 유효량의 항-TfR 항체 (임의로 신경계 장애 약물에 커플링됨)를 투여하는 것을 포함하는 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 그의 안전성을 개선시키기 위해 변형된 낮은 친화도 항-TfR 항체를 제공한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 신경계 질환 또는 장애 (예를 들어, 알츠하이머병)의 위험이 있거나 또는 이를 앓고 있는 환자에서 아밀로이드 플라크 형성을 감소 또는 억제하는데 사용하기 위한, 그의 안전성을 개선시키기 위해 변형된 항-TfR 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 임의로 인간이다. 특정 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 항-TfR 항체는 그와 커플링된 신경계 장애 약물의 흡수를 개선시킨다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제작 또는 제조에서의 본 발명의 낮은 친화도 항-TfR 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 신경계 질환 또는 장애의 치료를 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 신경계 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 신경계 질환 또는 장애의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 알츠하이머병을 갖는 개체에게 BACE1 및 TfR 둘 다 또는 A베타 및 TfR 둘 다에 결합하는 본 발명의 다중특이적 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
본 발명의 항-TfR 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-TfR 항체는 적어도 1종의 추가의 치료제와 공-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-TfR 항체가 치료를 위해 사용되는 것과 동일한 또는 상이한 신경계 장애를 치료하는데 효과적인 치료제이다. 예시적인 추가의 치료제는 상기 기재된 다양한 신경계 약물, 콜린에스테라제 억제제 (예컨대 도네페질, 갈란타민, 로바스티그민 및 타크린), NMDA 수용체 길항제 (예컨대 메만틴), 아밀로이드 베타 펩티드 응집 억제제, 항산화제, γ-세크레타제 조절제, 신경 성장 인자 (NGF) 모방체 또는 NGF 유전자 요법, PPARγ 효능제, HMS-CoA 리덕타제 억제제 (스타틴), 암파카인, 칼슘 채널 차단제, GABA 수용체 길항제, 글리코겐 신타제 키나제 억제제, 정맥내 이뮤노글로불린, 무스카린성 수용체 효능제, 니코틴성 수용체 조절제, 능동적 또는 수동적 아밀로이드 베타 펩티드 면역화, 포스포디에스테라제 억제제, 세로토닌 수용체 길항제 및 항-아밀로이드 베타 펩티드 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 적어도 1종의 추가의 치료제는 신경계 약물의 하나 이상의 부작용을 완화시키는 그의 능력에 대해 선택된다.
본원에 예시된 바와 같이, 특정 항-TfR 항체는 항-TfR 항체로 치료된 대상체에서 망상적혈구 집단에 부정적 영향을 미치는 부작용을 가질 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 망상적혈구 집단에 대한 이러한 부정적 부작용을 완화시키는 능력에 대해 선택된 적어도 1종의 추가의 치료제가 본 발명의 항-TfR 항체와 공투여된다. 이러한 치료제의 예는 적혈구 (즉, 망상적혈구) 집단을 증가시키는 작용제, 적혈구 (즉, 망상적혈구)의 성장 및 발달을 지지하는 작용제, 및 항-TfR 항체의 효과로부터 적혈구 집단을 보호하는 작용제를 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 이러한 작용제는 에리트로포이에틴 (EPO), 철 보충제, 비타민 C, 폴산 및 비타민 B12, 뿐만 아니라 예를 들어 혈액형이 유사한 또 다른 개체로부터의 것일 수 있거나 항-TfR 항체가 투여된 대상체로부터 이전에 추출된 것일 수 있는 유사한 세포의 수혈에 의한 적혈구 (즉, 망상적혈구)의 물리적 대체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 기존의 적혈구 (즉, 망상적혈구)를 보호하도록 의도되는 작용제는 바람직하게는 항-TfR 항체 요법에 선행하거나 병행하여 대상체에게 투여되는 한편, 적혈구 또는 혈액 세포 집단 (즉, 망상적혈구 또는 망상적혈구 집단)의 재성장/발달을 지지하거나 개시시키도록 의도되는 작용제는 이러한 혈액 세포가 항-TfR 항체 치료 후에 보충될 수 있도록 바람직하게는 항-TfR 항체 요법과 병행하여 또는 그 후에 투여된다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
특정의 다른 이러한 실시양태에서, 적어도 1종의 추가의 치료제는 항-TfR 항체의 투여 시 보체 경로의 활성화를 억제하거나 방지하는 그의 능력에 대해 선택된다. 이러한 치료제의 예는 보체 경로에 결합하거나 또는 이를 활성화시키는 항-TfR 항체의 능력을 방해하는 작용제 및 보체 경로 내의 1종 이상의 분자 상호작용을 억제하는 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않고, 이는 그 내용이 명백하게 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Mollnes and Kirschfink (2006) Molec. Immunol. 43:107-121]에 일반적으로 기재되어 있다.
상기 및 본원에 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제는 동일 또는 개별 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포괄하고, 이러한 경우에 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전, 그와 동시, 및/또는 그 후에 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 항-TfR 항체의 투여 및 추가의 치료제의 투여는 서로 약 1개월 내, 또는 약 1, 2 또는 3주 내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 내에 이루어진다. 본 발명의 항체는 또한 방사선 요법, 행동 요법, 또는 치료 또는 예방할 신경계 장애에 대해 관련 기술분야에 공지되어 있고 적절한 다른 요법과 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는 다른 중재 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 항-TfR 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내, 원하는 경우에 국부 치료를 위해, 병변내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 그러할 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방하거나 치료하는데 또는 항체 투여의 하나 이상의 부작용을 예방하거나 완화시키거나 호전시키는데 현재 사용되는 1종 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이는 일반적으로 상기 기재된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 1종 이상의 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 의존할 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 의존하여, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든 관계없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1mg/kg-10mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 의존하여 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 의존하여 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 하나의 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 40 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg 또는 40 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록). 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 항-TfR 항체에 투여에 의한 망상적혈구 집단에 대한 영향을 감소시키기 위한 한 방법은 전체적으로 보다 낮은 양의 순환 항체가 혈류 내에 존재하여 망상적혈구와 상호작용하도록 용량의 양 또는 시기를 변형시키는 것이라는 것이 인식될 것이다. 하나의 비제한적 예에서, 보다 낮은 용량의 항-TfR 항체가 보다 높은 용량이 투여되는 것보다 더 큰 빈도로 투여될 수 있다. 사용된 투여량은 CNS에 전달될 필요가 있는 항체의 양 (항체의 CNS 항원-특이적 부분의 친화도와 관련된 그 자체), 그러한 항체의 TfR에 대한 친화도, 및 적혈구 (즉, 망상적혈구)-보호, 성장 및 발달-자극, 또는 보체 경로-억제 화합물(들)이 항체와 공-투여되는지 또는 연속적으로 투여되는지 여부 사이에서 균형을 이룰 수 있다. 본원에 기재되고 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같은 통상의 기술 및 검정에 의해 이러한 요법의 진행이 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 항-TfR 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제조 물품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 회합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 조성물을 그 자체로 수용하거나 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 내부에 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 수용된 제1 용기; 및 (b) 내부에 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 수용된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조 물품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 물품은 제약상-허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 항-TfR 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
실시예 1: 인간/시노 교차-반응성 항-TFR 항체의 생성, 특성화 및 인간화
먼저, TfR에의 결합에 대해 Tf와 추가로 경쟁하지 않는 인간 TfR 및 시노몰구스 ("시노") 원숭이로부터의 TfR 둘 다와 교차-반응성 항체를 식별하기 위한 시도로 나이브 항체 파지 패닝 공정을 수행하였다 (Lee et al. JMB (2004) 1073-1093). 이러한 파지 패닝 공정으로부터 어떠한 이러한 교차-반응성, 비-Tf-경쟁 클론도 식별되지 않았다. 그러나, 후속해서 생성된 하이브리도마 클론을 특성화하는데 유용한 2종의 항체가 식별되었다.
종 교차-반응성 항체는 인간 또는 시노 TfR에의 결합에 대해 Tf와 경쟁하는 것으로 식별되었다 (Tf-경쟁 항체). 인간 TfR에 특이적인 또 다른 클론의 에피토프는 마우스/인간 키메라 TfR 수용체를 사용하여 huTfR의 정단 도메인에 대해 맵핑되었다 (도 1). 이러한 정단 도메인-결합 클론은 정단 도메인 내 마우스 TfR 서열을 huTfR로 치환시킨 경우에 huTfR에 대한 결합을 상실하였다.
다음으로, 교차-반응성 항-인간/시노 TfR 항체를 생성하기 위해 면역화-기반 접근법을 수행하였다. N-말단 His 태그 및 인간 혈색소증 단백질 ("HFE")을 함유하는 인간 TfR 세포외 도메인 ("ecd")을 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다 (Bennet et al., Nature (2000) 403, 46-53). 유사한 시노 TfR ecd 구축물을 또한 제조하였다. 시노 TfR을 유사한 방식으로 발현시키고 정제하였다. 5마리의 Balb/C 마우스를 발바닥으로 각각 시노TfR 및 huTfR ecd 2 μg을 함유하는 6회 용량 (1주에 2회)으로 면역화시켜 인간 및 시노 교차-반응성 TfR 항체를 생성하였다. 모든 마우스 혈청은 FACS 양성이었고, 모든 마우스는 융합되었다. 스크리닝된 1632개의 하이브리도마 중에서, 111개가 인간 및 시노 TfR 둘 다에의 결합에 대해 ELISA 양성이었다.
생성된 ELISA-양성 하이브리도마를 인간 또는 시노 TfR을 일시적으로 발현하는 293 세포에의 결합에 대해 1 μM 인간 홀로-Tf의 존재 하에 FACS에 의해 스크리닝하였다. 간략하게, FACS 분석 전에 리포펙타민 2000 플러스 (인비트로젠(Invitrogen))를 48-72시간 사용하여 전장 인간 또는 시노 TfR로 형질감염시킨 293 세포를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. 비-형질감염 (대조군) 및 형질감염 293 세포를 FACS 완충제 (1% BSA 함유 PBS)로 2회 세척하고, 50 μl의 하이브리도마 상청액 (10 μg/ml로 정규화됨)을 1 μM 인간 홀로-Tf의 존재 하에 293 세포에 첨가하고, 빙상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하고, 50 μl의 PE-염소-항-뮤린 Fcγ (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 세포에 첨가하고, 이를 빙상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제로 세척하고, 분석을 위해 100μl FACS 완충제 중에 재현탁시켰다.
14개의 클론이 인간 및 시노 TfR 둘 다에의 결합에 대해 양성이었다 (도 2a 및 2b). 이들 클론을 추가로 서브클로닝하고, ELISA에 의해 인간 및 시노 TfR 둘 다에의 결합에 대해 평가하고, 상기 식별된 정단 결합 파지 클론을 사용하여 에피토프를 huTfR 상에서 맵핑하였다. 간략하게, PBS 중 정제된 인간 또는 시노 TfR 2 μg/ml로 코팅된 맥시소르프 플레이트에서 4℃에서 밤새 정단 도메인 파지 경쟁 ELISA를 수행하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 카세인 함유 슈퍼블록 (써모 사이언티픽, 뉴햄프셔주 허드슨)을 사용하여 차단시켰다. 하이브리도마 상청액의 30 μl 분취물 (10 μg/ml로 정규화됨)을 각각의 웰에 45분 동안 첨가하였다. 이어서 30 μl 정단 도메인-결합 파지를 OD 0.05로 15분 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 1:1000 희석된 HRP-마우스-항 M13 (지이 헬스케어(GE healthcare))을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, TMB 기질 (바이오FX 래보러토리즈, 오잉스 밀스)을 사용하여 결합된 파지를 검출하였다. 14개의 클론 중 9개가 파지 상에 디스플레이된 정단 결합 항체의 결합을 차단하는 것으로 발견되었다 (도 2c 참조).
항체 친화도는 표면 플라즈몬 공명 ("SPR") (비아코어™, 지이 헬스케어)을 사용하여 측정하였다. 항-His 항체 (퀴아젠(Qiagen))를 비아코어TM CM5 센서 칩 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)의 4종의 상이한 유동 세포에 6000 내지 8000 RU로 커플링시켰다. 고정화는 제조업체에 의해 제공된 프로토콜을 사용하여 아미노 기를 통한 무작위 커플링에 의해 달성하였다. 10X HBS-P (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)를 물 중에 희석시키고, 희석 및 구동 완충제로서 제공하였다. 정제된 인간 또는 시노 TfR이 포획되었고, 이어서 단일 사이클 동역학적 방법을 사용하여 30 ml/분의 유량으로 주입된 IgG 또는 Fab의 3-배 희석 시리즈가 포획되었다. 친화도 상수는 단순 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하거나 또는 k온 또는 k오프가 검출 한계를 초과하는 경우에 정상 상태 모델을 사용하여 결정하였다. 평형 해리 상수 (KD)는 회합률 상수 (k온) 및 해리율 상수 (k오프)의 비로서 계산하였다. 결과를 도 2c에 제시한다.
각각의 하이브리도마를 클로닝하였다. RNeasy 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 하이브리도마로부터 총 RNA를 단리하였다. SMART 5' RACE cDNA 증폭 키트 (클론테크(Clontech))를 제조업체의 지침에 기초하여 사용하여 cDNA를 생성하였다. 각각의 항체의 가변 영역을 키트에 제공된 UPM (5' 올리고) 및 불변 영역에 어닐링되는 3' 올리고를 사용하여 증폭시켰다. 이어서 전체 PCR 산물을 서열분석을 위해 pCR4Blunt-TOPO 벡터 (인비트로젠) 내로 클로닝하였다. 서열 분석 후에, 하이브리도마를 추가로 4개의 군으로 세분할 수 있었다 (도 3a-3d). 정단 결합 항체와 경쟁하는 클론은 3개의 관련 서열 부류에 속한다 (도 3 a-c). 4개의 비-정단 클론 (도 3d)은 2개의 관련 클론 및 2개의 다른 고유한 서열로 이루어졌다. 각각의 클론의 경쇄 및 중쇄 CDR을 표 3에 제공한다.
<표 3> 교차-반응성 항-시노/인간 TfR 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR
Figure 112015123222158-pct00003
Figure 112015123222158-pct00004
각각의 부류로부터의 대표적인 클론, (15G11, 7A4, 16F6 및 7G7)이 인간화 및 추가의 특성화를 위한 것으로 본원에 예시된다. 인간화는 하기 및 도 4a-4e에 개략화된 바와 같이 선택 버니어 위치를 포함시키는 것과 함께 HVR 그라프트를 사용하여 달성하였다. 15G11은 HVR을 IGKV1-NL1*01 및 IGHV1-3*01 인간 가변 도메인 내로 그라프팅시켜 인간화하였다. 도 4e에 개략화된 바와 같이 상이한 마우스 버니어 위치의 조합을 인간화 변이체에 포함시켰다. 인간화 15G11 변이체 15G11.v5는 도 4a에 개략화된 바와 같이 VL (위치 43 및 48) 및 VH (위치 48, 67, 69, 71 및 73) 내에 선택된 버니어 위치를 함유한다. 또한, VH의 N-말단을 Q에서 E로 변화시켰다. 7A4의 인간화를 위해, 7A4 중쇄 및 8A2 경쇄 HVR (7A4 및 8A2는 관련 클론임, 도 3a)을 사용하여 HVR 그라프트를 제조하였다. HVR을 IGKV4-1*01 및 IGHV1-2*02 인간 가변 도메인 내로 그라프트시켰다. 도 4e에 개략화된 바와 같이 상이한 마우스 버니어 위치의 조합을 인간화 변이체에 포함시켰다. 도 4b에 개략화된 바와 같이, 인간화 7A4 변이체, 7A4.v15는 VL (위치 68) 및 VH (위치 24 및 71) 내에 선택된 버니어 위치를 함유하고, CDR-L3은 G94A로 변화된다. 7G7은 도 4c에 개략화된 바와 같이 VH (위치 93) 내의 선택된 버니어 위치와 함께 HVR을 카파 4 및 하위군 I 인간 컨센서스 가변 도메인 내로 그라프팅시켜 인간화하였다. 이러한 인간화 변이체를 7G7.v1이라 부른다. 16F6은 HVR을 IGKV1-9*01 및 IGHV4-59*01 인간 가변 도메인 내로 그라프팅시켜 인간화하였다. 도 4e에 개략화된 바와 같이 상이한 마우스 버니어 위치의 조합을 인간화 변이체에 포함시켰다. 인간화 16F6 변이체 16F6.v4는 도 4d에 개략화된 바와 같이 VL 내에 2개의 변화 (I48L 및 F71Y) 뿐만 아니라 VL (위치 43 및 44) 및 VH (위치 71 및 78) 내에 선택된 버니어 위치를 함유한다.
<표 4> 인간화 항체/Fab의 경쇄 및 중쇄 CDR
Figure 112015123222158-pct00005
인간 및 시노 TfR에 대한 인간화 변이체의 친화도를 IgG로서 SPR에 의해 결정하였다 (도 4e). 또한 선택된 클론을 Fab로서 SPR에 의해 분석하여 1가 친화도를 평가하였다 (표 7). 둘 다의 경우에, SPR 실험은 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
<표 5> 선택된 Fab-포맷 변이체에 대한 비아코어 결합 데이터
Figure 112015123222158-pct00006
항체의 결합 에피토프는 다음과 같이 재-확인하였다. PBS 중 정제된 인간 TfR 2 μg/ml로 코팅된 맥시소르프 플레이트에서 4℃에서 밤새 Tf-TfR 차단 ELISA를 수행하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, PBS 중 슈퍼블록 차단 완충제 (써모 사이언티픽, 뉴햄프셔주 허드슨)를 사용하여 차단시켰다. 50 μl의 12.5 μM 인간 홀로-Tf (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)를 플레이트에 40분 동안 첨가하였다. hu7A4.v15, hu15G11.v5, Tf 경쟁 항체, 및 hu7G7.v1의 50 μl 적정 (10 ug/ml에서 시작, 1:3 연속 희석물)을 플레이트에 첨가하고, 20분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 1:1000 희석된 HRP-염소-항 인간 Fcγ (잭슨 이뮤노리서치)를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, TMB 기질 (바이오FX 래보러토리즈, 오잉스 밀스)을 사용하여 검출하였다.
PBS 중 HFE 1 μg/ml로 코팅된 맥시소르프 플레이트에서 4℃에서 밤새 HFE-TfR 결합 ELISA를 수행하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, PBS 중 슈퍼블록 차단 완충제 (써모 사이언티픽, 뉴햄프셔주 허드슨)를 사용하여 차단시켰다. 인간 TfR의 적정 (100 ug/ml에서 시작, 1:3 연속 희석물)을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 1μg/ml의 hu15G11.v5, hu7A4.v15 또는 hu7G7.v1을 플레이트에 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 1:1000 희석된 HRP-염소-항 인간 Fcγ (잭슨 이뮤노리서치)를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, TMB 기질 (바이오FX 래보러토리즈, 오잉스 밀스)을 사용하여 검출하였다. PBS 중 HFE 1 μg/ml로 코팅된 맥시소르프 플레이트에서 4℃에서 밤새 HFE-TfR 차단 ELISA를 수행하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, PBS 중 슈퍼블록 차단 완충제 (써모 사이언티픽, 뉴햄프셔주 허드슨)를 사용하여 차단시켰다. 눈크(NUNC)™ 플레이트에서, hu7A4.v15, hu15G11.v5, Tf 경쟁 항체, 인간 홀로-Tf 및 대조군 IgG의 적정 (모든 항체의 경우에 400μg, 홀로 트랜스페린의 경우에 8000μg/ml, 1:3 연속 희석물)을 2 μg/ml 비오티닐화 인간 TfR과 조합하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 혼합물을 HFE 코팅된 플레이트에 1시간 동안 실온에서 참가하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 1:1000 희석된 HRP-스트렙타비딘 (서던바이오테크(SouthernBiotech), 버밍햄)을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 플레이트에 결합된 비오티닐화 인간 TfR을 TMB 기질 (바이오FX 래보러토리즈, 오잉스 밀스)을 사용하여 검출하였다.
TfR에 대한 이들 인간화 변이체의 결합은 6.3 μM 홀로-Tf의 존재에 의해 영향을 받지 않은 반면에, TfR 상의 Tf 결합 부위에 결합하는 Tf 경쟁 항체의 결합은 억제되었다 (도 5). 또한, 인간화 7A4.v15, 15G11.v5 및 7G7.v1은 여전히 HFE 포획된 huTfR에 결합할 수 있었고, 이는 이들이 고정된 HFE에 대한 huTfR의 결합에 영향을 미치지 않음을 나타낸다 (도 6a). 관련 실험에서, 7A4.v15 및 15G11.v5는 비오티닐화 TfR을 고정된 HFE에의 결합으로부터 차단하지 않았다. 대조적으로, 이러한 상호작용은 Tf 경쟁 항체 및 홀로 Tf에 의해 차단되었다 (도 6b). HFE 및 Tf는 TfR 상에서 유사한 에피토프를 공유하는 것으로 공지되어 있다 (Bennet et al., Nature (2000) 403, 46-53).
고정된 15G11v.5 및 항-TfRC12에 대해 비오티닐화 인간 TfR ECD 또는 인간 TfR 정단 도메인을 디스플레이하는 1가 M13 파지에 대한 결합을 평가하였다. 항-TfRC12는 인간 TfR ECD에 대해 패닝된 합성 항체 파지 라이브러리로부터 유래되었고, 인간 TfR 상의 트랜스페린 결합과 경쟁하는 부위에 결합한다. 항체를 맥시소르프 플레이트 상에 PBS 중 1 μg/ml로 코팅하였다. 결합된 비오티닐화 인간 TfR ECD 또는 TfR-정단 도메인 파지를 각각 HRP-스트렙타비딘 (지이 헬스 케어, RPN 4401V) 또는 HRP-항-M13 (지이 헬스 케어, 27-9421-01)으로 검출하였다. 도 25는 15G11v.5가 인간 TfR 정단 도메인에 결합함을 제시한다. 15G11v.5 결합 부위는 TfR 리간드 결합 부위와 떨어진 부위인 정단 도메인에 대해 맵핑되었다.
실시예 2: 친화도 조작 인간/시노 교차-반응성 항-TFR 항체
상기 기재된 인간화 변이체에 더하여, 추가의 친화도 조작된 변이체를 제조하였다. 15G11.v5 및 7A4.v15의 친화도 조작이 본원에 예시된다. 친화도 변이체는 표준 기술을 사용하여 CDR-L3 또는 CDR-H3에서 개별 알라닌 치환을 행함으로써 생성하였다. 이들 변이체를 IgG로서 ELISA 및 SPR에 의해 스크리닝하여 인간 및 시노 TfR에의 결합을 위해 중요한 위치를 식별하고; Fab로서 선택된 변이체의 1가 친화도를 또한 결정하였다. Ala 스캔 변이체 IgG 또는 Fab를 293 세포에서 발현시키고, 인간 또는 시노 TfR에 대한 결합을 PBS 중 염소 항-인간 Fcγ (잭슨 이뮤노리서치) 1.8 μg/ml로 코팅된 맥시소르프 플레이트에서 4℃에서 밤새 ELISA에 의해 정량화하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, PBS 중 슈퍼블록 차단 완충제 (써모 사이언티픽, 뉴햄프셔주 허드슨)를 사용하여 차단시켰다. 발현된 IgG를 함유하는 상청액을 연속적으로 1:5 희석시키고, 플레이트에 1시간 동안 첨가하였다. 정제된 hu15G11.v5 또는 hu7A4.v15를 표준으로서 사용하였다 (1 ug/ml에서 시작하여 1:5 희석됨). 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 1:1000 희석된 HRP-염소-항 카파 (서던 바이오테크)를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, TMB 기질 (바이오FX 래보러토리즈, 오잉스 밀스)을 사용하여 검출하였다. 또한 결합을 상기 기재된 바와 같이 SPR에 의해 평가하였다. 결과를 도 7a (15G11.v5 변이체) 및 7b (7A4.v15 변이체)에 제시한다.
CDR-L1, CDR-L2, CDR-H1 및 CDR-H2 내의 위치에서 개별 알라닌 치환을 갖는 추가의 15G11.v5 변이체를 또한 생성하고, 발현시키고, ELISA에 의해 인간 및 시노 TfR에의 결합에 대해 제1 스크리닝하였다 (표 6). PBS 중 정제된 인간 또는 시노 TfR 2 μg/ml로 코팅된 맥시소르프 플레이트에서 4℃에서 밤새 Hu/Cy 결합 ELISA를 수행하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, PBS 중 슈퍼블록 차단 완충제 (써모 사이언티픽, 뉴햄프셔주 허드슨)를 사용하여 차단시켰다. 발현된 Ala 스캔 변이체 IgG를 함유하는 세포 배양 상청액을 1:5 연속 희석시키고, 웰에 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 1:1000 희석된 HRP-염소-항 인간 Fcγ (잭슨 이뮤노리서치)를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, TMB 기질 (바이오FX 래보러토리즈, 오잉스 밀스)을 사용하여 검출하였다.
<표 6> hu15G11.v5 IgG Ala 변이체의 ELISA 분석
Figure 112015123222158-pct00007
이어서 선택된 변이체를 정제하고, 인간 또는 시노 TfR에 대한 그의 1가 친화도를 SPR에 의해 평가하였다 (표 7).
<표 7> 선택 15G11.v5 Fab 알라닌 변이체의 1가 SPR 분석
Figure 112015123222158-pct00008
실시예 3: 이중특이적 항-인간 TfR 항체 구축 및 시험관내 분석
특정의 상기 항체 변이체를 BACE1에 특이적으로 결합하는 제2 아암을 갖는 이중특이적 항체로서 재포맷하였다. 항-인간 TfR 항체 Hu15G11.v5, Hu15G11.LC92A, Hu15G11.HC52A 및 Hu15G11.HC53A를 사용하여 '노브 인 홀' 이중특이적 항체 구축 기술을 사용하여 이중특이적 TfR 결합 아암을 조작하였다 (Carter, P. (2001) J. Immunol. Methods 248, 7-15; Ridgway, J. B., Presta, L. G., and Carter, P. (1996) Protein Eng. 9, 617-621; Merchant, A. M., Zhu, Z., Yuan, J. Q., Goddard, A., Adams, C. W., Presta, L. G., and Carter, P. (1998) Nat. Biotechnol. 16, 677-681; Atwell, S., Ridgway, J. B., Wells, J. A., 및 Carter, P. (1997) J. Mol. Biol. 270, 26-35). 항-TfR (홀) 및 항-BACE1 (노브)에 대한 Fc에서의 노브 및 홀 돌연변이에 더하여, 모든 절반-항체는 Fc 영역에서 이펙터 기능을 없애는 돌연변이를 함유하였고 (N297G), Hu15G11.v5 및 Hu15G11.LC92A는 이펙터 기능을 없애는 추가의 Fc 돌연변이를 함유하였다 (D265A). 노브 및 홀 절반-항체를 이. 콜라이로부터 개별적으로 정제하고, 항-TfR 동종이량체의 형성을 방지하기 위해 1:1.1 비의 항-TfR로 조합하였다. 이중특이적 항체의 어셈블리는 항체에 대해 100x 비의 환원 글루타티온 및 200 mM 아르기닌 pH 8.0을 함유하는 완충제 중에서 실온에서 적어도 3일 동안의 환원 어닐링에 의해 완료하였다. 어셈블리에 이어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 이중특이적 항체를 정제하였다. 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법 및 SDS-PAGE에 의해 어셈블리를 확인하였다. 정제된 항체는 크기 배제 및 다중 각도 레이저 광 분광분석법에 의해 균질하고 단분산인 것으로 확인되었다.
생성된 이중특이적 항체를 15G11.v5 (항-TfR1), 15G11.W92A (15G11.LC92A 또는 항-TfR2), Hu15G11.N52A (항-TfR52A) 및 Hu15G11.T53A (항-TfR53A)라 부른다. 인간 및 시노 TfR에 대한 1가 친화도 및 동역학은 상기와 같이 SPR에 의해 115G11.v5 및 115G11.W92A에 대해 결정하였다 (표 9 참조). 항-TfR1 및 항-TfR2는 항-TfRA 및 항-TfRD가 마우스 TfR에 결합하는 것과 유사한 1가 결합 친화도를 보유하였다 (문헌 [Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sci. Transl. Med. 25 May 2011: Vol. 3, Issue 84, p. 84ra44] 참조).
<표 8> 15G11.v5 (TfR1) 및 15G11.W92A (LC92A, TfR2)의 1가 SPR 분석
Figure 112015123222158-pct00009
추가로, 항-TfR1, 항-TfR2, Hu15G11.N52A 및 Hu15G11.T53A 이중특이적 항체의 결합 친화도를 이전에 기재된 바와 같이 SPR에 의해 인간 및 시노 TfR에 대해 측정하였다. 하기 표 9에 제시된 바와 같이, 항-TfR52A 및 항-TfR53A는 인간 및 시노 TfR에 대해 TfR1h15G11.v5 및 TfR2LC92A 사이의 결합 친화도를 가졌다.
<표 9>
Figure 112015123222158-pct00010
실시예 4: 인간 적백혈병 세포주 및 1차 골수 단핵 세포에 대한 이펙터-함유 및 무이펙터 단일특이적 및 이중특이적 항체의 영향
마우스에서의 이전 연구는 이펙터 기능 및/또는 보체 결합 능력을 갖는 뮤린 TfR에 결합하는 항체가 TfR-발현 망상적혈구를 선택적으로 고갈시키는 것으로 결정하였다. 마우스 연구에서 관찰된 고갈이 뮤린 시스템에 고유한 것인지 여부를 확인하기 위해, 인간 TfR에 결합하는 항-TfR을 사용하여 추가의 실험을 수행하였다.
이펙터 세포로서 건강한 인간 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여 ADCC 검정을 수행하였다. 인간 적백혈병 세포주 (HEL, ATCC) 및 1차 인간 골수 단핵 세포 (올셀즈, 인크.(AllCells, Inc.))를 표적 세포로서 사용하였다. FcγRIIIA 내 잔기 158 위치에서의 동종이형 차이로 인해 잠재적으로 발생할 수 있는 공여자-간 가변성을 최소화하기 위해, 제1 실험 세트에서 혈액 공여자를 이형접합 RcγRIIIA 유전자형 (F/V158)을 보유하는 이로 제한하였다 (도 8a-b). 제2 실험 세트 (도 9a-b)의 경우에는, F/V158 유전자형 또는 FcγRIIIA V/V158 유전자형을 보유하는 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC와 함께, 오직 HEL 세포만을 표적 세포로서 사용하였다. 증가된 NK 세포-매개 ADCC 활성과의 공지된 연관성 뿐만 아니라 IgG4 항체에 결합하는 능력으로 인해 V/V158 유전자형을 또한 본 검정에 포함시켰다 (Bowles and Weiner, 2005; Bruhns et al. 2008). 바이-셀(Vi-CELL)® (베크만 쿨터(Beckman Coulter); 캘리포니아주 풀러턴)에 의해 제조업체의 지침에 따라 세포를 계수하고 생존율을 결정하였다.
유니-셉(Uni-Sep)™ 혈액 분리 튜브 (아큐레이트 케미칼 & 사이언티픽 코포레이션(Accurate Chemical & Scientific Corp.); 뉴욕주 웨스트베리)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리하였다. 50 μL의 검정 배지 (1% BSA 및 100 단위/mL 페니실린 및 스트렙토마이신 함유 RPMI-1640) 중 표적 세포를 96-웰, 둥근-바닥 플레이트에 4 x 104개/웰로 시딩하였다. 시험 및 대조군 항체의 연속 희석물 (50 μL/웰)을 표적 세포를 함유하는 플레이트에 첨가한 후, 37 C에서 5% CO2 하에 30분 동안 인큐베이션하여 옵소닌화되게 하였다. 총 10개의 데이터 포인트를 위해 5-배 연속 희석 후의 항체의 최종 농도는 0.0051 내지 10,000 ng/mL 범위였다. 인큐베이션 후에, 25:1 이펙터:표적 세포의 비를 제공하도록 100 μL의 검정 배지 중 1.0 x 106개의 PBMC 이펙터 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말미에 플레이트를 원심분리하고, 세포독성 검출 키트™ (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Scinece); 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 활성에 대해 상청액을 시험하였다. LDH 반응 혼합물을 상청액에 첨가하고, 일정하게 진탕시키면서 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 1 M H3PO4로 반응을 종결시키고, 스펙트라맥스 플러스(SpectraMax Plus) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다 (650 nm에서 측정된 배경을 각각의 웰에 대해 차감함). 표적 세포만을 함유하는 웰의 흡광도는 배경에 대한 대조군으로서의 역할을 하였고 (저 대조군), 한편 트리톤-X100으로 용해된 표적 세포를 함유하는 웰은 이용가능한 최대 신호를 제공하였다 (고 대조군). 항체-비의존성 세포성 세포독성 (AICC)을 항체의 첨가 없이 표적 및 이펙터 세포를 함유하는 웰에서 측정하였다. 구체적 ADCC의 정도는 하기와 같이 계산하였다:
Figure 112015123222158-pct00011
샘플 희석물의 ADCC 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, 소프트맥스 프로(SoftMax Pro)를 사용하여 용량-반응 곡선을 4-파라미터 모델에 피팅하였다.
제1 실험 세트에서, 인간 적백혈병 세포주 (HEL 세포) 또는 1차 인간 골수 단핵 세포를 표적 세포로서 사용하여 다양한 항-인간 TfR 구축물의 ADCC 활성을 평가하였다. 항-gD WT IgG1을 음성 대조군으로서 및 뮤린 항-인간 HLA (부류 I)를 양성 대조군으로서 사용하여, 2가 IgG1 이펙터 기능-적격 항-인간 TfR1 항체 15G11, 및 이펙터 기능을 없애기 위해 D265A 및 N297G 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 포맷의 항-BACE1 아암을 갖는 이러한 항체의 이중특이적 형태 (실시예 3 참조)를 ADCC 검정에서 다양한 농도에서 시험하였다. 결과를 도 8a 및 8b에 제시한다. 표적으로서 HEL 세포 (도 8a) 또는 표적으로서 골수 단핵 세포 (도 8b)로, 단일특이적 이펙터 양성 항-인간 TfR 항체 15G11은 유의한 ADCC 활성을 도출하였다. 이러한 활성은 HEL 세포에 대해서는 양성 대조군 항-인간 HLA 항체의 활성과 유사하였고, 골수 단핵 세포에 대해서는 강건하지만 양성 대조군보다 낮은 수준이었다. 골수 단핵 세포 실험에서 관찰된 다소 더 낮은 수준은 실험에 사용된 골수 및 적혈구 계통 PBMC 세포의 이종 혼합물의 부분만이 높은 수준의 TfR을 발현하는 반면에, HEL 세포는 클론 세포 집단 전반에 걸쳐 일관되게 높은 TfR 발현을 갖는다는 사실로 인한 것일 수 있다. 선명하게 대조적으로, 이중특이적 무이펙터 항-인간TfR/BACE1 항체는 HEL 또는 골수 단핵 세포에서 음성 대조군과 유사하게 어떠한 ADCC 활성도 디스플레이하지 않았다.
제2 실험 세트에서, 본 검정 시스템에서 항체 이소형을 스위칭하는 것의 영향을 평가하였다. 모든 표적 세포가 HEL 세포이고, 이펙터 세포는 이형접합 FcγRIIIa-V/F158 유전자형 또는 동형접합 FcγRIIIa-V/V158 유전자형을 보유하는 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC라는 것을 제외하고, ADCC 검정 절차는 상기 기재된 것과 동일하였다. 시험된 모든 항-인간 TfR은 항-gD와 함께 3종의 상이한 Ig 백본: 야생형 인간 IgG1, N297G 돌연변이를 갖는 인간 IgG1, 및 인간 IgG4에 관하여 이중특이적이었다. 인간 IgG4 백본을 갖는 항-A베타 항체를 또한 시험하였고, 마우스 항-인간 HLA (부류 I)가 양성 대조군으로서 역할을 하였다. 결과를 도 9a 및 9b에 제시한다. 이펙터 세포 활성화와 V/V158 유전자형 사이의 공지된 연관성 (Bowles and Weiner 2005)에 기초하여 예상되는 바와 같이, ADCC 활성은 F/V158 공여자 (~ 25%의 표적 세포가 영향을 받음)와 비교하여 V/V158 공여자 PBMC (~ 45%의 표적 세포가 영향을 받음)에 의해 보다 강건하게 도출되었다 (도 9a 대 도 9b 비교). 제1 실험 세트로부터의 결과를 되풀이하여, 야생형 IgG1에 의해 항-TfR/gD는 HEL 세포에서 강건한 ADCC를 유도한 반면에, 무이펙터 IgG1에 의해 항-TfR/gD는 HEL 세포에서 어떠한 ADCC 활성도 나타내지 않았다. 명백하게, 100 ng/mL 이상의 농도에서, IgG4 이소형의 항-TfR/gD는 온화한 ADCC 활성을 나타내었다. 이러한 활성은 항-A베타 IgG4 결과에서 관찰되지 않았고, 이는 TfR 결합이 ADCC 활성에 요구됨을 나타낸다. 이러한 발견은 IgG4가 최소이지만 측정가능한 이펙터 기능을 갖는다는 이전의 보고 (Adolffson et al., J. Neurosci. 32(28):9677-9689 (2012); van der Zee et al. Clin Exp. Immunol. 64: 415-422 (1986)); Tao et al., J. Exp. Med. 173:1025-1028 (1991))와 상호관련된다.
실시예 5: 이중특이적 항-인간 TfR/BACE1 이중특이적 항체의 생체내 평가
A. 약동학적, 약역학적 및 안전성 연구
이중특이적 항-인간 TfR 항체의 약물 농도, 약역학적 효과 및 안전성을 생체내 평가하기 위해, 이전 실시예에서 사용된 동일한 항-BACE1 아암과 쌍형성된 항-TfR 항체 클론 15G11 (항-TfR1/BACE1), 또는 이전 실시예에서 사용된 동일한 항-BACE1 아암과 쌍형성된 클론 15G11.LC92A (항-TfR2/BACE1) 또는 Hu15G11.N52A (항-TfR52A/BACE1) 및 Hu15G11.T53A (항-TfR53A/BACE1)를 사용하여 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))에게 이중특이적 항체를 투여하였다. 이들 이중특이적 항체는 이전에 기재된 바와 같이 인간 IgG1 포맷으로, 이펙터 기능을 없애는 N297G 또는 D265A 및 N297G 돌연변이를 가졌다. 대조군으로서, 항-gD 분자를 인간 IgG1로 사용하였다. 이들 항-TfR 항체의 교차반응성은 비-인간 영장류 및 인간으로 제한되기 때문에 본 연구는 비-인간 영장류에서 수행하였다. 또한, 연구는 뇌척수액 (CSF)과 혈장 구획 사이의 약물 수송 메카니즘이 인간과 영장류 사이에 유사할 수 있음을 나타내었다 (Poplack et al., 1977). 항체를, 유치 거대 수조 카테터를 갖는 의식있는 시노몰구스 원숭이에게 30 mg/kg의 용량으로 복재 정맥 내로의 단일 정맥내 (IV) 볼루스 주사에 의해 투여하였다. 투여-후 최대 60일의 다양한 시점에서, 혈장, 혈청, 및 (CSF)를 샘플링하였다. 샘플 분석은 혈액학 (전혈), 임상 화학 (혈청), 항체 농도 (혈청 및 CSF) 및 항체에 대한 약역학적 반응 (혈장 및 CSF)을 포함하였다. 상세한 샘플링 계획에 대해서는 도 10을 참조한다.
시노몰구스 원숭이 혈청 및 CSF 내의 투여된 항체의 농도는 ELISA에 의해, 양 항-인간 IgG 원숭이 흡수 항체 코트를 사용하고, 이어서 혈청 샘플을 1:100의 희석에서 시작하여 첨가하고, 검출을 위해 양고추냉이 퍼옥시다제 원숭이 흡착에 접합된 염소 항-인간 IgG 항체를 첨가함으로써 마무리하여 측정하였다. 검정은 0.78-50 ng/mL의 표준 곡선 범위 및 0.08 μg/mL의 검출 한계를 가졌다. 이러한 검출 한계 미만의 결과는 보고가능한 것 미만 (LTR)으로서 보고하였다.
도 11a-b는 항-TfR1/BACE1 및 항-TfR2/BACE1에 대한 약동학적 분석의 결과를 제시한다. 항-gD에 대한 약동학적 프로파일은 평균 클리어런스가 3.98 mL/일/kg으로, 시노몰구스 원숭이에서 전형적인 인간 IgG1 항체에 대해 예상되는 것이었다. 둘 다의 항-TfR/BACE1 항체는 항-gD보다 신속하게 클리어되었고, 이는 아마도 말초 표적-매개 클리어런스로 인한 것일 것이다. 항-TfR1/BACE1은 TfR에 대해 가장 높은 결합 친화도를 갖는다는 것과 일치되게 가장 신속한 클리어런스를 가진 반면에, 항-TfR2/BACE1은 항-TfR1/BACE1과 비교하여 개선된 약동학적 프로파일 (즉, 혈청 중 지속 노출)을 나타내었고, 이는 아마도 TfR에 대한 그의 감소된 친화도로 인한 것일 것이다. 항-TfR1/BACE1 및 항-TfR2/BACE1에 대한 클리어런스는 각각 18.9 mL/일/kg 및 8.14 mL/일/kg이었다. 모든 항체는 CSF에서 혈청 농도의 대략 1-천분의 1로 검출되었다. 그러나, 분자 전반에 걸쳐 높은 가변성이 존재하였고, 전체적으로 CSF 항체 농도에서 어떠한 검출가능한 차이도 존재하지 않았다.
<표 10> 시노몰구스 원숭이 (n=5)에서 30 mg/kg으로의 단일 IV 볼루스 용량 투여 후의 모든 시험 항체에 대한 평균 (± SD) PK 파라미터 추정치
Figure 112015123222158-pct00012
도 19는 항-TfR1/BACE1, 항-TfR52A/BACE1 및 항-TfR53A/BACE1에 대한 약동학적 분석의 결과를 제시한다. 모든 항-TfR/BACE1 항체는 항-gD보다 신속하게 클리어되었고, 이는 아마도 말초 표적-매개 클리어런스로 인한 것일 것이다. 항-TfR1/BACE1은 TfR에 대해 가장 높은 결합 친화도를 갖는다는 것과 일치되게 가장 신속한 클리어런스를 가진 반면에, 항-TfR52A/BACE1 및 항-TfR53A/BACE1은 항-TfR1/BACE1과 비교하여 개선된 약동학적 프로파일 (즉, 혈청 중 지속 노출)을 나타내었고, 이는 아마도 항-TfR52A/BACE1 및 항-TfR53A/BACE1의 TfR에 대한 감소된 친화도로 인한 것일 것이다.
항-TfR/BACE1 투여에 대한 반응으로 약역학적 효과를 관찰하기 위해, 본 발명자들은 시노몰구스 원숭이 혈장 및 CSF에서 A베타1 -40 및 sAPPα 및 sAPPβ 수준을 측정하였다. A베타1 -40은 ELISA에 의해, 항-A베타1 -40 특이적 폴리클로날 항체 코트를 사용하고, 이어서 샘플을 첨가하고, 검출을 위해 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 마우스 항-인간 A베타1 -40 모노클로날 항체를 첨가함으로써 마무리하여 측정하였다. 검정은 혈장의 경우에 60 pg/mL 및 CSF의 경우에 140 pg/mL의 검출 한계를 가졌다. 이러한 농도 미만의 결과는 보고가능한 것 미만 (LTR)으로서 보고하였다. sAPPα 및 sAPPβ의 CSF 농도를 sAPPα/sAPPβ 멀티-스팟 검정 (메조스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery) (메릴랜드주 게이더스버그))을 사용하여 결정하였다. CSF를 빙상에서 해동시킨 다음, TBS-T (10 mM 트리스 완충제, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈-20) 중 1% BSA로 1:10으로 희석시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 검정을 수행하였다. 검정은 sAPPα의 경우에 0.05 ng/ml 및 sAPPβ의 경우에 0.03 ng/mL의 정량 하한치 값을 가졌다.
도 12a-e는 항체의 약역학적 행동을 요약하였다. 말초에서, 혈장 A베타1 -40 수준은 항-gD 투여 후에 변화없이 유지되었지만, 항-TfR/BACE1 투여 후에는 일시적으로 감소되었다. 둘 다의 변이체는 혈장 A베타1 -40 수준을 감소시켰고, 50% 최대 억제는 투여-후 제1일에 달성되었다. 혈장 A베타1 -40 수준은 서서히 회복되었고, 항-TfR1/BACE1이 제공된 동물은 투여-후 제14일 쯤에 기준선 A베타1 -40 수준으로 복귀되었다. 항-TfR2/BACE1로 처리된 동물에서 A베타1 -40 수준은 투여-후 제21일 및 제30일 사이에 기준선 수준으로 복귀되었다. 둘 다의 항-TfR/BACE1 항체는 CSF A베타1-40 수준을 감소시켰고, 항-gD 투여된 동물에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 항-TfR1/BACE1 투여는 CSF A베타1 -40 수준에서 항-TfR2/BACE1의 그것보다 (기준선의 평균 최대 억제 20%) 더 유의한 감소를 야기하였다 (기준선의 평균 최대 억제 50%). sAPPβ 생산은 항-TfR/BACE1 처리된 동물에서 억제되었지만, 항-gD를 제공받은 동물에서는 그렇지 않았다. Aβ40에 대한 결과와 유사하게, 항-TfR1/BACE1는 항-TfR2/BACE1보다 sAPPβ 생산에 대해 더 강력한 억제 효과를 가졌다. sAPPα 생산은 BACE1 억제 동안 항-TfR1/BACE1 및 항-TfR2/BACE1 둘 다에 의해 자극되었고, 반응은 sAPPβ 및 A베타1 -40에 대해 관찰된 억제 수준과 역으로 상호관련되었다. SAPPα 및 sAPPβ는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 1차 프로세싱 산물이고, 그의 수준은 매우 상호관련된다. sAPPβ/sAPPα의 비는 기저 APP 발현에서의 잠재적 변화 또는 CSF 수집 및 연구 과정 전반을 다루는 것에서의 잠재적 사전분석 차이에 대한 결과를 정규화한다. 항-TfR1/BACE1에 의한 CSF sAPPβ/sAPPα의 비는 항-TfR2/BACE1보다 강건한 PD 효과를 입증하였다. 따라서, 이들 결과는 항-TfR/BACE1 항체에 의한 표적 (즉, BACE1) 연관을 지지한다.
항-TfR52A/BACE1 및 항-TfR53A/BACE1에 대한 PD 반응도 또한 항체 노출의 지속시간과 상호관련되었고, 감소된 친화도 TfR 아암은 Aβ40에서의 증가된 감소를 제시하였다 (데이터는 제시되지 않음). 이들 데이터는 또한 이들 이중특이적 항체에 의한 표적 연관을 지지한다.
전체적으로, 이들 결과는 항-TfR1/BACE1 및 항-TfR2/BACE1의 그것 사이의 인간 TfR에 대한 친화도를 갖는 이중특이적 항-TfR/BACE1 항체가 아마도 바람직한 약동학적/약역학적 균형을 가질 것임을 시사한다.
본 연구에서는 어떠한 안전성 신호도 관찰되지 않았다. 투여-후 최대 60일까지 투여된 임의의 이중특이적 항체를 30 mg/kg으로 제공받은 원숭이의 임의의 혈액학 또는 임상 화학 파라미터에 대한 어떠한 분명한 효과도 존재하지 않았다. 중요한 것은, 항-TfR1/BACE1 또는 항-TfR2/BACE1 항체가 이펙터 기능이 손상되었고, 높은 TfR 수준을 갖는 순환 초기 망상적혈구의 전체 수준은 정상 영장류에서 매우 낮기 때문에 (실시예 4 참조) 예상되는 바와 같이 망상적혈구 수준은 이들 항체로의 처리에 의해 영향을 받지 않았다 (도 13).
실시예 6: 이중특이적 항-인간 TfR/BACE1 이중특이적 항체의 생체내 평가
CSF에서의 항체 약역학과 뇌에서의 약동학 사이의 관계를 조사하기 위해, 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에게 이전 실시예에서와 같이 이중특이적 항체 항-TfR1/BACE1 또는 항-TfR2/BACE1을 투여하였다. 이들 이중특이적 항체는 인간 IgG1 포맷으로, 이펙터 기능을 없애는 D265A 및 N297G 돌연변이를 가졌다. 대조군으로서, 항-gD 분자를 인간 IgG1로 사용하였다. 비교를 위해, 본 발명자들은 또한 이중특이적 항체를 위해 사용된 동일한 클론인 2가 항-BACE1 항체를 투여하였다. 항체를, 유치 거대 수조 카테터를 갖는 의식있는 시노몰구스 원숭이에게 30 mg/kg의 용량으로 복재 정맥 내로의 단일 정맥내 (IV) 볼루스 주사에 의해 투여하였다. 투여 전 24시간 및 48시간에 기준선 CSF 샘플을 수집하고, 투여-후 24시간에 또 다른 CSF 샘플을 수집하였다 (도 14에서 개략적으로 제시된 바와 같음). 투여-후 24시간에 CSF 수집 후, 동물을 염수로 관류시키고, 항체 농도의 분석을 위해 뇌를 수거하였다. 상이한 뇌 영역을 완전 미니 EDTA-무함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))를 함유하는 PBS 중의 1% NP-40 (칼-바이오켐(Cal-Biochem)) 중에서 균질화하였다. 균질화된 뇌 샘플을 4℃에서 1시간 동안 회전시킨 후 14,000 rpm에서 20분 동안 스피닝시켰다. 상청액을 단리하여 이전 실시예에 기재된 ELISA 방법을 사용하여 뇌 항체를 측정하였다. 또한 혈액을 수집하여 말초 노출 및 약역학적 반응을 확인하였고, 이는 실시예 5에서의 본 발명자들의 관찰과 유사하였다.
CSF에서 평가된 바와 같은 항-TfR1/BACE1 및 항-TfR2/BACE1의 약역학적 효과는 또한 이전 실시예에서 관찰된 것과 유사하였다. 도 15는 CSF sAPPβ/sAPPα의 비가 항-TfR1/BACE1의 투여 후에 강건하게 감소되었음을 입증하였다. 항-TfR2/BACE1은 본 연구에서 투여-후 24시간에 분명한 감소를 나타내지 않았다. 항-BACE1도 또한 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 항체의 뇌 농도의 분석은 대조군 IgG 및 항-BACE1 항체 둘 다가 본 발명자들의 검정에서 검출을 간신히 초과하는 수준으로 (평균 ~670 pM) 뇌로의 제한된 흡수를 가짐을 밝혀내었다. 항-TfR2/BACE1은 대조군 IgG보다 ~3-배 개선된 뇌 흡수 (평균 ~2 nM)를 가졌고, 항-TfR1/BACE1은 대조군 IgG보다 ~15-배 더 큰 (평균 ~10 nM) 최대 뇌 흡수를 가졌다. 항-TfR1/BACE1이 최대 뇌 흡수 및 가장 강건한 약역학적 효과를 갖고, 항-TfR2/BACE1이 보다 낮은 뇌 흡수 및 보다 약간의 효과를 가져, 상이한 항체에 대한 뇌 항체 농도는 본 발명자들의 연구에서 CSF에서 관찰된 약역학적 반응과 상호관련되었다.
이들 결과는 TfR-결합 이중특이적 항체가 비-인간 영장류의 뇌에서 흡수를 개선시킴을 입증한 본 발명자들의 이전 발견을 확장시켰다. 마우스에서와 같이 영장류에서, 뇌 흡수 및 TfR-매개 클리어런스의 최대 균형을 이루는 TfR에 대한 최적 친화도가 아마도 존재할 것이다. 본 발명자들의 실시예에서, 보다 높은 친화도의 항-TfR1/BACE1은 양호한 뇌 흡수를 입증하였고, 이는 말초 표적-매개 클리어런스에 의해 영향을 받았다. 감소된 친화도의 TfR2/BACE1은 개선된 클리어런스 특성을 가졌지만, TfR에 의해 효율적으로 수송될 수 없게 하는 TfR에 대해 이러한 낮은 결합을 갖는 것으로 보였다 (매우 동일한 방식으로 US2012/0171120의 최저-친화도 항-TfR 항체 TfRE는 TfR이 전위 과정을 시작함에 따라 항체가 TfR과 회합된 채로 남아있게 할, 항체와 TfR 사이의 충분한 상호작용을 허용하기에는 너무 낮은 친화도를 초과하는 약간의 친화도 역치를 넘음). 본 실험의 결과로부터, TfR1 및 TfR2의 그것 사이의 TfR에 대한 친화도를 갖는 항-인간/시노 TfR/BACE1 이중특이적 항체가 본 시스템에서 항-TfR1/BACE1 또는 항-TfR2/BACE1보다 개선된 흡수 및 클리어런스 특성을 가질 것으로 예측될 것이다.
실시예 7: 이중특이적 트랜스페린 수용체 항체와 관련하여 추가의 무이펙터 돌연변이의 생성
N297G 및 D265A에 더하여 이펙터 기능을 없애는 Fc 영역에서의 다른 돌연변이에 대해 TfR-발현 망상적혈구의 고갈을 감소시키거나 방지하는 그의 능력을 시험하였다. 구체적으로, 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 공개 번호 2012/0251531에 기재되어 있는 Fc 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G ("LALAPG")를 항-TfRD/BACE1 항체에 혼입시켰다 (이는 국제 출원 공개 번호 WO 2013/177062에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참조로 포함됨).
마우스에서 단일 항체 투여 후의 약동학적 분석 및 망상적혈구 계수를 하기와 같이 수행하였다. 야생형 암컷 C57B/6 마우스 6-8주령을 모든 연구에 사용하였다. 동물의 관리는 협회 가이드라인에 따랐다. 마우스에게 LALAPG 돌연변이를 갖는 항-gD 항체 (뮤린 IgG2a) 또는 LALAPG 돌연변이를 갖는 항-TfRD/BACE1 항체 (래트/뮤린 키메라)를 단일 50mg/kg 용량으로 정맥내 투여하였다. 총 주사 부피는 250μL를 초과하지 않았고, 항체는 필요할 경우에 D-PBS 중에 희석시켰다 (인비트로젠). 24시간 후에, 전혈을 수집한 후 EDTA 마이크로테이너 튜브 (BD 다이아그노스틱스(BD Diagnostics)) 내에서 관류시키고, 30분 동안 실온에서 가라앉게 두고, 5000x g에서 10분 동안 스피닝시켰다. 혈장의 상부 층을 새로운 튜브로 옮겨 항체를 측정하였다.
마우스 혈장 내 총 항체 농도는 항-마우스 IgG2a (동종이형 a)/ 항-마우스 IgG2a (동종이형 a) ELISA를 사용하여 측정하였다. 눈크 384-웰 맥시소르프 이뮤노플레이트 (넵튠, 뉴저지)를 마우스 항-마우스 IgG2a 동종이형 A, 동종이형 A 특이적 항체 (BD/파밍겐(Pharmigen), 캘리포니아주 산호세)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS, 0.5% BSA로 25℃에서 1시간 동안 차단시켰다. 각각의 항체 (항-gD 및 항-TfR/BACEl 이중특이적 변이체)를 각각의 항체 농도를 정량화하기 위한 표준으로서 사용하였다. 플레이트를 마이크로플레이트 세척제 (바이오-텍 인스트루먼츠, 인크.(Bio-Tek Instruments, Inc.), 버몬트주 위누스키)를 사용하여 PBS, 0.05% 트윈-20으로 세척하고, 0.5% BSA, 0.35 M NaCl, 0.25% CHAPS, 5 mM EDTA, 0.2% BgG, 0.05% 트윈-20 및 15 ppm 프로클린(Proclin)® (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 함유하는 PBS 중에 희석시킨 표준 및 샘플을 25℃에서 2시간 동안 첨가하였다. 결합된 항체를 비오틴-접합된 마우스 항-마우스 IgG2a 동종이형 A, 동종이형 A 특이적 항체 (BD/파밍겐, 캘리포니아주 산호세)로 검출하였다. 결합된 비오틴-접합된 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Helathcare Life Sciences), 펜실베니아주 피츠버그)으로 검출하였다. 3,3',5,5'- 테트라메틸 벤지딘 (TMB) (KPL, 인크., 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 샘플을 발색시키고, 멀티스캔 아센트(Multiskan Ascent) 판독기 (써모 사이언티픽, 뉴햄프셔주 허드슨) 상에서 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 4-파라미터 비-선형 회귀 프로그램을 사용하여 표준 곡선으로부터 농도를 결정하였다. 검정은 혈장에서 78.13 ng/ml의 보다 낮은 정량 하한치 (LLOQ) 값을 가졌다. 실험 군들 사이의 차이의 통계적 분석은 2-꼬리 독립표본 t-검정을 사용하여 수행하였다.
Fc LALAPG 돌연변이를 함유하는 항-TfRD/BACE1 항체의 투여 시, 마우스는 완전 이펙터 기능을 갖는 항체를 사용하여 이전에 관찰된 것과 같은 어떠한 임상 증상도 디스플레이하지 않았다. 문헌 [Couch et al., Sci. Trans. Med. 5:183ra57 (2013)]을 참조한다. 도 20은 약동학적 분석의 결과를 제시한다.
추가로, 시스멕스(Sysmex) XT2000iV (시스멕스, 일본 고베)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 미성숙 및 총 망상적혈구 계수를 결정하였다. 투여 후 24시간에, 도 21에서 관찰되는 바와 같이 시험된 임의의 항체에 의한 미성숙 망상적혈구 분율 또는 총 망상적혈구 계수에서의 어떠한 관찰되는 차이도 존재하지 않았다. 이들 결과는 LALAPG 돌연변이가 항체 이펙터 기능을 없앨 뿐만 아니라 무이펙터 항체 프레임워크에 의해서도 관찰되는 보체 결합 및 보체-매개 망상적혈구 클리어런스를 감소시킴을 시사한다 (Couch et al. 2013). 이는 인간 IgG1에의 LALA 돌연변이의 혼입이 보체 결합을 제한할 수 있다는 또 다른 보고와 일치한다 (Hessell et al. Nature 449:101-104 (2007)).
실시예 8 - FcRn고 이중특이적 변이체의 생성
이중특이적 항체의 반감기를 증가시키고, 그에 의해 뇌 내의 항체의 농도를 잠재적으로 증가시키기 위해, IgG 불변 도메인에서, 구체적으로 Fc 수용체-신생아 (FcRn) 결합 도메인에서 돌연변이 (FcRn고 돌연변이)를 함유하는 이중특이적 변이체를 제조하였다. FcRn 결합 도메인은 항체의 모체-태아 전송과 관련된다. 문헌 [Story et al., J. Exp. Med., 180:2377 2381, 1994]을 참조한다. FcRn 결합 도메인에서의 아미노산 치환은 FcRn에 대한 불변 도메인의 친화도를 증가시키고, 그에 의해 항체의 반감기를 증가시킨다.
FcRn 결합 도메인 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E (YTE)는 FcRn 결합을 증가시켜 항체의 반감기를 증가시키는 것으로 기재되어 있다. 미국 공개 특허 출원 번호 2003/0190311 및 문헌 [Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-23524 (2006)]을 참조한다. 추가로, FcRn 결합 도메인 돌연변이 N434A 및 Y436I (AI)가 FcRn 결합을 또한 증가시키는 것으로 기재되어 있다. 문헌 [Yeung et al., J. Immunol. 182: 7663-7671 (2009)]을 참조한다. YTE (M252Y/S254T/T256E) 및 AI (N434/Y436I) 돌연변이를 WT 인간 IgG1 또는 무이펙터 LALAPG 또는 N297G 돌연변이를 함유하는 항-TfR52A/BACE1 및 항-TfR2/BACE1 이중특이적 항체 둘 다에 혼입시켰다. 또한, 대조군으로서 항-gD hIgG1 항체 내에 FcRn고 돌연변이를 제조하였다. 돌연변이는 쿤켈(Kunkel) 돌연변이 유발을 사용하여 구축하였고, 항체를 CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 단백질을 정제하였다.
FcRn에 대한 FcRn고 변이체 항체의 결합을 비아코아를 사용하여 측정하였다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 FcRn 단백질을 CHO에서 발현시키고, IgG 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 데이터는 비아코어 T200 기기 상에서 획득하였다. 시리즈 S 센서 칩 CM5 (지이 헬스케어, Cat. BR100530)를 EDC 및 NHS 시약으로 공급업체의 지침에 따라 활성화시키고, 항-Fab 항체 (인간 Fab 포획 키트, 지이 헬스 케어 바이오-사이언스. AB SE-75184, 스웨덴 웁살라)를 커플링시켜 대략 10,000 반응 단위 (RU)를 달성한 다음, 1 메탄올아민으로 미-반응 기를 차단시켰다. 친화도 측정을 위해, 먼저 항체를 10 μl/분 유량으로 주입하여 FC1 (참조)을 제외하고 3종의 상이한 유동 세포 (FC)에 대해 대략 1000 RU로 포획시키고, 이어서 pH6 완충제 (0.1M 인산나트륨) 중 인간 FcRn (또는 시노 FcRn)의 2-배 연속 희석물을 저 (1 nM)에서 고 (25 μM)로, 주입 사이에 어떠한 재생 없이 동일한 사이클에서 교대로 주입하였다 (유량: 30 μl/분). 센소그램을 기록하고, 참조 및 완충제 차감 후에, 비아코어 T200 평가 소프트웨어 (버전 2.0)을 사용하여 평가하였다. 1:1 결합 모델을 기반으로 하여 정상 상태에서의 결합 수준을 분석함으로써 친화도를 결정하였다. 항-TfR52A/BACE1의 LALAPG, N297G, LALAPG.YTE, 및 LALAPG.AI 변이체에 대한 결합 친화도를 하기 표 11에 제시한다. 데이터는 FcRn고 변이체가 엔도솜 (pH 6)에서 인간 및 시노 FcRn 둘 다에 대한 친화도를 증진시킴을 제시하였다.
<표 11>
Figure 112015123222158-pct00013
선택 FcRn고 변이체는 FcRn 친화도의 증진이 약동학적 특성을 개선시킬 수 있고/거나 항-TfR/BACE1 항체의 뇌 노출을 증가시킬 수 있는 여부를 결정하기 위해 시노몰구스 원숭이에서 시험될 것이다.
무이펙터 및 FcRn고 돌연변이의 안전성을 평가하기 위해, 특정 이중특이적 항체를 인간 트랜스페린 수용체를 발현하는 인간 트랜스페린 수용체 녹-인 마우스에게 투여하였다. huTfR 녹-인 마우스를 하기와 같이 생성하였다. 재조합조작의 조합 (Warming et al. Molecular and Cellular Biology vol. 26 (18) pp. 6913-22 2006; Liu et al. Genome Research (2003) vol. 13 (3) pp. 476-84) 및 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 인간 TFRC cDNA를 ES 세포 내 C57BL/6 Tfrc 유전자좌 내로 표적화하기 위한 구축물을 제조하였다.
간략하게, 마우스 Tfrc 유전자에 대한 짧은 상동성에 의해 플랭킹된 카세트 (인간 TFRC cDNA, SV40 pA, 및 frt-PGK-em7-Neo-BGHpA-frt)를 재조합조작에 의해 Tfrc C57BL/6J BAC (RP23 BAC 라이브러리)를 변형시키는데 사용하였다. 인간 TFRC cDNA 카세트를 내인성 ATG에서 삽입하고, Tfrc 엑손 2의 나머지 플러스 인트론 2의 시작점을 결실시켰다. 이어서 BAC 내의 표적화 영역을 ES 세포 표적화를 위한 상동성 아암으로서 플랭킹 게놈 Tfrc 서열과 함께 pBlight-TK 내로 복구시켰다 (Warming et al. Molecular and Cellular Biology vol. 26 (18) pp. 6913-22 2006). 구체적으로, 2950 bp 5' 상동성 아암은 (어셈블리 NCBI37/mm9): chr.16:32,610,333-32,613,282에 상응하고, 2599 bp 3' 상동성 아암은 chr.16:32,613,320-32,615,918에 상응한다. 최종 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
Tfrc/TFRC KI 벡터를 NotI로 선형화하고, 표준 방법을 사용하여 C57BL/6N C2 ES 세포를 표적화하였다 (G418 양성 및 간시클로비르 음성 선택). 양성 클론은 PCR 및 택맨 분석을 사용하여 식별하고, 변형된 유전자좌의 서열분석에 의해 확인하였다. 정확하게 표적화된 ES 세포를 Flpe 플라스미드로 형질감염시켜 Neo를 제거하고, 이어서 표준 기술을 사용하여 ES 세포를 배반포 내로 주입하였다. 생성된 키메라의 C57BL/6N 암컷 과의 교배 후에 배선 전이가 수득되었다.
구체적으로, 하기 표에 열거된 항체를 huTfR 녹-인 마우스에 단일 50mg/kg 용량으로 투여하고, 24시간 후에 혈액 및 망상적혈구를 채취하였다.
<표 12>
Figure 112015123222158-pct00014
항-TfR52A/BACE1 LALAPG, LALAPG/YTE 또는 LALAPG/AI 항체의 투여 후에 (표 12에서 군 3-5), 인간 TfR 녹-인 마우스는 완전 이펙터 기능을 갖는 항-TfR 항체를 사용하여 이전에 관찰된 바와 같은 (Couch et al. 2013) 어떠한 임상 증상 또는 망상적혈구 상실도 디스플레이하지 않았다 (도 22). 이들 결과는 인간 IgG1 프레임워크에 대한 LALAPG 돌연변이의 혼입이 또한 이펙터 기능을 없앤다는 것을 나타내고, 추가로 YTE 또는 AI FcRn고 돌연변이의 부가는 항체가 무이펙터가 되게 하는 LALAPG 돌연변이의 목적하는 특성을 방해하지 않음을 시사한다.
ADCC 검정을 또한 수행하여 인간-유래 세포주에서 LALAPG, LALAPG/YTE, 및 LALAPG/AI 돌연변이 조합의 무이펙터 상태를 확인하였다. 이전과 같이, 인간 적백혈병 세포주 (HEL, ATCC)를 F/V158 유전자형 또는 FcγRIIIA V/V158 유전자형을 보유하는 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC에 의한 표적 세포로서 사용하였다. 증가된 NK 세포-매개 ADCC 활성과의 공지된 연관성, 뿐만 아니라 IgG4 항체에 결합하는 능력으로 인해 V/V158 유전자형을 또한 본 검정에 포함시켰다 (Bowles and Weiner, 2005; Bruhns et al. 2008). 바이-셀® (베크만 쿨터; 캘리포니아주 풀러턴)에 의해 제조업체의 지침에 따라 세포를 계수하고 생존율을 결정하였다.
유니-셉™ 혈액 분리 튜브 (아큐레이트 케미칼 & 사이언티픽 코포레이션; 뉴욕주 웨스트베리)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리하였다. 50 μL의 검정 배지 (1% BSA 및 100 단위/mL 페니실린 및 스트렙토마이신 함유 RPMI-1640) 중 표적 세포를 96-웰, 둥근-바닥 플레이트에 4 x 104개/웰로 시딩하였다. 시험 및 대조군 항체의 연속 희석물 (50 μL/웰)을 표적 세포를 함유하는 플레이트에 첨가한 후, 37℃에서 5% CO2 하에 30분 동안 인큐베이션하여 옵소닌화되게 하였다. 총 10개의 데이터 포인트를 위해 5-배 연속 희석 후의 항체의 최종 농도는 0.0051 내지 10,000 ng/mL 범위였다. 인큐베이션 후에, 25:1 이펙터:표적 세포의 비를 제공하도록 100 μL의 검정 배지 중 1.0 x 106개의 PBMC 이펙터 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말미에 플레이트를 원심분리하고, 세포독성 검출 키트™ (로슈 어플라이드 사이언스; 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 활성에 대해 상청액을 시험하였다. LDH 반응 혼합물을 상청액에 첨가하고, 일정하게 진탕시키면서 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 1 M H3PO4로 반응을 종결시키고, 스펙트라맥스 플러스 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다 (650 nm에서 측정된 배경을 각각의 웰에 대해 차감함). 표적 세포만을 함유하는 웰의 흡광도는 배경에 대한 대조군으로서의 역할을 하였고 (저 대조군), 한편 트리톤-X100으로 용해된 표적 세포를 함유하는 웰은 이용가능한 최대 신호를 제공하였다 (고 대조군). 항체-비의존성 세포성 세포독성 (AICC)을 항체의 첨가 없이 표적 및 이펙터 세포를 함유하는 웰에서 측정하였다. 구체적 ADCC의 정도는 하기와 같이 계산하였다:
Figure 112015123222158-pct00015
샘플 희석물의 ADCC 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, 소프트맥스 프로를 사용하여 용량-반응 곡선을 4-파라미터 모델에 피팅하였다.
ADCC 검정의 결과를 도 23에 제시한다. 예상된 바와 같이, 이펙터 양성 항-인간 TfR 항체 (항-TfR1/gD IgG1 WT)는 HEL 세포에 대해 유의한 ADCC 활성을 도출하였다. 대조적으로, LALAPG, LALAPG/YTE, 또는 LALAPG/AI 돌연변이를 함유하는 항-TfR52A/BACE1 항체 변이체는 음성 대조군 항-TfR52A /gD N297G 항체와 유사하게 HEL 세포에서 어떠한 ADCC 활성도 디스플레이하지 않았다.
상기 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> P5641R1-WO <140> <141> <150> 61/825,477 <151> 2013-05-20 <160> 175 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Ser Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala 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Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Leu 85 90 95 Met Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro <210> 168 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 168 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ile Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Arg Ala Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 <210> 169 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 169 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Thr Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Arg Ala Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr 115 <210> 170 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 170 Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Thr Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro <210> 171 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 171 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Ser Glu 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Tyr Gly Asn Pro Ala Thr Arg Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro 115 120 125 Ser Val Tyr 130 <210> 172 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 172 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asp Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Tyr Asp Ser Arg Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr 115 120 <210> 173 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 173 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Tyr Asp Ser Arg Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr 115 120 <210> 174 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 174 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Phe Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Asn Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Gly Ala Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr 115 120 125 <210> 175 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 175 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Tyr Asp Gly Glu Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr 115 120

Claims (74)

  1. 인간 트랜스페린 수용체 (TfR) 및 영장류 TfR에 결합하고, TfR에 대한 트랜스페린의 결합은 억제하지 않고,
    a) 서열 53, 54 및 55, 및 서열 50, 51 및 52;
    b) 서열 53, 156 및 55, 및 서열 50, 51 및 52;
    c) 서열 53, 157 및 55, 및 서열 50, 51 및 52; 또는
    d) 서열 53, 54 및 55, 및 서열 50, 51 및 155
    의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3를 포함하는,
    단리된 항체.
  2. 인간 TfR 및 영장류 TfR에 결합하고, TfR에 대한 트랜스페린의 결합은 억제하지 않는 단리된 항체이며,
    여기서 항체의 하나 이상의 특성이 상기 항체로 치료된 대상체 또는 포유동물에서 망상적혈구에 대한 항체의 영향을 감소 또는 제거하거나 급성 임상 증상의 중증도 또는 존재를 감소시키도록 변형되어 있는 것이고,
    a) 서열 53, 54 및 55, 및 서열 50, 51 및 52;
    b) 서열 53, 156 및 55, 및 서열 50, 51 및 52;
    c) 서열 53, 157 및 55, 및 서열 50, 51 및 52; 또는
    d) 서열 53, 54 및 55, 및 서열 50, 51 및 155
    의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3를 포함하는,
    단리된 항체.
  3. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체인 단리된 항체.
  4. 제1항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 단리된 항체.
  5. 제1항에 있어서, 인간 TfR 및 영장류 TfR에 결합하는 항체 단편인 단리된 항체.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 108, 153 또는 154의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    (b) 서열 105 또는 151의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는
    (c) 상기 (a)에서와 같은 VH 서열 및 상기 (b)에서와 같은 VL 서열
    을 포함하고;
    제1항에 제시된 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함하는,
    단리된 항체.
  12. 제11항에 있어서,
    a. 서열 108;
    b. 서열 153; 또는
    c. 서열 154
    의 VH 서열을 포함하는 단리된 항체.
  13. 제11항에 있어서,
    a. 서열 105; 또는
    b. 서열 151
    의 VL 서열을 포함하는 단리된 항체.
  14. a. 서열 108의 VH 서열 및
    서열 105의 VL 서열;
    b. 서열 153의 VH 서열 및
    서열 105의 VL 서열;
    c. 서열 154의 VH 서열 및
    서열 105의 VL 서열; 또는
    d. 서열 108의 VH 서열 및
    서열 151의 VL 서열
    을 포함하는 항체.
  15. 제2항에 있어서, 하나 이상의 특성이 항체 Fc 영역의 이펙터 기능, 항체의 보체 활성화 기능, 항체의 반감기 및 TfR에 대한 항체의 친화도로부터 선택된 것인 단리된 항체.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 특성이 항체 Fc 영역의 이펙터 기능 및 항체의 보체 활성화 기능으로부터 선택되고, 여기서 이펙터 기능 또는 보체 활성화 기능이 동일한 이소형의 야생형 항체와 비교하여 감소되거나 제거되어 있는 것인 단리된 항체.
  17. 제16항에 있어서, 이펙터 기능이 항체의 글리코실화의 감소, 자연적으로 감소되거나 제거된 이펙터 기능을 갖는 이소형으로의 항체 이소형의 변형, 및 Fc 영역의 변형으로부터 선택된 방법에 의해 감소되거나 제거된 것인 단리된 항체.
  18. 제17항에 있어서, 항체의 글리코실화가
    야생형 글리코실화를 허용하지 않는 환경에서의 항체의 생산;
    항체 상에 이미 존재하는 탄수화물 기의 제거; 및
    야생형 글리코실화가 발생하지 않도록 하는 항체의 변형
    으로부터 선택된 방법에 의해 감소된 것인 단리된 항체.
  19. 제18항에 있어서, 항체의 Fc 영역이, 위치 297에서의 야생형 아스파라긴 잔기가 그 위치에서의 글리코실화를 방해하는 또 다른 아미노산으로 대체되도록 하는 위치 297에서의 돌연변이를 포함하는 것인 단리된 항체.
  20. 제17항에 있어서, 이펙터 기능 또는 보체 활성화 기능이 Fc 영역의 모두 또는 부분의 결실에 의해, 또는 이펙터 기능 또는 보체 활성화 기능에 적격인 Fc 영역 또는 비-Fc 영역을 포함하지 않도록 항체를 조작하는 것에 의해 감소되거나 제거된 것인 단리된 항체.
  21. 제17항에 있어서, 변형이
    위치 234, 235, 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438, 및 439로부터 선택된, 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합을 손상시키는 Fc 영역의 점 돌연변이;
    위치 270, 322, 329, 및 321로부터 선택된, C1q에 대한 결합을 손상시키는 Fc 영역의 점 돌연변이;
    Fc 영역의 일부 또는 모두의 제거; 및
    CH1 도메인의 위치 132에서의 점 돌연변이
    로부터 선택된 것인 단리된 항체.
  22. 제21항에 있어서, 변형이 N297G; D265A 및 N297A 또는 D265A 및 N297G; 또는 L234A, L235A, 및 P329G인 단리된 항체.
  23. 제15항에 있어서, 항체의 FcRn 결합 도메인 내 252, 254, 256, 434 및 436으로부터 선택된 위치에서의 변형에 의해 반감기가 증가된 것인 단리된 항체.
  24. 제23항에 있어서, 변형이 M252Y, S254T 및 T256E; 또는 N434A 및 Y436I인 단리된 항체.
  25. 제1항에 있어서, 치료 화합물에 커플링된 단리된 항체.
  26. 제25항에 있어서, 항체가 다중특이적 항체이고, 치료 화합물이 임의로 다중특이적 항체의 한 부분을 형성하는 것인 단리된 항체.
  27. 제26항에 있어서, 다중특이적 항체가
    TfR에 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및
    뇌 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위
    를 포함하는 것인 단리된 항체.
  28. 제27항에 있어서, 뇌 항원이 베타-세크레타제 1 (BACE1), A베타, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 타우, 아포지단백질 E (ApoE), 알파-시뉴클레인, CD20, 헌팅틴, 프리온 단백질 (PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2 (LRRK2), 파르킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), p75 뉴로트로핀 수용체 (p75NTR) 및 카스파제 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단리된 항체.
  29. 제28항에 있어서, 다중특이적 항체가 TfR 및 BACE1 둘 다에 결합하는 것인 단리된 항체.
  30. 제28항에 있어서, 다중특이적 항체가 TfR 및 A베타 둘 다에 결합하는 것인 단리된 항체.
  31. 제25항에 있어서, 치료 화합물이 신경계 장애 약물인 단리된 항체.
  32. 제1항 내지 제5항 및 제11항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  33. 제32항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  34. 제33항의 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계를 포함하고, 임의로는 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  35. 제1항 내지 제5항 및 제11항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 뇌 또는 CNS에 영향을 미치는 질환 또는 장애의 진단, 예방 또는 치료를 위한 제약 제제.
  36. 제1항 내지 제5항 및 제11항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 뇌 또는 CNS에 영향을 미치는 질환 또는 장애의 진단, 예방 또는 치료를 위한 의약.
  37. 제36항에 있어서, 뇌 또는 CNS에 영향을 미치는 질환 또는 장애가 신경계 장애인 것인 의약.
  38. 제37항에 있어서, 신경계 장애가 신경병증 장애, 신경변성 질환, 암, 안구 질환 장애, 발작 장애, 리소솜 축적 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 행동 장애 및 CNS 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 의약.
  39. 제1항 내지 제5항 및 제11항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, BBB를 가로질러 1종 이상의 화합물을 수송하는데 사용하기 위한 의약.
  40. 제25항의 항체를 포함하는,
    제25항의 항체가 BBB를 가로질러 그에 커플링된 화합물을 수송하도록 상기 항체를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 대상체에서 BBB를 가로질러 화합물을 수송하는 방법에 사용하기 위한
    제약 조성물.
  41. 제25항의 항체를 포함하는,
    제25항의 항체가 BBB를 가로질러 그에 커플링된 화합물을 수송하도록 상기 항체를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 대상체의 CNS의 화합물에 대한 노출을 증가시키는 방법에 사용하기 위한
    제약 조성물.
  42. 제25항의 항체를 포함하는,
    대상체에 투여된 화합물의 CNS 내 체류가 증가되도록 제25항의 항체를 BBB에 노출시키는 것을 포함하는, 상기 화합물의 CNS 내 체류를 증가시키는 방법에 사용하기 위한
    제약 조성물.
  43. 제25항의 항체를 포함하는, 포유동물에서 신경계 장애를 치료하기 위한 제약 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 신경계 장애가 신경병증 장애, 신경변성 질환, 암, 안구 질환 장애, 발작 장애, 리소솜 축적 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 행동 장애 및 CNS 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    BBB 또는 신경계 장애가 인간 대상체에 존재하거나, 또는
    투여 용량 또는 빈도가, 적혈구가 노출되는 항체의 농도를 감소시키도록 조절되는 것인
    제약 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 대상체 또는 포유동물이 적혈구의 고갈에 대해 모니터링되는 것인 제약 조성물.
  47. 제45항에 있어서,
    화합물에 커플링된 항체가 치료 용량으로 투여되거나, 또는
    치료 용량이 TfR-포화시키는 것인
    제약 조성물.
  48. 제45항에 있어서, 항체의 투여가 항체 투여의 급성 임상 증상을 최소화하도록 보정된 용량 또는 용량 빈도로 이루어진 것인 제약 조성물.
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
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