TW201500373A - 抗轉鐵蛋白受體抗體及其使用方法 - Google Patents

抗轉鐵蛋白受體抗體及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明係關於抗轉鐵蛋白受體抗體及其使用方法。

Description

抗轉鐵蛋白受體抗體及其使用方法
本發明係關於抗轉鐵蛋白受體抗體及其使用方法。
大分子藥物之腦穿透性極大地受基本上不可滲透之血腦障壁(BBB)限制。克服此障礙之多種策略之一係利用在腦毛細血管內皮上表現之內源受體的轉胞吞運輸路徑。已經設計出針對此等受體以使得大分子能夠以受體介導之方式遞送至腦中的重組蛋白(諸如單株抗體)。使腦吸收最大化同時使回到血液之反向轉胞吞作用最小，以及使治療性給藥之後積累之程度最大的策略已藉由以下發現解決：對BBB受體具有低親和力的抗體有可能相對於針對此類受體之典型高親和力抗體實質上增加相關治療部分/分子的BBB轉運及CNS滯留(Atwal等人，Sci.Transl.Med.3,84ra43(2011)；Yu等人，Sci.Transl.Med.2011年5月25日：第3卷，第84期，第84ra44頁)。然而，該等抗體不特異性結合於人類及靈長類動物TfR。
單株抗體具有治療神經或中樞神經系統(CNS)疾病之巨大治療潛能，但其進入腦中之通路受血腦障壁(BBB)限制。過去的研究已顯示，在血流中循環的IgG中有極少數(約0.1%)穿過BBB進入CNS中(Felgenhauer,Klin.Wschr.52：1158-1164(1974))，其中該抗體之CNS 濃度可能不足以允許穩固的作用。先前已發現，分佈至CNS中之抗體的百分比可藉由利用BBB受體(亦即，轉鐵蛋白受體、胰島素受體及其類似物)來改善(參看例如WO9502421)。舉例而言，抗BBB受體抗體可以具有多特異性以靶向CNS中之一或多種所需抗原，或可將一或多個異源分子偶合至該抗BBB受體抗體；在任一情形中，該抗BBB受體抗體均可幫助將治療分子跨BBB遞送至CNS中。
然而，用傳統之特定高親和力抗體靶向BBB受體一般引起BBB轉運之有限增加。申請人後來發現，在所研究的抗BBB抗體中，CNS中吸收及分佈之抗體的數量與其對BBB受體的結合親和力呈反相關。舉例而言，相對於較高親和力之抗TfR抗體，以治療劑量含量給與之針對轉鐵蛋白受體(TfR)的低親和力抗體極大地改善了抗TfR抗體之BBB轉運及CNS滯留，且使得有可能更易於在CNS中獲得治療濃度(Atwal等人，Sci.Transl.Med.3,84ra43(2011))。使用同時結合TfR及澱粉樣前驅體蛋白(APP)裂解酶β-分泌酶(BACE1)之雙特異性抗體證實了此類BBB轉運。相較於單獨單特異性抗BACE1抗體，單次全身劑量的使用本發明方法工程改造之雙特異性抗TfR/BACE1抗體不僅在腦中產生顯著之抗體吸收，且亦使得腦Aβ1-40之含量顯著降低，表明BBB穿透性影響抗BACE1之效力。(Atwal等人，Sci.Transl.Med.3,84ra43(2011)；Yu等人，Sci.Transl.Med.3,84ra44(2011))。
該等資料及實驗突出了引起使用較低親和力抗體方法增加CNS中抗體吸收的若干機制。首先，高親和力抗BBB受體(BBB-R)抗體(例如，抗TfRA，來自Atwal等人及Yu等人，同上文)藉由使腦血管系統中之BBB-R迅速飽和來限制腦吸收，由此降低了吸收至腦中的抗體總量且亦限制其在該血管系統中之分佈。驚人的是，降低對BBB-R之親和力使腦吸收及分佈改善，且觀測到定位自血管系統穩固地轉向在CNS內分佈之神經元及相關神經纖維網。其次，已提出抗體對BBB-R之較 低親和力會削弱抗體自膜之CNS側經由BBB-R返回至BBB之血管側的能力，因為抗體對BBB-R之總親和力較低且抗體在BBB之CNS側之局部濃度因抗體快速分散至CNS區室中而成為非飽和的。再次，在活體內，且如關於TfR系統所觀測的，對BBB-R之親和力較低之抗體自系統中清除之效率低於對BBB-R之親和力較高之抗體，且因此所保持之循環濃度高於其較高親和力之對應物。此為有利的，因為較低親和力抗體之循環抗體含量在治療劑量下持續之時段長於較高親和力抗體，因此在較長時段內改善抗體在腦中之吸收。此外，此種血漿及腦暴露之改善可降低臨床中之給藥頻率，此不僅對患者順應性及便利性具有潛在益處且亦在降低抗體及/或其所偶合之治療化合物之任何潛在副作用或脫靶效應方面具有潛在益處。
以上參考之研究中所描述的低親和力BBB-R抗體經選擇/工程改造以避免干擾轉鐵蛋白與TfR之間之自然結合，且由此避免潛在的與鐵轉運相關之副作用。儘管如此，在小鼠中投與該等抗體中之某些時，仍觀測到一些明顯的副作用。該等小鼠呈現的主要反應為網狀紅血球群之穩固耗竭，伴隨急性臨床症狀之迅速發作。儘管小鼠及時自急性臨床症狀及降低之網狀紅血球含量恢復，但避免或以其他方式減輕此對網狀紅血球之影響明顯為抗TfR抗體能夠安全地用作治療性分子所需的。已發現，針對抗TfR投藥之主要反應(穩固網狀紅血球耗竭及急性臨床病徵)在很大程度上係由該抗體之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性驅動，而殘留網狀紅血球耗竭效應係由補體路徑介導。
先前之該等研究利用了特異性結合於小鼠TfR，但不特異性識別靈長類動物或人類TfR之小鼠抗體。因此，本發明提供了同時特異性識別靈長類動物及人類TfR，以便利在治療性或診斷性用於人體中之前在靈長類動物中用抗體進行之安全性及功效研究的抗體及其功能部 分。使用以本發明之抗人類TfR抗體處理之人紅血球母細胞之細胞株及原代骨髓細胞進行的活體外研究證實，如在小鼠中一樣，在人類/靈長類動物細胞系統中亦可觀測到TfR陽性紅血球系細胞之穩固耗竭(參看例如實例4)。因此，本文亦提供了對於本發明抗體之修飾，該等修飾極大地降低或消除了在投與抗TfR之後表現TfR之網狀紅細胞群之不想要的減少，同時仍能夠藉由以治療濃度投與之抗人類/靈長類動物TfR抗體提供增強之BBB轉運、增加之CNS分佈及CNS滯留。本文提供了減少所觀測的本發明之抗TfR抗體對主要及殘留網狀紅細胞耗竭之影響的若干通用方法，且該等方法可單獨或組合使用。
在一種方法中，使得抗人類/食蟹獼猴TfR抗體之效應功能減少或消除，以便降低或消除ADCC活性。在另一種方法中，抗人類/食蟹獼猴TfR抗體對人類或靈長類動物TfR之親和力進一步減小，由此使該抗體與網狀紅細胞群之相互作用對該群體之有害作用減小。第三種方法係針對降低血漿中存在之抗人類/食蟹獼猴TfR抗體的量以減少網狀紅細胞群對潛在地有害濃度之抗體的暴露。第四種方法試圖保護、穩定及/或補充網狀紅細胞群，以使得藉由投與抗人類/食蟹獼猴Tfr抗體引起的循環中或骨髓中網狀紅細胞群之任何潛在的耗竭得以避免、減少或降低。
如本文所述，效應功能減少或消除可藉由以下方式實現：(i)減少或消除該抗體之野生型哺乳動物糖基化(例如，藉由在無法發生此類糖基化之環境中產生該抗體；藉由使一或多個碳水化合物連接點突變，以使得該抗體無法糖基化；或在抗體糖基化之後，藉由化學方式或酶促方式自其移除一或多種碳水化合物)；(ii)藉由降低或消除抗人類/食蟹獼猴TfR抗體之Fc受體結合能力(例如，藉由使Fc區突變；藉由缺失Fc區或消除Fc區)；或(iii)藉由利用已知具有最小或無效應功能之抗體同型(亦即，包括(但不限於)IgG4)。
如本文所述，減少抗體補體活化可藉由以下方式實現：降低或消除抗人類/食蟹獼猴TfR抗體之C1q結合能力(例如，藉由使Fc區突變、缺失或消除Fc區，或藉由修飾抗人類/食蟹獼猴TfR抗體之非Fc部分)，或藉由以其他方式抑制補體系統之活化或活性(例如，藉由共投與一或多種補體路徑活化或補體路徑活性抑制劑)。
當抗人類/食蟹獼猴TfR抗體在網狀紅細胞或以較高程度表現TfR之其他細胞類型上結合於人類或食蟹獼猴TfR觸發其耗竭(如同本文所例示之抗人類/食蟹獼猴TfR抗體一樣)時，減少該等抗體與在網狀紅細胞或其他細胞類型上之人類或食蟹獼猴TfR之結合又應減少在投與抗體之後所觀測到的循環中或骨髓中網狀紅細胞或其他細胞類型耗竭的量。抗人類/食蟹獼猴TfR抗體對靈長類動物或人類TfR之親和力可使用本文所述及實例中所示方法中之任一種來修飾。
減少血漿中存在之抗人類/食蟹獼猴TfR抗體的量以便減少網狀紅細胞群對於潛在有害濃度之抗體的暴露可以若干方式實現。一種方法係簡單地減少所給與之抗體的量，同時亦潛在地增加給藥頻率，由此使血漿中的最大濃度降低，但維持足夠血清含量以提供功效，同時仍低於細胞耗竭副作用之臨限值。另一種方法可與給藥調整組合，係選擇或工程改造抗TfR抗體以使其與TfR之結合具有pH敏感性，由此其在pH 7.4下於血漿中以所需地較低親和力(如本文所述)結合於細胞表面TfR，但在內化至內體區室中之後，此種與TfR之結合在該區室之相對較低pH值(pH 5.5-6.0)下迅速且顯著地減少。此類解離可保護該抗體免於發生抗原介導之清除，或增加跨BBB遞送至CNS或反向再循環至抗體的量一在任一情形中，該抗體之有效濃度相對於不包含此類pH敏感性之抗TfR抗體有所增加，而不增加該抗體之投藥劑量，且此又潛在地允許較低的抗體劑量，並伴隨較低的副作用風險。
保護、穩定及/或補充網狀紅細胞群可使用醫藥或物理方法實 現。除抗人類/食蟹獼猴TfR抗體外，亦可共投與(同時地或依序地)至少一種其他治療劑，該治療劑可減少該抗體對網狀紅細胞群之負面副作用。此類治療劑之實例包括(但不限於)紅血球生成素(EPO)、鐵補充劑、維生素C、葉酸及維生素B12。亦可能藉由例如輸注類似細胞以物理方式更換紅血球(亦即，網狀紅細胞)，該等類似細胞可來自具有類似血型之另一個體，或可先前自投與了抗人類/食蟹獼猴TfR抗體之個體提取。
熟習此項技術者將理解，可採用前述方法之任何組合來工程改造抗體(及/或其劑量方案)以在以下特性之間得到最佳平衡：(i)所需地對靈長類動物或人類TfR之低親和力，此將使該抗體及任何結合之化合物向CNS中之轉運最大化；(ii)所結合之化合物(包括(作為非限制性實例)，在抗人類/食蟹獼猴TfR抗體中之第二或其他抗原結合特異性)對其CNS抗原之親和力，因為此與達到治療作用而需要存在於CNS中之化合物的量有關；(iii)抗人類/食蟹獼猴TfR抗體之清除率；(iv)抗TfR/所結合化合物在低pH值下促進所結合化合物在BBB之CNS/腦側釋放的不穩定性；及(v)對網狀紅細胞群之影響。
亦應理解，本文所識別的抗TfR抗體投與之網狀紅細胞耗竭效應可用於治療網狀紅細胞之過度增殖帶來問題之任何疾病或病症。舉例而言，在先天性紅血球增多症或贅生性真性紅血球增多症中，由例如網狀紅細胞過度增殖引起之紅血球計數升高導致血液變稠且伴隨發生生理症狀。投與本發明之抗人類/食蟹獼猴TfR抗體(其中該等抗體之至少部分效應功能得以保留)將允許選擇性移除不成熟之網狀紅細胞群，而不影響轉鐵蛋白向CNS中之正常轉運。如此項技術中充分瞭解的，此類抗體之給與可經調節以使急性臨床症狀減到最少(亦即，藉由以極低劑量或以較寬間隔之時間間隔給藥)。
抗TfR/BACE1及抗TfR/Aβ各自為治療阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)之頗具前景並且新穎之治療候選物。此外，基於受體介導之轉運(RMT)之雙特異性靶向技術為多種針對CNS疾病之潛在治療方案開啟了大門。本發明提供了工程改造BBB滲透劑治療劑的方法，該等方法極大地改善了該治療劑之跨BBB轉運及CNS分佈，同時不耗竭網狀紅細胞。
因此，在第一實施例中，本發明提供一種經分離抗體，其結合於人類轉鐵蛋白受體(TfR)及靈長類動物TfR，其中該抗體不抑制轉鐵蛋白與TfR之結合。在一個態樣中，該結合為特異性結合。在另一個態樣中，該抗體另外不抑制人類血色病蛋白(「HFE」)與TfR之結合。在一個態樣中，該結合為特異性結合。在一個態樣中，該抗體為單株抗體。在另一個態樣中，該抗體為人類抗體。在另一個態樣中，該抗體為人類化抗體。在另一個態樣中，該抗體為嵌合抗體。在另一個態樣中，該抗體為結合人類TfR及靈長類動物TfR之抗體片段。在另一個態樣中，該靈長類動物TfR係來自食蟹獼猴。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：31、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：36、38及39之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：36、40及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：42、43及44之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：31、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：46、48及49之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、 HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：52、54及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：52、58及59之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：62、63及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：52、65及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：68、69及70之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：73、75及76之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：79、81及82之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：79、83及84之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：87、89及90之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：93、95及96之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：99、101及102之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：127、33及34之胺基酸序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：37、38及39之胺基酸序列。在以上實施例之 另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、40及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：37、43及44之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：47、48及49之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、54及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、58及59之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、63及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、65及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、69及70之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：74、75及76之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：80、81及82之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：80、83及84之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：88、89及90之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：94、95及96之胺基酸序列。 在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：100、101及102之胺基酸序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及31之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：35、30及36之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：41、30及42之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及31之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：45、30及46之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：50、51及52之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：56、57及52之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：60、61及62之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：60、64及52之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：66、67及68之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：71、72及73之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：77、78及79之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：85、86及87之 胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：91、92及93之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：97、98及99之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及127之胺基酸序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及31之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：35、30及36之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：37、38及39之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：35、30及36之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、40及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：41、30及42之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：37、43及44之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及31之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：45、30及46之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：47、48及49之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR- L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：50、51及52之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、54及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：56、57及52之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、58及59之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：60、61及62之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、63及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：60、64及52之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、65及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：66、67及68之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、69及70之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：71、72及73之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：74、75及76之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：77、78及79之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：80、81及82之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：77、78及79之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：80、83及84之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分 別包含SEQ ID NO：85、86及87之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：88、89及90之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：91、92及93之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：94、95及96之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：97、98及99之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：100、101及102之胺基酸序列。在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及127之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含至少一個選自由以下組成之序列之群的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2或HVR-L3序列：SEQ ID NO：47、53或100之HVR-H1序列；SEQ ID NO：48、69或101之HVR-H2序列；SEQ ID NO：49、76或102之HVR-H3序列；SEQ ID NO：45、66或97之HVR-L1序列；SEQ ID NO：30、67或98之HVR-L2序列；及SEQ ID NO：46、68或102之HVR-L3序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含(a)與SEQ ID NO：7、8、9、10、15、16、17、18、20、25、26、27、28、108、114、120或126之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的VH序列；(b)與SEQ ID NO：4、5、6、11、12、13、14、19、21、22、23、24、105、111、117或123之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一個此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：4之VL序列及SEQ ID NO：7之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：5之VL序列及SEQ ID NO：8之VH序列。 在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：5之VL序列及SEQ ID NO：9之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：6之VL序列及SEQ ID NO：10之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：11之VL序列及SEQ ID NO：15之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：12之VL序列及SEQ ID NO：16之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：13之VL序列及SEQ ID NO：17之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：14之VL序列及SEQ ID NO：18之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：19之VL序列及SEQ ID NO：20之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：21之VL序列及SEQ ID NO：25之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：22之VL序列及SEQ ID NO：26之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：23之VL序列及SEQ ID NO：27之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：24之VL序列及SEQ ID NO：28之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：105之VL序列及SEQ ID NO：108之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：111之VL序列及SEQ ID NO：114之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：117之VL序列及SEQ ID NO：120之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：123之VL序列及SEQ ID NO：126之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含(a)SEQ ID NO：108、(b)SEQ ID NO：114、(c)SEQ ID NO：120或(d)SEQ ID NO：126之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含(a)SEQ ID NO：105、(b)SEQ ID NO：111、(c)SEQ ID NO：117或(d)SEQ ID NO：123之VL序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體係選自由以下組成之群：抗體7A4、8A2、15D2、10D11、7B10、15G11、16G5、13C3、16G4、16F6、7G7、4C2、1B12及13D4。在一個此類態樣中，該抗體 為7A4。在另一此類態樣中，該抗體為8A2。在另一此類態樣中，該抗體為15D2。在另一此類態樣中，該抗體為10D11。在另一此類態樣中，該抗體為7B10。在另一此類態樣中，該抗體為15G11。在另一此類態樣中，該抗體為16G5。在另一此類態樣中，該抗體為13C3。在另一此類態樣中，該抗體為16G4。在另一此類態樣中，該抗體為16F6。在另一此類態樣中，該抗體為7G7。在另一此類態樣中，該抗體為4C2。在另一此類態樣中，該抗體為1B12。在另一此類態樣中，該抗體為13D4。
在前述任一者之一個態樣中，該抗體為進一步親和力已成熟。在一個此類態樣中，該抗體係選自由以下組成之群：15G11.v1、15G11.v2、15G11.v3、15G11.v4、15G11.v5、7A4.v1、7A4.v2、7A4.v3、7A4.v4、7A4.v5、7A4.v6、7A4.v7、7A4.v8、7A4.v9、7A4.v10、7A4.v11、7A4.v12、7A4.v13、7A4.v14、7A4.v15、7G7.v1、16F6.v1、16F6.v2、16F6.v3及16F6.v4。在一個此類態樣中，該抗體為15G11.v1。在另一此類態樣中，該抗體為15G11.v2。在另一此類態樣中，該抗體為15G11.v3。在另一此類態樣中，該抗體為15G11.v4。在另一此類態樣中，該抗體為15G11.v5。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v1。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v2。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v3。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v4。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v5。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v6。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v7。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v8。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v9。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v10。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v11。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v12。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v13。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v14。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v15。在另一此類態樣中，該抗體為 7G7.v1。在另一此類態樣中，該抗體為16F6.v1。在另一此類態樣中，該抗體為16F6.v2。在另一此類態樣中，該抗體為16F6.v3。在另一此類態樣中，該抗體為16F6.v4。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體在VH或VL中之一或多個胺基酸位置處經修飾成圖6-1及6-2中該位置所指示之胺基酸。在以上實施例之另一態樣中，該抗體包含對應於關於圖3及4以及圖6-1及6-2中之任一純系所陳述之序列或該等序列中一或多者的序列或者一或多個HVR序列。在以上實施例之另一態樣中，該抗體包含對應於關於圖3及4以及圖6-1及6-2中之任一純系所陳述之序列的VH或VL序列。在以上實施例之另一態樣中，該抗體包含對應於關於圖3及4以及圖6-1及6-2中之任一純系所陳述之該等序列中之一或多者的一或多個HVR序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體偶合至治療化合物。在以上實施例之另一態樣中，該抗體偶合至顯影劑或標記。在一個此類態樣中，該抗體為多特異性抗體且該治療化合物視情況形成該多特異性抗體之一部分。在一個此類態樣中，該多特異性抗體包含結合TfR之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在一個此類態樣中，腦抗原係選自由以下組成之群：β分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、τ蛋白、脂蛋白元E(ApoE)、α-突觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白(huntingtin)、普里昂蛋白質(PrP)、富含白胺酸之重複激酶2(LRRK2)、泊蛋白(parkin)、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、澱粉樣前驅蛋白(APP)、p75神經營養因子受體(p75NTR)及卡斯蛋白酶6。在另一此類態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1。在另一此類態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ。在另一此類態樣中，該治療化合物為神經病症藥物。
在以上實施例之一個態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼前述抗體中之任一種。在另一態樣中，本發明提供一種包含此類核酸之宿主細胞。在另一態樣中，本發明提供一種產生前述抗體中之任一種之方法，該方法包含培養該宿主細胞以產生該抗體且視情況進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。
在以上實施例之一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含前述抗體中之任一種及醫藥學上可接受之載劑。
在以上實施例之一個態樣中，本發明提供前述抗體中之任一種，其係用作藥物。在以上實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任一種的用途，其係用於製造供治療神經病症之藥物。在一個此類態樣中，該神經病症係選自由以下組成之群：神經病變、神經退化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙及CNS炎症。
在以上實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任一種，其係用於治療神經病症。在一個此類態樣中，該神經病症係選自由以下組成之群：神經病變、神經退化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙及CNS炎症。
在以上實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任一種，其係用於跨BBB轉運一或多種化合物。在以上實施例之另一態樣中，提供前述抗體中之任一種的用途，其係用於製造供跨BBB轉運一或多種化合物的藥物。
在以上實施例之一個態樣中，提供一種在個體中跨BBB轉運化合物的方法，該方法包含使前述抗體中之任一種暴露於BBB，由此使該抗體跨BBB轉運與其偶合之化合物。在另一此類態樣中，BBB係在人類個體中。在另一此類態樣中，投藥劑量及/或頻率經調節以降低暴 露於紅血球之抗體的濃度。在另一此類態樣中，該方法另外包含監測該個體中紅血球之耗竭的步驟。在另一此類態樣中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個此類態樣中，該治療劑量為TfR飽和的。在另一此類態樣中，該抗體係以經校準以使該抗體投與之急性臨床症狀減到最少的劑量及/或劑量頻率投與。
在以上實施例之另一態樣中，提供一種增加個體之CNS對化合物之暴露的方法，該方法包含使前述抗體中之任一種暴露於BBB，由此使該抗體跨BBB轉運與其偶合之化合物。在另一此類態樣中，BBB係在人類個體中。在另一此類態樣中，投藥劑量及/或頻率經調節以降低暴露於紅血球之抗體的濃度。在另一此類態樣中，該方法另外包含監測該個體中紅血球之耗竭的步驟。在另一此類態樣中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個此類態樣中，該治療劑量為TfR飽和的。在另一此類態樣中，該抗體係以經校準以使該抗體投與之急性臨床症狀減到最少的劑量及/或劑量頻率投與。
在以上實施例之一個態樣中，提供一種增加投與個體之化合物在CNS中之滯留時間的方法，該方法包含使前述抗體中之任一種暴露於BBB，由此使該化合物在CNS中之滯留時間增加。在另一此類態樣中，BBB係在人類個體中。在另一此類態樣中，投藥劑量及/或頻率經調節以降低暴露於紅血球之抗體的濃度。在另一此類態樣中，該方法另外包含監測該個體中紅血球之耗竭的步驟。在另一此類態樣中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個此類態樣中，該治療劑量為TfR飽和的。在另一此類態樣中，該抗體係以經校準以使該抗體投與之急性臨床症狀減到最少的劑量及/或劑量頻率投與。
在以上實施例之一個態樣中，提供一種治療哺乳動物之神經病症的方法，該方法包含用前述抗體中之任一種治療哺乳動物。在一個此類態樣中，該神經病症係選自由以下組成之群：神經病變、神經退 化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙及CNS炎症。在另一此類態樣中，該神經病症係在人類個體中。在另一此類態樣中，投藥劑量及/或頻率經調節以降低暴露於紅血球之抗體的濃度。在另一此類態樣中，該方法另外包含監測該個體中紅血球之耗竭的步驟。在另一此類態樣中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個此類態樣中，該治療劑量為TfR飽和的。在另一此類態樣中，該抗體係以經校準以使該抗體投與之急性臨床症狀減到最少的劑量及/或劑量頻率投與。
在另一實施例中，本發明提供一種結合於人類TfR及靈長類動物TfR的經分離抗體，其中該抗體不抑制轉鐵蛋白與TfR之結合，且其中該抗體之一或多種特性已經修飾以降低或消除該抗體對網狀紅血球之影響及/或減小用該抗體治療之個體或哺乳動物中急性臨床症狀之嚴重程度或存在。在一個態樣中，該結合為特異性結合。在另一個態樣中，該抗體另外不抑制HFE與TfR之結合。在一個態樣中，該抗體為單株抗體。在另一個態樣中，該抗體為人類抗體。在另一個態樣中，該抗體為人類化抗體。在另一個態樣中，該抗體為嵌合抗體。在另一個態樣中，該抗體為結合人類TfR及靈長類動物TfR之抗體片段。在另一個態樣中，該靈長類動物TfR係來自食蟹獼猴。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：31、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：36、38及39之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：36、40及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：42、43及44之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：31、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：46、48及49之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：52、54及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：52、58及59之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：62、63及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：52、65及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：68、69及70之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：73、75及76之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：79、81及82之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：79、83及84之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：87、89及90之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：93、95及96之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：99、101及102之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：127、33及34之胺基酸序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：37、38及39之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、40及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：37、43及44之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：47、48及49之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、54及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、58及59之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、63及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、65及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、69及70之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：74、75及76之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：80、81及82之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含 HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：80、83及84之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：88、89及90之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：94、95及96之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：100、101及102之胺基酸序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及31之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：35、30及36之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：41、30及42之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及31之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：45、30及46之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：50、51及52之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：56、57及52之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：60、61及62之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：60、64及52之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：66、67及68之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態 樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：71、72及73之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：77、78及79之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：85、86及87之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：91、92及93之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：97、98及99之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及127之胺基酸序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及31之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：35、30及36之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：37、38及39之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：35、30及36之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、40及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：41、30及42之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：37、43及44之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及31之胺基酸序列，且包含HVR-H1、 HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：45、30及46之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：47、48及49之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：50、51及52之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、54及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：56、57及52之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、58及59之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：60、61及62之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、63及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：60、64及52之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、65及55之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：66、67及68之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：53、69及70之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：71、72及73之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：74、75及76之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：77、78及79之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包 含SEQ ID NO：80、81及82之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：77、78及79之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：80、83及84之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：85、86及87之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：88、89及90之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：91、92及93之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：94、95及96之胺基酸序列。在以上實施例之另一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：97、98及99之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：100、101及102之胺基酸序列。在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含SEQ ID NO：29、30及127之胺基酸序列，且包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含SEQ ID NO：32、33及34之胺基酸序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含至少一個選自由以下組成之序列之群的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2或HVR-L3序列：SEQ ID NO：47、53或100之HVR-H1序列；SEQ ID NO：48、69或101之HVR-H2序列；SEQ ID NO：49、76或102之HVR-H3序列；SEQ ID NO：45、66或97之HVR-L1序列；SEQ ID NO：30、67或98之HVR-L2序列；及SEQ ID NO：46、68或102之HVR-L3序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體包含(a)與SEQ ID NO：7、8、9、10、15、16、17、18、20、25、26、27、28、108、114、120或126之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的VH序列；(b)與SEQ ID NO：4、5、6、11、12、13、14、19、21、22、23、24、105、111、117或123之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一個此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：4之VL序列及SEQ ID NO：7之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：5之VL序列及SEQ ID NO：8之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：5之VL序列及SEQ ID NO：9之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：6之VL序列及SEQ ID NO：10之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：11之VL序列及SEQ ID NO：15之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：12之VL序列及SEQ ID NO：16之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：13之VL序列及SEQ ID NO：17之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：14之VL序列及SEQ ID NO：18之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：19之VL序列及SEQ ID NO：20之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：21之VL序列及SEQ ID NO：25之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：22之VL序列及SEQ ID NO：26之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：23之VL序列及SEQ ID NO：27之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：24之VL序列及SEQ ID NO：28之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：105之VL序列及SEQ ID NO：108之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：111之VL序列及SEQ ID NO：114之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：117之VL序列及SEQ ID NO：120之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含SEQ ID NO：123之VL序列及SEQ ID NO：126之VH序列。在另一此類態樣中，該抗體包含(a)SEQ ID NO：108、(b)SEQ ID NO：114、(c)SEQ ID NO：120或(d)SEQ ID NO：126之VH序 列。在另一此類態樣中，該抗體包含(a)SEQ ID NO：105、(b)SEQ ID NO：111、(c)SEQ ID NO：117或(d)SEQ ID NO：123之VL序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體係選自由以下組成之群：抗體7A4、8A2、15D2、10D11、7B10、15G11、16G5、13C3、16G4、16F6、7G7、4C2、1B12及13D4。在一個此類態樣中，該抗體為7A4。在另一此類態樣中，該抗體為8A2。在另一此類態樣中，該抗體為15D2。在另一此類態樣中，該抗體為10D11。在另一此類態樣中，該抗體為7B10。在另一此類態樣中，該抗體為15G11。在另一此類態樣中，該抗體為16G5。在另一此類態樣中，該抗體為13C3。在另一此類態樣中，該抗體為16G4。在另一此類態樣中，該抗體為16F6。在另一此類態樣中，該抗體為7G7。在另一此類態樣中，該抗體為4C2。在另一此類態樣中，該抗體為1B12。在另一此類態樣中，該抗體為13D4。
在前述任一者之一個態樣中，該抗體為進一步親和力已成熟。在一個此類態樣中，該抗體係選自由以下組成之群：15G11.v1、15G11.v2、15G11.v3、15G11.v4、15G11.v5、7A4.v1、7A4.v2、7A4.v3、7A4.v4、7A4.v5、7A4.v6、7A4.v7、7A4.v8、7A4.v9、7A4.v10、7A4.v11、7A4.v12、7A4.v13、7A4.v14、7A4.v15、7G7.v1、16F6.v1、16F6.v2、16F6.v3及16F6.v4。在一個此類態樣中，該抗體為15G11.v1。在另一此類態樣中，該抗體為15G11.v2。在另一此類態樣中，該抗體為15G11.v3。在另一此類態樣中，該抗體為15G11.v4。在另一此類態樣中，該抗體為15G11.v5。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v1。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v2。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v3。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v4。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v5。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v6。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v7。在另一此類 態樣中，該抗體為7A4.v8。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v9。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v10。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v11。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v12。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v13。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v14。在另一此類態樣中，該抗體為7A4.v15。在另一此類態樣中，該抗體為7G7.v1。在另一此類態樣中，該抗體為16F6.v1。在另一此類態樣中，該抗體為16F6.v2。在另一此類態樣中，該抗體為16F6.v3。在另一此類態樣中，該抗體為16F6.v4。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體在VH或VL中之一或多個胺基酸位置處經修飾成圖6-1及6-2中該位置所指示之胺基酸。在以上實施例之另一態樣中，該抗體包含對應於關於圖3及4以及圖6-1及6-2中之任一純系所陳述之序列或該等序列中一或多者的序列或者一或多個HVR序列。在以上實施例之另一態樣中，該抗體包含對應於關於圖3及4以及圖6-1及6-2中之任一純系所陳述之序列的VH或VL序列。在以上實施例之另一態樣中，該抗體包含對應於關於圖3及4以及圖6-1及6-2中之任一純系所陳述之該等序列中之一或多者的一或多個HVR序列。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體之一或多種特性係選自抗體Fc區之效應功能、抗體之補體活化功能及抗體對TfR之親和力。在一個此類態樣中，該特性為抗體Fc區之效應功能。在另一此類態樣中，該特性為抗體之補體活化功能。在另一此類態樣中，該特性為抗體對TfR之親和力。在一個此類態樣中，該效應功能或補體活化功能相對於同一同型之野生型抗體有所降低或消除。在一個態樣中，該效應功能係藉由選自以下之方法降低或消除：減少抗體之糖基化、將抗體同型修飾成天然地具有降低或消除之效應功能的同型及修飾Fc區。
在一個此類態樣中，該效應功能係藉由減少抗體之糖基化來降 低或消除。在一個此類態樣中，該抗體之糖基化係藉由選自以下之方法減少：在不允許野生型糖基化之環境中產生抗體；移除已存在於抗體上之碳水化合物基團；及對抗體進行修飾以使野生型糖基化不發生。在一個此類態樣中，該抗體之糖基化係藉由在不允許野生型糖基化之環境中產生抗體，諸如在非哺乳動物細胞產生系統中產生或以合成方式產生抗體來降低。在一個此類態樣中，該抗體係在非哺乳動物細胞產生系統中產生。在另一此類態樣中，該抗體係以合成方式產生。在另一此類態樣中，該抗體之糖基化係藉由對抗體進行修飾以使野生型糖基化不發生來降低，諸如其中抗體之Fc區在297-位置包含突變，以致在該位置處之野生型天冬醯胺殘基經干擾在該位置處之糖基化的另一胺基酸替代。
在另一此類態樣中，該效應功能係藉由Fc區之至少一種修飾來降低或消除。在一種此類態樣中，該效應功能或補體活化功能係藉由缺失Fc區之全部或一部分，或藉由對抗體進行工程改造以使其不包括勝任效應功能或補體活化功能之Fc區或非Fc區來降低或消除。在另一此類態樣中，該Fc區之至少一種修飾係選自：Fc區中削弱與一或多種Fc受體之結合的點突變，該點突變選自以下位置：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439；Fc區中削弱與C1q之結合的點突變，該點突變選自以下位置：270、322、329及321；消除Fc區之一部分或全部；及在CH1結構域之132-位置處的點突變。在一個此類態樣中，該修飾為Fc區中削弱與C1q之結合的點突變，該點突變選自以下位置：270、322、329及321。在另一此類態樣中，該修飾為消除Fc區之一部分或全部。在另一此類態樣中，補體觸發功能係藉由缺失Fc區之全部或一 部分，或藉由對抗體進行工程改造以使其不包括接合補體路徑之Fc區來降低或消除。在一個此類態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一此類態樣中，抗體之非Fc區經修飾以減少或消除該抗體對補體路徑之活化。在一個此類態樣中，該修飾為CH1區中削弱與C3之結合的點突變。在一個此類態樣中，該點突變係在132-位置處(參看例如，Vidarte等人(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223)。
在一個態樣中，該抗體係與降低或有助於減少對網狀紅血球含量之影響或急性臨床症狀的另一化合物組合。在一個此類態樣中，該另一化合物保護網狀紅血球免於發生抗體相關之耗竭，或支持網狀紅血球之生長、發育或重建。在另一此類態樣中，該另一化合物係選自紅血球生成素(EPO)、鐵補充劑、維生素C、葉酸及維生素B12，或為紅血球或網狀紅血球。
在以上實施例之一個態樣中，如相對於對TfR不具有降低之親和力的同一同型之野生型抗體所量測，該抗體對TfR之親和力降低。在一個此類態樣中，該抗體對TfR之KD或IC50值為約1pM至約100μM。在另一態樣中，抗體之投藥劑量及/或頻率經調節以降低暴露於紅血球之抗體的濃度。
在以上實施例之一個態樣中，該抗體偶合至治療化合物。在以上實施例之另一態樣中，該抗體偶合至顯影劑或標記。在一個此類態樣中，該抗體為多特異性抗體且該治療化合物視情況形成該多特異性抗體之一部分。在一個此類態樣中，該多特異性抗體包含結合TfR之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在一個此類態樣中，腦抗原係選自由以下組成之群：β分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、τ蛋白、脂蛋白元E(ApoE)、α-突觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、普里昂蛋白質(PrP)、富含白胺酸之重複激酶2(LRRK2)、泊蛋白、早老素1、早老素 2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、澱粉樣前驅蛋白(APP)、p75神經營養因子受體(p75NTR)及卡斯蛋白酶6。在另一此類態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1。在另一此類態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ。在另一此類態樣中，該治療化合物為神經病症藥物。
在以上實施例之一個態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼前述抗體中之任一種。在另一態樣中，本發明提供一種包含此類核酸之宿主細胞。在另一態樣中，本發明提供一種產生前述抗體中之任一種之方法，該方法包含培養該宿主細胞以產生該抗體且視情況進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。
在以上實施例之一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含前述抗體中之任一種及醫藥學上可接受之載劑。
在以上實施例之一個態樣中，本發明提供前述抗體中之任一種，其係用作藥物。在以上實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任一種的用途，其係用於製造供治療神經病症之藥物。在一個此類態樣中，該神經病症係選自由以下組成之群：神經病變、神經退化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙及CNS炎症。
在以上實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任一種，其係用於治療神經病症。在一個此類態樣中，該神經病症係選自由以下組成之群：神經病變、神經退化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙及CNS炎症。
在以上實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任一種，其係用於跨BBB轉運一或多種化合物。在以上實施例之另一態樣中，提供前述抗體中之任一種的用途，其係用於製造供跨BBB轉運一或多種化合物的藥物。
在以上實施例之一個態樣中，提供一種在個體中跨BBB轉運化合物的方法，該方法包含使前述抗體中之任一種暴露於BBB，由此使該抗體跨BBB轉運與其偶合之化合物。在另一此類態樣中，BBB係在人類個體中。在另一此類態樣中，投藥劑量及/或頻率經調節以降低暴露於紅血球之抗體的濃度。在另一此類態樣中，該方法另外包含監測該個體中紅血球之耗竭的步驟。在另一此類態樣中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個此類態樣中，該治療劑量為TfR飽和的。在另一此類態樣中，該抗體係以經校準以使該抗體投與之急性臨床症狀減到最少的劑量及/或劑量頻率投與。
在以上實施例之另一態樣中，提供一種增加個體之CNS對化合物之暴露的方法，該方法包含使前述抗體中之任一種暴露於BBB，由此使該抗體跨BBB轉運與其偶合之化合物。在另一此類態樣中，BBB係在人類個體中。在另一此類態樣中，投藥劑量及/或頻率經調節以降低暴露於紅血球之抗體的濃度。在另一此類態樣中，該方法另外包含監測該個體中紅血球之耗竭的步驟。在另一此類態樣中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個此類態樣中，該治療劑量為TfR飽和的。在另一此類態樣中，該抗體係以經校準以使該抗體投與之急性臨床症狀減到最少的劑量及/或劑量頻率投與。
在以上實施例之一個態樣中，提供一種增加投與個體之化合物在CNS中之滯留的方法，該方法包含使前述抗體中之任一種暴露於BBB，由此使該化合物在CNS中之滯留增加。在另一此類態樣中，BBB係在人類個體中。在另一此類態樣中，投藥劑量及/或頻率經調節以降低暴露於紅血球之抗體的濃度。在另一此類態樣中，該方法另外包含監測該個體中紅血球之耗竭的步驟。在另一此類態樣中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個此類態樣中，該治療劑量為TfR飽和的。在另一此類態樣中，該抗體係以經校準以使該抗體 投與之急性臨床症狀減到最少的劑量及/或劑量頻率投與。
在以上實施例之一個態樣中，提供一種治療哺乳動物之神經病症的方法，該方法包含用前述抗體中之任一種治療哺乳動物。在一個此類態樣中，該神經病症係選自由以下組成之群：神經病變、神經退化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙及CNS炎症。在另一此類態樣中，該神經病症係在人類個體中。在另一此類態樣中，投藥劑量及/或頻率經調節以降低暴露於紅血球之抗體的濃度。在另一此類態樣中，該方法另外包含監測該個體中紅血球之耗竭的步驟。在另一此類態樣中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個此類態樣中，該治療劑量為TfR飽和的。在另一此類態樣中，該抗體係以經校準以使該抗體投與之急性臨床症狀減到最少的劑量及/或劑量頻率投與。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離抗體，其結合於TfR上與選自由以下組成之群之抗體相同的抗原決定基：抗體7A4、8A2、15D2、10D11、7B10、15G11、16G5、13C3、16G4、16F6、7G7、4C2、1B12、13D4、15G11.v1、15G11.v2、15G11.v3、15G11.v4、15G11.v5、7A4.v1、7A4.v2、7A4.v3、7A4.v4、7A4.v5、7A4.v6、7A4.v7、7A4.v8、7A4.v9、7A4.v10、7A4.v11、7A4.v12、7A4.v13、7A4.v14、7A4.v15、7G7.v1、16F6.v1、16F6.v2、16F6.v3及16F6.v4。
在另一實施例中，提供一種降低投與個體之化合物之清除率的方法，其中該化合物偶合至以低親和力結合於TfR之抗體，以致該化合物之清除率降低，且其中在對該個體投與化合物偶合之抗體之後，該個體之紅血球含量降低得以減小或消除。
在另一實施例中，提供了一種優化化合物之藥物動力學及/或藥 效學以在個體之CNS中有效的方法，其中該化合物偶合至以低親和力結合於TfR之抗體，且該抗體經選擇以使得其在偶合至該化合物之後對TfR之親和力引起一定量結合至該化合物之抗體跨BBB轉運，從而優化該化合物在CNS中之藥物動力學及/或藥效學，其中在向該個體投與化合物偶合之抗體之後，該個體之紅血球含量降低得以減少或消除。
應瞭解，上述任何本發明方法及組合物可彼此組合及/或與本說明書中所述之本發明其他態樣組合。
圖1描繪了基於pdb文件3SM9，TfR二聚體與Tf之複合物的三維晶體結構。標出了TfR之非Tf結合之頂端區域。
圖2A-2B描繪了在1μM人holo-Tf存在下在293細胞中短暫表現的結合於人及食蟹獼猴TfR之小鼠融合瘤親本純系上清液的FACS分析。除非另作指示，否則每一圖中之實心灰色跡線為來自偵測抗體之背景，中等灰色跡線係結合於內源性表現基礎含量之人TfR的293細胞，粗體黑色跡線表示結合於短暫表現之人TfR且細灰色跡線表示結合於短暫表現之食蟹獼猴TfR。
圖2C描繪了如實例1中所述之人/食蟹獼猴交叉反應抗體競爭分析之結果。發現十四個純系中有九個阻斷在噬菌體上呈現之頂端結合抗體的結合。
圖3A-1、3A-2、3B-1、3B-2、3C-1、3C-2、3D-1及3D-2描繪了結合於TfR之頂端區及非頂端區之融合瘤純系的重鏈及輕鏈可變區序列。該等序列可藉由抗原決定基及序列相似性而細分為I-III類(頂端結合序列)及IV類(非頂端結合序列)。根據Kabat之HVR係以下劃線指示。
圖4A-1、4A-2、4B-1、4B-2、4C-1、4C-2、4D-1及4D-2描繪了 (A)15G11、(B)7A4/8A2、(C)7G7及(D)16F6之人類化序列之比對。將每一小鼠輕鏈或重鏈可變結構域序列(第二條線)與最緊密之人類生殖系或共同可變結構域(第一條線)相比對。每一抗體之人類化型式顯示於下部(第三條線)。與人類生殖系或共同序列之差異以陰影表示。移植於人類構架中之HVR序列加框表示。指示了根據Kabat之CDR定義。
圖4E-1及4E-2顯示，對於第I-III類抗體組，在FR之一或多個殘基處具有修飾之抗體的變異體形式保持親和力及結合特異性。
圖5描繪了在6.3μM holo-Tf存在下hu7A4.v15、hu15G11.v5及hu7G7.v1與huTfR之結合。示出了在6.3μM holo-Tf存在(空心符號及虛線)或不存在(實心符號及實線)下抗體與固定之huTfR之結合。圖6A-B描繪了實例1中所述之HFE-HuTfR結合及HFE阻斷分析之結果。
圖6A顯示了抗體與經由固定之HFE捕獲的遞增濃度之huTfR的結合。
圖6B顯示了在遞增濃度之抗體存在下huTfR與固定之HFE的結合。
圖7A-B描繪了在食蟹獼猴及人TfR上15G11.v5及7A4.v5 IgG與Fab Ala變異體之結合分析，呈現了對於以IgG形式藉由ELISA結合以及以IgG或Fab形式藉由SPR分析所評估的每一抗體之CDR-L3及CDR-H3中Ala突變對固定之人或食蟹獼猴TfR之親和力的影響，如實例2中所述。
圖8A-B及圖9A-B描繪了評估在原代人骨髓單核細胞中或在人紅血球母細胞之細胞株中效應功能狀態對抗人類TfR(「抗hTFR」)抗體之ADCC活性之影響的實驗結果，如實例4中所述。
圖10描繪了實例5中所述之有關靈長類動物研究之給藥及取樣方案。
圖11A-11B描繪了實例5中所述之實驗的藥物動力學結果，詳言之，在食蟹獼猴單次靜脈內快速注射投與30mg/kg之後，血清(圖11A)及CSF(圖11B)中個別及組平均抗TfR1/BACE1、抗TfR2/BACE1及抗gD血清之濃度隨時間的變化。
圖12A-12E描繪了實例5中所述之實驗的藥物動力學結果，詳言之，在食蟹獼猴單次靜脈內快速注射投與30mg/kg之後，個別及組平均抗TfR1/BACE1、抗TfR2/BACE1及抗gD血漿(A)或CSF(B-E)之濃度隨時間的變化。上圖顯示血漿(圖12A)及CSF(圖12B)中之Aβ1-40含量，而下圖顯示可溶性APPα含量(圖12C)、可溶性APPβ含量(圖12D)及sAPPβ/sAPPα比率(圖12E)隨時間之變化。
圖13A-13D描繪了在實例5中所述研究期間進行之血液取樣之結果。在每一指定時間點，使用標準技術量測總網狀紅血球(圖13A)、紅血球(圖13B)、血紅素(圖13D)及總網狀紅血球池中不成熟網狀紅血球之百分比(圖13C)。
圖14描繪了實例6中所述之有關靈長類動物研究之給藥及取樣方案。
圖15A-15B描繪了實例6中所述之實驗的藥效學結果(A)及腦部抗體濃度(B)。詳言之，圖15A顯示了在食蟹獼猴中單次靜脈內快速注射給與30mg/kg之後，CSF中個別及組平均抗TfR1/BACE1、抗TfR2/BACE1、抗gD，及sAPPβ/sAPPα之抗BACE1定量隨時間之變化。圖15B顯示了在給藥後24小時，各種腦區域中個別抗TfR1/BACE1、抗TfR2/BACE1、抗gD及抗BACE1抗體之濃度。
圖16A-B描繪了自天然多樣性噬菌體呈現文庫之天然分類獲得的抗BACE1純系YW412.8之輕鏈及重鏈胺基酸序列以及YW412.8之親和力成熟形式。圖16A描繪了輕鏈可變區(VL)序列比對(SEQ ID NO.132-137)。圖16B描繪重鏈可變區(VH)序列比對(SEQ ID No.138- 139)。在兩個圖中，各純系之HVR序列係由加框區域指示，其中第一方框指示HVR-L1(圖16A)或HVR-H1(圖16B)，第二方框指示HVR-L2(圖16A)或HVR-H2(圖16B)，且第三方框指示HVR-L3(圖16A)或HVR-H3(圖16B)。
圖17A-B描繪了自合成多樣性噬菌體呈現文庫之天然分類獲得的抗BACE1純系Fab 12之輕鏈及重鏈胺基酸序列以及Fab 12之親和力成熟形式。圖17A描繪了輕鏈序列比對(SEQ ID NO.140-143)。圖17B描繪重鏈序列比對(SEQ ID NO.144)。在兩個圖中，各純系之HVR序列係由加框區域指示，其中第一方框指示HVR-L1(圖17A)或HVR-H1(圖17B)，第二方框指示HVR-L2(圖17A)或HVR-H2(圖17B)，且第三方框指示HVR-L3(圖17A)或HVR-H3(圖17B)。
圖18A-B描繪例示性抗Aβ抗體之重鏈(圖18A；SEQ ID NO.145)及輕鏈(圖18B；SEQ ID NO.146)。
圖19描繪了如實例5中所述之抗TfR1/BACE1、抗Tfr52A/BACE1及抗TfR53A/BACE1之藥物動力學特性。
圖20描繪了如實例7中所述的具有Fc效應功能LALAPG突變之鼠類IgG2a抗TfRD/BACE1及抗gD抗體之藥物動力學特性。
圖21描繪了如實例7中所述，在投與50mg/kg劑量具有Fc效應功能LALAPG突變之鼠類IgG2a抗TfRD/BACE1及抗gD抗體之後24小時小鼠中總網狀紅血球及不成熟網狀紅血球計數。
圖22描繪了如實例8中所述，在嵌入人轉鐵蛋白受體之小鼠中投與50mg/kg劑量抗TfR52A/BACE1(N297G)、抗TfR52A/BACE1(LALAPG)、抗TfR52A/BACE1(LALAPG/YTE)、TfR52A/BACE1(LALAPG/AI)抗體之後24小時小鼠中之總網狀紅血球計數。
圖23描繪了評估在原代人骨髓單核細胞中或在人紅血球母細胞之細胞株中效應功能狀態對於抗TfR/gD、抗TfR/BACE1(N297G)、抗 TfR/BACE1(LALAPG)、抗TfR/BACE1(N297G/434A/436I)及抗TfR/BACE1(LALAPG/YTE)抗體之ADCC活性之影響的實驗結果，如實例8中所述。
圖24描繪了1511Gv.5親和力變異體15G11.52A及15G11.53A之重鏈及輕鏈可變區序列。根據Kabat之HVR係以下劃線指示。
圖25描繪了如實例1中所述的15G11v.5與抗TfRC12之間的競爭分析。
1. 定義
「親和力」係指一種分子(例如抗體)之單一結合位點與該分子之結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另作指示，否則如本文中所使用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間之1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可以解離常數(KD，其為X與Y之解離速率(kd或Koff)比X與Y之締合速率(ka或kon)的比率)表示。有關一或多種抗體對其靶之親和力的代用量度係其半數最大抑制濃度(IC50)，其為使已知配體與抗體靶之結合抑制50%所需之抗體量的一種量度。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。用於量測結合親和力之具體說明性且示例性實施例描述於本文中。「血腦屏障」或「BBB」係指在周圍循環與腦及脊髓(即，CNS)之間的生理屏障，其係藉由腦毛細血管內皮漿膜內之緊密連接所形成，由此建立了限制分子(甚至是極小分子，諸如尿素(60道爾頓))向腦中之轉運的緊密屏障。腦內之血腦屏障、脊髓內之血液-脊髓屏障及視網膜內之血液-視網膜屏障為CNS內之相鄰毛細血管屏障，且在本文中統稱作血腦屏障或BBB。BBB亦涵蓋學業-CSF屏障(脈絡叢)，其中該屏障包含室管膜細胞而非毛細血管內皮細胞。
術語「澱粉樣β蛋白(amyloid beta)」、「β-澱粉樣蛋白」、「Aβ(Abeta)」、「澱粉樣β蛋白(amyloid β)」及「Aβ」在本文中可互換使用，意思指在APP經β-分泌酶1(「BACE1」)裂解後產生的澱粉樣前驅蛋白(「APP」)之片段，以及其修飾、片段及任何功能等效物，包括(但不限於)Aβ1-40及Aβ1-42。已知Aβ係以單體形式存在，且締合形成寡聚物及原纖維結構，此可被發現為澱粉樣斑塊之組成成員。該Aβ肽之結構及序列係熟習此項技術者熟知的且製備該等肽或自腦及其他組織提取該等肽之方法描述於例如Glenner及Wong,Biochem Biophys Res.Comm.129：885-890(1984)中。此外，Aβ亦可以各種形式商購。
「抗Aβ免疫球蛋白」、「抗Aβ抗體」及「結合Aβ之抗體」在本文中可互換使用，且意思指特異性結合於人Aβ之抗體。抗Aβ抗體之非限制性實例為克雷內治單抗(crenezumab)。抗Aβ抗體之其他非限制性實例為蘇蘭珠單抗(solanezumab)、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、蓋特納單抗(gantenerumab)、艾杜卡單抗(aducanumab)、普恩珠單抗(ponezumab)及以下公開案中所揭示之任何抗Aβ抗體：WO2000162801、WO2002046237、WO2002003911、WO2003016466、WO2003016467、WO2003077858、WO2004029629、WO2004032868、WO2004032868、WO2004108895、WO2005028511、WO2006039470、WO2006036291、WO2006066089、WO2006066171、WO2006066049、WO2006095041、WO2009027105。
術語「克雷內治單抗」及「MABT5102A」在本文中可互換使用，且意思指結合於Aβ之單體、寡聚物及原纖維形式且與CAS註冊號1095207關聯的特定抗Aβ抗體。在一個實施例中，此類抗體包含圖18A及18B中所陳述之序列。
「脂蛋白元E4載體」或「ApoE4載體」在本文中可與「脂蛋白 元E4陽性」或「ApoE4陽性」互換使用，意思指具有至少一個脂蛋白元E4(或「ApoE4」)對偶基因之個體。不具有ApoE4對偶基因之個體在本文中稱為「ApoE4陰性」或「非ApoE4載體」。亦參看Prekumar等人，1996,Am.J Pathol.148：2083-95。
術語「血管源性腦水腫」係指腦部細胞內或細胞外空間中血管內流體或蛋白質之過量積累。血管源性腦水腫可藉由例如腦MRI，包括(但不限於)FLAIR MRI偵測，且可為無症狀的(「無症狀性血管源性水腫」)，或伴隨神經學症狀，諸如精神混亂、頭昏眼花、嘔吐及疲倦(「有症狀性血管源性水腫」)(參看Sperling等人，Alzheimer's & Dementia,7：367,2011)。
術語「腦大出血」係指直徑超過約1cm之區域的顱內出血，或腦中出血。腦大出血可藉由例如腦MRI，包括(但不限於)T2*加權之GRE MRI偵測，且可為無症狀的(「無症狀性大出血」)，或伴隨諸如短暫或持久病灶活動或感覺減弱、共濟失調、失語及發音困難之症狀(「有症狀性大出血」)(參看例如，Chalela JA,Gomes J.Expert Rev.Neurother.2004 4：267,2004；及Sperling等人，Alzheimer's & Dementia,7：367,2011)。
術語「腦微出血」係指直徑小於約1cm之區域的顱內出血，或腦中出血。腦微出血可藉由例如腦MRI，包括(但不限於)T2*加權之GRE MRI偵測，且可為無症狀的(「無症狀性微出血」)或可潛在地伴隨諸如短暫或持久病灶活動或感覺減弱、共濟失調、失語及發音困難之症狀(「有症狀性微出血」)。參看例如，Greenberg等人，2009,Lancet Neurol.8：165-74。
術語「腦溝積液(sulcal effusion)」係指腦部大溝或腦溝中流體積液。腦溝積液可藉由例如腦MRI，包括(但不限於)FLAIR MRI來偵測。參看Sperling等人，Alzheimer's & Dementia,7：367,2011。
術語「中樞神經系統表面含鐵血黃素沈積症(superficial siderosis of the central nervous system)」係指腦部蛛網膜下隙中流血或出血且可藉由例如腦MRI，包括(但不限於)T2*加權值GRE MRI來偵測。中樞神經系統表面含鐵血黃素沈積症之症狀指征包括感音神經性耳聾、小腦共濟失調及錐體束徵象。參看Kumara-N,Am J Neuroradiol.31：5,2010。
如本文中所使用，術語「澱粉樣變性」係指由澱粉樣蛋白或類澱粉樣蛋白引起或與之相關的一組疾病及病症，且包括(但不限於)由呈單體、原纖維或多聚體狀態，或三者之任何組合形式的類澱粉樣蛋白之存在或活性，包括由澱粉樣斑塊引起之疾病及病症。該等疾病包括(但不限於)繼發性澱粉樣變性及年齡相關性澱粉樣變性，諸如包括(但不限於)以下疾病：神經病症，諸如阿茲海默氏病(「AD」)；以認知記憶能力喪失為特徵之疾病或病狀，諸如輕度認知障礙(MCI)、路易體性癡呆(Lewy body dementia)、唐氏症候群(Down's syndrome)、伴隨澱粉樣變性之遺傳性腦出血(荷蘭型)、關島型帕金森氏症-癡呆複合症(Guam Parkinson-Demential complex)，及基於類澱粉樣蛋白或與之相關之其他疾病，諸如進行性核上麻痺、多發性硬化症、克羅伊茨費爾特雅各布氏病(Creutzfeld Jacob disease)、帕金森氏病、HIV相關性癡呆、ALS(肌萎縮側索硬化症)、包涵體肌炎(IBM)、成人發作型糖尿病、內分泌腫瘤及老年性心臟澱粉樣變性，及因β-澱粉樣蛋白沈積引起之各種眼部疾病，包括黃斑變性、脈絡膜疣相關性視神經病變、青光眼及白內障。
青光眼係一組涉及特有視神經病變模式之視網膜神經節細胞(RGC)喪失的視神經疾病。RGC為將視覺信號自眼睛傳遞至腦部之神經細胞。在細胞凋亡過程中，細胞凋亡過程中之兩種主要酶，即卡斯蛋白酶3及卡斯蛋白8活化，從而導致RGC之凋亡。卡斯帕酶-3裂解澱 粉樣前驅蛋白(APP)產生神經毒性片段，包括Aβ。在無APP保護作用情況下，Aβ積累於視網膜神經節細胞層中，導致RGC死亡及視力之不可逆喪失。
青光眼通常(但不一定)伴發眼壓增加，此可由眼房水循環或其排水堵塞引起。儘管眼內壓升高係發展青光眼之重要風險因素，但無法界定會對引起青光眼起決定性作用之眼內壓臨限值。該損傷亦可能由重要視神經纖維之血液供應不足、神經結構薄弱及/或神經纖維本身之健康問題所引起。未經治療之青光眼導致視神經之永久損傷且隨之產生視場損失，此可能發展成失明。
如本文中所使用(例如，「診斷患有輕度AD」之患者)，術語「輕度阿茲海默氏病」或「輕度AD」係指以MMSE評分為20至26分為特徵的AD之一個階段。
如本文中所使用，術語「輕度至中度阿茲海默氏病」或「輕度至中度AD」涵蓋輕度及中度AD，且以MMSE評分為18至26分為特徵。
如本文中所使用(例如，「診斷患有中度AD之患者」)，術語「中度阿茲海默氏病」或「中度AD」係指以MMSE評分為18至19分為特徵的AD之一個階段。
「中樞神經系統」或「CNS」係指控制身體功能之神經組織的複合體，且包括腦及脊髓。
「血腦屏障受體」(本文縮寫為「BBB-R」)為在腦內皮細胞上表現的能夠跨血腦屏障轉運分子之跨膜受體蛋白。BBB-R之實例包括(但不限於)：轉鐵蛋白受體(TfR)；胰島素受體；類胰島素生長因子受體(IGF-R)；低密度脂蛋白受體，包括(但不限於)低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)及低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)；葡萄糖轉運蛋白1(Glut1)；及肝素結合之表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。本 文之例示性BBB-R為轉鐵蛋白受體(TfR)。
除非另作指示，否則如本文中所使用，術語「轉鐵蛋白受體」或「TfR」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何天然TfR。該術語涵蓋「全長」未加工之TfR以及由在細胞中加工得到之任何TfR形式。該術語亦涵蓋TfR之天然存在之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。TfR係涉及脊椎動物中鐵吸收的由兩個二硫鍵鍵接之次單元(各自之表觀分子量為約90,000)構成的跨膜糖蛋白(分子量為約180,000)。在一個實施例中，本文中之TfR為包含如Schneider等人，Nature 311：675-678(1984)，例如(SEQ ID NO：1)中所陳述之胺基酸序列的人類TfR(「hTfR」)。在另一實施例中，本文中之TfR為包含如Genbank參考號AFD18260.1(SEQ ID NO：2)中所陳述之胺基酸序列的靈長類動物TfR(「pTfR」)。為作比較，可在Genbank參考號AAH54522.1(SEQ ID NO：3)中發現小鼠TfR序列。
如本文中所使用，「神經病症」係指影響CNS及/或具有在CNS中之病源學的疾病或病症。例示性CNS疾病或病症包括(但不限於)神經病、澱粉樣變性、癌症、眼部疾病或病症、病毒或微生物感染、炎症、局部缺血、神經退化性疾病、癲癇發作、行為障礙及溶酶體貯積病。出於本申請案之目的，應瞭解CNS包括眼睛，其通常由血液-視網膜屏障與身體其餘部分隔開。神經病症之具體實例包括(但不限於)神經退化性疾病(包括(但不限於)路易體病(Lewy body disease)、脊髓灰質炎後症候群、夏伊-德雷格症候群(Shy-Draeger syndrome)、橄欖體腦橋小腦萎縮、帕金森氏病、多系統萎縮症、紋狀體黑質變性、τ蛋白病(包括(但不限於)阿茲海默氏症病及核上麻痺)、朊病毒疾病(包括(但不限於)牛海綿狀腦病、綿羊癢病、克羅伊茨費爾特-雅各布氏症候群(Creutzfeldt-Jakob syndrome)、庫魯症(kuru)、格斯特曼-斯脫司 勒-史茵格氏病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、慢性消耗性疾病及致死性家族性失眠症)、延髓性麻痺、運動神經元病及神經系統遺傳性退化性病症(包括(但不限於)卡那文病(Canavan disease)、亨丁頓氏病(Huntington's disease)、神經元蠟樣脂褐質沈積症、亞歷山大氏病(Alexander's disease)、妥瑞氏症候群(Tourette's syndrome)、麥克氏卷髮症候群(Menkes kinky hair syndrome)、科凱恩症候群(Cockayne syndrome)、哈-斯二氏症候群(Halervorden-Spatz syndrome)、拉福拉病(lafora disease)、蕾特氏症候群(Rett syndrome)、肝豆狀核變性、萊-納二氏症候群(Lesch-Nyhan syndrome)及翁韋里希特-倫德伯格症候群(Unverricht-Lundborg syndrome))、癡呆(包括(但不限於)皮克氏病(Pick's disease)及脊髓小腦失調)、癌症(例如CNS之癌症，包括由體內別處癌症引起之腦轉移)。
「神經病症藥物」為治療一或多種神經病症之藥物或治療劑。本發明之神經病症藥物包括(但不限於)抗體、肽、蛋白質、一或多種CNS靶之天然配體、一或多種CNS靶之天然配體的經修飾型式、適體、抑制性核酸(亦即，小抑制性RNA(siRNA)及短髮夾RNA(shRNA))、核糖核酸酶及小分子，或上述任一者之活性片段。本發明之例示性神經病症藥物描述於本文中且包括(但不限於)：抗體、適體、蛋白質、肽、抑制性核酸及小分子，以及上述任一者之活性片段，其本身為或特異性識別及/或作用於(亦即，抑制、活化或偵測)CNS抗原或靶分子，諸如(但不限於)澱粉樣前驅蛋白或其部分、澱粉樣蛋白β、β-分泌酶、γ-分泌酶、τ蛋白、α-突觸核蛋白、泊蛋白、亨廷頓蛋白、DR6、早老素、ApoE、神經膠質瘤或其他CNS癌症標記物，及神經營養因子。神經病症藥物之非限制性實例及可使用其治療之病症提供於下表1中：
「顯影劑」為具有允許直接或間接偵測存在及/或位置之一或多種特性的化合物。該等顯影劑之實例包括併入允許偵測之經標記部分的蛋白質及小分子化合物。
「CNS抗原」或「腦抗原」為在CNS(包括腦)中表現之抗原，其可由抗體或小分子靶向。該等抗原之實例包括(但不限於)：β-分泌酶1(BACE1)、澱粉樣蛋白β(Aβ)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、τ蛋白、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白、普里昂蛋白質(PrP)、富含白胺酸之重複激酶2(LRRK2)、泊蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、澱粉樣前驅蛋白(APP)、p75神經營養因子受體(p75NTR)、白介素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、白介素1β(IL1β)及卡斯蛋白酶6。在一個實施例中，該抗原為BACE1。
除非另作指示，否則如本文中所使用，術語「BACE1」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))的任何天然β-分泌酶1(亦稱為β位點澱粉樣 前驅蛋白裂解酶1、膜相關天冬胺酸蛋白酶2、切割酶2(memapsin 2)、天冬胺醯基蛋白酶2或Asp2)。該術語涵蓋「全長」未加工之BACE1以及由在細胞中加工產生之BACE1之任何形式。該術語亦涵蓋BACE1之天然存在之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。例示性BACE1多肽之胺基酸序列為如Vassar等人，Science 286：735-741(1999)中所報導之人類BACE1同功異型物A的序列，該文獻以全文引用之方式併入本文中。存在人類BACE1之若干其他同功異型物，包括同功異型物B、C及D。參見UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817，其以全文引用之方式併入本文中。
術語「抗β-分泌酶抗體」、「抗BACE1抗體」、「結合至β-分泌酶之抗體」及「結合至BACE1之抗體」係指能夠以足夠親和力結合BACE1之抗體，從而該抗體可用作靶向BACE1之診斷及/或治療劑。在一個實施例中，抗BACE1抗體與不相關之非BACE1蛋白質之結合程度為抗體與BACE1之結合的約10%以下，如例如由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至BACE1之抗體的解離常數(Kd)1μM，100nM，10nM，1nM，0.1nM，0.01nM，或0.001nM(例如，10-8M或10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗BACE1抗體結合至BACE1之在不同物種之BACE1及同功異型物之間保守的抗原決定基。在一個實施例中，提供了結合至BACE1上由抗BACE1抗體YW412.8.31所結合之抗原決定基的抗體。在其他實施例中，提供了結合至BACE1內位於BACE1之催化結構域中之外結合位點(exosite)的抗體。在一個實施例中，提供了與Kornacker等人，Biochem.44：11567-11573(2005)(其以全文引用之方式併入本文中)中所鑑別之肽(亦即，肽1、2、3、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、2-12、3-12、4-12、5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12、4、5、6、5-10、5-9、混雜肽、Y5A、P6A、 Y7A、F8A、I9A、P10A及L11A)競爭結合至BACE1的抗體。例示性BACE1抗體序列描繪於圖15A-B及圖16A-B中。本文中之一種例示性抗體包含抗YW412.8.31(例如，如圖15A-B中)之可變結構域。
本文中之「天然序列」蛋白質係指包含在自然界中所見之蛋白質(包括天然存在之蛋白質變異體)之胺基酸序列的蛋白質。如本文中所使用，該術語包括自天然來源分離或重組產生之蛋白質。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需之抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指並非完整抗體之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原之一部分。抗體片段之實例為此項技術中熟知的(參看例如，Nelson,MAbs(2010)2(1)：77-83)且包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2及Fv；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，包括(但不限於)單鏈可變片段(scFv)、具有或不具有連接子(且視情況串聯的)輕鏈及/或重鏈抗原結合結構域之融合物；及有抗體片段形成的單特異性或多特異性抗原結合分子(包括(但不限於)由多個可變結構域構建之缺乏Fc區之多特異性抗體。
如本文中所使用，術語「單株抗體」係指自實質上均質之抗體群獲得的抗體，亦即，包含該等個別抗體之群體除例如含有天然存在之突變或可能在單株抗體之產生期間產生的可能之變異體外為一致的及/或結合相同抗原決定基，該等變異體一般以極少量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相對，單株抗體製劑之每一單株抗體係針對抗原上之單個決定子。修飾語「單株」指示抗體自實質上均質之抗體群體獲得之特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術產生，包括(但不限於)融合瘤法(參看例如， Kohler等人，Nature,256：495(1975))、重組DNA法(參看例如，美國專利第4,816,567號)、噬菌體呈現法(例如，使用using the techniques described in Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中描述之技術)及利用含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分之轉殖基因動物的方法，該等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法描述於本文中。本文之單株抗體之具體實例包括嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體，包括其抗原結合片段。
本文之單株抗體特定地包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重鏈及/或輕鏈與源自於特定物種或屬於特定抗體種類或亞類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(該等)鏈之其餘部分與源自於另一物種或屬於另一抗體種類或亞類之抗體中的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現出所需生物學活性即可(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
出於本文之目的，「接受體人類構架」為包含來源於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架(如以下所定義)之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下、或2個或2個以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架在序列上一致。
「人類共同構架」為代表所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列 中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變結構域序列之亞群。一般而言，該序列亞群係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，該亞群為如Kabat等人(同上文)中之亞群κI。在一個實施例中，對於VH，該亞群為如Kabat等人(同上文)中之亞群III。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為含有最少的來源於非人類抗體之序列的嵌合抗體。大多數人類化抗體為人類抗體(接受體抗體)，其中來自接受體之高變區的殘基經來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種(供體抗體)之高變區的具有所需特異性、親和力及能力之殘基置換。舉例而言，在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上所有的至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有HVR(例如CDR)對應於非人類抗體之高變區並且所有或實質上所有構架區(FR)對應於人類抗體之FR區。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含不曾在接受體抗體或供者抗體中發現之殘基。進行此等修飾以進一步改善抗體效能。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上所有的至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有高變區對應於非人類抗體之高變區並且所有或實質上所有FR區對應於人類抗體之FR區，但如上述之FR取代除外。人類化抗體視情況還將包含抗體恆定區之至少一部分，通常為人類抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。欲知詳情，參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
本文中之「人類抗體」係指該抗體包含之胺基酸序列結構對應於由人類或人類細胞所產生或由非人類來源利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列所衍生抗體之胺基酸序列結構。該人類抗體定義特定地排除了包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。該等抗體可藉由多種技術來鑑別或製備，包括(但不限於)：藉由在免疫接種之後能夠在不產生內源免疫球蛋白情況下產生人類抗體的轉殖基因動物(例如小鼠)產生(參看例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.,7：33(1993)；及美國專利第5,591,669號、第5,589,369號及第5,545,807)號)；自表現人類抗體或人類抗體片段之噬菌體呈現文庫選擇(參看例如，McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)；Johnson等人，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)；Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)；美國專利第5,565,332號及第5,573,905號)；經由活體外活化之B細胞產生(參看美國專利5,567,610及5,229,275)；及自產生人類抗體之融合瘤分離。
本文中之「多特異性抗體」為對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性之抗體。例示性多特異性抗體可同時結合TfR及腦抗原。多特異性抗體可以全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)形式製備。亦涵蓋具有兩個、三個或三個以上(例如四個)功能性抗原結合位點的經工程改造之抗體(參看例如，Miller等人之美國申請案第US 2002/0004587 A1號)。多特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製備。
本文中之抗體包括抗原結合或生物活性改變之「胺基酸序列變異體」。該等胺基酸改變之實例包括對抗原之親和力增強之抗體(例如 「親和力成熟」抗體)，及可能存在Fc區改變，例如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(增加或降低)(參看例如，Presta,L.之WO 00/42072；及Iduosogie等人之WO 99/51642)；及/或血清半衰期延長或縮短(參看例如，Presta,L.之WO00/42072)之抗體。
「親和力修飾之變異體」具有親本抗體(例如親本嵌合、人類化或人類抗體)之一或多個改變(增加或降低)親和力之經取代高變區或構架殘基。用於產生該等取代變異體之便利方法使用噬菌體呈現。簡言之，使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在每一位點處產生所有可能之胺基取代。由此產生之抗體變異體自絲狀噬菌體顆粒以單價方式作為與封裝於每一顆粒中之M13之基因III產物的融合物形式呈現。接著針對經噬菌體呈現之變異體之生物活性(例如結合親和力)篩選經噬菌體呈現之變異體。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變誘發以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。替代地或另外，分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與其靶之間的接觸點可為有益的。該等接觸殘基及鄰近殘基為根據本文中詳述之技術進行取代的候選物。在產生該等變異體後，對變異體組進行篩選且可選擇親和力改變之抗體以用於進一步研發。
「pH敏感性抗體變異體」為在第一pH值下對於靶抗原具有的結合親和力不同於在不同pH值下其對於該靶抗原之結合親和力的抗體變異體。作為非限制性實例，本發明之抗TfR抗體可經選擇或工程改造成與TfR具有pH敏感性結合，由此其在pH 7.4之血漿中以所需低親和力(如本文所述)結合於細胞表面TfR，但在內化至細胞內體區室中之後，在相對較低之pH值(pH 5.5-6.0)下迅速自TfR解離；此解離可保護該抗體免於發生抗原介導之清除，且增加傳遞至CNS或跨BBB返回循環之抗體的量-在任一情形中，該抗體之有效濃度均相對於不包含 此pH敏感性之抗TfR抗體有所增加(參看例如，Chaparro-Riggers等人，J.Biol.Chem.287(14)：11090-11097；Igawa等人，Nature Biotechnol.28(11)：1203-1208)。一般熟習此項技術者可易於測定TfR及所結合之化合物在血清pH值及細胞內體區室pH值下所需之親和力組合。
本文中之抗體可與「異源分子」結合例如以延長半衰期或增強穩定性或以其他方式改善抗體。舉例而言，抗體可連接至多種非蛋白質聚合物中之一者，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物。連接至一或多個PEG分子之抗體片段(諸如Fab')為本發明之一例示性實施例。在另一實例中，該異源分子為一種治療化合物或觀測劑(亦即，可偵測標記)，且該抗體被用於跨BBB轉運該異源分子。異源分子之實例包括(但不限於)化合物、肽、聚合物、脂質、核酸及蛋白質。
本文中之抗體可為「糖基化變異體」，以致連接至Fc區之任何糖基化(若存在的話)改變，即，存在/或不存在修飾，或類型經修飾。舉例而言，具有缺乏連接至抗體Fc區之海藻糖之成熟碳水化合物結構的抗體已描述於美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta,L.)中。亦參看US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。在連接至抗體Fc區之碳水化合物中具有對分N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)之抗體參見WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)及美國專利第6,602,684號(Umana等人)。連接至抗體Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體報導於WO 1997/30087(Patel等人)中。有關具有連接至抗體Fc區之經變化之碳水化合物的抗體，亦參看WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)。亦參看US 2005/0123546(Umana等人)，其描述了具有經修飾之糖基化之抗體。Fc區中共同糖基化序列之突變(在297-299位為Asn-X-Ser/Thr，其中X不為脯胺酸)，例如藉由使此序列之Asn突變成任何其它胺基酸；藉由在298位置放Pro；或藉由將299位 修飾成除Ser或Thr外之任何胺基酸，應廢除該位置處之糖基化(參看例如，Fares Al-Ejeh等人，Clin.Cancer Res.(2007)13：5519s-5527s；Imperiali及Shannon,Biochemistry(1991)30(18)：4374-4380；Katsuri,Biochem J.(1997)323(Pt 2)：415-419；Shakin-Eshleman等人，J.Biol.Chem.(1996)271：6363-6366)。
如本文中所使用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變結構域中具有高變序列(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構確定之環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸」)之每一區域。一般而言，抗體包含六個HVR：三個位於VH中(H1，H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。本文中之例示性HVR包括：(a)在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處出現之高變環(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；(b)在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處出現之CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；(c)在胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處出現之抗原接觸(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
在一個實施例中，HVR殘基包含圖3A-D或4A-D、表4或表5或本說明書中別處所鑑別之殘基。
除非另作指示，否則可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘 基)係根據上文Kabat等人進行編號。
「構架」或「FR」殘基為除如本文中所定義之高變區殘基以外的彼等可變結構域殘基。可變結構域之FR一般由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般按以下順序出現於VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。在某些實施例中，一或多個FR殘基可經修飾以調節該抗體之穩定性或調節該抗體一或多個HVR之三維定位，以例如增強結合。
「全長抗體」為包含抗原結合可變區以及輕鏈恆定結構域(CL)及重鏈恆定結構域(CH1、CH2及CH3)之抗體。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如人類天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變異體。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，意思指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
「裸抗體」係指未結合至異源部分(例如，細胞毒性部分或放射性標記)之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有變化之結構的天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓之雜四聚醣蛋白，由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N末端至C末端，每一重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域，繼而為3個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N末端至C末端，，每一輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域，繼而為恆定輕鏈(CL)結構域。抗體之輕鏈可基於其恆定結構域之胺基酸序列而歸為兩種類型中之一種，稱為κ及λ。
抗體「效應功能」係指引起除補體路徑之活化外之免疫系統活化的抗體之生物活性。該等活性主要見於抗體之Fc區(天然序列Fc區 或胺基酸序列變異體Fc區)。抗體效應功能之實例包括例如Fc受體結合及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在一個實施例中，本文中之抗體基本上缺乏效應功能。在另一個實施例中，本文中之抗體保留了極少的效應功能。改變或消除效應功能之方法為此項技術中熟知的且包括(但不限於)消除負責效應功能之Fc區的全部或一部分(亦即，使用缺乏全部或一部分Fc區之型式的抗體或抗體片段，諸如(但不限於)Fab片段、單鏈抗體及其類似物，如本文中所述且如此項技術中所知)；對Fc區之一或多個胺基酸位置進行修飾以消除效應功能(影響Fc結合位置：238、239、248、249、252、254、256、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、311、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、436、437、438及439；及對該抗體之糖基化進行修飾(包括(但不限於)在不允許野生型哺乳動物糖基化之環境中製備抗體、自已糖基化之抗體移除一或多個碳水化合物基團及對抗體一或多個胺基酸位置進行修飾以消除抗體在該等位置糖基化之能力(包括(但不限於)N297G及N297A及D265A)。
抗體「補體活化」功能，或抗體實現或觸發「補體路徑活化」之特性可互換使用，且意思指抗體接合或刺激個體免疫系統中之補體路徑的生物活性。該等活性包括例如C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)，且可藉由抗體之Fc部分及非Fc部分介導。改變或消除補體活化功能之方法為此項技術中熟知的且包括(但不限於)消除負責補體活化之Fc區之全部或一部分(亦即，使用缺乏全部或一部分Fc區之型式的抗體或抗體片段，諸如(但不限於)Fab片段、單鏈抗體及其類似物，如本文中所述且如此項技術中所知)；或對Fc區中已知涉及C1q活化之一或多個胺基酸位置進行修飾以消除或減少與補體組分之相互作用或活化補體組分之能力，諸如位置270、322、329及321)，及修飾 或消除負責補體活化之非Fc區之一部分(亦即，對CH1區之132-位置進行修飾(參看例如，Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223))。
取決於全長抗體重鏈之恆定結構域的胺基酸序列，全長抗體可歸為不同「類別」。存在五個主要類別之全長抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干類別可進一步分成「子類」(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於不同類別抗體之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、λ及μ。此項技術中熟知不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維組態。
如本文中所使用，術語「重組抗體」係指由包含編碼抗體之核酸的重組宿主細胞表現之抗體(例如嵌合、人類化或人類抗體，或其抗原結合片段)。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且意思指引入了外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型株」及「經轉型細胞」，其包括原代轉型細胞及來源於其之子代，不管傳代次數如何。子代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，而且可含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩選或選擇的具有相同功能或生物活性之突變子代。用於產生重組抗體之「宿主細胞」的實例包括：(1)哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS、骨髓瘤細胞(包括Y0及NS0細胞)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、Hela細胞及Vero細胞；(2)昆蟲細胞，例如sf9、sf21及Tn5；(3)植物細胞，例如屬於菸草屬(Nicotiana)之植物(例如菸草(Nicotiana tabacum))；(4)酵母細胞，例如屬於酵母菌屬(Saccharomyces)之酵母細胞(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或屬於米麴菌屬(Aspergillus)之酵母細胞(例如黑麴菌(Aspergillus niger))；(5)細菌細胞，例如大腸桿菌(Escherichia.coli)細胞或枯草桿菌(Bacillus subtilis)細胞等。
如本文中所使用，「特異性結合」或「特異性結合至」係指抗體選擇性或優先結合至抗原。結合親和力一般使用標準分析(諸如斯卡查德分析(Scatchard analysis)或表面電漿子共振技術(例如使用BIACORE®))來測定。
與參照抗體「結合至相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析中將參照抗體與其抗原之結合阻斷50%或50%以上之抗體，及反之，參照抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或50%以上。在一個實施例中，形成本發明之雙特異性或多特異性抗體中之一者的抗BACE1抗體結合至YW412.8.31所結合之BACE1。本文提供一種例示性競爭分析。
如本文中所使用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、及Lu放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核分解酶；抗生素；毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；及本文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時間有效達成所需治療或預防結果之量。
術語「Fc區」在本文中用於定義含有至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈的C末端區域。該術語包括天然序列Fc區及變異體Fc區。 在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可存在或不存在。除非本文另作具體說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
如本文中所使用，術語「FcRn受體」或「FcRn」係指已知涉及母體IgG經由人類或靈長類動物胎盤，或卵黃囊(兔)轉移至胎兒及自初乳經由小腸轉移至新生兒的Fc受體(「n」指示新生兒)。亦已知FcRn涉及藉由結合IgG分子且將其再循環至血清中來維持恆定血清IgG含量。「FcRn結合區」或「FcRn受體結合區」係指抗體與FcRn受體相互作用之部分。在抗體FcRn結合區中之某些修飾使該抗體或其片段對FcRn之親和力增加，且亦增加該分子之活體內半衰期。在以下一或多個胺基酸位置中之胺基酸取代使抗體與FcRn受體之相互作用增加：251、256、285、290、308、314、385、389、428、434及436。在以下位置處之取代亦增加抗體與FcRn受體之相互作用：238、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如(美國專利第7,371,826號)之取代。
「免疫結合物」為結合至包括(但不限於)標記或細胞毒性劑之一或多個異源分子的抗體。該結合視情況經由連接子進行。
如本文中所使用，「連接子」為將抗TfR抗體共價或非共價連接至異源分子之結構。在某些實施例中，連接子為肽。在其他實施例中，連接子為化學連接子。
「標記」為與本文之抗體偶合且用於偵測或顯影之標記物。該等標記之實例包括：放射性標記、螢光團、發色團或親和力標籤。在 一個實施例中，標記為用於醫學顯影之放射性標記，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳、鐵等。
「個體」或「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體或個體為人類。
「經分離」抗體為與自然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體係純化至大於95%或99%純度，如由例如電泳法(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析法(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評估抗體純度之方法的評述，參看例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「經分離核酸」係指已與其天然環境組分分離之核酸分子。經分離核酸包括這樣一種核酸分子，其含於通常含有該核酸分子之細胞中，但該核酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
「編碼抗TfR抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括在單一載體或單獨載體中之該(該等)核酸分子，及存在於宿主細胞中一或多個位置處的該(該等)核酸分子。
術語「藥品說明書」用於指示市售治療產品包裝中慣常包括之說明，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌症之資訊及/或關於使用該治療產品之警告。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一 致性百分比之後，且在不將任何保守型取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術內之多種方式，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體，達成比對以測定胺基酸序列一致性百分比的目的。熟習此項技術者可確定適於比對序列之參數，包括在所比較之序列之全長內達成最大對準所需的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.創作，且源程式碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office)(Washington D.C.,20559)存檔，在該版權局其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開獲得，或可自源程式碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯以供在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，如下計算給定胺基酸序列A對於、與、或相對於給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可稱為給定胺基酸序列A具有或包含對於、與、或相對於給定胺基酸序列B之某一胺基酸序列一致性%)：100乘以分數X/Y
其中X為在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配的胺基酸殘基數目，且其中Y為B中胺基酸殘基總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A與B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B與A之胺基酸序列一致性百分比。除非另作明確規定，否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性百分比值均如前一段中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈允許所含活性成分之生物活性有效之形式且不含對將投與調配物之個體產生不可接受之毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外的對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所使用，「治療(treatment)」(及其語法變體，諸如「治療(treat)」或「治療(treating」)係指試圖改變所治療之個體的自然病程之臨床干預，且可出於預防而進行或在臨床病理學病程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病出現或復發、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態，及緩和或改善預後。在一些實施例中，本發明抗體被用於延遲疾病之產生或減慢疾病進展。
術語「可變區」或「可變結構域」係指涉及抗體與抗原之結合的抗體重鏈或輕鏈之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)一般具有類似結構，其中每一結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參看例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體的VH或VL結構域，分別篩選互補VL或VH結構域之文庫來進行分離。參看例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所使用，術語「載體」係指能夠傳播所連接之另一核酸的一種核酸分子。該術語包括呈自我複製型核酸結構形式之載體以及併入其所引入之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠引導其可 操作地連接之核酸之表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
2. 組合物及方法 A. 抗TfR抗體及其結合物之產生
在一個態樣中，本發明係部分基於可用於跨BBB轉運所需分子之抗TfR抗體。在某些實施例中，提供了結合至人類TfR之抗體。在某些實施例中，提供了結合至人類TfR及靈長類動物TfR之抗體。本發明之抗體可用於例如診斷或治療影響腦及/或CNS之疾病。
A. 例示性抗TfR抗體
在一個態樣中，本發明提供了結合至TfR之經分離抗體。在某些實施例中，本發明之抗TfR抗體特異性結合至人類TfR及靈長類動物TfR。在某些此類實施例中，本發明之抗TfR抗體不抑制轉鐵蛋白與TfR之結合。在某些此類實施例中，本發明之抗TfR抗體結合至TfR之頂端結構域。在其他此類實施例中，本發明之抗TfR抗體結合至TfR之非頂端結構域。在某些態樣中，抗TfR抗體可用於跨BBB轉運一或多種所結合之顯影或治療化合物。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系7A4，如圖3A及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序 列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系8A2，如圖3A及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系15D2，如圖3A及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系10D11，如圖3A及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30 之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系7B10，如圖3A及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系15G11，如圖3B及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系16G5，如圖3B及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另 一態樣中，該抗體為純系13C3，如圖3B及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系16G4，如圖3B及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系16F6，如圖3C及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系7G7，如圖3D及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、 兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系4C2，如圖3D及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系1B12，如圖3D及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系13D4，如圖3D及表4中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序 列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。在另一態樣中，該抗體為純系7A4.v15，如圖4B及表5中所示。
以上純系在四個互補組內，且在HVR內具有序列相似性。如表4中所示，共同序列易於自關於每一HVR所提供之抗體序列得到。作為一個非限制性實例，I類抗體共同HVR如下：HVR-L1：Arg-Ala-Ser-Gly-Ser-Val-Asp-[Ser或Asp]-Tyr-Gly-[Asn或Pro]-Ser-Phe-Met-His(SEQ ID NO：45)；HVR-L2：Arg-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser(SEQ ID NO：30)；HVR-L3：Gln-[Gln或His]-Ser-Asn-Glu-[Ala,Gly或Asp]-Pro-Pro-Thr(SEQ ID NO：46)；HVR-H1：Asp-Tyr-[Ala或Gly]-Met-His(SEQ ID NO：47)；HVR-H2：[Gly或Val]-Ile-Ser-[Thr,Phe或Pro]-Tyr-[Phe或Ser]-Gly-[Arg或Lys]-Thr-Asn-Tyr-[Asn或Ser]-Gln-[Lys或Asn]-Phe-[Lys或Met]-Gly(SEQ ID NO：48)；HVR-H3：Gly-Leu-Ser-Gly-Asn-[Tyr或Phe]-Val-[Met或Val]-Asp-[Tyr或Phe](SEQ ID NO：49)。(參看表4)。II類及IV類之共同序列亦提供於表4中。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之 HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。
在一個態樣中，本發明提供一種抗TfR抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列之HVR-L3。在一個態樣中，該抗體包含全部六個上述HVR序列。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含以上所述任一抗體之至少一個、至少兩個或全部三個VH HVR序列。在一個實施例中，該抗體包含以上所述任一抗體之HVR-H3序列。在另一實施例中，該抗體包含以上所述任一抗體之HVR-H3及HVR-L3序列。在另一實施例中，該抗體包含以上所述任一抗體之HVR-H3、HVR-L3及HVR-H2序列。在另一實施例中，該抗體包含以上所述任一抗體之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3序列。在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含以上所述任一抗體之至少一個、至少兩個或全部三個VL HVR序列。在一個實施例中，該抗體包含以上所述任一抗體之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3序列。
在另一態樣中，本發明之抗體包含：(a)包含選自以上所述任一 抗體之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3序列之至少一個、至少兩個或全部三個VH HVR序列的VH結構域；及(b)包含選自以上所述任一抗體之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3序列之至少一個、至少兩個或全部三個VL HVR序列的VL結構域。
在以上任一實施例中，抗TfR抗體為人類化的。在一個實施例中，抗TfR抗體包含如以上任一實施例中之HVR，且進一步包含接受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在另一實施例中，抗TfR抗體包含如以上任一實施例中之HVR，且進一步包含在一或多個FR區中含一或多個胺基酸取代之VH或VL。根據本文中之實例2，申請者對選自以上抗體之某些抗體進行了丙胺酸掃描，且確定儘管在所選FR位置處存在胺基酸修飾，但仍獲得類似或改善之結合。如圖6-1及6-2及本文之實例2中所示，對於第I-III類抗體組，在FR之一或多個殘基處具有修飾之抗體的變體形式保持親和力及結合特異性。舉例而言，對於抗體15G11，在輕鏈FR2之43位及48位、重鏈FR2之48位及重鏈FR3之67位、69位、71位及73位可如圖6-1及6-2中所示進行修飾，且所得抗體仍保持對於人類/靈長類動物TfR之特異性及強結合親和力。在另一實例中，對於抗體7A4，在輕鏈FR3之58位及68位、重鏈FR1之24位及重鏈FR3之71位可如圖6-1及6-2中所示進行修飾，且所得抗體仍保持對於人類/靈長類動物TfR之特異性及強結合親和力。在第三實例中，對於抗體16F6，在輕鏈FR2之43位及44位及重鏈FR3之71位及78位可如圖6-1及6-2中所示進行修飾，且所得抗體仍保持對於人類/靈長類動物TfR之特異性及強結合親和力。在另一態樣中，抗TfR抗體包含與SEQ ID NO：7-10、15-18、20、25-28、108、114、120及126中之任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗TfR抗體保持結合至TfR的能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：7-10、15-18、20、25-28、108、114、120及126之任一者中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失係在HVR外之區域(亦即，在FR中)發生。視情況，抗TfR抗體包含SEQ ID NO：7-10、15-18、20、25-28、108、114、120及126之任一者之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，特定抗體之VH包含一個、兩個或三個選自以上及表4或5中關於該特定抗體所陳述之HVR之HVR。本發明抗體之VH序列顯示於本文之圖3及4中。
在另一態樣中，提供一種抗TfR抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：4-6、11-14、19、21-24、105、111、117及123中之任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗TfR抗體保持結合至TfR的能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：4-6、11-14、19、21-24、105、111、117及123之任一者中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失係在HVR外之區域(亦即，在FR中)發生。視情況，抗TfR抗體包含SEQ ID NO：4-6、11-14、19、21-24、105、111、117及123之任一者之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以上及表4或5中關於該特定抗體所陳述之HVR之HVR。本發明抗體之VL序列顯示於本文之圖3及4中。
在另一態樣中，提供一種抗TfR抗體，其中該抗體包含如以上所提供任何實施例中之VH及如以上所提供任何實施例中之VL。在一個實施例中，該抗體包含分別為SEQ ID NO：4及7；5及8；5及9；6及10；4及7；11及15；12及16；13及17；14及18；19及20；21及25；22及26；23及27；24及28；105及108；111及114；117及120；以及123及126之VL及VH序列，包括該等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，本發明提供一種與本文提供之抗TfR抗體結合相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供一種與抗TfR抗體結合相同抗原決定基之抗體，其包含分別具有SEQ ID NO：4及7；5及8；5及9；6及10；4及7；11及15；12及16；13及17；14及18；19及20；21及25；22及26；23及27；24及28；105及108；111及114；117及120；或123及126之VL及VH序列。在一個態樣中，該抗體與任何I類抗體(亦即，純系7A4、8A2、15D2、10D11或7B10，或該等抗體中任一者之親和力成熟型式)競爭結合至TfR。在另一態樣中，該抗體與任何II類抗體(亦即，純系15G11、16G5、13C3或16G，或該等抗體中任一者之親和力成熟型式)競爭結合至TfR。在另一態樣中，該抗體與純系16F6或其親和力成熟型式競爭結合至TfR。在另一態樣中，該抗體與任何IV類抗體(亦即，純系7G7、4C2、1B12或13D4，或其親和力成熟型式)競爭結合至TfR。
在本發明之另一態樣中，根據以上任一實施例之抗TfR抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一實施例中，抗TfR抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，該抗體為全長抗體，例如完整IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體，或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據以上任一實施例之抗TfR抗體可併入如以下章節1-7中所述之任何特徵中之一者或其組合。
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文提供之抗體的解離常數(Kd)1μM，100nM，10nM，1nM，0.1nM，0.01nM，或0.001nM(例如，10-8M或10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在本發明之某些態樣中，本發明之「低親和力」抗TfR抗體係例如基於實例5中及Atwal等人，Sci.Transl.Med.3,84ra43(2011)及Yu等人，Sci.Transl.Med.2011年5月25日：第3卷，第84期，第84ra44頁中之結果選擇，顯示了該等對於TfR具有低親和力之抗體在腦/CNS中呈現改善之CNS(例如腦)吸收及/或持久性。為鑑別該等低親和力抗體，可用各種用於量測抗體親和力之分析，包括(不限於)：斯卡查德分析以及表面電漿子共振技術(例如使用BIACORE®)。根據本發明一個實施例，該抗體對於人類或靈長類動物TfR具有約5nM，或約20nM，或約100nM，至約50μM，或至約30μM，或至約10μM，或至約1μM，或到約500nM之親和力。因此，例如，如藉由斯卡查德分析或BIACORE®所量測，該親和力可在約5nM到約50μM範圍內，或在約20nM到約30μM範圍內，或在約30nM到約30μM範圍內，或在約50nM到約1μM範圍內，或在約100nM到約500nM範圍內。在本發明另一實施例中，如藉由競爭性結合分析或BIACORE®所量測，該抗體自TfR之解離半衰期小於1分鐘、小於2分鐘、小於3分鐘、小於4分鐘、小於5分鐘或小於10分鐘至約20分鐘或至約30分鐘。
因此，本發明提供一種製備可用於跨血腦屏障轉運神經病症藥物之抗體的方法，該方法包含自一組抗體中選擇針對TfR之抗體，因為其對TfR之親和力在約5nM，或約20nM，或約100nM，至約50μM，或至約30μM，或至約10μM，或至約1μM，或至約500mM範圍內。因此，例如，如藉由斯卡查德分析或BIACORE®所量測，該親 和力可在約5nM到約50μM範圍內，或在約20nM到約30μM範圍內，或在約30nM到約30μM範圍內，或在約50nM到約1μM範圍內，或在約100nM到約500nM範圍內。如一般熟悉此項技術者所瞭解，將異源分子/化合物結合至抗體常因例如位阻或甚至因在製備具有一或多個結合至與抗體原始靶之不同之抗原的結合臂之多特異性抗體的情況下消除一個結合臂而降低抗體對其靶之親和力。在一個實施例中，如由BIACORE所量測，本發明之結合至抗BACE1的對TfR具特異性之低親和力抗體對TfR之Kd為約30nM。在另一實施例中，如由BIACORE所量測，本發明之結合至BACE1的對TfR具特異性之低親和力抗體對TfR之Kd為約600nM。在另一實施例中，如由BIACORE所量測，本發明之結合至BACE1的對TfR具特異性之低親和力抗體對TfR之Kd為約20μM。在另一實施例中，如由BIACORE所量測，本發明之結合至BACE1的對TfR具特異性之低親和力抗體對TfR之Kd為約30μM。
在一個實施例中，Kd係藉由放射性標記之抗原結合分析(RIA)來量測。在一個實施例中，RIA係以所關注抗體之Fab型式及其靶來進行。舉例而言，藉由在未標記抗原滴定系列存在下使Fab與最小濃度之經(125I)標記抗原平衡，接著用塗佈抗Fab抗體之板捕獲經結合抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(參看例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為確定分析條件，用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕獲抗Fab抗體(Cappel Labs)塗佈MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)隔夜，隨後在室溫(約23℃)下用PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在非吸附板(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與所關注Fab之連續稀釋液混合(例如按照Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中之抗VEGF抗體Fab-12之評估)。接著培育所關注之Fab隔夜；然而，培育可持續較長時期(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，在室溫下將混合物轉移至捕獲板中進行 培育(例如1小時)。接著移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)之PBS將板洗滌8次。當板乾燥時，添加150微升/孔之閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對板計數十分鐘。選擇提供小於或等於20%最大結合之每一Fab的濃度用於競爭性結合分析。
在一個態樣中，該RIA為斯卡查德分析。舉例而言，所關注之抗TfR抗體可使用乳過氧化酶方法碘化(Bennett及Horuk,Methods in Enzymology 288第134-148頁(1997))。放射性標記之抗TfR抗體係自游離125I-Na藉由使用NAP-5管柱之凝膠過濾來純化且量測其特異性活性。將50μL含有固定濃度之碘化抗體及遞減濃度的連續稀釋之未標記抗體之競爭反應混合物置放於96孔板中。在37℃下5% CO2中，在由補充有10% FBS、2mM L-麩醯胺酸及1×青黴素-鏈黴素之杜貝卡氏改善型伊格氏培養基(Dulbecco's modified eagle's medium，DMEM)(Genentech)組成的生長培養基中培養短暫表現TfR之細胞。使用Sigma細胞解離溶液使細胞自培養皿脫離，且用結合緩衝液(含1%牛血清白蛋白、50mM HEPES(pH 7.2)及0.2%疊氮化鈉之DMEM)洗滌。將經洗滌之細胞以於0.2mL結合緩衝液中約200,000個細胞之密度添加至含有50μL競爭反應混合物之96孔板中。在與細胞之競爭反應物中未標記抗體之最終濃度不同，以1000nM起始且接著藉由1：2倍稀釋降低得到10種濃度且包括未添加未標記抗體的僅含緩衝液之樣品。一式三份分析每種濃度之未標記抗體與細胞之競爭反應。在室溫下將競爭反應物與細胞一起培育2小時。2小時培育後，將競爭反應物轉移至過濾板中且用結合緩衝液洗滌四次以使游離抗體與結合之碘化抗體分離。藉由γ計數器對過濾器進行計數，且使用Munson及Rodbard(1980)之擬合算法評估結合資料以測定抗體之結合親和力。
可如下使用本發明之組合物進行例示性BIACORE®分析。使用 表面電漿子共振分析，使用BIACORE®-2000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下使用抗人類Fc套組(BiAcore Inc.,Piscataway,NJ)來量測Kd。簡言之，根據供應商之說明，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)使羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)活化。用10mM乙酸鈉(pH 4.0)將抗人類Fc抗體稀釋至50μg/ml，隨後以5微升/分鐘流速注射以達到約10000個反應單元(RU)之偶合蛋白。在注射抗體之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應組。對於動力學量測，注射含單特異性或多特異性抗TfR抗體變異體之HBS-P以達到約220RU，接著在25℃下以約30μl/min流速注射MuTfR-His於HBS-P中之兩倍連續稀釋液(0.61nM至157nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model；BIACORE®評估軟體3.2版)，藉由同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)係以koff/kon比率計算。參看例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。
根據另一實施例，使用表面電漿子共振分析，用BIACORE®-2000裝置(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下使用抗人類Fc套組(BiAcorc Inc.,Piscataway,NJ)來量測Kd。簡言之，根據供應商之說明，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)使羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)活化。用10mM乙酸鈉(pH 4.0)將抗人類Fc抗體稀釋至50μg/ml，隨後以5微升/分鐘流速注射以達到約10000個反應單元(RU)之偶合蛋白。在注射抗體之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應組。對於動力學量測，注射含抗TfR抗體變異體之HBS-P以達到約220RU，接著在25℃下以約30μl/min流速注射TfR-His於HBS-P中之兩倍連續稀釋液(0.61nM至157nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型 (BIACORE®評估軟體3.2版)，藉由同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)係以koff/kon比率計算。參看例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。
測定給定化合物之IC50的若干方法為此項技術中已知的；常用方法係進行競爭結合分析，諸如本文所述者。一般而言，高IC50值指示需要較多的抗體來抑制已知配體之結合，且由此抗體對該配體之親和力相對較低。相反，低IC50值指示需要較少的抗體來抑制已知配體之結合，且由此抗體對該配體之親和力相對較高。
量測IC50值之例示性競爭性ELISA分析係使用遞增濃度之抗TfR或抗TfR/腦抗原(亦即，抗TfR/BACE1、抗TfR/Aβ及其類似物)變異體抗體與生物素化之已知抗TfR抗體競爭結合至TfR。在4℃下，在塗有含2.5μg/ml純化之鼠類TfR細胞外結構域之PBS之Maxisorp板(Neptune,N.J.)中進行抗TfR競爭ELISA隔夜。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用Superblock阻斷緩衝劑(Thermo Scientific,Hudson,NH)之PBS溶液阻斷。將每一個別抗TfR或抗TfR/腦抗原(亦即，抗TfR/BACE1或抗TfR/Aβ)抗體(1：3連續稀釋)之滴定液與生物素化之已知抗TfR抗體(0.5nM最終濃度)組合且在室溫下添加至板中，保持1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板，且將HRP-抗生蛋白鏈菌素(Southern Biotech,Birmingham)添加至板中且在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板，且使用TMB受質(BioFX Laboratories,Owings Mills)偵測結合至該板之生物素化之抗TfR抗體。
2. 抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段，及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之評述，參看Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之評述，參看例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參看WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參看美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的。參看例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單結構域抗體為包含抗體之所有或一部分重鏈可變結構域或所有或一部分輕鏈可變結構域的抗體片段。在某些實施例中，單結構域抗體為人類單結構域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參看例如，美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種方法製備，包括(但不限於)完整抗體之蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文中所述。
3. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。本文中所關注之嵌合抗體包括「霊長類化」抗體，其包含來源於非人類靈長類動物(例如舊大陸猴(Old World Monkey)，諸如狒狒、恆河猴或食蟹獼猴)之可變結構域抗原結合序列及人類恆定區序列(美國專利第5,693,780號)。在另一實例 中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類抗體視情況亦將包含至少一部分人類恆定區。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代，例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法評述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述了特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了「表面重塑」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述了「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述了用於FR改組之「導引選擇」法)。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」法選擇之構架區(參看例如，Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；來源於具有特定亞組之輕鏈或重鏈可變區之人類抗體的共同序列的構架區(參看例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；及人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(see,e.g.,Almagro and Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及來源於篩選FR文庫之構架區(參看例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4. 人類抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體大體上描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)，及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
人類抗體可藉由向轉殖基因動物投與免疫原來製備，該轉殖基因動物已經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。此等動物通常含有置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中之全部或一部分人類免疫球蛋白基因座。在此等轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般為不活化的。關於由轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的評述，參看Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參看例如，美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其描述了XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，其描述了HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，其描述了K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其描述了VELOCIMOUSE®技術。來自由此等動物產生之完整抗體的人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合來進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株。(參看例如，Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86 (1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如描述於美國專利第7,189,826號(描述了自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述了人類-人類融合瘤)中之該等方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)，以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類來源之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變結構域序列來產生。此等可變結構域序列接著可與所需人類恆定結構域組合。下文描述自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
5. 來源於文庫之抗體
本發明之抗體可藉由篩選組合文庫中具有一或多種所需活性之抗體來分離。舉例而言，此項技術中已知用於產生噬菌體呈現文庫及篩選此等文庫中具有所需結合特徵之抗體的多種方法。此等方法評述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，且進一步描述於例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中。
在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因之譜系且在噬菌體文庫中隨機重組，其接著可如Winter等 人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構建融合瘤。作為替代，可對天然譜系(例如，來自人類)進行選殖以提供針對多種非自身抗原及自身抗原的單一抗體來源，而無需進行任何免疫接種，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)中所述。最後，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述，亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高可變CDR3區且完成活體外重排來合成產生天然文庫。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號，以及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，一種結合特異性係針對TfR且另一種針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至TfR之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現TfR之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參看Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))；及「按鈕與孔(knob-in-hole)」工程改造(參看例如，美 國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下方式製備：工程改造靜電牽引作用以製備抗體Fc雜二聚體分子(WO 2009/089004A1)；使兩種或兩種以上抗體或片段交聯(參看例如，美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參看例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術製備雙特異性抗體片段(參看例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參看例如，Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述。
本文之抗體或片段亦包括了包含結合至TfR以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙作用FAb」或「DAF」(參看例如US 2008/0069820)。
根據本發明之一個實施例，「偶合」係藉由產生多特異性抗體(例如雙特異性抗體)而達成。多特異性抗體為對至少兩種不同抗原或抗原決定基具有結合特異性之單株抗體。在一個實施例中，多特異性抗體包含結合TfR之第一抗原結合位點及結合腦抗原(諸如β-分泌酶1(BACE1)或Aβ，及本文所揭示之其他腦抗原)之第二抗原結合位點。
該等多特異性/雙特異性抗體所結合之例示性腦抗原為BACE1，且與其結合之例示性抗體為本文圖16A-B中之YW412.8.31抗體。
在另一實施例中，該腦抗原為Aβ，例示性該等抗體描述於WO2007068412、WO2008011348、WO20080156622及WO2008156621(以引用之方式清楚地併入本文中)中，其中例示性Aβ抗體包含了包括分別描述於圖11A及11B中之重鏈及輕鏈胺基酸序列的IgG4 MABT5102A抗體。
用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異性之 兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參看Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))；及「按鈕與孔」工程改造(參看例如，美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下方式製備：工程改造靜電牽引作用以製備抗體Fc雜二聚體分子(WO 2009/089004A1)；使兩種或兩種以上抗體或片段交聯(參看例如，美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參看例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術製備雙特異性抗體片段(參看例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參看例如，Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述。
具有三個或三個以上功能性抗原結合位點的工程改造之抗體，包括「Octopus抗體」或「雙可變結構域免疫球蛋白」(DVD)亦包括在本文中(參看例如，US 2006/0025576A1；及Wu等人，Nature Biotechnology(2007))。
7. 抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可需要改善抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成進行製備。此等修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內進行殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構建體，只要最終構建體具有所需特徵，例如抗原結合。
a)取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於進行取代突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守取代顯示於表2中「較佳取代」之標題下。更多實質改變提供於表2中「例示性取代」之標題下，且如以下參照胺基酸側鏈類別進一步描述。胺基酸取代可引入所關注抗體中且篩選具有所需活性，例如保留/改善之抗原結合、降低之免疫原性或改善之ADCC或CDC的產物。
胺基酸可根據共有側鏈性質進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。
一類取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有改進(例如改善)(例如增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。一種例示性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異體抗體，並針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改善抗體親和力。該等改變可在HVR「熱點」，亦即，由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變的密碼子所編碼的殘基(參看例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或接觸抗原之殘基中進行，其中所得變異體VH或VL之結合親和力經過測試。藉由構建二級文庫並自二級文庫再選擇來進行親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法之任一者(例如易出錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。接著產生二級文庫。接著篩選文庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導之方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。涉及抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來具體鑑別。尤其常以CDR-H3及CDR-L3為目標。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR 內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如，如本文所提供之保守性取代)。該等改變可例如在HVR中之抗原接觸殘基之外。在以上提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於鑑別抗體中可靶向用於突變誘發之殘基或區域的一種有用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在該方法中，鑑別一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且藉由帶中性或負電荷之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換來確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。其他取代可引入展現對初始取代之功能敏感性的胺基酸位置。替代地或另外，利用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之靶或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入物包括長度為一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽之胺基及/或羧基未端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如，對於ADEPT而言)或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合物。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，對本文提供之抗體進行改變以增加或減小抗體糖基化之程度。在抗體上添加或缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地達成。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變與其連接之碳水化合物。由 哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支之雙觸角(biantennary)寡醣，其一般藉由N-鍵聯連接至Fc區之CH2結構域的Asn297。參看例如，Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改善之特性之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有缺乏與Fc區連接(直接或間接)之海藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，此抗體中海藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如例如WO 2008/077546中所述，藉由相對於與Asn 297連接之所有醣結構(例如複合、雜交及高甘露糖結構)之總和計算Asn297處糖鏈內海藻糖的平均量來測定海藻糖之量(如藉由MALDI-TOF質譜所量測)。Asn297係指大致位於Fc區中297-位置(Fc區殘基之Eu編號)處之天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可能位於297-位置之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即，介於位置294與300之間。此等海藻糖基化變異體可具有改善之ADCC功能。參看例如，美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。關於「去海藻糖化」或「海藻糖缺陷型」抗體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614 (2004)。能夠產生去海藻糖化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質海藻糖化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；Presta,L之美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號；及Adams等人之WO 2004/056312 A1，尤其實例11)；及基因敲除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因FUT8基因敲除之CHO細胞(參看例如，Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
另外提供了具有對分之寡醣的抗體變異體，例如其中連接至抗體Fc區之雙觸角寡醣經GlcNAc對分。該等抗體變異體可具有減少之海藻糖化及/或改善之ADCC功能。該等抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供寡醣中至少1個半乳糖殘基連接至Fc區之抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善之CDC功能。此等抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些但非所有效應功能之抗體變異體，此使得其成為合乎應用需要之候選物，在該等應用中，活體內抗體半衰期較重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確定CDC及/或ADCC活性之降低/衰竭。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分 析，以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概括於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464頁之表3中。用於評估所關注分子之ADCC活性的非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號中(參看例如，Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參看Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可使用非放射性分析方法(參看例如，有關流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。適用於該等分析之效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及自然殺滅(NK)細胞。替代地或另外，可在活體內，例如在動物模型(諸如在Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中揭示之動物模型)中，評估所關注分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確定抗體無法與C1q結合且因此缺乏CDC活性。參看例如，WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可進行CDC分析(參看例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(參看例如，Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
效應功能降低之抗體的非限制性實例包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多個具有取代的該等抗體(美國專 利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與FcR之結合得到改善或減弱之某些抗體變異體已有描述。(參看例如，美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。)
在某些實施例中，抗體變異體包含具有改善ADCC之一或多個胺基酸取代(例如Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代)的Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中產生改變，致使C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即，改善或削弱)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
在US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了半衰期增加且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合得到改善的抗體，其負責將母本IgG轉移至胎兒中(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。此等抗體包含具有一或多個改善Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此等非限制性Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之Fc變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例，亦參看Duncan & Winter Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO94/29351。
d)半胱胺酸工程改造之抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體，例如「硫代MAb(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於抗體之可達位點處且可用於將抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，以下任一個或多個殘基可用半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸工程改造抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本文提供之抗體可進行進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之其他非蛋白質部分。適於使抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可在製造時具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或不具支鏈。連接至抗體之聚合物的數目可變化，且若連接一種以上聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於以下考慮來確定：包括(但不限於)待改善抗體之特殊特性或功能，抗體衍生物是否將在指定條件下用於療法等。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由曝露於輻射來選擇性加熱 之非蛋白部分的結合物。在一個實施例中，該非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。此輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)不損傷普通細胞但能將非蛋白部分加熱至殺死抗體-非蛋白部分近側之細胞之溫度的波長。
B. 重組方法及組合物
可使用如美國專利第4,816,567號中所述之重組方法及組合物來產生抗體。在一個實施例中，提供了編碼本文所述之抗TfR抗體的經分離核酸。該核酸可編碼包含抗體VL之胺基酸序列及/或包含抗體VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供了包含該核酸之一或多種載體(例如表現載體)。在又一實施例中，提供一種包含該核酸之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含(例如已經以下轉型)：(1)包含一種核酸之載體，該核酸編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列，或(2)包含編碼含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製備抗TfR抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
對於重組產生抗TfR抗體，對(例如)如以上所述之編碼抗體的核酸進行分離，且將其插入一或多個載體中以進一步在宿主細胞中選殖及/或表現。此核酸可易於使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離及測序。
適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，特定言之，在不需要 糖基化及Fc效應功能時。關於在細菌中表現抗體片段及多肽，參看例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參看Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其描述了大腸桿菌中抗體片段之表現。)表現之後，可自細菌細胞糊漿之可溶部分中分離抗體且可進一步純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化模式的真菌及酵母菌株。參看Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦可自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)獲得。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出可與昆蟲細胞聯合使用且尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之眾多桿狀病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參看例如，美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述了用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株。有用的哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人胚腎細胞株(293或293細胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽托利氏細胞(sertoli cell)(TM4細胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株的評述，參看例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
C. 分析
本文提供之抗TfR抗體可藉由此項技術中已知之各種分析針對其物理/化學特性及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
1. 結合分析及其他分析
各種技術可用於測定抗體與TfR之結合。一種此類分析為酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)，其用於確定結合至人類TfR(及腦抗原)之能力。根據該分析，將塗有抗原(例如重組TfR)之板與包含抗TfR抗體之樣品一起培育且測定該抗體與所關注抗原之結合。
在一個態樣中，例如藉由已知方法(諸如ELISA、西方墨點法等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與本發明之任一抗體競爭結合至TfR之抗體。在某些實施例中，此類競爭抗體結合至與本發明之任一抗體所結合相同的抗原決定基(例如，線性或構形抗原決定基)，更具體言之，如本文所述之I類、II類、III類或IV類抗體特異性結合之任何抗原決定基(參看例如，實例1及表4)。用於定位抗體所結合之抗原決定基之詳細的例示性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols,」Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一個例示性競爭分析中，在包含結合至TfR之第一經標記抗體(例如，本文所揭示之一或多種抗體)及有待測試與該第一抗體競爭結合至TfR之能力的第二未標記抗體的溶液中培育固定之TfR。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照物，在包含第一經標記抗體但不含第二未標記抗體之溶液中共培育固定之TfR。在允許第一抗體結合至TfR之條件下培育之後，移除過量的未結合抗體，且量測與固定之TfR締合之標記的量。若測試樣品中與固定之TfR締合之標記的量相對於對照樣品實質上降低，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合至TfR。參看Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2. 活性分析
在一個態樣中，提供了用於鑑別具有生物活性之抗TfR抗體的分析。生物活性可包括例如將與抗體締合/結合之化合物跨BBB轉運至腦及/或CNS中。亦提供在活體內及/或在活體外具有此生物活性之抗體。
在某些實施例中，測試本發明抗體之此生物活性。
D. 免疫結合物
本發明亦提供包含與一或多種細胞毒性劑結合之本文之抗TfR抗體的免疫結合物，該等細胞毒性劑諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素；細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素；或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中，本文中之抗TfR抗體與神經病症藥物、化學治療劑及/或顯影劑偶合以便更有效地跨BBB轉運該藥物、化學治療劑及/或顯影劑。
可直接或經由連接子進行共價結合。在某些實施例中，直接結 合係藉由構建蛋白質融合物(亦即，藉由編碼抗TfR抗體與例如神經病症藥物之兩個基因的基因融合物且表現為單一蛋白質)來實現。在某些實施例中，直接結合係藉由在抗TfR抗體之兩個部分之一上的反應性基團與例如神經藥物上之相應基團或受體之間形成共價鍵來實現。在某些實施例中，直接結合係藉由修飾(亦即，基因修飾)欲結合之兩個分子中之一者以使其包括反應性基團(作為非限制性實例，硫氫基或羧基)來實現，該反應性基團在適當條件下與欲結合之另一分子形成共價連接。作為一個非限制性實例，可在抗TfR抗體中引入具有所需反應性基團(亦即，半胱胺酸殘基)之分子(亦即，胺基酸)且使其與例如神經藥物形成二硫鍵。用於將核酸共價結合至蛋白質的方法亦為此項技術中所知的(亦即，光交聯，參看例如Zatsepin等人，Russ.Chem.Rev.74：77-95(2005))。
如普通熟習此項技術者易於瞭解的，非共價結合可藉由任何非共價連接手段實現，包括疏水鍵、離子鍵、靜電相互作用及其類似手段。
結合亦可使用多種連接子進行。舉例而言，可使用多種雙官能蛋白質偶合劑使抗TfR抗體與神經藥物結合，該等雙官能蛋白質偶合劑為諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(諸如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。標記碳-14之1-異硫氰醯基苯 甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參看WO94/11026。亦可使用包含藉由肽鍵接合之一到二十個胺基酸之肽連接子。在某些此類實施例中，胺基酸係選自二十種天然存在之胺基酸。在某些其他此類實施例中，一或多種胺基酸係選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸及離胺酸。連接子可為有助於神經藥物在傳遞至腦中之後釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文中之發明清楚地涵蓋(但不限於)以交聯劑試劑製備之結合物，該等交聯劑試劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，以及SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，其為市售商品(例如，可購自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
在一個實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中抗體結合至一或多種藥物，包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參看美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧里斯他汀(auristatin)，諸如單甲基奧里斯他汀藥物部分體DE及DF(MMAE及MMAF)(參看美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參看美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res. 53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環黴素(anthracycline)，諸如道諾黴素(daunomycin)或小紅莓(doxorubicin)(參看Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；甲胺喋呤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，諸如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉羅紫杉醇(larotaxel)、特西紫杉醇(tesetaxel)及奧他紫杉醇(ortataxel)；單端孢烯(trichothecene)；及CC1065。
在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與酶活性毒素或其片段之結合物，該等毒素包括(但不限於)白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素(exotoxin)A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。
在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與放射性原子結合形成的放射性結合物。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、 Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當使用放射性結合物進行偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m或I123；用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
E. 用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，本文提供之任何抗TfR抗體可用於偵測生物樣品中TfR之存在。如本文所使用，術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，諸如血液(亦即，不成熟紅血球)、CSF及含BBB之組織。
在一個實施例中，提供一種用於診斷或偵測方法中之抗TfR抗體。在另一態樣中，提供一種偵測生物樣品中TfR之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與如本文所述之抗TfR抗體在允許該抗TfR抗體與TfR結合之條件下接觸，及偵測在該抗TfR抗體與TfR之間是否形成複合物。此方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，使用了抗TfR抗體來選擇適合於利用抗TfR抗體之療法中的個體，例如其中TfR為選擇患者之生物標記物。
歸因於TfR在網狀紅血球表現且因此可藉由任何本發明抗體偵測之事實，可使用本發明之抗體診斷之例示性病症包括涉及不成熟紅血球之病症。該等病症包括貧血及其他由網狀紅血球含量降低所引起之病症，或先天性紅血球增多症或贅生性真性紅血球增多症，其中銀例如網狀紅血球過度增殖引起之紅血球計數升高導致血液變稠且伴隨生理症狀。
在某些實施例中，提供經標記之抗TfR抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)，以及例如經由酶促反應或分子相 互作用間接偵測之部分，諸如酶或配體。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素(fluorescein)及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯基(dansyl)；傘酮(umbelliferone)；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素(luciferin)；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，以及使用過氧化氫來氧化染料前驅物之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基，及其類似物。
在一個實施例中，完整抗體缺乏效應功能。在另一個實施例中，完整抗體具有較少的效應功能。在另一個實施例中，完整抗體經工程改造而具有較少的效應功能。在一個態樣中，該抗體為Fab。在另一態樣中，該抗體具有一或多個減少或消除效應功能之Fc突變。在另一態樣中，歸因於例如在缺乏正常人類糖基化酶之系統中產生抗體，該抗體具有經修飾之糖基化。在另一態樣中，Ig主鏈經修飾成天然地具有有限或無效應功能者。
各種技術可用於測定抗體與TfR之結合。一種此類分析為酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)，其用於確定結合至人類TfR(及腦抗原)之能力。根據該分析，將塗有抗原(例如重組TfR)之板與包含抗TfR抗體之樣品一起培育且測定該抗體與所關注抗原之結合。
可如實例中所揭示或如對於所關注抗CNS抗原抗體所知來進行有關評估全身投與之抗體之吸收及抗體之其他生物活性的分析。
在一個態樣中，提供了用於鑑別抗TfR抗體與具有生物活性之抗BACE1抗體之結合物(共價或非共價結合)的分析。生物活性可包括例 如抑制BACE1天冬胺醯基蛋白酶活性。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體，例如，如藉由均質時差式螢光HTRF分析或微流毛細管電泳(MCE)分析使用合成受質肽或活體內在表現BACE1受質(諸如APP)之細胞株中所評估。
F. 醫藥調配物
如本文所述之抗TfR抗體之醫藥調配物係藉由將具有所需純度之該抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980))混合來製備，其係呈凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下一般對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文之例示性醫藥學上可接受之載劑包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®,Baxter International,Inc.)。某些例示性 sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，均描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多個另外的葡萄糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)(諸如硫酸軟骨素酶)組合。
例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中描述之該等調配物，後一調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文中之調配物視所治療之特定適應症之需要，亦可含有超過一種活性成分，較佳為具有不會相互不利地影響之互補活性的該等活性成分。舉例而言，可能需要進一步提供一或多種用於治療神經病變、神經退化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙或CNS炎症的活性成分。例示性該等藥物於下文中論述。此等活性成分適合以有效達成預定目的之量組合存在。
可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分覆埋於所製備之微囊中，例如分別覆埋於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或於巨乳液中的羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊。該等技術揭示於例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980)中。可將一或多種活性成分囊封於偶合至本文所述之抗TfR抗體的脂質體中(參看例如，美國專利申請公開案第20020025313號)。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半滲透性基質，該等基質呈成形物品(例如薄膜或微囊)之形式。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與L-麩胺酸γ乙酯之共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、 可降解性乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成之可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
欲用於活體內投藥之調配物一般為無菌的。可易於例如藉由經無菌過濾膜過濾實現滅菌。
G.治療方法及組合物
本文所提供之任何抗TfR抗體均可用於治療方法中。在一個態樣中，提供了用作藥物之抗TfR抗體。舉例而言，本發明提供一種以降低或消除之對紅血球群之影響跨血腦屏障轉運治療化合物的方法，該方法包含使偶合至治療化合物(例如，同時結合TfR及腦抗原之多特異性抗體)之抗TfR抗體暴露於BBB，由此該抗體將與其偶合之治療化合物跨越BBB轉運。在另一實施例中，本發明提供一種跨血腦屏障轉運神經病症藥物的方法，該方法包含使偶合至腦部病症藥物(例如，同時結合TfR及腦抗原之多特異性抗體)之本發明抗TfR抗體暴露於BBB，由此該抗體以降低或消除之對紅血球群之影響將與其偶合之神經病症藥物跨越BBB轉運。在一個實施例中，BBB係在哺乳動物(例如人類)，例如患有神經病症之哺乳動物中，該神經病症包括(不限於)：阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌萎縮側索硬化症(ALS)、囊腫性纖維化、安格曼氏症候群(Angelman's syndrome)、利德氏症候群(Liddle syndrome)、帕金森氏病、佩吉特氏病(Paget's disease)、癌症、創傷性腦損傷等。
在一個實施例中，該神經病症係選自：神經病變、澱粉樣變性、癌症(例如，涉及CNS或腦部)、眼部疾病或病症、病毒或微生物感染、炎症(例如，CNS或腦部炎症)、局部缺血、神經退化性疾病、癲癇發作、行為障礙、溶酶體貯積症等。本發明之抗體因能夠跨BBB轉運一或多種相連活性成分/偶合之治療化合物且轉運至CNS/腦 中而特別適合於治療該等神經病症，其中該等病症發現其分子、細胞或病毒/微生物基礎。
神經病症為特徵在於神經信號傳導不當或不受控制或缺乏神經信號傳導之神經系統疾病或異常，且包括(但不限於)慢性疼痛(包括感受傷害性疼痛)、由身體組織之損傷所引起的疼痛(包括癌症相關疼痛)、神經痛(由神經、脊髓或腦異常所引起之疼痛)，及心因性疼痛(完全或主要與心理障礙有關)、頭痛、偏頭痛、神經病變及常伴隨該等神經病症之症狀及症候群，諸如眩暈或噁心。
對於神經病症，可選擇之神經藥物為鎮痛劑，包括(但不限於)麻藥/類鴉片鎮痛劑(亦即，嗎啡(morphine)、芬太尼(fentanyl)、氫可酮(hydrocodone)、派替啶(meperidine)、美沙酮(methadone)、氧嗎啡酮(oxymorphone)、鎮痛新(pentazocine)、丙氧芬(propoxyphene)、曲馬多(tramadol)、可待因(codeine)及氧可酮(oxycodone))、非類固醇消炎藥(NSAID)(亦即，布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、雙氯芬酸(diclofenac)、二氟苯水楊酸(diflunisal)、依託度酸(etodolac)、非諾洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、甲滅酸(mefenamic acid)、美儂西康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、奧沙普嗪(oxaprozin)、吡羅昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)及托美汀(tolmetin))、皮質類固醇(亦即，皮質酮(cortisone)、潑尼松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、甲潑尼松龍(methylprednisolone)及曲安西龍(triamcinolone))、抗偏頭痛劑(亦即，舒馬曲停(sumatriptin)、阿莫曲坦(almotriptan)、夫羅曲坦(frovatriptan)、舒馬曲坦(sumatriptan)、利紮曲坦(rizatriptan)、依來曲普坦(eletriptan)、佐米曲普坦(zolmitriptan)、二氫麥角胺(dihydroergotamine)、依來曲普坦及麥角胺(ergotamine))、乙醯胺苯酚、水楊酸鹽(亦即，阿司匹靈(aspirin)、 膽鹼水楊酸鹽(choline salicylate)、水楊酸鎂、二氟苯水楊酸(diflunisal)及雙水楊酯(salsalate))、抗驚厥劑(亦即，卡馬西平(carbamazepine)、氯硝西泮(clonazepam)、加巴噴丁(gabapentin)、拉莫三嗪(lamotrigine)、普瑞巴林(pregabalin)、噻加賓(tiagabine)及托吡酯(topiramate))、麻醉劑(亦即，異氟烷(isoflurane)、三氯乙烯、氟烷(halothane)、七氟醚(sevoflurane)、苯佐卡因(benzocaine)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、可卡因(cocaine)、環甲卡因(cyclomethycaine)、二甲卡因(dimethocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、普魯卡因(procaine)、奴佛卡因(novocaine)、丙對卡因(proparacaine)、丁卡因(tetracaine)、阿替卡因(articaine)、丁哌卡因(bupivacaine)、卡鐵卡因(carticaine)、辛可卡因(cinchocaine)、依替卡因(etidocaine)、左布比卡因(levobupivacaine)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、哌羅卡因(piperocaine)、丙胺卡因(prilocaine)、羅哌卡因(ropivacaine)、三甲卡因(trimecaine)、麻痺性貝毒素(saxitoxin)及河豚毒素(tetrodotoxin))，以及cox-2抑制劑(亦即，賽利克西(celecoxib)、羅非考昔(rofecoxib)及伐地考昔(valdecoxib))。對於涉及眩暈之神經病症，可選擇之神經藥物為抗眩暈劑，包括(但不限於)美其敏(meclizine)、苯海拉明(diphenhydramine)、普敏太定(promethazine)及安定(diazepam)。對於涉及噁心之神經病症，可選擇之神經藥物為一種抗噁心劑，包括(但不限於)普敏太定、氯丙嗪(chlorpromazine)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、三甲氧苯醯胺(trimethobenzamide)及滅吐靈(metoclopramide)。
澱粉樣變性為與CNS中細胞外蛋白質沈積有關之一組疾病及病症，包括(但不限於)繼發性澱粉樣變性、年齡相關澱粉樣變性、阿茲海默氏病(AD)、輕度認知障礙(MCI)、路易體性癡呆、唐氏症候群(Down's syndrome)、伴隨澱粉樣變性之遺傳性腦出血(荷蘭型)；關島 型帕金森氏症-癡呆複合症(Guam Parkinson-Dementia complex)、大腦類澱粉血管病、亨丁頓氏病、進行性核上麻痺、多發性硬化症；克羅伊茨費爾特雅各布氏病、帕金森氏病、傳染性海綿狀腦病、HIV相關性癡呆、肌萎縮側索硬化症(ALS)、包涵體肌炎(IBM)，及與β澱粉樣蛋白沈積有關之眼部疾病(亦即，黃斑變性、脈絡膜疣相關性視神經病變及白內障)。
對於澱粉樣變性，可選擇之神經藥物包括(但不限於)特異性結合至選自以下之靶的抗體或其他結合分子(包括(但不限於)小分子、肽、適體或其他蛋白質結合劑)：β分泌酶、τ蛋白、早老素、澱粉樣前驅蛋白或其部分、類澱粉β肽或其寡聚物或原纖維、死亡受體6(DR6)、晚期糖基化終產物(RAGE)之受體、泊蛋白及亨廷頓蛋白；膽鹼酯酶抑制劑(亦即，加蘭他敏(galantamine)、多奈哌齊(donepezil)、雷斯替明(rivastigmine)及他可林(tacrine))；NMDA受體拮抗劑(亦即，美金胺(memantine))、單胺耗竭劑(亦即，丁苯那嗪(tetrabenazine))；甲磺酸二氫麥角鹼(ergoloid mesylate)；抗膽鹼激導性抗帕金森氏症劑(亦即，丙環定(procyclidine)、苯海拉明、苯海索(trihexylphenidyl)、苯托品(benztropine)、安克痙(biperiden)及三己芬迪(trihexyphenidyl))；多巴胺激導性抗帕金森氏症劑(亦即，恩他卡朋(entacapone)、司來吉蘭(selegiline)、普拉克索(pramipexole)、溴麥角環肽(bromocriptine)、羅替戈汀(rotigotine)、司來吉蘭、羅匹尼羅(ropinirole)、雷沙吉蘭(rasagiline)、阿撲嗎啡(apomorphine)、卡比多巴(carbidopa)、左旋多巴(levodopa)、培高利特(pergolide)、托卡朋(tolcapone)及金剛胺(amantadine))；丁苯那嗪(tetrabenazine)；消炎藥(包括(但不限於)非類固醇消炎藥(亦即，吲哚美辛(indomethicin)及以上所列其他化合物)；激素(亦即，雌激素、孕酮及亮丙瑞林)；維生素(亦即，葉酸及菸鹼醯胺)；丹吡芙蓉(dimebolin)；高牛磺酸(亦即，3-胺基丙烷磺酸； 3APS)；血清素受體活性調節劑(亦即，紮利羅登(xaliproden))；干擾素，及糖皮質激素。
CNS癌症之特徵在於一或多種CNS細胞(亦即，神經細胞)之異常增殖，且其包括(但不限於)神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、腦膜瘤、星形細胞瘤、聽神經瘤、軟骨瘤、少枝膠質瘤、神經管母細胞瘤、神經節神經膠質瘤、神經鞘瘤、纖維神經瘤、神經母細胞瘤，及硬膜外、髓內或硬膜內腫瘤。
對於癌症，可選擇之神經藥物為化學治療劑。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如塞替派(thiotepa)及CYTOXAN®環磷醯胺；磺酸烷酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯佐多帕(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、麥曲多帕(meturedopa)及尤利多帕(uredopa)；伸乙基亞胺及伸甲基胺，包括六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷醯胺、三乙烯硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；多聚乙醯(尤其泡番荔枝辛(bullatacin)及泡番荔枝辛酮(bullatacinone))；δ-9-四羥基大麻酚(曲大麻酚(dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicine)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康(topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹鹼(acetylcamptothecin)、司考波萊辛(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；開利斯塔汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼毒素酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycins)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素；多卡黴素(duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；潘卡替斯汀 (pancratistatin)；沙科地辛(sarcodictyin)；斯旁斯汀(spongistatin)；芥子氮，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、膽磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺、氮芥、鹽酸氧化氮芥、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、苯芥膽固醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥子氣(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及萊尼莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1(參看例如，Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；地奈黴素(dynemicin)，包括地奈黴素A；艾司匹拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團及相關色素蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克萊諾米星(aclacinomysins)、放線菌素、奧萊米星(authramycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素(bleomycins)、放線菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、卡莫黴素(chromomycinis)、放線菌素D、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®小紅莓(包括嗎啉基-小紅莓、氰基嗎啉基-小紅莓、2-吡咯基-小紅莓及去氧小紅莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、黃膽素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、諸如絲裂黴素C之絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、波替諾黴素(potfiromycin)、嘌羅黴素(puromycin)、炔萊黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺 喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酪(testolactone)；抗腎上腺素，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充物，諸如醛葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；尹陸萊辛(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝曲布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；伊達曲仙(edatraxate)；德弗法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；伊弗尼辛(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；艾普塞隆(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖(lentinan)；洛尼達寧(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安沙米托辛(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫吡丹莫(mopidanmol)；尼曲伊寧(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；比柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecenes)(尤其T-2毒素、維萊庫寧A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及安古定(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；瓜西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；塞替派；紫杉醇類，例如TAXOL®太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、無十六醇聚氧乙烯醚之ABRAXANETM、太平洋紫杉醇之白蛋白工程改造之奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及TAXOTERE®多烯紫杉醇(Rhône-Poulenc Rorer,Antony,France)；氯萊布辛(chloranbucil)；吉西他賓(gemcitabine)(GEMZAR®)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(vinblastine)(VELBAN®)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN®)；奧賽力鉑(oxaliplatin)；氯扣沃新(leucovovin)；長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE®)；諾消靈(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；諸如視黃酸之類視色素；卡西他賓(capecitabine)(XELODA®)；以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上兩者或兩者以上之組合，諸如CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼與潑尼龍(prednisolone)之組合療法之縮寫)及FOLFOX(使用奧賽力鉑(oxaliplatin)(ELOXATINTM)與5-FU及氯扣沃新之組合治療方案的縮寫)。
在此化學治療劑之定義中亦包括用於調節、減少、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素之作用的抗激素劑，且其常呈系統性或全身治療之形式。其可為激素本身。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體 調節劑(SERM)，例如包括它莫西芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX®它莫西芬)、EVISTA®雷洛西芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基它莫西芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽(keoxifene)、LY117018、歐納氏酮(onapristone)及FARESTON®托瑞米芬(toremifene)；抗黃體酮；雌激素受體減量調節劑(ERD)；具有抑制或制止卵巢之功能的藥劑，例如黃體素釋放激素(LHRH)促效劑，諸如LUPRON®及ELIGARD®醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)及曲特瑞林(tripterelin)；其他抗雄性激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)及必卡他胺(bicalutamide)；以及抑制芳香酶的芳香酶抑制劑(芳香酶可調節腎上腺中之雌激素產生)，諸如4(5)-咪唑、胺基苯乙哌啶酮(aminoglutethimide)、MEGASE®醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN®依西美坦(exemestane)、弗米斯坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR®伏氯唑(vorozole)、FEMARA®來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX®瑞寧德(anastrozole)。另外，該化學治療劑定義包括雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS®或OSTAC®)、DIDROCAL®依替膦酸鹽(etidronate)、NE-58095、ZOMETA®唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽、FOSAMAX®阿侖膦酸鹽(alendronate)、AREDIA®帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID®替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL®利塞膦酸鹽(risedronate)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制涉及異常細胞增殖之信號傳導路徑中之基因表現的反義寡核苷酸，該等基因諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2及EGFR雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為GW572016)；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
可選作用於癌症治療或預防之神經藥物的另一組化合物為抗癌免疫球蛋白(包括(但不限於)曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、貝伐單抗、阿來組單抗(alemtuxumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、帕尼單抗(panitumumab)及利妥昔單抗(rituximab))。在一些情形中，抗體聯合有毒標記或結合物可用於靶向並殺死所需細胞(亦即，癌細胞)，包括(但不限於)具有131I放射性標記之托西莫單抗(tositumomab)或曲妥珠單抗美坦辛(trastuzumab emtansine)。
眼部疾病或病症為眼睛之疾病或病症，出於本文之目的，其被視為一種由BBB阻隔之CNS器官。眼部疾病或病症包括(但不限於)鞏膜、角膜、虹膜及睫狀體之病症(亦即，鞏膜炎、角膜炎、角膜潰瘍、角膜磨損、雪盲症、電弧眼、希傑森氏表層點狀角膜病(Thygeson's superficial punctate keratopathy)、角膜新血管生成、福斯氏角膜失養症(Fuchs' dystrophy)、圓錐角膜、乾躁性角膜結膜炎、虹膜炎及葡萄膜炎)、晶狀體病症(亦即，白內障)、脈絡膜及視網膜病症(亦即，視網膜脫落、視網膜分層剝離、高血壓性視網膜病變、糖尿病性視網膜病、視網膜病、早產兒視網膜病、年齡相關之黃斑變性、黃斑變性(濕性或乾性)、視網膜前膜、色素性視網膜炎及黃斑水腫)、青光眼、飛蚊症(floaters)、視神經及視路病症(亦即，賴博氏遺傳性視神經病變(Leber's hereditary optic neuropathy)及視神經盤脈絡膜疣)、眼肌/雙眼運動調節/屈光病症(亦即，斜視、眼肌癱瘓、進行性外部眼肌麻痺、內斜視、外斜視、遠視、近視、散光、屈光參差、老花眼及眼肌麻痺)、視力障礙及失明(亦即，弱視、利伯氏先天性黑蒙 (Lever's congenital amaurosis)、盲點、色盲(color blindness)、全色盲(achromatopsia)、夜盲症、失明、河盲症及小眼症/缺損)、紅眼病、阿蓋耳羅伯遜氏瞳孔(Argyll Robertson pupil)、角膜真菌病、乾眼病及無虹膜症。
對於眼部疾病或病症，可選擇之神經藥物為抗血管生成性眼科藥劑(亦即，貝伐單抗、蘭尼單抗(ranibizumab)及哌加他尼(pegaptanib))、眼科青光眼藥劑(亦即，碳醯膽鹼(carbachol)、腎上腺素(epinephrine)、地美溴銨(demecarium bromide)、安普樂定(apraclonidine)、溴莫尼定(brimonidine)、布林佐胺(brinzolamide)、左布諾洛爾(levobunolol)、噻嗎洛爾(timolol)、倍他索洛爾(betaxolol)、多佐胺(dorzolamide)、比馬前列素(bimatoprost)、卡替洛爾(carteolol)、美替洛爾(metipranolol)、地匹福林(dipivefrin)、曲沃前列素(travoprost)及拉坦前列素(latanoprost))、碳酸酐酶抑制劑(亦即，醋甲唑胺(methazolamide)及乙醯唑胺(acetazolamide))、眼科抗組織胺劑(亦即，萘唑啉(naphazoline)、苯腎上腺素(phenylephrine)及四氫唑啉(tetrahydrozoline))、眼部潤滑劑、眼科類固醇(亦即，氟米龍(fluorometholone)、潑尼松龍(prednisolone)、氯替潑諾(loteprednol)、地塞米松(dexamethasone)、二氟潑尼酯(difluprednate)、利美索龍(rimexolone)、膚輕鬆(fluocinolone)、甲羥孕酮(medrysone)及曲安西龍(triamcinolone))、眼科麻醉劑(亦即，利多卡因、丙對卡因及丁卡因)、眼科抗感染劑(亦即，左氧氟沙星(levofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、氯黴素(chloramphenicol)、枯草菌素(bacitracin)/多黏菌素b(polymyxin b)、磺胺醋醯(sulfacetamide)、托普黴素(tobramycin)、阿奇黴素(azithromycin)、貝西沙星(besifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、磺胺異噁唑(sulfisoxazole)、慶大黴素(gentamicin)、碘苷(idoxuridine)、 紅黴素(erythromycin)、遊黴素(natamycin)、短桿菌素(gramicidin)、新黴素(neomycin)、氧氟沙星(ofloxacin)、三氟尿苷(trifluridine)、更昔洛韋(ganciclovir)、阿糖腺苷(vidarabine))、眼科消炎劑(亦即，奈帕芬胺(nepafenac)、酮咯酸(ketorolac)、氟比洛芬(flurbiprofen)、舒洛芬(suprofen)、環孢素(cyclosporine)、曲安西龍(triamcinolone)、雙氯芬酸(diclofenac)及溴芬酸(bromfenac))，及眼科抗組織胺劑或解充血劑(亦即，酮替芬(ketotifen)、奧洛他定(olopatadine)、依匹斯汀(epinastine)、萘唑啉(naphazoline)、色甘酸(cromolyn)、四氫唑啉(tetrahydrozoline)、吡嘧司特(pemirolast)、貝泊司汀(bepotastine)、萘唑啉(naphazoline)、苯腎上腺素(phenylephrine)、奈多羅米(nedocromil)、洛度沙胺(lodoxamide)、苯腎上腺素、依美斯汀(emedastine)及氮卓斯汀(azelastine))。
CNS之病毒或微生物感染包括(但不限於)病毒(亦即，流感、HIV、脊髓灰質炎病毒、風疹)感染、細菌(亦即，奈瑟菌屬(Neisseria sp.)、鏈球菌屬(Streptococcus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、變形桿菌屬(Proteus sp.)、大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎球菌屬(Pneumococcus sp.)、腦膜炎球菌屬(Meningococcus sp.)、嗜血桿菌屬(Haemophilus sp.)及結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))感染，及其他微生物感染，諸如真菌(亦即，酵母、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans))、寄生物(亦即，弓蟲(toxoplasma gondii))或阿米巴(amoebas)感染，其導致CNS病理生理學，包括(但不限於)急性或慢性腦膜炎、腦炎、脊髓炎、血管炎及膿腫。
對於病毒或微生物疾病，可選擇之神經藥物包括(但不限於)抗病毒化合物(包括(但不限於)金剛烷抗病毒劑(亦即，金剛乙胺(rimantadine)及金剛胺)、抗病毒干擾素(亦即，聚乙二醇干擾素α- 2b)、趨化因子受體拮抗劑(亦即，馬拉維若(maraviroc))、整合酶鏈轉移抑制劑(亦即，雷特格韋(raltegravir))、神經胺糖酸苷酶抑制劑(亦即，奧塞米韋(oseltamivir)及紮那米韋(zanamivir))、非核苷逆轉錄酶抑制劑(亦即，依法韋侖(efavirenz)、依曲韋林(etravirine)、地拉韋啶(delavirdine)及奈維拉平(nevirapine))、核苷逆轉錄酶抑制劑(替諾福韋(tenofovir)、阿巴卡韋(abacavir)、拉米夫定(lamivudine)、迭氮胸苷(zidovudine)、司他夫定(stavudine)、恩替卡韋(entecavir)、恩曲他濱(emtricitabine)、阿德福韋酯(adefovir)、紮西他濱(zalcitabine)、替比夫定(telbivudine)及去羥肌苷(didanosine))、蛋白酶抑制劑(亦即，達蘆那韋(darunavir)、阿紮那韋(atazanavir)、福沙那韋(fosamprenavir)、替拉那韋(tipranavir)、利托那韋(ritonavir)、奈非那韋(nelfinavir)、安普那韋(amprenavir)、茚地那韋(indinavir)及沙喹那韋(saquinavir))、嘌呤核苷(亦即，伐昔洛韋(valacyclovir)、泛昔洛韋(famciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)、病毒唑(ribavirin)、更昔洛韋(ganciclovir)、纈更昔洛韋(valganciclovir)及西多福韋(cidofovir))，及各種抗病毒劑(亦即，恩夫韋地(enfuvirtide)、膦甲酸(foscarnet)、帕利珠單抗(palivizumab)及福米韋生(fomivirsen))、抗生素(包括(但不限於)胺基青黴素(aminopenicillin)(亦即，阿莫西林(amoxicillin)、安比西林(ampicillin)、新青黴素(oxacillin)、乙氧萘青黴素(nafcillin)、鄰氯青黴素(cloxacillin)、雙氯青黴素(dicloxacillin)、氟氯西林(flucoxacillin)、替莫西林(temocillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄青黴素(carbenicillin)、羧噻吩青黴素(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)、哌拉西林(piperacillin)及巴卡西林(bacampicillin))、頭孢菌素(cephalosporin)(亦即，頭孢唑啉(cefazolin)、先鋒黴素(cephalexin)、頭孢金素(cephalothin)、頭孢羥唑(cefamandole)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、 頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢羥胺苄(cefadroxil)、頭孢拉定(cephradine)、氯碳頭孢(loracarbef)、頭孢替坦(cefotetan)、頭孢呋新(cefuroxime)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢克洛(cefaclor)及頭孢噻吩(cefoxitin))、碳青黴烯(carbapenem)/青黴烯(penem)(亦即，亞胺培南(imipenem)、美羅培南(meropenem)、伊特培南(ertapenem)、法羅培南(faropenem)及多尼培南(doripenem))、單環菌素(monobactam)(亦即，胺曲南(aztreonam)、替吉莫南(tigemonam)、諾卡黴素A(norcardicin A)及菸草毒素-β-內醯胺(tabtoxinine-beta-lactam)、β-內醯胺酶抑制劑(亦即，克拉維酸(clavulanic acid)、三唑巴坦(tazobactam)及舒巴坦(sulbactam))連同另一β-內醯胺抗生素、胺基醣苷(亦即，胺丁卡黴素(amikacin)、慶大黴素(gentamicin)、卡那黴素(kanamycin)、新黴素(neomycin)、乙基西梭黴素(netilmicin)、鏈黴素(streptomycin)、托普黴素(tobramycin)及巴龍黴素(paromomycin))、安莎黴素(ansamycin)(亦即，格爾德黴素(geldanamycin)及除莠黴素(herbimycin))、碳頭孢烯(carbacephem)(亦即，氯碳頭孢(loracarbef))、醣肽(亦即，替考拉寧(teicoplanin)及萬古黴素(vancomycin))、巨環內酯(macrolide)(亦即，阿奇黴素(azithromycin)、克拉黴素(clarithromycin)、地紅黴素(dirithromycin)、紅黴素(erythromycin)、羅紅黴素(roxithromycin)、醋竹桃黴素(troleandomycin)、泰利黴素(telithromycin)及壯觀黴素(spectinomycin))、單環菌素(monobactam)(亦即，胺曲南)、喹諾酮(亦即，環丙沙星(ciprofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、格帕沙星(grepafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)及替馬沙星(temafloxacin))、磺醯胺(亦即，磺胺米隆 (mafenide)、偶氮磺胺(sulfonamidochrysoidine)、磺胺醋醯(sulfacetamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、磺胺(sulfanilamide)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、磺胺異噁唑(sulfisoxazole)、甲氧苄胺嘧啶(trimethoprim)、甲氧苄胺嘧啶及磺胺甲基異噁唑(sulfamethoxazole))、四環素(tetracycline)(亦即，四環素、地美環素(demeclocycline)、強力黴素(doxycycline)、二甲胺四環素(minocycline)及土黴素(oxytetracycline))、抗贅生性或細胞毒性抗生素(亦即，小紅莓、米托蒽醌、博萊黴素、道諾黴素、更生黴素、表柔比星、黃膽素、普卡黴素(plicamycin)、絲裂黴素、噴司他丁及戊柔比星(valrubicin))及各種抗細菌化合物(亦即，枯草菌素、黏菌素(colistin)及多黏菌素B))、抗真菌劑(亦即，甲硝噠唑(metronidazole)、硝唑尼特(nitazoxanide)、磺甲硝咪唑(tinidazole)、氯喹(chloroquine)、雙碘喹啉(iodoquinol)及巴龍黴素(paromomycin))，及抗寄生蟲藥(包括(但不限於)奎寧(quinine)、氯喹(chloroquine)、阿莫地喹(amodiaquine)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、長效磺胺(sulphadoxine)、氯胍(proguanil)、甲氟喹(mefloquine)、阿托伐醌(atovaquone)、伯胺喹(primaquine)、青蒿素(artemesinin)、鹵泛曲林(halofantrine)、強力黴素(doxycycline)、克林達黴素(clindamycin)、甲苯咪唑(mebendazole)、雙羥萘酸喹嘧啶(pyrantel pamoate)、噻苯咪唑(thiabendazole)、乙胺嗪(diethylcarbamazine)、伊維菌素(ivermectin)、利福平(rifampin)、兩性黴素B(amphotericin B)、米拉索普(melarsoprol)、依氟鳥胺酸(efornithine)及丙硫咪唑(albendazole))。
CNS之炎症包括(但不限於)由CNS損傷引起之炎症，其可為一種肉體損傷(亦即，由事故、手術、腦外傷、脊髓損傷、振震盪引起)及由一或多種其他CNS疾病或病症(亦即，膿腫、癌症、病毒或微生物 感染)引起或與之相關之損傷。
對於CNS炎症，可選擇作用於炎症本身之神經藥物(亦即，非類固醇消炎劑，諸如布洛芬或萘普生)，或治療炎症潛在病因之藥物(亦即，抗病毒劑或抗癌劑)。
如本文所使用，CNS缺血係指與腦中之異常血液流動或血管行為或其病因相關之一組病症，且包括(但不限於)：局灶性腦缺血、全腦缺血、中風(亦即，蛛網膜下出血及腦內出血)及動脈瘤。
對於局部缺血，可選擇之神經藥物包括(但不限於)溶解血栓劑(亦即，尿激酶(urokinase)、阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)及替奈替普酶(tenecteplase))、血小板聚集抑制劑(亦即，阿司匹靈、西洛他唑(cilostazol)、氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)及雙嘧達莫(dipyridamole))、他汀(statin)(亦即，洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)及匹伐他汀(pitavastatin))，及改善血流或血管可撓性之化合物，包括例如血壓藥。
神經退化性疾病為與CNS中神經細胞功能喪失或死亡相關的一組疾病及病症，且包括(但不限於)：腎上腺腦白質營養不良、亞歷山大氏病、阿耳珀氏病(Alper's disease)、肌萎縮側索硬化症、共濟失調毛細血管擴張、巴登氏病(Batten disease)、科凱恩症候群、皮質基底核退化症、由澱粉樣變性所致或與其相關之退化症、弗里德賴希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)、額顳葉退化症、肯尼迪病(Kennedy's disease)、多系統萎縮症、多發性硬化症、原發性側索硬化、進行性核上麻痺、脊髓性肌萎縮、橫貫性脊髓炎、雷弗素姆氏病(Refsum's disease)及脊髓小腦失調。
對於神經退化性疾病，可選擇之神經藥物為生長激素或神經營 養因子；實例包括(但不限於)腦源性神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、神經營養因子-4/5、纖維母細胞生長因子(FGF)-2及其他FGF、神經營養因子(NT)-3、紅血球生成素(EPO)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)-α、TGF-β、血管內皮生長因子(VEGF)、介白素-1受體拮抗劑(IL-1ra)、睫狀神經營養因子(CNTF)、神經膠質源性神經營養因子(GDNF)、神經生長因子、血小板源性生長因子(PDGF)、調蛋白、神經調節蛋白、阿特明(artemin)、普塞芬(persephin)、介白素、神經膠質細胞株源性神經營養因子(GFR)、粒細胞集落刺激因子(CSF)、粒細胞-巨噬細胞-CSF、紡錘蛋白(netrin)、心肌營養因子-1、刺蝟狀蛋白(hedgehog)、白血病抑制因子(LIF)、中期因子、多效生長因子(pleiotrophin)、骨形態生成蛋白(BMP)、紡錘蛋白、蛋白脂質微粒體(saposin)、臂板蛋白(semaphorin)及幹細胞因子(SCF)。
CNS之癲癇發作疾病及病症涉及CNS中之不當及/或異常電傳導，且包括(但不限於)：癲癇症(亦即，失神性發作、無張力性發作、良性羅蘭癲癇(benign Rolandic epilepsy)、兒童期失神、陣攣性發作、複雜性部分發作、額葉癲癇症、熱性痙攣、嬰兒痙攣、青少年肌陣攣性癲癇、青少年失神癲癇症、林諾克斯-戈斯托特症候群(Lennox-Gastaut syndrome)、蘭達-克萊夫納症候群(Landau-Kleffner Syndrome)、德拉韋氏症候群(Dravet's syndrome)、大田原症候群(Otahara syndrome)、韋氏症候群(West syndrome)、肌陣攣性發作、粒線體病症、進行性肌陣攣性癲癇症、心因性發作、反射性癲癇、拉斯穆森氏症候群(Rasmussen's Syndrome)、單純性部分發作、繼發性全身性發作、顳葉癲癇、強直陣發性發作、強直性發作、精神運動性發作、邊緣葉癲癇(limbic epilepsy)、部分性癲癇發作、全身性癲癇發作、癲癇持續狀態、腹性癲癇症、運動不能發作、自主神經性發作、 大規模雙側肌陣攣、經期癲癇症、跌倒發作(drop seizures)、情感性發作、局灶性發作、癡笑性發作(gelastic seizure)、傑克遜步伐(Jacksonian March)、拉福拉病、運動性發作、多灶性發作、夜間發作、光敏感性發作、假癲癇發作、感覺性癲癇發作、隱微性發作、叢林性發作(sylvan seizure)、戒斷性癲癇發作及視覺反射性癲癇發作)。
對於癲癇發作病症，可選擇之神經藥物為抗驚厥劑或抗癲病劑，包括(但不限於)巴比妥類抗驚厥劑(亦即，撲米酮(primidone)、美沙比妥(metharbital)、甲苯比妥(mephobarbital)、阿洛巴比妥(allobarbital)、異戊巴比妥(amobarbital)、阿普比妥(aprobarbital)、烯丙苯巴比妥(alphenal)、巴比妥(barbital)、溴烯比妥(brallobarbital)及苯巴比妥(phenobarbital))、苯并二氮呯類抗驚厥劑(亦即，地西泮(diazepam)、氯硝西泮(clonazepam)及勞拉西泮(lorazepam))、胺基甲酸酯類抗驚厥劑(亦即，非爾胺酯(felbamate))、碳酸酐酶抑制劑類抗驚厥劑(亦即，乙醯唑胺(acetazolamide)、托吡酯(topiramate)及唑尼沙胺(zonisamide))、二苯并氮呯類抗驚厥劑(亦即，盧非醯胺(rufinamide)、卡巴氮平(carbamazepine)及奧卡西平(oxcarbazepine))、脂肪酸衍生物類抗驚厥劑(亦即，雙丙戊酸(divalproex)及丙戊酸(valproic acid))、γ-胺基丁酸類似物類(亦即，普瑞巴林(pregabalin)、加巴噴丁(gabapentin)及胺己烯酸(vigabatrin))、γ-胺基丁酸再吸收抑制劑類(亦即，噻加賓(tiagabine))、γ-胺基丁酸轉胺酶抑制劑類(亦即，胺己烯酸(vigabatrin))、乙內醯脲類抗驚厥劑(亦即，苯妥英(phenytoin)、乙苯妥英(ethotoin)、磷苯妥英(fosphenytoin)及美芬妥英(mephenytoin))、各種抗驚厥劑(亦即，拉考沙胺(lacosamide)及硫酸鎂)、助孕素類(亦即，黃體酮(progesterone))、噁唑啶二酮類抗驚厥劑(亦即，甲乙雙酮(paramethadione)及三甲雙酮(trimethadione))、吡咯啶類抗驚厥劑(亦即，左乙拉西坦(levetiracetam))、琥珀醯亞胺類抗驚 厥劑(亦即，乙琥胺(ethosuximide)及甲琥胺(methsuximide))、三嗪類抗驚厥劑(亦即，拉莫三嗪(lamotrigine))及脲類抗驚厥劑(亦即，苯乙醯脲(phenacemide)及苯丁醯脲(pheneturide))。
行為障礙係特徵在於患病個體之局部異常行為的CNS病症，且包括(但不限於)：睡眠障礙(亦即，失眠症、類睡症、夜驚、晝夜節律睡眠障礙及發作性睡病)、情感障礙(亦即，抑鬱症、自殺性抑鬱、焦慮症、慢性情感障礙、恐懼症、恐慌發作、強迫症、注意力不足過動症(ADHD)、注意力缺乏症(ADD)、慢性疲勞症候群、畏曠症、創傷後壓力症、躁鬱症)、飲食障礙(亦即，厭食症或貪食症)、精神病、發育行為障礙(亦即，自閉症、雷特氏症候群、亞斯伯格氏症候群(Aspberger's syndrome))、人格障礙及精神病症(亦即，精神分裂症、妄想症及其類似病症)。
對於行為障礙，神經藥物可選自行為調節化合物，包括(但不限於)非典型抗精神病藥(亦即，利培酮(risperidone)、奧氮平(olanzapine)、阿立哌唑(apripiprazole)、喹硫平(quetiapine)、帕潘立酮(paliperidone)、阿莫沙平(asenapine)、氯氮平(clozapine)、伊潘立酮(iloperidone)及齊拉西酮(ziprasidone))、啡噻嗪(phenothiazine)抗精神病藥(亦即，丙氯拉嗪、氯丙嗪、氟非那嗪(fluphenazine)、奮乃靜(perphenazine)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、甲硫噠嗪(thioridazine)及甲碸達嗪(mesoridazine))、噻噸(thioxanthene)(亦即，胺碸噻噸(thiothixene))、各種抗精神病藥(亦即，哌迷清(pimozide)、鋰、莫林酮(molindone)、氟哌啶醇(haloperidol)及克塞平(loxapine))、選擇性血清素再吸收抑制劑(亦即，西它普蘭(citalopram)、依地普蘭(escitalopram)、帕羅西汀(paroxetine)、費洛克汀(fluoxetine)及舍曲林(sertraline))、血清素-去甲腎上腺素再吸收抑制劑(亦即，度洛西汀(duloxetine)、文拉法新(venlafaxine)、去甲文拉法辛 (desvenlafaxine)、三環抗抑鬱劑(亦即，多慮平(doxepin)、氯米帕明(clomipramine)、阿莫沙平(amoxapine)、去甲替林(nortriptyline)、阿米替林(amitriptyline)、三甲丙咪嗪(trimipramine)、丙咪嗪(imipramine)、普羅替林(protriptyline)及去甲丙咪嗪(desipramine))、四環抗抑鬱劑(亦即，米氮平(mirtazapine)及馬普替林(maprotiline))、苯基哌嗪抗抑鬱劑(亦即，曲拉唑酮(trazodone)及奈法唑酮(nefazodone))、單胺氧化酶抑制劑(亦即，異唑肼(isocarboxazid)、苯乙肼(phenelzine)、司來吉蘭(selegiline)及反苯環丙胺(tranylcypromine))、苯并二氮呯(亦即，阿普唑侖(alprazolam)、艾司唑侖(estazolam)、氟西泮(flurazeptam)、氯硝西泮、氯羥安定及安定)、去甲腎上腺素-多巴胺再吸收抑制劑(亦即，丁胺苯丙酮(bupropion))、CNS刺激物(亦即，苯丁胺(phentermine)、二乙胺苯丙酮(diethylpropion)、甲基苯異丙胺(methamphetamine)、右旋苯丙胺(dextroamphetamine)、安非他命(amphetamine)、哌醋甲酯(methylphenidate)、右哌甲酯(dexmethylphenidate)、離胺酸安非他命(lisdexamfetamine)、莫達非尼(modafinil)、佩默林(pemoline)、苯基雙五甲烯四氮嗪(phendimetrazine)、甲基苯異丙基苄胺(benzphetamine)、苯基雙五甲烯四氮嗪(phendimetrazine)、阿莫達非尼(armodafinil)、二乙胺苯丙酮(diethylpropion)、咖啡鹼(caffeine)、阿托莫西汀(atomoxetine)、嗎乙苯吡酮(doxapram)及氯苯咪吲哚(mazindol))、抗焦慮/鎮靜/安眠劑(包括(但不限於)巴比妥酸鹽(亦即，司可巴比妥(secobarbital)、苯巴比妥及甲苯巴比妥)、苯并二氮呯(如上文所述)，及各種抗焦慮/鎮靜/安眠劑(亦即，苯海拉明、羥丁酸鈉(sodium oxybate)、紮來普隆(zaleplon)、羥嗪(hydroxyzine)、水合氯醛(chloral hydrate)、佐必登(aolpidem)、丁螺環酮(buspirone)、多慮平、右佐匹克隆(eszopiclone)、雷美爾通(ramelteon)、眠爾通 (meprobamate)及乙氯戊烯炔醇(ethclorvynol)))、分泌素(參看例如，Ratliff-Schaub等人，Autism 9：256-265(2005))、類鴉片肽(參看例如，Cowen等人，J.Neurochem.89：273-285(2004))及神經肽(參看例如，Hethwa等人，Am.J.Physiol.289：E301-305(2005))。
溶酶體貯積症為在一些狀況下與CNS相關或具有CNS特異性症狀的代謝病症；該等病症包括(但不限於)：泰-薩二氏病(Tay-Sachs disease)、高雪氏病(Gaucher's disease)、法布瑞氏病(Fabry disease)、黏多糖病(I型、II型、III型、IV型、V型、VI型及VII型)、肝糖貯積病、GM1神經節苷脂貯積病、異染性腦白質營養不良、法伯氏病(Farber's disease)、卡納萬氏腦白質營養不良(Canavan's leukodystrophy)及神經元類蠟脂褐質沈積症1型及2型、尼-皮二氏病(Niemann-Pick disease)、龐貝氏病(Pompe disease)及克拉伯氏病(Krabbe's disease)。
對於溶酶體貯積病，可選擇之神經藥物本身或以其他方式模擬疾病中受損之酶的活性。用於治療溶酶體貯積症之例示性重組酶包括(但不限於)例如美國專利申請公開案第2005/0142141號中所闡述之酶(亦即，α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-硫酸酯酶、α-N-乙醯基葡萄糖苷酶、N-乙醯基-半乳糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、β-葡糖醛酸酶、酸性α-葡糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶A、己糖胺酶A、酸性鞘磷脂酶、β-半乳糖腦苷脂酶、β-半乳糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、酸性神經醯胺酶、天冬胺酸醯化酶、棕櫚醯-蛋白質硫酯酶1及三肽基胺基肽酶1)。
在另一實施例中，與紅血球之不當或過度產生有關或由之引起，或紅血球之過度產生為疾病之一種作用的疾病可藉由本文中所識別的保留至少部分效應功能之抗TfR抗體的網狀紅血球耗竭作用來預防或治療。舉例而言，在先天性或贅生性真性紅血球增多症中，由例 如網狀紅血球過度增殖引起之紅血球計數升高導致血液變稠且伴隨出現生理症狀(d'Onofrio等人，Clin.Lab.Haematol.(1996)增刊1：29-34)。投與本發明之抗TfR抗體(其中該抗體之至少部分效應功能得以保留)將允許選擇性移除不成熟之網狀紅血球群，而不影響轉鐵蛋白向CNS中之正常轉運。如此項技術中充分瞭解的，此類抗體之給與可經調節以使急性臨床症狀減到最少(亦即，藉由以極低劑量或以較寬間隔之時間間隔給藥)。
在一個態樣中，使用本發明之抗體在症狀發作之前偵測神經病症及/或評估該疾病或病症之嚴重程度或持續時間。在一個態樣中，該抗體允許偵測神經病症及/或使神經病症顯影，包括藉由射線照相術、斷層攝影術或磁共振顯影(MRI)顯影。
在一個態樣中，提供了用作藥物之本發明之低親和力抗TfR抗體。在其他態樣中，提供了用於治療神經疾病或病症(例如阿茲海默氏病)而不耗竭紅血球(亦即，網狀紅血球)之低親和力抗TfR抗體。在某些實施例中，提供了用於如本文所述之治療方法中的經修飾低親和力抗TfR抗體。在某些實施例中，本發明提供一種經修飾以改善其安全性之低親和力抗TfR抗體，其係用於治療患有神經疾病或病症之個體之方法中，該方法包含向該個體投與有效量之抗TfR抗體(視情況偶合至神經病症藥物)。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑。在其他實施例中，本發明提供一種經修飾以改善其安全性之抗TfR抗體，其係用於減少或抑制有患神經疾病或病症(例如阿茲海默氏病)風險或患上該神經疾病或病症之患者體內的澱粉樣斑塊形成。根據上述任何實施例，「個體」視情況為人類。在某些態樣中，用於本發明方法中之本發明之抗TfR抗體使其所偶合之神經病症藥物之吸收改善。
在另一態樣中，本發明提供本發明之低親和力抗TfR抗體之用 途，其係用於製造或製備藥物。在一個實施例中，該藥物係用於治療神經疾病或病症。在另一實施例中，該藥物用於治療神經疾病或病症之方法中，該方法包含向患有神經疾病或病症之個體投與有效量之該藥物。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療阿茲海默氏病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有阿茲海默氏病之個體投與有效量的結合BACE1及TfR或結合Aβ及TfR之本發明之多特異性抗體。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑。根據上述任何實施例，「個體」可為人類。
本發明之抗TfR抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明之抗TfR抗體可與至少一種其他治療劑共投與。在某些實施例中，其他治療劑為一種可有效治療與採用抗TfR抗體治療相同或不同之神經病症的治療劑。例示性其他治療劑包括(但不限於)：上文所述之各種神經藥物、膽鹼酯酶抑制劑(諸如多奈哌齊、加蘭他敏、卡巴拉汀(rovastigmine)及他可林)、NMDA受體拮抗劑(諸如美金胺)、澱粉樣β肽聚集抑制劑、抗氧化劑、γ-分泌酶調節劑、神經生長因子(NGF)模擬物或NGF基因療法、PPARγ促效劑、HMS-CoA還原酶抑制劑(他汀)、安帕金(ampakine)、鈣通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝糖合成酶激酶抑制劑、靜脈內免疫球蛋白、蕈毒鹼受體促效劑、菸鹼受體調節劑、主動或被動澱粉樣β肽免疫、磷酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑及抗澱粉樣β肽抗體。在某些實施例中，針對減輕神經藥物之一或多種副作用的能力來選擇至少一種其他治療劑。
如本文所例示，某些抗TfR抗體可具有負面地影響用該抗TfR抗體所治療之個體體內之網狀紅血球群的副作用。因此，在某些實施例中，將針對減輕對於網狀紅血球群之此類副作用之能力所選擇的至少 一種其他治療劑與本發明之抗TfR抗體共投與。該等治療劑之實例包括(但不限於)增加紅血球(亦即，網狀紅血球)群之藥劑、支持紅血球(亦即，網狀紅血球)之生長及發育的藥劑，及保護紅血球群免受抗TfR抗體影響之藥劑；該等藥劑包括(但不限於)紅血球生成素(EPO)、鐵補充劑、維生素C、葉酸及維生素B12，以及藉由例如輸注類似細胞進行之紅血球(亦即，網狀紅血球)的物理替代療法，該等類似細胞可來自具有類似血型之另一個體，或可預先自投與該抗TfR抗體之個體提取。普通熟習此項技術者應瞭解，在一些情況下，欲用於保護現有紅血球(亦即，網狀紅血球)之藥劑較佳係在投與抗TfR抗體療法之前或同時投與個體，而欲用於支持或起始紅血球或紅血球群(亦即，網狀紅血球或網狀紅血球群)之再生長/發育的藥劑較佳係在投與抗TfR抗體療法之同時或之後投與，由此該等血細胞可在抗TfR抗體治療之後得到補充。
在某些其他此類實施例中，針對在投與抗TfR抗體之後抑制或預防補體路徑活化之能力來選擇該至少一種其他治療劑。該等治療劑之實例包括(但不限於)干擾抗TfR抗體結合至或活化補體路徑之能力的藥劑，及抑制該補體路徑內之一或多種分子相互作用的藥劑，且其大體上描述於Mollnes及Kirschfink(2006)Molec.Immunol.43：107-121中，其內容清楚地以引用之方式併入本文中。
以上及本文所述之該等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑係包括在同一或單獨調配物中)，及分開投藥，在此情形中，本發明抗體之投與可在該其他治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後發生。在一個實施例中，抗TfR抗體之投與及其他治療劑之投與係彼此間隔在約一個月內，或在約一週、兩週或三週內，或在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內發生。本發明之抗體亦可與其他干預療法組合使用，該等干預療法諸如(但不限於)放射療法、行 為療法或其他在此項技術中已知且適於待治療或預防之神經病症的療法。
本發明之抗TfR抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何適合手段投與，包括非經腸、肺內及鼻內，及必要時局部治療、病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。部分取決於投藥之短期或長期性，可藉由任何適合途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。本發明涵蓋多種給藥時程，包括(但不限於)在多個時間點單次或多次投與、快速注射投與及脈衝輸注。
本發明之抗體將以與優良醫療規範相符之方式調配、給與及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及從業醫生已知之其他因素。該抗體無需但視情況與一或多種同時用於預防或治療所論及之病症或者預防、減輕或改善抗體投藥之一或多種副作用的藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於調配物中存在之抗體之量、病症或治療之類型以及以上論述之其他因素。該等藥劑一般以相同劑量且利用本文中所述之投藥途徑使用，或以本文中所述劑量之約1%至99%使用，或憑經驗/臨床上確定為適當的以任意劑量及任何途徑使用。
為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他另外的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係達成預防抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應，以及主治醫師之判斷。抗體適於一次性或經一系列治療投與至患者。無論例如藉由一或多次分開投藥，或藉由連續輸注，取決於疾病類型及嚴重程度，抗體投與患者的初始候選劑量可例如為約1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)。一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更高劑量之 範圍內，此取決於上文所提及之因素。對於歷經數天或更長時間的重複投藥，取決於病狀，治療通常可持續直至疾病症狀之所需抑制發生為止。該抗體之一種例示性劑量將在約0.05mg/kg至約40mg/kg範圍內。以你，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg或40mg/kg(或其任何組合)之一或多次劑量。該等劑量可間歇地投與，例如，隔週或隔三週(例如，以使得患者接受約二至約二十或例如約六次劑量的抗體)。最初可投與較高負荷劑量，接著可投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。應理解，藉由投與抗TfR抗體來降低對網狀紅血球群之影響的一種方法係調節給藥劑量或時程，由此使總體較低數量之循環抗體存在於血流中與網狀紅血球相互作用。在一個非限制性事例中，可以比較高劑量更高的頻率投與較低劑量之抗TfR抗體。所用劑量可在必需傳遞至CNS之抗體量(本身與該抗體之CNS抗原特異性部分的親和力相關)、該抗體對TfR之親和力與是否將保護紅血球(亦即，網狀紅血球)、刺激生長及發育或抑制補體路徑之化合物與該抗體共投與或依序投與之間達到平衡。該療法之進展易於藉由如本文所述及此項技術中所知之習知技術及分析來監測。
應瞭解，以上任何調配物或治療方法均可使用本發明之免疫結合物作為抗TfR抗體之替代物或補充來進行。
H. 製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有可用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之物質的製品。該製品包含容器及在該容器上或與該容器相關聯之標記或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。該容器容納組合物自身或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另 一組合物組合的組合物，且可具有無菌存取口(例如該容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。該組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標記或藥品說明書指示該組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)內含組合物的第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)內含組合物的第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明該實施例中之製品可進一步包含藥品說明書，該藥品說明書指示組合物可用於治療特定病狀。替代地或另外，該製品可進一步包含一包含醫藥學上可接受之緩衝液(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液)的第二(或第三)容器。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應瞭解，以上任何製品均可包括本發明之免疫結合物作為抗TfR抗體之替代物或補充來進行。
實例 實例1：人類/食蟹獼猴交叉反應性抗TFR抗體之產生、表徵及人類化
首先，進行天然抗體噬菌體淘選製程以嘗試鑑別不與Tf競爭結合至TfR之抗體與人類TfR及食蟹獼猴(「cyno」)TfR的交叉反應性(Lee等人，JMB(2004)1073-1093)。自該噬菌體淘選製程未鑑別出該交叉反應性、非Tf競爭性純系。不過，鑑別出可用於隨後表徵所產生之融合瘤純系的兩種抗體。
鑑別出一種與Tf競爭結合至人類或食蟹獼猴TfR的物種交叉反應性抗體(Tf競爭性抗體)。使用小鼠/人類嵌合TfR受體，對人類TfR具有特異性之另一純系的抗原決定基定位於huTfR之頂端結構域(圖1)。當在該頂端結構域中以小鼠TfR序列取代huTfR時，該頂端結構域結合純系失去與huTfR之結合。
接下來，進行基於免疫接種之方法以產生交叉反應性抗人類/食蟹獼猴TfR抗體。如所述(Bennet等人，Nature(2000)403,46-53)，表現並純化含有N末端His標籤及人類血色病蛋白(「HFE」)之人類TfR細胞外結構域(「ecd」)。亦製備類似的食蟹獼猴TfR ecd構建體。以類似方式表現並純化食蟹獼猴TfR。藉由用含有食蟹獼猴TfR及huTfR ecd各2μg之6次劑量(每週兩次)對5隻Balb/C小鼠之足墊免疫接種來產生人類及食蟹獼猴交叉反應性TfR抗體。所有小鼠血清均呈FACS陽性且所有小鼠均融合。在所篩選之1632個融合瘤中，有111個對於結合至人類及食蟹獼猴TfR兩者呈ELISA陽性。
在1μM人類holo-Tf存在下，藉由FACS篩選結合至短暫表現人類或食蟹獼猴TfR之293細胞的所得ELISA陽性融合瘤。簡言之，使用在FACS分析之前48-72小時，使用脂染胺2000 plus(Invitrogen)以全長人類或食蟹獼猴TfR轉染的293細胞進行FACS分析。用FACS緩衝液(含1% BSA之PBS)洗滌未轉染(對照物)及經轉染之293細胞兩次，在1μM人類holo-Tf存在下向293細胞中添加50μl融合瘤上清液(標準化至10μg/ml)並在冰上培育30分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞兩次，向細胞中添加50μl PE-山羊抗鼠類Fcγ(Jackson ImmunoResearch)且將其在冰上培育30分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞且將其再懸浮於100μl FACS緩衝液中以供分析。
14個純系對於結合至人類及食蟹獼猴TfR兩者呈陽性(圖2A及2B)。對該等純系進行進一步次選殖且藉由ELISA評價其與人類及食蟹獼猴TfR兩者之結合，並使用以上鑑別之頂端結合噬菌體純系在huTfR上定位抗原決定基。簡言之，在4℃下，在塗有含2μg/ml經純化人類或食蟹獼猴TfR之PBS之maxisorp板中進行頂端結構域噬菌體競爭性ELISA隔夜。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用含酪蛋白之Superblock(Thermo Scientific,Hudson,NH)阻斷。向每一孔中添加融 合瘤上清液之30μl等分試樣(標準化至10μg/ml)，保持45分鐘。此後在OD 0.05下添加30μl頂端結構域結合噬菌體，保持15分鐘。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且向該板添加1：1000稀釋之HRP-小鼠-抗M13(GE healthcare)並在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用TMB受質(BioFX Laboratories,Owings Mills)偵測經結合噬菌體。發現十四個純系中有九個阻斷在噬菌體上呈現之頂端結合抗體的結合(參看圖2C)。
使用表面電漿子共振(「SPR」)(BiacoreTM,GE Healthcare)量測抗體親和力。將抗His抗體(Qiagen)以介於6000與8000之間之RU偶合至BIACORETM CM5感測器晶片(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)之四個不同流量槽上。使用由製造商所提供之方案，藉由胺基隨機偶合來達成固定。在水中稀釋10X HBS-P(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)且用作稀釋及操作緩衝液。捕獲純化之人類或食蟹獼猴TfR，隨後使用單循環動力學方法，以30ml/min之流動速率注射IgG或Fab之3倍連續稀釋液。使用簡單的1：1朗繆爾結合模型或在kon或koff超出偵測限時使用穩態模型來測定親和力常數。以締合速率常數(kon)與解離速率常數(koff)之比率來計算平衡解離常數(KD)。結果顯示於圖2C中。
對每一融合瘤進行選殖。使用RNeasy微型套組(Qiagen)自融合瘤分離總RNA。基於製造商之說明書，使用SMART 5' RACE cDNA擴增套組(Clontech)產生cDNA。使用該套組中提供之UPM(5'寡核苷酸)以及黏接至恆定區之3'寡核苷酸擴增每一抗體之可變區。接著將整個PCR產物選殖至pCR4Blunt-TOPO載體(Invitrogen)中以供測序。在序列分析之後，可將該等融合瘤進一步再分成4個組(圖3A-3D)。與頂端結合抗體競爭之純系分入3個相關之序列類別(圖3A-C)。4個非頂端純系(圖3D)由2個相關純系及2個其他獨特序列組成。每一純系之輕鏈及重鏈CDR提供於表3中。
本文中例示了來自每一類別之代表性純系(15G11、7A4、16F6及7G7)以用於人類化及進一步表徵。人類化係如下文及圖4A-4E中所略述，使用HVR移植以及包括選擇游標位置來達成。15G11係藉由將HVR移植至IGKV1-NL1*01及IGHV1-3*01人類可變結構域中來人類化。如圖4E中所略述，在人類化變異體中包括不同小鼠游標位置之組合。如圖4A中所略述，人類化15G11變異體15G11.v5在VL(位置43及48)及VH(位置48、67、69、71及73)中含有所選游標位置。此外，VH之N末端由Q變為E。對於7A4之人類化，使用7A4重鏈及8A2輕鏈HVR(7A4及8A2為相關純系，圖3A)製備HVR移植物。將HVR移植至IGKV4-1*01及IGHV1-2*02人類可變結構域中。如圖4E中所略述，在人類化變異體中包括不同小鼠游標位置之組合。如圖4B中所略述，人類化7A4變異體7A4.v15在VL(位置68)及VH(位置24及71)含有所選游標位置且含有CDR-L3變化G94A。如圖4C中所略述，藉由將HVR移植至κ4及亞組I人類共同可變結構域中以及在VH中具有所選游標位置(位置93)來使7G7人類化。該人類化變異體稱為7G7.v1。16F6係藉由將HVR移植至IGKV1-9*01及IGHV4-59*01人類可變結構域中來人類化。如圖4E中所略述，在人類化變異體中包括不同小鼠游標位置之組合。如圖4D中所略述，人類化16F6變異體16F6.v4在VL中含有2個變化(I48L及F71Y)且在VL(位置43及44)及VH(位置71及78)中含有所選游標位置。
藉由SPR以IgG形式測定人類化變異體對人類及食蟹獼猴TfR之親和力(圖4E)。亦藉由SPR以Fab形式分析所選純系，以評估單價親和力(表7)。在兩種情形中，SPR實驗均係如上文所述進行。
該等抗體之結合抗原決定基係如下重新確定。在4℃下，在塗有 2μg/ml經純化人類TfR之PBS之maxisorp板中進行Tf-TfR阻斷性ELISA隔夜。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用Superblock阻斷緩衝劑(Thermo Scientific,Hudson,NH)之PBS溶液阻斷。向該等板中添加50μl 12.5μM之人類holo-Tf(R&D Systems,Minneapolis,MN)，保持40分鐘。向該板中添加50μl之hu7A4.v15、hu15G11.v5、Tf競爭抗體及hu7G7.v1滴定液(以10μg/ml開始，1：3連續稀釋)並培育20分鐘。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且向該板添加1：1000稀釋之HRP-山羊抗人類Fcγ(Jackson ImmunoResearch)並在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用TMB受質(BioFX Laboratories,Owings Mills)進行偵測。
在4℃下，在塗有含1μg/ml HFE之PBS之maxisorp板中進行HFE-TfR結合ELISA隔夜。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用Superblock阻斷緩衝劑(Thermo Scientific,Hudson,NH)之PBS溶液阻斷。向該板中添加人類TfR之滴定液(以100μg/ml起始，1：3連續稀釋)且培育1小時。接著向該板中添加1μg/ml hu15G11.v5、hu7A4.v15或hu7G7.v1，保持1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且向該板添加1：1000稀釋之HRP-山羊抗人類Fcγ(Jackson ImmunoResearch)並在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用TMB受質(BioFX Laboratories,Owings Mills)進行偵測。在4℃下，在塗有含1μg/ml HFE之PBS之maxisorp板中進行HFE-TfR阻斷性ELISA隔夜。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用Superblock阻斷緩衝劑(Thermo Scientific,Hudson,NH)之PBS溶液阻斷。在NUNCTM板中，將hu7A4.v15、hu15G11.v5、Tf競爭抗體、人類holo-Tf及對照IgG之滴定液(對於所有抗體，400μg；對於holo轉鐵蛋白，8000μg/ml；1：3連續稀釋)與2μg/ml生物素化之人類TfR組合並培育1小時。接著在室溫下將該混合物添加至塗有HFE之板中，保持1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板，且將1：1000稀釋之HRP-抗生蛋白鏈菌素(SouthernBiotech,Birmingham)添加至板中且在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板，且使用TMB受質(BioFX Laboratories,Owings Mills)偵測結合至該板之生物素化人類TfR。
該等人類化變異體與TfR之結合不受6.3μM holo-Tf存在之影響，而結合至TfR上之Tf結合位點之Tf競爭抗體之結合受到抑制(圖5)。另外，人類化7A4.v15、15G11.v5及7G7.v1仍可結合捕獲HFE之huTfR，表明其不影響huTfR與固定之HFE之結合(圖6A)。在相關實驗中，7A4.v15及15G11.v5不阻止生物素化TfR結合至固定之HFE。相比之下，該相互作用受Tf競爭抗體及holo Tf阻斷(圖6B)。已知HFE及Tf在TfR上共用類似之抗原決定基(Bennet等人，Nature(2000)403,46-53)。
對固定之15G11v.5及抗TfRC12抗體與生物素化人類TfR ECD或呈現人類TfR頂端結構域之單價M13噬菌體之結合進行評價。抗TfRC12抗體來源於針對人類TfR ECD淘選且結合至人類TfR上與轉鐵蛋白結合相競爭之位點的合成抗體噬菌體文庫。將抗體在PBS中以1μg/ml塗佈於Maxisorp板上。分別用HRP-抗生蛋白鏈菌素(GE health care,RPN 4401V)或HRP-抗M13抗體(GE health care,27-9421-01)偵測經結合生物素化人類TfR ECD或TfR-頂端結構域噬菌體。圖25顯示，15G11v.5結合至人類TfR頂端結構域。該15G11v.5結合位點定位於頂端結構域，一個遠離TfR配體結合位點之位點。
實例2：人類/食蟹獼猴交叉反應性抗TFR抗體之親和力工程改造
除上述人類化變異體外，亦製備其他親和力工程改造之變異體。本文中例示了15G11.v5及7A4.v15之親和力工程改造。藉由使用標準技術在CDR-L3或CDR-H3中產生個別丙胺酸取代來產生親和力變異體。藉由ELISA及SPR以IgG形式篩選該等變異體以鑑別對於結合至 人類及食蟹獼猴TfR而言很重要之位置；亦測定呈Fab形式之所選變異體的單價親和力。在293細胞中表現Ala掃描變異體IgG或Fab且在4℃下，在塗有含1.8μg/ml山羊抗人類Fcγ(Jackson ImmunoResearch)之PBS之maxisorp板中藉由ELISA定量與人類或食蟹獼猴TfR之結合隔夜。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用Superblock阻斷緩衝劑(Thermo Scientific,Hudson,NH)之PBS溶液阻斷。將含有表現之IgG之上清液以1：5連續稀釋並添加至該板中，保持1小時。使用純化之hu15G11.v5或hu7A4.v15作為標準品(以1μg/ml開始，1：5稀釋)。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且向該板添加1：1000稀釋之HRP-山羊抗κ抗體(Southern Biotech)並在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用TMB受質(BioFX Laboratories,Owings Mills)進行偵測。如以上所述，亦藉由SPR評估結合。結果顯示於圖7A(15G11.v5變異體)及7B(7A4.v15變異體)中。
亦產生在CDR-L1、CDR-L2、CDR-H1及CDR-H2中之位置具有個別丙胺酸取代的15G11.v5之其他變異體，表現並首先藉由ELISA針對與人類及食蟹獼猴TfR之結合進行篩選(表6)。在4℃下，在塗有含2μg/ml經純化人類或食蟹獼猴TfR之PBS之maxisorp板中進行Hu/Cy結合ELISA隔夜。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用Superblock阻斷緩衝劑(Thermo Scientific,Hudson,NH)之PBS溶液阻斷。將含有表現之Ala掃描變異體IgG之細胞培養物上清液以1：5連續稀釋並添加至各孔中，保持1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且向該板添加1：1000稀釋之HRP-山羊抗人類Fcγ(Jackson ImmunoResearch)並在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌板且使用TMB受質(BioFX Laboratories,Owings Mills)進行偵測。
接著對所選變異體進行純化且藉由SPR評估其對人類或食蟹獼猴 TfR之單價親和力(表7)。
實例3：雙特異性抗人類TfR抗體之構建及活體外分析
將前述某些抗體變異體格式轉換為具有特異性結合至BACE1之第二臂的雙特異性抗體。使用抗人類TfR抗體Hu15G11.v5、Hu15G11.LC92A、Hu15G11.HC52A及Hu15G11.HC53A，使用『按鈕與孔』雙特異性抗體構建技術來工程改造該雙特異性抗體之TfR結合臂(Carter,P.(2001)J.Immunol.Methods 248,7-15；Ridgway,J.B.,Presta,L.G.及Carter,P.(1996)Protein Eng.9,617-621；Merchant,A.M.,Zhu,Z.,Yuan,J.Q.,Goddard,A.,Adams,C.W.,Presta,L.G.及Carter,P.(1998)Nat.Biotechnol.16,677-681；Atwell,S.,Ridgway,J.B.,Wells,J.A.及Carter,P.(1997)J.Mol.Biol.270,26-35)。除抗TfR(孔)及抗BACE1(按鈕)之Fc中的按鈕及孔突變外，所有半抗體均在廢除了效應功能之Fc區中含有突變(N297G)且Hu15G11.v5及Hu15G11.LC92A含有廢除了效應功能之另外的Fc突變(D265A)。將按鈕及孔半抗體分別自大腸桿菌純化且以1：1.1之比率與抗TfR組合以防止抗TfR均二聚體之形成。該雙特異性抗體之組裝係藉由在室溫下於含有與抗體成100x比率之還原麩胱甘肽及200mM精胺酸之緩衝液(pH 8.0)中還原黏接至少三天來完成。組裝之後，藉由疏水相互作用層析法來純化雙特異性抗體。該組裝係藉由液相層析質譜法及SDS-PAGE 來確定。藉由尺寸排阻法及多角度雷射光光譜法確定，該等經純化抗體為均質且單分散性的。
所得雙特異性抗體稱為15G11.v5(抗TfR1)、15G11.W92A(15G11.LC92A或抗TfR2)、Hu15G11.N52A(抗TfR52A)及Hu15G11.T53A(抗TfR53A)。如以上所述，藉由SPR測定115G11.v5及115G11.W92A對人類及食蟹獼猴TfR之單價親和力及動力學(參看表9)。對於結合至小鼠TfR，抗TfR1抗體及抗TfR2抗體與抗TfRA抗體及抗TfRD抗體具有類似的單價結合親和力(參看Atwal等人，Sci.Transl.Med. 3,84ra43(2011)；Yu等人，Sci.Transl.Med.2011年5月25日：第3卷，第84期，第84ra44頁)。
另外，如先前所述，藉由SPR量測抗TfR1、抗TfR2、Hu15G11.N52A及Hu15G11.T53A雙特異性抗體針對人類及食蟹獼猴TfR之結合親和力。如下表9中所示，抗TfR52A抗體及抗TfR53A抗體對於人類及食蟹獼猴TfR之結合親和力在TfR1h15G11.v5與TfR2LC92A之間。
實例4：含效應子及無效應子單特異性及雙特異性抗體對人類紅白血病細胞株及原代骨髓單核細胞之影響
先前在小鼠中進行之研究已測定，具有效應功能及/或補體結合能力的結合鼠類TfR之抗體選擇性耗竭表現TfR之網狀紅血球。為了確定在小鼠研究中所觀察到的耗竭是否為鼠類系統所特有的，利用結合至人類TfR之抗TfR抗體進行進一步實驗。
使用來自健康人類供體之周圍血液單核細胞(PBMC)作為效應細胞來進行ADCC分析。使用人類紅白血病細胞株(HEL，ATCC)及原代人類骨髓單核細胞(AllCells,Inc.)作為靶細胞。為了使可能潛在地由FcγRIIIA中殘基158位處之異型差異所引起的供體間可變性減到最小，在第一組實驗(圖8A-B)中將血液供體限定於帶有異型接合RcγRIIIA基因型(F/V158)之供體。對於第二組實驗(圖9A-B)，僅使用HEL細胞作為靶細胞，且來自健康人類供體之PBMC帶有F/V158基因型或FcγRIIIA V/V158基因型。由於已知與增加之NK細胞介導的ADCC活性相關聯且能夠結合IgG4抗體(Bowles及Weiner,2005；Bruhns等人，2008)，故在該分析中亦包括V/V158基因型。遵循製造商之說明書，藉由Vi-CELL®(Beckman Coulter；Fullerton,CA)對細胞進行計數且測定活力。
藉由密度梯度離心，使用Uni-SepTM血液分離管(Accurate Chemical & Scientific Corp.；Westbury,NY)來分離PBMC。在50μL分析培養基(含1% BSA及100個單位/毫升青黴素及鏈黴素之RPMI-1640)中將靶細胞以4×104個/孔接種於96孔圓底板中。向含有靶細胞之板中添加測試抗體及對照抗體之連續稀釋液(50微升/孔)，隨後在37℃及5% CO2下培育30分鐘以允許助噬素作用。在5倍連續稀釋得到總計10個資料點之後，抗體之最終濃度在0.0051至10,000ng/mL範圍內。培育之後，向每一孔中添加含1.0×106個PBMC效應細胞之100μL分析培養基以得到25：1之效應細胞：靶細胞比率，且該等板再培育4小時。在培育結束時，對該等板離心且使用Cytotoxicity Detection KitTM (Roche Applied Scinece；Indianapolis,IN)測試上清液中之乳酸脫氫酶(LDH)活性。向上清液中添加LDH反應混合物且在室溫下，在恆定振盪下培育該等板15分鐘。以1M H3PO4終止該反應，且使用SpectraMax Plus微板讀取器在490nm下量測吸光度(對於每一孔減去在650nm下量測之背景值)。僅含靶細胞之孔的吸光度用作背景對照物(低對照)，而含有用Triton-X100溶解之靶細胞之孔提供最大可得信號(高對照)。在含有靶細胞及效應細胞而未添加抗體之孔中量測不依賴於抗體之細胞之細胞毒性(AICC)。特定ADCC之程度計算如下：
將樣品稀釋液之ADCC值針對抗體濃度作圖，且使用SoftMax Pro將劑量-反應曲線與四參數模型相擬合。
在第一組實驗中，使用人類紅白血病細胞株(HEL細胞)或原代人類骨髓單核細胞作為靶細胞來評估各種抗人類TfR構建體之ADCC活性。在ADCC分析中，使用抗gD WT IgG1作為陰性對照物，使用鼠類抗人類HLA(I類)作為陽性對照物，測試各種濃度之二價IgG1效應功能勝任型抗人類TfR1抗體15G11，及呈含有D265A及N297G突變以廢除效應功能之人類IgG1形式的具有抗BACE1臂之該抗體之雙特異性形式(參看實例3)。結果顯示於圖8A及8B中。在HEL細胞作為標靶(圖8A)或骨髓單核細胞作為標靶(圖8B)之情況下，單特異性效應子陽性抗人類TfR抗體15G11引起顯著ADCC活性。該活性類似於陽性對照物抗人類HLA抗體對HEL細胞之活性，且相對於該陽性對照物對骨髓單核細胞處於穩固但較低之程度。在骨髓單核細胞實驗中觀察到的略微較低的程度可能歸因於以下事實：在該實驗中使用的骨髓及紅血球譜系PBMC細胞之非均質混合物中僅一部分具有高TfR表現量，而HEL細胞在整個純系細胞群中始終具有高TfR表現。在強烈的對比下，無 效應子雙特異性抗人類TfR/BACE1抗體在HEL或骨髓單核細胞中不呈現任何ADCC活性，與陰性對照物類似。
在第二組實驗中，評估了在該分析系統中抗體同型轉換之影響。ADCC分析程序與以上所述相同，但所有靶細胞均為HEL細胞，且效應細胞為來自帶有異型接合FcγRIIIa-V/F158基因型或同型接合FcγRIIIa-V/V158基因型之健康人類供體的PBMC。所測試之所有抗人類TfR與基於以下三種不同Ig主鏈之抗gD呈雙特異性：野生型人類IgG1、具有N297G突變之人類IgG1及人類IgG4。亦測試具有人類IgG4主鏈之抗Aβ抗體，且小鼠抗人類HLA(I類)用作陽性對照物。結果顯示於圖9A及9B中。如基於效應細胞活化與V/V158基因型之間之已知關聯(Bowles及Weiner 2005)所預期的，相對於F/V158供體(約25%靶細胞受影響)，V/V158供體PBMC(約45%靶細胞受影響)引起之ADCC活性更穩固(比較圖9A與圖9B)。具有野生型IgG1之抗TfR/gD抗體在HEL細胞中誘導穩固ADCC，而無效應子IgG1之抗TfR/gD抗體在HEL細胞中不顯示任何ADCC活性，重現了由第一組實驗得到的結果。值得注意的是，在100ng/mL或100ng/mL以上之濃度下，IgG4同型之抗TfR/gD抗體顯示輕微ADCC活性。該活性在抗Aβ IgG4結果中未觀察到，表明TfR結合係ADCC活性所需的。該發現與先前所報導的IgG4具有最小但可量測之效應功能相關(Adolffson等人，J.Neurosci.32(28)：9677-9689(2012)；van der Zee等人，Clin Exp.Immunol.64：415-422(1986))；Tao等人，J.Exp.Med.173：1025-1028(1991))。
實例5：活體內雙特異性抗人類TfR/BACE1雙特異性抗體之評估 A.藥物動力學、藥效學及安全性研究
為了評價活體內雙特異性抗人類TfR抗體之藥物濃度、藥效學作用及安全性，向食蟹獼猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))給與使用與先前實例中所使用相同之抗BACE1臂配對之抗TfR抗體純系15G11(抗 TfR1/BACE1)，或與先前實例中所使用相同之抗BACE1臂配對之純系15G11.LC92A(抗TfR2/BACE1)，或Hu15G11.N52A(抗TfR52A/BACE1)及Hu15G11.T53A(抗TfR53A/BACE1)的雙特異性抗體。該等雙特異性抗體呈如先前所述具有N297G或D265A及N297G突變從而廢除效應功能的人類IgG1形式。使用基於人類IgG1之抗gD分子作為對照物。該研究係在非人類靈長類動物中進行，因為該等抗TfR抗體之交叉反應性限定於非人類靈長類動物及人類。此外，研究已顯示，人類與靈長類動物在腦脊髓液(CSF)與血漿隔室(plasma compartment)之間之藥物轉運機制可能類似(Poplack等人，1977)。藉由單次靜脈內(IV)快速注射將30mg/kg劑量之該等抗體投與至留置小腦延髓池導管之有意識食蟹獼猴中。在給藥後長達60天之多個時間點，對血漿、血清及(CSF)進行取樣。樣品分析包括血液檢查(全血)、臨床化學檢驗(血清)、抗體濃度(血清及CSF)及對抗體之藥效學反應(血漿及CSF)。有關詳細取樣方案，參看圖10。
用ELISA，使用吸收抗體包被之綿羊抗人類IgG猴，隨後以1：100之稀釋液開始添加血清樣品，且最後藉由添加供偵測的結合至所吸收之辣根過氧化酶猴之山羊抗人類IgG抗體，來測量食蟹獼猴血清及CSF中給與之抗體的濃度。該分析具有0.78-50ng/mL之標準曲線範圍及0.08μg/mL之偵測限。低於該偵測限之結果報導為低於可報導值(LTR)。
圖11A-B顯示了抗TfR1/BACE1抗體及抗TfR2/BACE1抗體之藥物動力學分析的結果。抗gD抗體之藥物動力學型態係如關於典型人類IgG1抗體在食蟹獼猴所預期，且平均清除率為每天3.98mL/kg。兩種抗TfR/BACE1抗體之清除率均比抗gD抗體快，此可能歸因於周圍靶介導之清除作用。抗TfR1/BACE1抗體具有最快清除率，與其對TfR具有最高結合親和力相符，而抗TfR2/BACE1抗體顯示相較於抗 TfR1/BACE1抗體有所改善之藥物動力學型態(亦即，延長之血清暴露)，此可能歸因於其對TfR之親和力較低。抗TfR1/BACE1抗體及抗TfR2/BACE1抗體之清除率分別為每天18.9mL/kg及每天8.14mL/kg。所有抗體均在CSF中以約千分之一之血清濃度偵測。然而，在該等分子中存在高可變性且在CSF中抗體濃度存在總體不可偵測之差異。表
SD=標準偏差；IV=靜脈內；AUCall=自時間0至最後一個可量測濃度之時間時的濃度-時間曲線下面積；AUCinf=外推至無窮大之濃度-時間曲線下面積；Cmax=所觀察之最大血清濃度；CL=清除率；Vss=在穩態下之分佈體積；Min=最小值；Max=最大值。
圖19顯示了抗TfR1/BACE1抗體、抗TfR52A/BACE1抗體及抗TfR53A/BACE1抗體之藥物動力學分析的結果。所有抗TfR/BACE1抗體之清除率均比抗gD抗體快，此可能歸因於周圍靶介導之清除率。抗TfR1/BACE1抗體具有最快清除率，與其對TfR具有最高結合親和力相符，而抗TfR52A/BACE1抗體及抗TfR53A/BACE1抗體顯示相較於抗TfR1/BACE1抗體有所改善之藥物動力學型態(亦即，延長之血清暴露)，此可能歸因於抗TfR52A/BACE1抗體及抗TfR53A/BACE1抗體對TfR之親和力較低。
為了查看回應於給與抗TfR/BACE1抗體之藥效學作用，對食蟹獼猴血漿及CSF中Aβ1-40以及sAPPα及SAPPβ含量進行量測。Aβ1-40係以ELISA，使用抗Aβ1-40特異性多株抗體包被，隨後添加樣品，且最後藉由添加供偵測的結合至辣根過氧化酶小鼠抗人類Aβ1-40單株抗體來 量測。該分析對於血漿之偵測限為60pg/mL且對於CSF為140pg/mL。低於該濃度之結果報導為低於可報導值(LTR)。sAPPα及sAPPβ之濃度係使用sAPPα/sAPPβ多點分析(Mesoscale Discovery(Gaithersburg,MD))來測定。在冰上解凍CSF，接著以1：10稀釋於含1% BSA之TBS-T(10mM Tris緩衝液pH 8.0、150mM NaCl、0.1% Tween-20)中。該分析係遵照製造商之方案進行。該分析對於sAPPα具有0.05ng/ml之較低定量限值且對於sAPPβ為0.03ng/mL。
圖12A-E概述了該等抗體之藥效學特性。在周圍中，血漿Aβ1-40含量在投與抗gD抗體之後保持未改變，但在投與TfR/BACE1抗體之後有短暫地降低。兩種變異體均使血漿Aβ1-40含量降低，其中在給藥後1天達到50%的最大抑制。血漿Aβ1-40含量逐漸恢復，且給與抗TfR1/BACE1抗體之動物在給藥後約14天回到基線Aβ1-40含量。在用抗TfR2/BACE1抗體治療之動物中，Aβ1-40含量在給藥後21與30天之間回到基線含量。兩種抗TfR/BACE1抗體均使CSF Aβ1-40含量降低，而在給與抗gD動物中未觀察到改變。投與抗TfR1/BACE1抗體(50%基線之平均最大抑制作用)引起的CSF Aβ1-40含量降低比抗TfR2/BACE1抗體(20%基線之平均最大抑制作用)顯著。在抗TfR/BACE1治療之動物中sAPPβ產生受抑制，但在接受抗gD抗體之動物中則無。關於Aβ40之結果類似，抗TfR1/BACE1抗體對sAPPβ產生之抑制作用強於抗TfR2/BACE1抗體。在BACE1抑制期間，藉由抗TfR1/BACE1抗體及抗TfR2/BACE1抗體刺激sAPPα產生，且反應與關於sAPPβ及Aβ1-40所觀察到的抑制程度成反相關。sAPPα及sAPPβ為澱粉樣前驅蛋白(APP)之主要加工產物，且其含量高度相關。sAPPβ/sAPPα之比率將該等結果針對基礎APP表現之潛在改變或在整個研究中CSF之收集及處理之潛在分析前差異進行標準化。在抗TfR1/BACE1抗體存在下，CSF sAPPβ/sAPPα之比率呈現之PD效應比抗TfR2/BACE1抗體穩固。因 此，這些結果支持了由抗TfR/BACE1抗體引起之靶(亦即，BACE1)接合。
抗TfR52A/BACE1抗體及抗TfR53A/BACE1抗體之PD反應亦與抗體暴露之持續時間相關且TfR臂之親和力降低顯示Aβ40之減少增加(資料未示出)。該等資料亦支持了藉由該等雙特異性抗體進行之靶接合。
總體而言，該等結果表明，對人類TfR之親和力介於抗TfR1/BACE1抗體及抗TfR2/BACE1抗體之間的雙特異性抗TfR/BACE1抗體將可能具有所需之藥物動力學/藥效學平衡。
在本研究中未觀察到安全性信號。在給藥後長達60天投與30mg/kg任何雙特異性抗體對於猴的任何血液檢查或臨床化學檢驗參數無明顯影響。重要的是，如所預期的，網狀紅血球不受用抗TfR1/BACE1抗體或抗TfR2/BACE1抗體治療之影響(圖13)，因為該等抗體為效應功能削弱的且具有高TfR含量的正在循環之早期網狀紅血球之總含量在正常靈長類動物中極低(參看實例4)。
實例6：活體內雙特異性抗人類TfR/BACE1雙特異性抗體之評估
為了檢查抗體在CSF中之藥效學與在腦中之藥物動力學之間的關係，如在先前實例中一樣，給與食蟹獼猴(食蟹猴)雙特異性抗體抗TfR1/BACE1抗體或抗TfR2/BACE1抗體。該等雙特異性抗體呈具有D265A及N297G突變從而廢除效應功能之人類IgG1形式。使用基於人類IgG1之抗gD分子作為對照物。為比較，亦給與二價抗BACE1抗體，其為與用於該等雙特異性抗體相同之純系。藉由單次靜脈內(IV)快速注射至隱靜脈中將30mg/kg劑量之該等抗體投與留置小腦延髓池導管之有意識食蟹獼猴。在給藥前24及48小時收集基線CSF樣品，且在給藥後24小時收集另一CSF樣品(如圖14中示意性顯示)。在給藥後24小時收集CSF之後，向動物灌注生理食鹽水且採集腦以分析抗體濃度。將不同腦區在含有Complete Mini無EDTA蛋白酶抑制劑混合錠 (Roche Diagnostics)的含1% NP-40(Cal-Biochem)之PBS中均質化。均質化之腦樣品在4℃下旋轉1小時，之後以14,000rpm旋轉20分鐘。分離上清液以使用先前實例中所述之ELISA方法進行腦抗體量測。亦收集血液以確定周圍暴露及藥效學反應，此類似於在實例5中之觀察結果。
如在CSF中評估的抗TfR1/BACE1抗體及抗TfR2/BACE1抗體之藥效學作用亦類似於在先前實例中所觀察的作用。圖15證實，在給與抗TfR1/BACE1抗體之後，CSF sAPPβ/sAPPα之比率穩固地降低。在本研究中，抗TfR2/BACE1抗體在給藥後24小時未顯示明顯降低。抗BACE1抗體亦未顯示作用。抗體之腦濃度分析揭露，對照IgG及抗BACE1抗體在腦中之吸收有限，其含量剛好高於本分析之偵測值(平均為約670pM)。抗TfR2/BACE1抗體相對於對照IgG具有約3倍之腦吸收改善(平均為約2nM)，且抗TfR1/BACE1抗體具有最佳腦吸收，達到對照IgG之約15倍(平均為約10nM)。不同抗體之腦抗體濃度與在該等研究中於CSF中所見到的藥效學反應相關，其中抗TfR1/BACE1抗體具有最佳腦吸收及最穩固之藥效學作用，且抗TfR2/BACE1抗體具有較少腦吸收及更適度的作用。
該等結果將先前之發現擴展至證實，TfR結合性雙特異性抗體使非人類靈長類動物之腦中的吸收改善。在靈長類動物中，如在小鼠中，對於TfR可能存在最佳的親和力，其很好地平衡了腦吸收與TfR介導之清除率。在本實例中，較高親和力之抗TfR1/BACE1抗體展現良好腦吸收，且受周圍靶介導之清除率影響。較低親和力之TfR2/BACE1具有改善之清除率特性，但看來對於TfR具有低親和力以致無法有效地被TfR轉運(在很大程度上以與US2012/0171120中之最低親和力抗TfR抗體TfRE通過某一親和力臨限值相同的方式，超過該臨限值，該親和力過低而無法允許抗體與TfR之間之足夠相互作用，以 致在TfR開始轉位過程時，該抗體將保留與TfR之締合)。自本實驗之結果可知，預測對TfR之親和力在TfR1與TfR2之間的抗人類/食蟹獼猴TfR/BACE1雙特異性抗體在本系統中相對於抗TfR1/BACE1抗體或抗TfR2/BACE1抗體將具有改善之吸收及清除率特性。
實例7：在雙特異性轉鐵蛋白受體抗體之情形中產生另外的無效應子突變
測試Fc區中除N297G及D265A外亦廢除效應功能之其他突變減少或防止表現TfR之網狀紅血球之耗竭的能力。詳言之，將美國申請公開案第2012/0251531號(以引用之方式併入本文中)中所述之Fc突變L234A、L235A及P329G(「LALAPG」)併入抗TfRD/BACE1抗體中(描述於國際申請公開案第WO 2013/177062號中且以全文引用之方式併入本文中)。
在小鼠中單次抗體投藥之後，如下進行藥物動力學分析及網狀紅血球計數。對於所有研究使用6-8週齡之野生型雌性C57B/6小鼠。動物之護理係根據機構指南進行。對小鼠靜脈內給與單次50mg/kg劑量的具有LALAPG突變之抗gD抗體(鼠類IgG2a)及具有LALAPG突變之抗TfRD/BACE1抗體(大鼠/鼠類嵌合體)。總注射體積不超過250μL且必要時，在D-PBS(Invitrogen)中稀釋抗體。24小時之後，收集全血，之後灌注於EDTA microtainer管(BD Diagnostics)中，使其在室溫下靜置30分鐘，並以5000x g短暫離心10分鐘。將血漿頂層轉移至新管中進行抗體量測。
使用抗小鼠IgG2a(異型a)/抗小鼠IgG2a(異型a)ELISA量測小鼠血漿中之總抗體濃度。在4℃下，用小鼠抗小鼠IgG2a異型A(一種異型A特異性抗體；BD/Pharmigen San Jose,CA)塗佈NUNC 384孔Maxisorp免疫板(Neptune,NJ)隔夜。在25℃下，用PBS、0.5% BSA阻斷板，保持1小時。每一抗體(抗gD抗體及抗TfR/BACE1雙特異性變異 體)用作標準品以定量各別抗體之濃度。使用微量板洗滌器(Bio-Tek Instruments,Inc.,Winooski,VT)，用PBS、0.05% Tween-20洗滌板，且在含有0.5% BSA、0.35M NaCl、0.25% CHAPS、5mM EDTA、0.2% BgG、0.05% Tween-20之PBS中稀釋標準品及樣品，並在25℃下添加15ppm Proclin®(Sigma-Aldrich)，保持兩小時。用生物素結合之小鼠抗小鼠IgG2a異型A(一種異型A特異性抗體；BD/Pharmigen San Jose,CA)偵測經結合抗體。用辣根過氧化酶結合之抗生蛋白鏈菌素(GE Helathcare Life Sciences,Pittsburgh,PA)偵測經結合的生物素結合之抗體。使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)(KPL,Inc.,Gaithersburg,MD)使樣品顯影，且在Multiskan Ascent讀取器(Thermo Scientific,Hudson,NH)上在450nm下量測吸光度。使用四參數非線性回歸程式由標準曲線確定濃度。該分析在血漿中之下限定量(LLOQ)值為78.13ng/ml。使用雙尾非配對t測試對實驗組之間的差異進行統計分析。
在投與含Fc LALAPG突變之抗TfRD/BACE1抗體之後，小鼠未呈現如先前使用具有完整效應功能之抗體所觀察到的臨床症狀。參看Couch等人，Sci.Trans.Med.5：183ra57(2013)。圖20顯示了藥物動力學分析之結果。
另外，根據製造商之說明書，使用Sysmex XT2000iV(Sysmex,Kobe,Japan)測定不成熟網狀紅血球及總網狀紅血球計數。給藥後24小時，用所測試之任何抗體未觀察到在不成熟網狀紅血球比例或總網狀紅血球計數方面之差異，如圖21中所見。該等結果表明，LALAPG突變不僅廢除了抗體效應功能，而且亦使即使用無效應子抗體構架亦能見到之補體結合及補體介導之網狀紅血球清除減少(Couch等人，2013)。此與在人類IgG1上併入LALA突變可限制補體結合之另一報導一致(Hessell等人，Nature 449：101-104(2007))。
實例8-FcRn HIGH 雙特異性變異體之產生
為了增加該等雙特異性抗體之半衰期且藉此潛在地增加該抗體在腦中之濃度，製備在IgG恆定結構域中且詳言之在新生兒Fc受體(FcRn)結合結構域中含有突變(FcRnHIGH突變)之雙特異性變異體。FcRn結合結構域涉及到母體-胎兒之抗體轉移。參看Story等人，J.Exp.Med.,180：2377 2381,1994。在FcRn結合結構域中之胺基酸突變使該恆定結構域對FcRn之親和力增加，藉此使該抗體之半衰期增加。
已描述FcRn結合結構域突變M252Y、S254T及T256E(YTE)可增加FcRn結合且由此增加抗體之半衰期。參看美國公開之專利申請案第2003/0190311號及Dall'Acqua等人，J.Biol.Chem.281：23514-23524(2006)。另外，已描述FcRn結合結構域突變N434A及Y436I(AI)亦可增加FcRn結合。參看Yeung等人，J.Immunol.182：7663-7671(2009)。將YTE(M252Y/S254T/T256E)及AI(N434/Y436I)併入含有WT人類IgG1或無效應子LALAPG或N297G突變之抗TfR52A/BACE1及抗TfR2/BACE1雙特異性抗體中。此外，在抗gD hIgG1抗體進行FcRnHIGH突變作為對照物。使用Kunkel突變誘發來構建突變，在CHO細胞中短暫表現抗體，且使用蛋白質A層析法隨後尺寸排阻層析法(SEC)純化蛋白質。
使用BIAcore量測FcRnHIGH變異體抗體與FcRn之結合。在CHO中表現人類及食蟹獼猴FcRn蛋白質且使用IgG親和層析法純化。資料係在BIAcore T200儀器上獲取。根據供應商之說明書，使用EDC及NHS試劑活化S系列感測器晶片CM5(GE Healthcare,Cat.BR100530)，且偶合抗Fab抗體(人類Fab捕獲套組，GE Health care Bio-science.AB SE-75184，upsala，Sweden)以達到約10,000個反應單元(RU)，隨後用1M乙醇胺阻斷未反應之基團。對於親和力量測，首先以10μl/min流動速率注射抗體以在除FC1(參照流量槽)外之3個不同流量槽(FC)上捕獲約1000RU，且接著在相同循環中自低(1nM)至高(25μM)依次注射 (流動速率：30μl/min)人類FcRn(或食蟹獼猴FcRn)於pH6緩衝液(0.1M磷酸鈉)中之2倍連續稀釋液。記錄下感測器圖譜且進行參照值及緩衝液值減除，之後藉由使用BIAcore T200評價軟體(2.0版)進行評價。藉由基於1：1結合模型在穩態下分析結合程度來測定親和力。抗TfR52A/BACE1抗體之LALAPG、N297G、LALAPG.YTE及LALAPG.AI變異體的結合親和力顯示於下表11中。資料顯示，FcRnHIGH變異體在細胞內體(pH 6)處與人類及食蟹獼猴FcRn兩者之親和力增強。
選擇FcRnHIGH變異體在食蟹獼猴中進行測試以確定FcRn親和力增強是否能改善藥物動力學特性及/或增加抗TfR/BACE1抗體之腦暴露。
為了評價無效應子及FcRnHIGH突變之安全性，將某些雙特異性抗 體投與表現轉鐵蛋白受體的人類轉鐵蛋白受體基因嵌入之小鼠。huTfR基因嵌入小鼠係如下產生。使用重組(Warming等人，Molecular and Cellular Biology第26卷(18)第6913-222006頁；Liu等人，Genome Research(2003)第13卷(3)第476-84頁)及標準分子選殖技術之組合來製備用於靶向ES細胞中之C57BL/6 Tfrc基因座之人類TFRC cDNA的構建。
簡言之，使用側接小鼠Tfrc基因之短同源物的卡匣(人類TFRC cDNA、SV40 pA及frt-PGK-em7-Neo-BGHpA-frt)，藉由重組來修飾Tfrc C57BL/6J BAC(RP23 BAC文庫)。在內源ATG處插入人類TFRC cDNA卡匣且缺失Tfrc外顯子2之其餘部分及內含子2之開始部分。接著，將BAC中之靶向區連同側接的作為同源臂之基因組Tfrc序列放回pBlight-TK(Warming等人，Molecular and Cellular Biology第26卷(18)第6913-22 2006頁)中用於ES細胞靶向。詳言之，2950 bp之5'同源臂對應於(組裝物NCBI37/mm9)：chr.16：32,610,333-32,613,282且2599 bp之3'同源臂對應於chr.16：32,613,320-32,615,918。最終載體係藉由DNA測序確定。
用NotI使Tfrc/TFRC KI載體線性化且使用標準方法(G418陽性且更昔洛韋(gancyclovir)陰性選擇)靶向C57BL/6N C2 ES細胞。使用PCR及taqman分析陽性純系，且藉由經修飾基因座之測序來確定。用Flpe質體轉染正確靶向之ES細胞以移除Neo且接著使用標準技術將ES細胞注射至胚細胞中。在使所得嵌合體與C57BL/6N雌性小鼠雜交之後，獲得生殖系傳遞。
詳言之，向huTfR基因嵌入小鼠投與單次50mg/kg劑量的下表中所列之抗體且24小時之後，抽取血液及網狀紅血球。huIg1，N297G
在投與抗TfR52A/BACE1 LALAPG、LALAPG/YTE或LALAPG/AI抗體(表11中之第3-5組)之後，人類TfR基因嵌入小鼠未呈現如先前使用具有完整效應功能之抗TfR抗體(Couch等人，2013)所觀察到的臨床症狀或網狀紅血球損失(圖22)。該等結果表明，在人類IgG1構架上併入LALAPG突變亦廢除效應功能，且進一步表明，添加YTE或AI FcRnHIGH突變不會干擾LALAPG突變使抗體無效應子之所需特性。
亦進行ADCC分析以確定在人類來源之細胞株中LALAPG、LALAPG/YTE及LALAPG/AI突變之無效應子狀態。如先前所述，使用人類紅白血病細胞株(HEL，ATCC)及來自帶有F/V158基因型或FcγRIIIA V/V158基因型之健康人類供體之PBMC作為靶細胞。由於已知與增加之NK細胞介導的ADCC活性相關聯且能夠結合IgG4抗體(Bowles及Weiner,2005；Bruhns等人，2008)，故在該分析中亦包括V/V158基因型。遵循製造商之說明書，藉由Vi-CELL®(Beckman Coulter；Fullerton,CA)對細胞進行計數且測定活力。
藉由密度梯度離心，使用Uni-SepTM血液分離管(Accurate Chemical & Scientific Corp.；Westbury,NY)來分離PBMC。在50μL分析培養基(含1% BSA及100個單位/毫升青黴素及鏈黴素之RPMI-1640)中將靶細胞以4×104個/孔接種於96孔圓底板中。向含有靶細胞之板中添加測試抗體及對照抗體之連續稀釋液(50微升/孔)，隨後在37℃及5% CO2下培育30分鐘以允許助噬素作用。在5倍連續稀釋得到總計10個資料點之後，抗體之最終濃度在0.0051至10,000ng/mL範圍內。培 育之後，向每一孔中添加含1.0×106個PBMC效應細胞之100μL分析培養基以得到25：1之效應細胞：靶細胞比率，且該等板再培育4小時。在培育結束時，對該等板離心且使用Cytotoxicity Detection KitTM(Roche Applied Scinece；Indianapolis,IN)測試上清液中之乳酸脫氫酶(LDH)活性。向上清液中添加LDH反應混合物且在室溫下，在恆定振盪下培育該等板15分鐘。以1M H3PO4終止該反應，且使用SpectraMax Plus微板讀取器在490nm下量測吸光度(對於每一孔減去在650nm下量測之背景值)。僅含靶細胞之孔的吸光度用作背景對照物(低對照)，而含有用Triton-X100溶解之靶細胞之孔提供最大可得信號(高對照)。在含有靶細胞及效應細胞而未添加抗體之孔中量測不依賴於抗體之細胞之細胞毒性(AICC)。特定ADCC之程度計算如下：
將樣品稀釋液之ADCC值針對抗體濃度作圖，且使用SoftMax Pro將劑量-反應曲線與四參數模型相擬合。
ADCC分析之結果顯示於圖23中。如所預期的，效應子陽性抗人類TfR抗體(抗TfR1/gD IgG1 WT抗體)在HEL細胞上引起顯著ADCC活性。相比之下，含LALAPG、LALAPG/YTE或LALAPG/AI突變之抗TfR52A/BACE1抗體在HEL細胞中不呈現任何ADCC活性，與陰性對照物抗TfR52A/gD N297G抗體類似。
雖然上文已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例略為詳細地描述本發明，但不應將該等描述及實例解釋為限制本發明之範疇。本文引用之所有專利及科學文獻的揭示內容以全文引用的方式清楚地併入本文中。
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Claims (74)

  1. 一種結合於人類轉鐵蛋白受體(TfR)及靈長類動物TfR之經分離抗體，其中該抗體不會抑制轉鐵蛋白與TfR之結合。
  2. 一種結合於人類TfR及靈長類動物TfR之經分離抗體，其中該抗體不會抑制轉鐵蛋白與TfR之該結合，且其中該抗體之一或多種特性已經過修飾，以便為接受該抗體治療之個體或哺乳動物降低或消除該抗體對網狀紅血球之影響及/或減小急性臨床症狀之嚴重程度或存在。
  3. 如請求項1或2之抗體，其為單株抗體。
  4. 如請求項1或2之抗體，其為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
  5. 如請求項1或2之抗體，其為結合入類TfR及靈長類動物TfR之抗體片段。
  6. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含HVR-L3、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含以下胺基酸序列：SEQ ID NO：31、33及34；SEQ ID NO：36、38及39；SEQ ID NO：36、40及34；SEQ ID NO：42、43及44；SEQ ID NO：31、33及34；SEQ ID NO：46、48及49；SEQ ID NO：52、54及55；SEQ ID NO：52、58及59；SEQ ID NO：62、63及55；SEQ ID NO：52、65及55；SEQ ID NO：68、69及70；SEQ ID NO：73、75及76；SEQ ID NO：79、81及82；SEQ ID NO：79、83及84；SEQ ID NO：87、89及90；SEQ ID NO：93、95及96；SEQ ID NO：99、101及102；SEQ ID NO：127、33及34；QHFWGTPLT、EIAPTNGRTNYIEKFKS及GTRAYHY；或QHFWGTPLT及EINPANGRTNYIEKFKS及GTRAYHY。
  7. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其分別包含以下胺基酸序列：SEQ ID NO：32、33及34；SEQ ID NO：37、38及39；SEQ ID NO：32、40及34；SEQ ID NO：37、43及44；SEQ ID NO：32、33及34；SEQ ID NO：47、48及49；SEQ ID NO：53、54及55；SEQ ID NO：53、58及59；SEQ ID NO：53、63及55；SEQ ID NO：53、65及55；SEQ ID NO：53、69及70；SEQ ID NO：74、75及76；SEQ ID NO：80、81及82；SEQ ID NO：80、83及84；SEQ ID NO：88、89及90；SEQ ID NO：94、95及96；SEQ ID NO：100、101及102；SYWMH、EIAPTNGRTNYIEKFKS及GTRAYHY；或SYWMH、EINPANGRTNYIEKFKS及GTRAYHY。
  8. 如請求項7之抗體，該抗體進一步包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含以下胺基酸序列：SEQ ID NO：29、30及31；SEQ ID NO：35、30及36；SEQ ID NO：41、30及42；SEQ ID NO：29、30及31；SEQ ID NO：45、30及46；SEQ ID NO：50、51及52；SEQ ID NO：56、57及52；SEQ ID NO：60、61及62；SEQ ID NO：60、64及52；SEQ ID NO：66、67及68；SEQ ID NO：71、72及73；SEQ ID NO：77、78及79；SEQ ID NO：85、86及87；SEQ ID NO：91、92及93；SEQ ID NO：97、98及99；或SEQ ID NO：29、30及127。
  9. 如請求項1之抗體，該抗體包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其分別包含以下胺基酸序列：SEQ ID NO：29、30及31；SEQ ID NO：35、30及36；SEQ ID NO：41、30及42；SEQ ID NO：29、30及31；SEQ ID NO：45、30及46；SEQ ID NO：50、51及52；SEQ ID NO：56、57及52；SEQ ID NO：60、61及62；SEQ ID NO：60、64及52；SEQ ID NO：66、67及68；SEQ ID NO：71、72及 73；SEQ ID NO：77、78及79；SEQ ID NO：85、86及87；SEQ ID NO：91、92及93；SEQ ID NO：97、98及99；或SEQ ID NO：29、30及127。
  10. 如請求項1或2之抗體，其包含至少一個選自由以下組成之序列之群的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2或HVR-L3序列：a. SEQ ID NO：47、53、100之HVR-H1序列；或b. SEQ ID NO：48、69、101、EIAPTNGRTNYIEKFKS或EINPANGRTNYIEKFKS之HVR-H2序列；c. SEQ ID NO：49、76或102之HVR-H3序列；d. SEQ ID NO：45、66或97之HVR-L1序列；e. SEQ ID NO：30、67或98之HVR-L2序列；及f. SEQ ID NO：46、68或102之HVR-L3序列。
  11. 如請求項1或2之抗體，其包含(a)與SEQ ID NO：7、8、9、10、15、16、17、18、20、25、26、27、28、108、114、120或126之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的VH序列；(b)與SEQ ID NO：4、5、6、11、12、13、14、19、21、22、23、24、105、111、117或123、EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIAPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS；或EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPANGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
  12. 如請求項11之抗體，其包含以下VH序列a. SEQ ID NO：108；b. SEQ ID NO：114；c. SEQ ID NO：120；d. SEQ ID NO：126；e. EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIAPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS；或f. EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPANGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS。
  13. 如請求項11之抗體，其包含以下VL序列a. SEQ ID NO：105；b. SEQ ID NO：111；c. SEQ ID NO：117；d. SEQ ID NO：123。
  14. 一種抗體，其包含：a. SEQ ID NO：108之VH序列及SEQ ID NO：105之VL序列；b. SEQ ID NO：114之VH序列及SEQ ID NO：111之VL序列；c. SEQ ID NO：120之VH序列及SEQ ID NO：117之VL序列；d. SEQ ID NO：126之VH序列及SEQ ID NO：123之VL序列；e. EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIAPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS之VH序列及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQ HFWGTPLTFGQGTKVEIK之VL序列；或f. EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPANGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS之VH序列及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTFGQGTKVEIK之VL序列。
  15. 如請求項1或2之抗體，該抗體係選自由以下組成之群：抗體7A4、8A2、15D2、10D11、7B10、15G11、16G5、13C3、16G4、16F6、7G7、4C2、1B12及13D4。
  16. 如請求項15之抗體，其中該抗體進一步為親和力已成熟。
  17. 如請求項16之抗體，其中該抗體係選自由以下組成之群：15G11.v1、15G11.v2、15G11.v3、15G11.v4、15G11.v5、7A4.v1；7A4.v2、7A4.v3、7A4.v4、7A4.v5、7A4.v6、7A4.v7、7A4.v8、7A4.v9、7A4.v10、7A4.v11、7A4.v12、7A4.v13、7A4.v14、7A4.v15、7G7.v1、16F6.v1、16F6.v2、16F6.v3、16F6.v4、15G11.N52A及15G11.T53A。
  18. 如請求項17之抗體，其中該抗體在該VH或VL之一或多個胺基酸位置處經修飾成表6中關於該位置所指示之胺基酸。
  19. 如請求項1或2之抗體，其包含對應於關於圖3、4、23及表6中任一純系所示彼等序列中一或多者的序列或一或多個HVR序列。
  20. 一種經分離抗體，其結合於TfR上與選自由以下組成之群之抗體相同的抗原決定基：抗體7A4、8A2、15D2、10D11、7B10、15G11、16G5、13C3、16G4、16F6、7G7、4C2、1B12、13D4、15G11.v1、15G11.v2、15G11.v3、15G11.v4、15G11.v5、7A4.v1；7A4.v2、7A4.v3、7A4.v4、7A4.v5、7A4.v6、7A4.v7、 7A4.v8、7A4.v9、7A4.v10、7A4.v11、7A4.v12、7A4.v13、7A4.v14、7A4.v15、7G7.v1、16F6.v1、16F6.v2、16F6.v3、16F6.v4及15G11.N52A以及15G11.T53A。
  21. 如請求項2之抗體，其中該一或多種特性係選自該抗體Fc區之效應功能、該抗體之補體活化功能、該抗體之半衰期及該抗體對TfR之親和力。
  22. 如請求項21之抗體，其中該一或多種特性係選自該抗體Fc區之效應功能及該抗體之補體活化功能，且其中該效應功能或補體活化功能已比同一同型之野生型抗體降低或消除。
  23. 如請求項22之抗體，其中該效應功能係藉由選自以下之方法降低或消除：減少該抗體之糖基化、將該抗體同型修飾成天然地具有降低或消除之效應功能的同型及修飾該Fc區。
  24. 如請求項23之方法，其中該抗體之糖基化係藉由選自以下之方法減少：在不允許野生型糖基化之環境中產生該抗體；移除已存在於該抗體上之碳水化合物基團；及對該抗體進行修飾以使野生型糖基化不會發生。
  25. 如請求項24之抗體，其中該抗體係在非哺乳動物細胞產生系統中產生，或其中該抗體係合成產生。
  26. 如請求項24之抗體，其中該抗體之Fc區在297-位置包含突變以致在該位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一種會干擾該位置處之糖基化的胺基酸置換。
  27. 如請求項23之抗體，其中該效應功能係藉由該Fc區之至少一種修飾來降低或消除。
  28. 如請求項27之抗體，其中該效應功能或補體活化功能係藉由缺失該Fc區之全部或一部分，或藉由對該抗體進行工程改造以使其不包括勝任效應功能或補體活化功能之Fc區或非Fc區來降低 或消除。
  29. 如請求項27之抗體，其中該修飾係選自：該Fc區中削弱與一或多種Fc受體之結合的點突變，該點突變選自以下位置：234、235、238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439；該Fc區中削弱與C1q之結合的點突變，該點突變選自以下位置：270、322、329及321；消除該Fc區之一部分或全部；及在該CH1結構域之132-位置處的點突變。
  30. 如請求項29之抗體，其中該修飾為該Fc區中削弱與一或多種Fc受體之結合之至少一種選自234、235、265、297及329的點突變。
  31. 如請求項30之抗體，其中該修飾係在265-位置及297-位置。
  32. 如請求項30之抗體，其中該修飾係在234-位置、235-位置及329-位置。
  33. 如請求項31之抗體，其中該修飾為D265A及N297A或D265A及N297G。
  34. 如請求項31之抗體，其中該修飾為L234A、L235A及P329G。
  35. 如請求項21或22之抗體，其中該一或多種特性為該抗體之半衰期。
  36. 如請求項35之抗體，其中藉由在該抗體之FcRn結合結構域中選自：252、254、256、434及436之位置處之修飾來延長該半衰期。
  37. 如請求項36之抗體，其中該修飾係在252-位置、254-位置及256-位置。
  38. 如請求項36之抗體，其中該修飾係在434-位置及436-位置。
  39. 如請求項37之抗體，其中該修飾為M252Y、S254T及T256E。
  40. 如請求項38之抗體，其中該修飾為N434A及Y436I。
  41. 如請求項2之抗體，其中該抗體係與另一種可降低或有助於減少對網狀紅血球含量之影響或急性臨床症狀的化合物組合。
  42. 如請求項41之抗體，其中該另一種化合物可保護網狀紅血球免於發生抗體相關之耗竭，或支持網狀紅血球之生長、發育或重建。
  43. 如請求項42之抗體，其中該另一種化合物係選自紅血球生成素(EPO)、鐵補充劑、維生素C、葉酸及維生素B12，或為紅血球或網狀紅血球。
  44. 如請求項21之抗體，其中如相對於對TfR不具有降低之親和力的同一同型之野生型抗體所量測，該抗體對TfR之親和力降低。
  45. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體對於TfR具有約1pM至約100μM之KD或IC50。
  46. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體偶合至治療化合物。
  47. 如請求項46之抗體，其中該抗體為多特異性抗體且該治療化合物視情況形成該多特異性抗體之一部分。
  48. 如請求項47之抗體，其中該多特異性抗體包含結合TfR之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。
  49. 如請求項48之抗體，其中該腦抗原係選自由以下組成之群：β分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、τ蛋白、脂蛋白元E(ApoE)、α-突觸核蛋白、CD20、亨廷頓蛋白(huntingtin)、普里昂蛋白質(PrP)、富含白胺酸之重複激酶2(LRRK2)、泊蛋白(parkin)、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、澱粉樣前驅蛋白(APP)、p75 神經營養因子受體(p75NTR)及卡斯蛋白酶6。
  50. 如請求項49之抗體，其中該多特異性抗體結合TfR及BACE1兩者。
  51. 如請求項49之抗體，其中該多特異性抗體結合TfR及Aβ兩者。
  52. 如請求項46之抗體，其中該治療化合物為神經病症藥物。
  53. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至52中任一項之抗體。
  54. 一種宿主細胞，其包含如請求項53之核酸。
  55. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項54之宿主細胞，由此產生該抗體，且視情況進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。
  56. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至55中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  57. 如請求項1至52中任一項之抗體，其係用作藥物。
  58. 如請求項1之抗體，其係用於治療神經病症。
  59. 如請求項58之抗體，其中該神經病症係選自由以下組成之群：神經病變、神經退化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙及CNS炎症。
  60. 如請求項1至52中任一項之抗體，其係用於跨BBB轉運一或多種化合物。
  61. 一種如請求項1之抗體的用途，其係用於製造供治療神經病症之藥物。
  62. 如請求項61之用途，其中該神經病症係選自由以下組成之群：神經病變、神經退化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙及CNS炎症。
  63. 一種如請求項1之抗體的用途，其係用於製造用以轉運一或多種化合物跨越BBB之藥物。
  64. 一種在個體中轉運化合物跨越BBB的方法，其包含使如請求項46之抗體暴露於該BBB，由此該抗體即可轉運該與其偶合之化合物跨越BBB。
  65. 一種增加個體之CNS暴露於化合物之方法，其包含使如請求項46之抗體暴露於該BBB，由此該抗體即可轉運該與其偶合之化合物跨越BBB。
  66. 一種使投與個體之化合物延長滯留在該CNS中之方法，其包含使如請求項46之抗體暴露於該BBB，由此使該化合物延長滯留在該CNS中。
  67. 一種治療哺乳動物中之神經病症的方法，其包含用如請求項46之抗體治療該哺乳動物。
  68. 如請求項67之方法，其中該神經病症係選自由以下組成之群：神經病變、神經退化性疾病、癌症、眼部疾病或病症、癲癇發作病症、溶酶體貯積症、澱粉樣變性、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為障礙及CNS炎症。
  69. 如請求項64至68中任一項之方法，其中該BBB或神經病症係在人類個體中。
  70. 如請求項69之方法，其中投藥劑量及/或頻率經過調節，以降低暴露於紅血球之抗體濃度。
  71. 如請求項69之方法，其進一步包含監測該個體中紅血球之耗竭的步驟。
  72. 如請求項69之方法，其中偶合至該化合物之該抗體係依治療劑量投與。
  73. 如請求項72之方法，其中該治療劑量為經TfR飽和。
  74. 如請求項69之方法，其中該抗體之投藥劑量及/或劑量頻率係經過校準，以使該投與抗體之急性臨床症狀減到最少。
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