KR20240035825A - 디스트로핀병증을 치료하기 위한 근육 표적화 복합체 및 제제 - Google Patents

디스트로핀병증을 치료하기 위한 근육 표적화 복합체 및 제제 Download PDF

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KR20240035825A
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존 나짐
스콧 힐더브랜드
코디 에이. 데자르댕
모하메드 티. 콰타나니
션 스프링
로메쉬 알. 서브라마니안
페이이 선
티모시 위든
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Abstract

본 개시내용의 측면은 항체 (예를 들어, 항-TfR1 항체)에 공유 연결된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (예를 들어, DMD를 표적화하는 데 유용함)를 포함하는 복합체 (예를 들어, 여기서 각각의 복합체는 하기 제시된 예시적인 화학식을 가짐)에 관한 것이고, 다른 측면은 이러한 복합체를 포함하는 제제 (예를 들어, 수성, 동결건조된 형태)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 복합체는 명시된 pH (예를 들어, 약 5.0 내지 7.0)에서 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘) 및 수크로스와 함께 제제화된다. 뒤시엔느 근육 이영양증과 연관된 돌연변이된 DMD 대립유전자를 갖는 대상체를 치료하기 위한 이들 제제의 용도가 또한 제공된다. (화학식 I)
Figure pct00051

Description

디스트로핀병증을 치료하기 위한 근육 표적화 복합체 및 제제
관련 출원
본 출원은 2021년 7월 9일에 출원된 "디스트로핀병증을 치료하기 위한 근육 표적화 복합체 및 제제"라는 발명의 명칭의 미국 가출원 번호 63/220,426의 35 U.S.C § 119(e) 하의 출원일의 이익을 주장하며, 상기 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 세포에 올리고뉴클레오티드 분자 페이로드를 전달하기 위한 표적화 복합체, 이러한 복합체를 포함하는 제제 및 그의 용도, 특히 질환의 치료와 관련된 용도에 관한 것이다.
전자 서열 목록에 대한 참조
전자 서열 목록의 내용 (D082470061WO00-SEQ-CBD.xml; 크기: 55,409 바이트; 및 생성일: 2022년 7월 6일)은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
디스트로핀병증은 DMD 유전자 내의 돌연변이로부터 유발되는 특유한 신경근육 질환의 군이다. 디스트로핀병증은 뒤시엔느 근육 이영양증, 베커 근육 이영양증 및 X-연관 확장성 심근병증을 포함한다. 디스트로핀을 코딩하는 DMD는 79개의 엑손 및 약 2백6십만개의 총 염기 쌍을 함유하는 대형 유전자이다. 엑손 프레임시프트, 결실, 치환 및 중복 돌연변이를 포함한 DMD 내의 수많은 돌연변이는 기능적 디스트로핀의 발현을 감소시켜 디스트로핀병증을 유도할 수 있다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 복합체 및 이러한 복합체를 포함하는 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체는 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘) 및 수크로스와 함께 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체는 수성 또는 동결건조된 (예를 들어, 동결건조된 분말) 형태로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체는 동결된 형태로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체는 항체에 공유 연결된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체는 항-트랜스페린 수용체 1 (TfR1) 항체에 공유 연결된 PMO를 포함하는 근육-표적화 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-TfR1 항체는 번역후 변형으로부터 유발된 피로글루타메이트 형성을 겪었다. 일부 실시양태에서, 복합체는, 예를 들어 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 항-트랜스페린 수용체 1 (TfR1) 항체에 공유 연결된 PMO를 포함하는 근육-표적화 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PMO는 DMD 대립유전자 (예를 들어, 돌연변이된 DMD 대립유전자)를 표적화한다. 뒤시엔느 근육 이영양증과 연관된 돌연변이된 DMD 대립유전자 (예를 들어, 여기서 돌연변이된 DMD 대립유전자는 엑손 스킵핑이 적용가능한 돌연변이를 포함함)를 갖는 대상체를 치료하기 위해 본원에 기재된 복합체 및 제제를 사용하는 방법 및/또는 세포 (예를 들어, 근육 세포)에서 디스트로핀 단백질 (예를 들어, 말단절단된 디스트로핀 단백질)의 발현 또는 활성을 촉진하는 방법이 또한 제공된다.
본 개시내용의 일부 측면은 항-트랜스페린 수용체 1 (TfR1) 항체에 공유 연결된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하는 복합체를 포함하는 제제로서, 여기서 항체는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하고, 여기서 복합체는 히스티딘 및 수크로스와 함께 제제화된 것인 제제를 제공한다.
본 개시내용의 일부 측면은 화학식: [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체를 포함하는 제제로서, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 화학식 (Ia)의 기를 포함하고:
Figure pct00001
여기서
R2는 항체를 포함하고,
R3은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하고;
여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고;
여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고,
여기서 각각의 경우의 R1은 항체의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고;
여기서 복합체는 히스티딘 및 수크로스와 함께 제제화된 것인 제제를 제공한다.
일부 실시양태에서, 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다.
일부 실시양태에서, 항체는 항-TfR1 항체이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5의 범위이다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제제는 동결건조된 형태, 수용액 또는 동결된 고체 형태이다.
일부 실시양태에서, 제제는 수용액이고, 히스티딘은 수용액 중에 10 mM 내지 50 mM 범위의 농도로 존재한다.
일부 실시양태에서, 제제는 수용액이고, 수크로스는 수용액 중에 부피당 5 중량% 내지 15 중량% (w/v%) 범위의 농도로 존재한다.
일부 실시양태에서, 제제는 수용액이고, 수용액은 5.0 내지 7.0 범위의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 제제는 수용액이고, 히스티딘은 수용액 중에 25 mM의 농도로 존재하고/거나, 수크로스는 수용액 중에 10 w/v%의 농도로 존재하고/거나, 수용액은 pH 6.0이다.
일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv이다.
일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편이다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나; 항체는 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나; 항체는 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, PMO는 15-35개의 뉴클레오티드 길이인 핵염기 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, PMO는 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24 또는 서열식별번호: 22에 대해 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드 길이의 상보성 영역을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, PMO는 서열식별번호: 21에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, PMO는 서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 R1은 화학식 (Ib)의 기를 포함한다:
Figure pct00002
여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고, 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 핵염기 서열을 갖고, 여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, 각각의 R1은 화학식 (Ic)의 기를 포함한다:
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 복합체는 제제 중에 10 mg/mL 내지 50 mg/mL 범위의 농도로 존재한다.
대상체에서 디스트로핀 단백질의 발현 또는 활성을 촉진하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 제제를 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.
일부 실시양태에서, 디스트로핀 단백질은 말단절단된 디스트로핀 단백질이다.
추가로, 뒤시엔느 근육 이영양증과 연관된 돌연변이된 DMD 대립유전자를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 본원에 기재된 제제를 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 돌연변이된 DMD 대립유전자는 엑손 51 스킵핑이 적용가능한 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 돌연변이된 DMD 대립유전자는 엑손 51 내의 프레임시프트 돌연변이를 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체로서, 여기서
각각의 R1은 화학식 (Ia)의 기를 포함하고:
Figure pct00004
여기서 R3은 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하고;
여기서 R2는 Fab를 포함하고, 여기서 Fab는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고,
여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결된 것인 복합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, Fab는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, Fab는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다.
본 개시내용의 다른 측면은 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체로서, 여기서
각각의 R1은 화학식 (Ib)의 기를 포함하고:
Figure pct00005
여기서 R2는 Fab를 포함하고, 여기서 Fab는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고,
여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고, 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, 올리고뉴클레오티드 PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 핵염기 서열을 갖고;
여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결된 것인 복합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, Fab는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, Fab는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다.
본 개시내용의 다른 측면은 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체로서, 여기서
각각의 R1은 화학식 (Ic)의 기를 포함하고:
Figure pct00006
여기서 R2는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 Fab를 포함하고;
여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결된 것인 복합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다.
본 개시내용의 다른 측면은 화학식 (Id)의 구조를 포함하는 복합체로서,
Figure pct00007
여기서 R2는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 Fab를 포함하고;
여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고; 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함하고;
여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결된 것인 복합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다.
도 1은 뒤시엔느 근육 이영양증 환자 근관에서, 표 2에 제시된 VH/VL 서열을 갖는 항-TfR1 Fab를 포함하는 접합체 (여기서 Fab는 발린-시트룰린 서열을 포함하는 링커를 통해 DMD 엑손-스킵핑 올리고뉴클레오티드에 (리신 접합을 통해) 공유 연결됨)를 포함하는 조성물이 매칭되는 등몰 용량의 올리고뉴클레오티드에서 네이키드 DMD 엑손 스킵핑 올리고와 비교하여 증진된 엑손 스킵핑을 유발하였다는 것을 예시하는 데이터를 보여준다.
도 2는 시간 경과에 따른 접합체의 농도에 관하여, 제제 1 (25 mM 히스티딘, 10% 수크로스, 25 mg/mL 접합체, pH 6)의 DMD 엑손 51-스킵핑 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)에 발린-시트룰린 서열을 포함하는 링커를 통해 (리신 접합을 통해) 공유 연결된 표 2에 제시된 VH/VL 서열을 갖는 항-TfR1 Fab를 포함하는 접합체 ("접합체 1"로 지칭됨)를 포함하는 조성물의 안정성을 보여준다.
도 3은 DMD 엑손 51-스킵핑 ASO에 발린-시트룰린 서열을 포함하는 링커를 통해 (리신 접합을 통해) 공유 연결된 표 2에 제시된 VH/VL 서열을 갖는 항-TfR1 Fab ("접합체 1")를 포함하는 제제 1의 BCA 검정 결과를 보여준다. 항-TfR1 Fab-ASO 접합체 1이 25 mg/mL 농도로 존재하였을 때, 접합체의 샘플을 목적하는 용기 (유리, EVA, PC, HDPE)에 첨가하고, -80℃에서 밤새 동결시킨 다음, 2-8℃에서 4시간 동안 해동시켰다. 표준 곡선을 R2 값 0.9998로 생성하였다. 샘플의 농도를 이 곡선에 기초하여 계산하였다.
도 4는 DMD 엑손 51-스킵핑 ASO에 발린-시트룰린 서열을 포함하는 링커를 통해 (리신 접합을 통해) 공유 연결된 표 2에 제시된 VH/VL 서열을 갖는 항-TfR1 Fab ("항-TfR1 Fab-ASO 접합체")를 포함하는 제제 1의 SEC-HPLC 결과를 보여준다. 모든 샘플 제제에 걸쳐 피크의 조성에서 실질적 변화는 없었다. HMWS 1은 고분자량 표준물 1을 지칭하고, LMWS 1은 저분자량 표준물 1을 지칭한다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 복합체 및 이러한 복합체를 포함하는 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘) 및 수크로스와 함께 제제화된다. 일부 실시양태에서, 복합체는 수성 또는 동결건조된 (예를 들어, 동결건조된 분말) 형태로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 복합체는 항체에 공유 연결된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 항-트랜스페린 수용체 1 (TfR1) 항체에 공유 연결된 PMO를 포함하는 근육-표적화 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 표 2에 제시된 항-트랜스페린 수용체 1 (TfR1) 항체에 공유 연결된 PMO를 포함하는 근육-표적화 복합체를 포함한다. 뒤시엔느 근육 이영양증과 연관된 돌연변이된 DMD 대립유전자 (예를 들어, 여기서 돌연변이된 DMD 대립유전자는 엑손 스킵핑이 적용가능한 돌연변이를 포함함)를 갖는 대상체를 치료하기 위해 본원에 기재된 복합체 및 제제를 사용하는 방법 및/또는 세포에서 디스트로핀 단백질 (예를 들어, 말단절단된 디스트로핀 단백질)의 발현 또는 활성을 촉진하는 방법이 또한 제공된다.
정의된 용어의 설명을 포함한 본 개시내용의 추가 측면이 하기에 제공된다.
정의
투여: 본원에 사용된 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 생리학상 및/또는 (예를 들어, 및) 약리학상 유용한 (예를 들어, 대상체에서 상태를 치료하기 위한) 방식으로 대상체에게 복합체를 제공하는 것을 의미한다.
대략: 본원에 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 1개 이상의 관심 값에 적용되는 경우에 언급된 참조 값에 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않거나 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 방향으로 (초과 또는 미만) 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다 (이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함).
항체: 본원에 사용된 용어 "항체"는 적어도 1개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 또는 적어도 1개의 항원 결정기, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하는 파라토프를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 또는 scFv 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 낙타류 항체로부터 유래된 나노바디 또는 상어 항체로부터 유래된 나노바디이다. 일부 실시양태에서, 항체는 디아바디이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 배선 서열을 갖는 프레임워크를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 IgG, IgG1, IgG2, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM 및 IgE 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 (H) 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및/또는 (예를 들어, 및) 경쇄 (L) 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 불변 도메인, 예를 들어 Fc 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 지칭한다. 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열 및 그의 기능적 변이는 공지되어 있다. 중쇄와 관련하여, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄는 알파 (α), 델타 (Δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 뮤 (μ) 중쇄일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄는 인간 알파 (α), 델타 (Δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 뮤 (μ) 중쇄를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간 감마 1 CH1, CH2 및/또는 (예를 들어, 및) CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인의 아미노산 서열은 인간 감마 (γ) 중쇄 불변 영역, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적 예는 관련 기술분야에 기재되었으며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,693,780 및 상기 문헌 [Kabat E A et al., (1991)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인은 본원에 제공된 임의의 가변 쇄 불변 영역에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 변형되고, 예를 들어 글리코실화, 인산화, SUMO화 및/또는 (예를 들어, 및) 메틸화를 통해 변형된다. 일부 실시양태에서, 항체는 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자에 접합된 글리코실화 항체이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 N-글리코실화, O-글리코실화, C-글리코실화, GPI화 (GPI 앵커 부착) 및/또는 (예를 들어, 및) 포스포글리코실화를 통해 항체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드 또는 글리칸이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 분지형 올리고사카라이드 또는 분지형 글리칸이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 당 또는 탄수화물 분자는 만노스 단위, 글루코스 단위, N-아세틸글루코사민 단위, N-아세틸갈락토사민 단위, 갈락토스 단위, 푸코스 단위 또는 인지질 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 링커 폴리펩티드 또는 이뮤노글로불린 불변 도메인에 연결된 본 개시내용의 1개 이상의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 구축물이다. 링커 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 1개 이상의 항원 결합 부분을 연결하는 데 사용된다. 링커 폴리펩티드의 예가 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 추가로, 항체는 항체 또는 항체 부분과 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 보다 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용 (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오티닐화 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용 (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다.
CDR: 본원에 사용된 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 전형적인 항체 분자는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 이는 통상적으로 항원 결합에 수반된다. VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역" ("FR")으로 공지된 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, "상보성 결정 영역" ("CDR")으로도 또한 공지된 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 프레임워크 영역 및 CDR의 정도는 관련 기술분야에 공지된 방법론을 사용하여, 예를 들어 카바트 정의, IMGT 정의, 코티아 정의, AbM 정의 및/또는 (예를 들어, 및) 접촉 정의에 의해 정확하게 확인될 수 있으며, 이들 모두는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® http://www.imgt.org, Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999); Ruiz, M. et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); Lefranc, M.-P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); Lefranc, M.-P., Nucleic Acids Res., 31:307-310 (2003); Lefranc, M.-P. et al., In Silico Biol., 5, 0006 (2004) [Epub], 5:45-60 (2005); Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 33:D593-597 (2005); Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 37:D1006-1012 (2009); Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 43:D413-422 (2015); Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; 및 Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004)]을 참조한다. 또한, bioinf.org.uk/abs를 참조한다. 본원에 사용된 CDR은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 동일한 CDR을 갖는 2종의 항체는 2종의 항체가 동일한 방법, 예를 들어 IMGT 정의에 의해 결정 시 그 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 영역에 3개의 CDR이 존재하며, 이는 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. 본원에 사용된 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 발생하는 3개의 CDR의 군을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 카바트에 의해 기재된 시스템 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭될 수 있다. CDR의 하위-부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로 지정될 수 있으며, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지정한다. 이들 영역은 코티아 CDR로 지칭될 수 있으며, 이는 카바트 CDR과 중첩되는 경계를 갖는다. 카바트 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌 [Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) 및 MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996))]에 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 시스템 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있으나 그럼에도 불구하고 카바트 CDR과 중첩될 것이며, 다만 특정한 잔기 또는 잔기의 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있다. 본원에 사용된 방법은 임의의 이들 시스템에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. CDR 정의 시스템의 예가 표 1에 제공된다.
표 1. CDR 정의
Figure pct00008
1 IMGT®, 국제 이뮤노제네틱스 정보 시스템(international ImMunoGeneTics information system)®, imgt.org, [Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999)]
2 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]
3 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]
상보적: 본원에 사용된 용어 "상보적"은 2개의 뉴클레오티드 또는 2개 세트의 뉴클레오티드 사이의 정확한 쌍형성 능력을 지칭한다. 특히, 상보적은 2개의 뉴클레오티드 또는 2개 세트의 뉴클레오티드 사이의 결합을 가져오는 수소 결합 쌍형성의 정도를 특징화하는 용어이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 한 위치에서의 염기가 표적 핵산 (예를 들어, mRNA)의 상응하는 위치에서의 염기와 수소 결합할 수 있으면, 염기들이 그 위치에서 서로에 대해 상보적인 것으로 간주된다. 염기 쌍형성은 정규 왓슨-크릭 염기 쌍형성 및 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성 (예를 들어, 워블 염기 쌍형성 및 후그스틴 염기 쌍형성) 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상보적 염기 쌍형성의 경우, 아데노신-유형 염기 (A)는 티미딘-유형 염기 (T) 또는 우라실-유형 염기 (U)에 대해 상보적이고, 시토신-유형 염기 (C)는 구아노신-유형 염기 (G)에 대해 상보적이고, 범용 염기, 예컨대 3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌은 임의의 A, C, U 또는 T에 혼성화할 수 있고 그에 대해 상보적인 것으로 간주된다. 이노신 (I)은 또한 관련 기술분야에서 범용 염기인 것으로 간주되었고 임의의 A, C, U 또는 T에 대해 상보적인 것으로 간주된다.
공유 연결된: 본원에 사용된 용어 "공유 연결된"은 2개 이상의 분자가 적어도 1개의 공유 결합을 통해 함께 연결된 특징을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 2개의 분자는 분자들 사이의 링커로서의 역할을 하는 단일 결합, 예를 들어 디술피드 결합 또는 디술피드 가교에 의해 함께 공유 연결될 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 2개 이상의 분자는 다수의 공유 결합을 통해 2개 이상의 분자를 함께 연결하는 링커로서의 역할을 하는 분자를 통해 함께 공유 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 링커는 비-절단가능한 링커일 수 있다.
DMD: 본원에 사용된 용어 "DMD"는 근육 세포, 특히 근육 섬유에서 내부 세포골격 및 세포외 매트릭스를 가교하는, 디스트로핀-당단백질 복합체의 주요 성분인 디스트로핀 단백질을 코딩하는 유전자를 지칭한다. DMD 내의 결실, 중복 및 점 돌연변이는 디스트로핀병증, 예컨대 뒤시엔느 근육 이영양증, 베커 근육 이영양증 또는 심근병증을 유발할 수 있다. 대안적 프로모터 용법 및 대안적 스플라이싱은 이 유전자에 대해 수많은 별개의 전사체 변이체 및 단백질 이소형을 생성한다. 일부 실시양태에서, DMD 유전자는 인간 (진(Gene) ID: 1756), 비-인간 영장류 (예를 들어, 진 ID: 465559) 또는 설치류 유전자 (예를 들어, 진 ID: 13405; 진 ID: 24907)일 수 있다. 추가로, 상이한 단백질 이소형을 코딩하는 다수의 인간 전사체 변이체 (예를 들어, 진뱅크(GenBank) RefSeq 수탁 번호: NM_000109.3, NM_004006.2 (서열식별번호: 24), NM_004009.3, NM_004010.3 및 NM_004011.3 하에 주석달린 바와 같음)가 특징화되었다.
DMD 대립유전자: 본원에 사용된 용어 "DMD 대립유전자"는 DMD 유전자의 대안적 형태 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이 형태) 중 어느 하나를 지칭한다. 일부 실시양태에서, DMD 대립유전자는 그의 정상적 및 전형적 기능을 보유하는 디스트로핀을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, DMD 대립유전자는 근육 이영양증을 유발하는 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 뒤시엔느 근육 이영양증을 유도하는 통상의 돌연변이는 DMD 대립유전자에 존재하는 79개의 엑손, 예를 들어 엑손 8, 엑손 23, 엑손 41, 엑손 44, 엑손 50, 엑손 51, 엑손 52, 엑손 53 또는 엑손 55 중 1개 이상의 프레임시프트, 결실, 치환 및 중복 돌연변이를 수반한다. DMD 돌연변이의 추가의 예는, 예를 들어 문헌 [Flanigan KM, et al., Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Hum Mutat. 2009 Dec; 30 (12):1657-66]에 개시되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
디스트로핀병증: 본원에 사용된 용어 "디스트로핀병증"은 1개 이상의 돌연변이된 DMD 대립유전자로부터 유발된 근육 질환을 지칭한다. 디스트로핀병증은 뒤시엔느 근육 이영양증, 베커 근육 이영양증 및 DMD-연관 확장성 심근병증 (DCM)을 포함하는 넓은 범위의 상태 (경도 내지 중증의 범위)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 범위의 한쪽 단부에서, 디스트로핀병증은 크레아틴 포스포키나제 (CK)의 혈청 농도의 무증상 증가 및/또는 (예를 들어, 및) 미오글로빈뇨를 동반한 근육 경련과 표현형적으로 연관된다. 일부 실시양태에서, 범위의 다른쪽 단부에서, 디스트로핀병증은 일반적으로 골격근에 주로 이환되는 경우에 뒤시엔느 또는 베커 근육 이영양증으로서 분류되고 심장에 주로 이환되는 경우에 DMD-연관 확장성 심근병증 (DCM)으로 분류되는 진행성 근육 질환과 표현형적으로 연관된다. 뒤시엔느 근육 이영양증의 증상은 근육 손실 또는 변성, 감소된 근육 기능, 혀 및 송아지 근육의 가성비대, 신경계 이상의 보다 높은 위험 및 단축된 수명을 포함한다. 뒤시엔느 근육 이영양증은 온라인 인간 멘델 유전 (OMIM) 엔트리 # 310200과 연관된다. 베커 근육 이영양증은 OMIM 엔트리 # 300376과 연관된다. 확장성 심근병증은 OMIM 엔트리 X# 302045와 연관된다.
엑손 스플라이싱 인핸서 (ESE): 본원에 사용된 용어 "엑손 스플라이싱 인핸서" 또는 "ESE"는, 예를 들어 문헌 [Blencowe et al., Trends Biochem Sci 25, 106-10. (2000)] (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 프리-mRNA의 mRNA로의 스플라이싱을 지시하거나 증진시키는 유전자, 프리-mRNA 또는 mRNA의 엑손 내의 핵산 서열 모티프를 지칭한다. ESE는 스플라이싱 특징부이다. ESE는, 예를 들어 유전자 전사체로부터 1개 이상의 인트론 및/또는 1개 이상의 엑손을 제거하기 위해 스플라이싱을 지시하거나 증진시킬 수 있다. ESE 모티프는 전형적으로 6-8개의 핵염기 길이이다. SR 단백질 (예를 들어, 유전자 SRSF1, SRSF2, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRSF7, SRSF8, SRSF9, SRSF10, SRSF11, SRSF12, TRA2A 또는 TRA2B에 의해 코딩되는 단백질)은 ESE에 그의 RNA 인식 모티프 영역을 통해 결합하여 스플라이싱을 용이하게 한다. ESE 모티프는 문헌 [Cartegni et al., Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 13, 3568-3571] (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한 다수의 방법을 통해 확인될 수 있다.
프레임워크: 본원에 사용된 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 CDR을 제외한 가변 영역의 나머지 서열을 지칭한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 프레임워크 서열의 의미는 상응하는 상이한 해석에 따른다. 6개의 CDR (경쇄의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 및 중쇄의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 또한 경쇄 및 중쇄 상의 프레임워크 영역을 각각의 쇄 상에서 4개의 하위-영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 분류하며, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2 사이에, CDR2는 FR2와 FR3 사이에, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. 특정한 하위-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 명시하지 않으면서, 다른 것으로 지칭되는 프레임워크 영역은, 단일의 자연 발생 이뮤노글로불린 쇄의 가변 영역 내의 조합 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 FR은 4개의 하위-영역 중 1개를 나타내고, FR들은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 하위-영역 중 2개 이상을 나타낸다. 인간 중쇄 및 경쇄 수용자 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 관련 기술분야에 공지된 수용자 서열은 본원에 개시된 항체에 사용될 수 있다.
인간 항체: 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 인간 항체는, 예를 들어 CDR, 특히 CDR3 내에, 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프트된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
인간화 항체: 용어 "인간화 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 (예를 들어, 및) VL 서열의 적어도 한 부분이 보다 "인간-유사"하도록, 즉 인간 배선 가변 서열과 보다 유사하도록 변경된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 한 유형은 인간 CDR 서열이 비-인간 VH 및 VL 서열에 도입되어 상응하는 비인간 CDR 서열을 대체하는 CDR-그라프트된 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항-트랜스페린 수용체 항체 및 항원 결합 부분이 제공된다. 이러한 항체는 전통적인 하이브리도마 기술을 사용하여 뮤린 항-트랜스페린 수용체 모노클로날 항체를 수득하고, 이어서 시험관내 유전자 조작, 예컨대 PCT 공개 번호 WO 2005/123126 A2 (Kasaian et al.)에 개시된 것을 사용하여 인간화함으로써 생성될 수 있다.
카바트 넘버링: 용어 "카바트 넘버링", "카바트 정의" 및 "카바트 라벨링"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 관련 기술분야에서 인식되는 이들 용어는 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 다른 아미노산 잔기보다 더 가변적인 (즉, 초가변적인) 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다 (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 및 Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 중쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역은 CDR1의 경우 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2의 경우 아미노산 위치 50 내지 65 및 CDR3의 경우 아미노산 위치 95 내지 102의 범위이다. 경쇄 가변 영역에서, 초가변 영역은 CDR1의 경우 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2의 경우 아미노산 위치 50 내지 56 및 CDR3의 경우 아미노산 위치 89 내지 97의 범위이다.
모르폴리노: 본원에 사용된 용어 "모르폴리노" ("포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머"로도 또한 지칭됨)는 포스포로디아미데이트 기를 통해 연결된 메틸렌모르폴린 고리의 백본에 부착된 핵염기를 함유하는 분자 구조를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노-기재 화합물일 수 있다. 모르폴리노-기재 올리고머 화합물은 문헌 [Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510); Genesis, volume 30, issue 3, 2001; Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214; Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220; Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596]; 및 1991년 7월 23일에 허여된 미국 특허 번호 5,034,506에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 모르폴리노-기재 올리고머 화합물은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)이다 (예를 들어, 문헌 [Iverson, Curr. Opin. Mol. Ther., 3:235-238, 2001; 및 Wang et al., J. Gene Med., 12:354-364, 2010]에 기재된 바와 같고, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
올리고뉴클레오티드: 본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 200개 이하의 뉴클레오티드 길이의 올리고머 핵산 화합물을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드의 예는 RNAi 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA, shRNA), 마이크로RNA, 갭머, 믹스머, 포스포로디아미데이트 모르폴리노, 펩티드 핵산, 압타머, 가이드 핵산 (예를 들어, Cas9 가이드 RNA) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 2'-O-메틸 당 변형, 퓨린 또는 피리미딘 변형)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 Rp 또는 Sp 입체화학적 입체형태일 수 있는 1개 이상의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다.
상보성 영역: 본원에 사용된 용어 "상보성 영역"은 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 동족 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 표적 핵산의 동족 뉴클레오티드 서열에 대해, 2개의 뉴클레오티드 서열이 생리학적 조건 하에 (예를 들어, 세포에서) 서로에 대해 어닐링될 수 있도록 하는 데 충분히 상보적인 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 핵산의 동족 뉴클레오티드 서열에 대해 완전히 상보적이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 핵산의 동족 뉴클레오티드 서열에 대해 부분적으로 상보적이다 (예를 들어, 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 상보성). 일부 실시양태에서, 상보성 영역은 표적 핵산의 동족 뉴클레오티드 서열과 비교하여 1, 2, 3 또는 4개의 미스매치를 함유한다.
특이적으로 결합한다: 본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는 분자가 결합 검정 또는 다른 결합 상황에서 결합 파트너를 적절한 대조군과 구별하는 데 사용될 수 있게 하는 친화도 또는 결합력의 정도로 분자가 결합 파트너에 결합하는 능력을 지칭한다. 항체와 관련하여, 용어 "특이적으로 결합한다"는 적절한 참조 항원 또는 항원들과 비교하여, 항체가 특이적 항원을 다른 것과 구별하는 데, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 항원에 대한 결합을 통해 특정 세포, 예를 들어 근육 세포에 대한 우선적 표적화를 허용하는 정도로 사용될 수 있게 하는 친화도 또는 결합력의 정도로 항체가 특이적 항원에 결합하는 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항체가 표적에의 결합에 대해 적어도 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만의 KD를 갖는 경우에 항체는 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 트랜스페린 수용체, 예를 들어 트랜스페린 수용체의 정단 도메인의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
대상체: 본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류 또는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자, 예를 들어 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 인간 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 돌연변이된 DMD 유전자 서열, 예를 들어 DMD 유전자 서열의 엑손 내의 돌연변이로 인한 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 인간 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 디스트로핀병증, 예를 들어 뒤시엔느 근육 이영양증을 갖는다.
트랜스페린 수용체: 본원에 사용된 용어 "트랜스페린 수용체" (TFRC, CD71, p90, TFR 또는 TFR1로도 또한 공지됨)는 트랜스페린에 결합하여 세포내이입에 의한 철 흡수를 용이하게 하는 내재화 세포 표면 수용체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 트랜스페린 수용체는 인간 (NCBI 진 ID 7037), 비-인간 영장류 (예를 들어, NCBI 진 ID 711568 또는 NCBI 진 ID 102136007) 또는 설치류 (예를 들어, NCBI 진 ID 22042) 기원의 것일 수 있다. 추가로, 수용체의 상이한 이소형을 코딩하는 다수의 인간 전사체 변이체 (예를 들어, 진뱅크 RefSeq 수탁 번호: NP_001121620.1, NP_003225.2, NP_001300894.1 및 NP_001300895.1 하에 주석달린 바와 같음)가 특징화되었다.
범위: 본 개시내용에 제공된 모든 범위는 종점을 포함한다.
복합체
올리고뉴클레오티드에 공유 연결된 표적화제, 예를 들어 항체를 포함하는 복합체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 복합체는 1개 이상의 올리고뉴클레오티드에 공유 연결된 근육-표적화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 PMO이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 엑손 스킵핑을 촉진하는 돌연변이된 DMD 대립유전자를 표적화하는 올리고뉴클레오티드이다.
본원에 기재된 복합체는 일반적으로 본원에 기재된 항체 (예를 들어, 항-TfR1 항체 중 어느 하나)를 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, PMO)에 공유 연결하는 링커를 포함한다. 링커는 적어도 1개의 공유 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물 또는 제제 중)는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, PMO)를 포함하는 화합물을 포함하고, R2는 항체 (예를 들어, 항-TfR1 항체)를 포함하고, 여기서 n1은 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 1 이상의) 정수이다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 0 이상의) 정수이다. 일부 실시양태에서, 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드 이외에 추가의 요소를 포함하는 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 (예를 들어, 항-TfR1 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체의 각각의 R1은 R2의 상이한 아미노산 잔기 (예를 들어, 리신 또는 시스테인)에 독립적으로 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, R2는 항-TfR1 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서, n1은 독립적으로 0 이상의 정수이다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서, n1은 독립적으로 1 이상의 정수이다. 일부 실시양태에서, n1은 1 이상의 정수이다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편이다.
일부 실시양태에서, 각각의 또는 임의의 복합체 (예를 들어, 본원에 개시된 조성물 또는 제제 중 어느 것에서의 임의의 복합체)의 n1의 값은 1 내지 접합이 요구되거나 표적화되는 항체 내의 아미노산 잔기의 수 (예를 들어, 리신 잔기의 수)까지의 정수이다. 일부 실시양태에서, n1의 값은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, n1의 값은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, n1의 값은 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3의 범위이다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서, n1의 값은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서, n1의 값은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서, n1의 값은 독립적으로 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3의 범위이다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 3-5 또는 1-2)의 범위이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체 유형에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체 유형의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 조성물의 상이한 복합체 유형은 상이한 n1 값 (예를 들어, 1-27, 1-26, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 n1 값)을 갖는 것을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 복수의 상이한 복합체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 히스티딘 및/또는 수크로스를 포함하는 제제)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 복수의 상이한 복합체는 공통 표적화제 (예를 들어, 항체) 및 공통 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, PMO)를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 상이한 복합체 유형은 항체에 공유 연결된 상이한 수의 올리고뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 복합체 유형을 포함하는 조성물로서, 여기서 각각의 복합체 유형은 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하고, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, PMO)를 포함하는 화합물을 포함하고, R2는 항체 (예를 들어, 항-TfR1 항체)를 포함하고, 여기서 각각의 복합체 유형에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체 유형의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 조성물의 상이한 복합체 유형은 상이한 n1 값 (예를 들어, 1-27, 1-26 범위의 n1 값)을 갖는 것을 특징으로 하는 것인 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물의 각각의 상이한 복합체 유형은 1-27, 1-26, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 상이한 n1 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체에서 n1은 독립적으로 정수이다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 n1이 0인 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비접합된 항체 (예를 들어, 미량) 및 1개 이상의 올리고뉴클레오티드에 접합된 항체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 히스티딘 및/또는 수크로스를 포함하는 제제)이 본원에 제공된다. 본원에 사용된 "비접합된 항체"는 올리고뉴클레오티드에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 비접합된 항체는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 화합물로서 지칭될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 화합물 (예를 들어, 복합체)을 포함하며, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기를 포함하고, R2는 항체를 포함하고, n1은 복합체에서 R1의 경우의 개수를 반영하는 0 이상의 정수인 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 제제)이 제공된다. 일부 실시양태에서, n1은 독립적으로 각각의 화합물 (예를 들어, 복합체)에서 R1의 경우의 개수를 반영하는 0 이상의 정수이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 화합물의 분율은 조성물 중 상기 구조에 대해 n1이 1 이상인 모든 화합물의 분율과 비교하여 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만 또는 0.01% 미만이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 복합체에서 각각의 경우의 R1은 항체의 상이한 아미노산 잔기에 접합된다. 일부 실시양태에서, 복합체에서 각각의 경우의 R1은 항체의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, R1이 공유 연결된 아미노산은 ε-아미노 기 (예를 들어, 리신, 아르기닌)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 상이한 아미노산은 ε-아미노 기 (예를 들어, 리신, 아르기닌)를 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, R1이 공유 연결된 아미노산은 시스테인이다. 일부 실시양태에서, R1이 공유 연결된 각각의 상이한 아미노산은 시스테인이다. 일부 실시양태에서, R1은 항체의 아미노산 잔기에 직접 공유 연결된다. 그러나, 일부 실시양태에서, R1은 항체의 아미노산에 간접적으로 공유 연결되며, 예를 들어 아미노산 상의 글리코실화 부위에 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, R1은 항체의 CDR 영역에 존재하는 아미노산 잔기에는 공유 연결되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물 또는 제제)는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며, 여기서 각각의 경우의 R1은 독립적으로 화학식 (Ia)의 기를 포함한다:
Figure pct00009
여기서 R3은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하고; R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된다 (예를 들어, 간접적으로 또는 직접적으로 연결, 예를 들어 직접적으로 연결됨). 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 1 이상의) 정수이다. 일부 실시양태에서, R2는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R3은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab를 포함하고, 각각의 R1은 부착 지점 A에서 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 정수 (예를 들어, 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 정수)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물 또는 제제)는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며, 여기서 각각의 R1은 화학식 (Ib)의 기를 포함한다:
Figure pct00010
여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고; R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고 (예를 들어, 간접적으로 또는 직접적으로 연결, 예를 들어 직접적으로 연결됨), 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 1 이상의) 정수이고, 각각의 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, R2는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 정수 (예를 들어, 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 정수)이다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab를 포함하고, 각각의 R1은 부착 지점 A에서 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물 또는 제제)는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며, 여기서 각각의 R1은 화학식 (Ic)의 기를 포함한다:
Figure pct00011
여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된다 (예를 들어, 간접적으로 또는 직접적으로 연결, 예를 들어 직접적으로 연결됨). 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 1 이상의) 정수이고, 여기서 각각의 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, R2는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 정수 (예를 들어, 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 정수)이다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab를 포함하고, 각각의 R1은 부착 지점 A에서 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물 또는 제제)는 화학식 (Id)의 구조를 포함한다:
Figure pct00012
여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고; 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함하고; 여기서 R2는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 항체를 포함하고; 여기서 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 대괄호에 의해 둘러싸인 기의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 1 이상의) 정수이고, 여기서 대괄호에 의해 둘러싸인 각각의 경우의 기는 항체 (예를 들어, Fab)의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 정수 (예를 들어, 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 정수)이다. 일부 실시양태에서, R2는 항체 (예를 들어, Fab)의 상이한 아미노산 잔기를 통해 공유 연결된 항체 (예를 들어, Fab)를 포함하며, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 하기의 구조를 포함한다:
여기서 y는 0-15 (예를 들어, 3)이고, z는 0-15 (예를 들어, 4)이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-TfR1 항체 (예를 들어, 표 2에 제공된 항-TfR1 항체)이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 PMO이고, 서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구조 (A)에서 항-TfR1 항체에 인접하여 제시된 아미드는 항-TfR1 항체의 아민, 예컨대 리신 엡실론 아민과의 반응으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 항-TfR1 Fab를 포함하고, 이는 Fab의 리신을 통해 PMO의 5' 단부에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv이다.
항체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 복합체는 인간 트랜스페린 수용체 1 (TfR1)에 결합하는 항체를 포함한다. NCBI 서열 NP_003225.2 (트랜스페린 수용체 단백질 1 이소형 1, 호모 사피엔스(homo sapiens))에 상응하는 인간 트랜스페린 수용체 1 아미노산 서열의 예는 하기와 같다:
Figure pct00014
표 2는 본원에 제공된 복합체에 유용한 항-TfR1 항체의 서열의 예를 제공한다.
표 2. 항-TfR1 항체 서열의 예
Figure pct00015
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 1의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1) (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 2의 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2) (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 3의 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3) (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 4의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1) (IMGT 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 5의 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) (IMGT 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 6의 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3) (IMGT 정의 시스템에 따름)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 7의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1) (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 8의 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2) (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 9의 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3) (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 10의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1) (카바트 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 11의 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) (카바트 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 6의 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3) (카바트 정의 시스템에 따름)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 12의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1) (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 13의 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2) (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 14의 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3) (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 15의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1) (코티아 정의 시스템에 따름), 서열식별번호: 5의 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) (코티아 정의 시스템에 따름) 및 서열식별번호: 16의 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3) (코티아 정의 시스템에 따름)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 비교하여 프레임워크 영역에 25개 이하의 아미노산 변이 (예를 들어, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH에 대해 프레임워크 영역에서 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL에 대해 프레임워크 영역에서 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 Fab이다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열에 대해 적어도 75% (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 Fab이다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 (예를 들어, 추가로), 본 개시내용의 항-TfR1 항체는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-TfR1 항체는 1종 이상의 번역후 변형을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 피로글루타메이트 형성 (피로-Glu)으로도 또한 불리는 N-말단 고리화는 생산 동안 항체에서 N-말단 글루타메이트 (Glu) 및/또는 글루타민 (Gln) 잔기에서 발생할 수 있다. 따라서, N-말단 글루타메이트 또는 글루타민 잔기를 포함하는 서열을 갖는 것으로 명시된 항체는 번역후 변형으로부터 생성된 피로글루타메이트 형성을 겪은 항체를 포괄한다는 것이 인지될 것이다. 일부 실시양태에서, 피로글루타메이트 형성은 중쇄 서열에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 피로글루타메이트 형성은 경쇄 서열에서 발생한다.
올리고뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체의 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용하다. 일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 DMD 대립유전자 (예를 들어, 돌연변이된 DMD 대립유전자)를 표적화한다. 일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 DMD RNA (예를 들어, 서열식별번호: 24의 Dp427m 전사체)의 영역을 표적화한다. 일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 DMD RNA (예를 들어, 서열식별번호: 23의 Dp427m 전사체)에 대한 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 DMD RNA의 엑손 (예를 들어, 엑손 8, 23, 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 53 또는 55) 또는 인트론에 대한 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 DMD RNA (예를 들어, 호모 사피엔스 DMD 유전자 (예를 들어, NCBI 수탁 번호 NG_012232.1)에 의해 코딩되는 DMD 프리-mRNA)의 스플라이싱 공여자 부위, 스플라이싱 수용자 부위, 분지점 또는 엑손 스플라이싱 인핸서 (ESE)를 표적화한다. 일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 DMD 내의 엑손 스플라이싱 인핸서 (ESE) 서열 (예를 들어, 엑손 23, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 53 또는 55의 ESE 서열)을 표적화한다.
복합체의 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화될 수 있는 DMD RNA 서열 및 엑손 서열의 예가 하기에 제공된다.
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, mRNA (NCBI 참조 서열: NM_004006.2) (서열식별번호: 23).
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 51 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 7554-7786)
Figure pct00016
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 8 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 894-1075)
Figure pct00017
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 23 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 3194-3406)
Figure pct00018
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 43 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 6362-6534)
Figure pct00019
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 44 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 6535-6682)
Figure pct00020
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 45 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 6683-6858)
Figure pct00021
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 46 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 6859-7006)
Figure pct00022
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 50 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 7445-7553)
Figure pct00023
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 51 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 7554-7786)
Figure pct00024
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 52 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 7787-7904)
Figure pct00025
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 53 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 7905-8116)
Figure pct00026
호모 사피엔스 디스트로핀 (DMD), 전사체 변이체 Dp427m, 엑손 55 (NCBI 참조 서열: NM_004006.2의 뉴클레오티드 위치 8272-8461)
Figure pct00027
일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 15-40개 (예를 들어, 15-40, 15-35, 15-30, 15-25, 15-20, 20-40, 20-35, 20-30, 20-25, 25-40, 25-35, 25-30, 25-28, 28-30, 30-40, 30-32, 32-35, 30-35 또는 35-40개)의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 길이, 임의로 20-35 또는 30개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 DMD RNA에 대한 적어도 8개 (예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 연속 뉴클레오티드의 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 DMD RNA의 엑손에 대한 적어도 8개 (예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 연속 뉴클레오티드의 상보성 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 23-34 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 DMD 서열에 대해 적어도 8개 (예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 연속 뉴클레오티드의 상보성 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 22에 제시된 바와 같은 표적 서열 (CTAGAAATGCCATCTTCCTTGATGTTGGAG)에 대해 적어도 8개 (예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 연속 뉴클레오티드의 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 21에 제시된 바와 같은 서열 (CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG)의 적어도 8개 (예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, DMD를 표적화하는 데 (예를 들어, 엑손 스킵핑에) 유용한 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나는 PMO이다.
일부 실시양태에서, C5 위치에서의 핵염기 우라실의 메틸화는 티민을 형성한다는 것이 인지될 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, C5 메틸화 우라실 (또는 5-메틸-우라실)을 갖는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 동등하게 티민 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드로서 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 서열식별번호: 21에 제시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드) 중 어느 하나 내의 티민 염기 (T) 중 어느 1개 이상은 독립적으로 및 임의로 우라실 염기 (U)일 수 있고/거나 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 내의 U 중 어느 1개 이상은 독립적으로 및 임의로 T일 수 있다.
조성물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 복합체 (즉, 복수의 복합체)를 포함하며, 각각의 복합체는 1개 이상의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드)에 공유 연결된 항체 (예를 들어, 항-TFR1 항체)를 포함하고, 여기서 항체는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 복합체의 항체는 표 2에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다. 본원에 기재된 조성물의 복합체는 본원에 제공된 임의의 구조, 예를 들어 화학식 (I) (예를 들어, 화학식 (Ia), 화학식 (Ib), 화학식 (Ic) 또는 화학식 (Id)의 기를 포함함) 또는 화학식 (A)의 구조를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 복합체 (즉, 복수의 복합체)를 포함하며, 여기서 각각의 복합체는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하고, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 화합물을 포함하고 R2에 공유 연결되고, 여기서 R2는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 (예를 들어, 항-TfR1 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체의 각각의 R1은 독립적으로 R2의 상이한 아미노산 잔기 (예를 들어, 리신 또는 시스테인)에 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, 조성물 중 복합체의 n1의 값은 독립적으로 및 임의로 1 내지 항체 (예를 들어, R2 내에 포함된 항체) 내의 접합이 요구되거나 표적화되는 아미노산 잔기의 수 (예를 들어, 리신 잔기의 수)까지의 정수이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 각각의 복합체의 n1의 값은 독립적으로 및 임의로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 각각의 복합체의 n1의 값은 독립적으로 및 임의로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 각각의 복합체의 n1의 값은 독립적으로 및 임의로 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3 범위의 정수로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 26 또는 1 내지 27의 범위이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 n1의 값이 0인 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 올리고뉴클레오티드에 접합되지 않은 항체 (예를 들어, 미량) 및 1개 이상의 올리고뉴클레오티드에 접합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드에 접합되지 않은 항체는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 화합물로서 지칭될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 대상체에게 투여하기 위한 조성물은 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 화합물 (예를 들어, 복합체)을 포함하며, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기를 포함하고, R2는 항체를 포함하고, n1은 독립적으로 각각의 화합물 (예를 들어, 복합체)에서 R1의 경우의 개수를 반영하는 0 이상의 정수이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 화합물의 분율은 조성물 중 상기 구조에 대해 n1이 1 이상인 모든 화합물의 분율과 비교하여 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만 또는 0.01% 미만이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 중 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다.
제제
본원에 제공된 복합체는 제약 용도에 적합한 방식으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 복합체는 분해를 최소화하거나, 전달 및/또는 (예를 들어, 및) 흡수를 용이하게 하거나, 또는 제제 중 복합체에 또 다른 유익한 특성을 제공하는 제제를 사용하여 대상체에게 전달될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 복합체 (예를 들어, Fab와 공유 연결된 PMO를 포함하는 복합체)를 히스티딘 및/또는 수크로스와 함께 제제화하는 것이, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 제약 용도에 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 실시양태에서, 복합체를 히스티딘 및/또는 수크로스와 함께 포함하는 제제 (예를 들어, 수용액, 동결건조된 형태)가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 복합체를 히스티딘 및/또는 수크로스와 함께 포함하는 동결된 형태의 제제가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 복합체 (예를 들어, Fab와 공유 연결된 PMO를 포함하는 복수의 복합체), 히스티딘 및 수크로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 근육-표적화 복합체 (예를 들어, Fab와 공유 연결된 PMO를 포함하는 복합체)를 포함하는 제제는 수용액 중 히스티딘 및/또는 수크로스와 함께 제제화된다. 일부 실시양태에서, 복수의 복합체, 히스티딘 및 수크로스를 포함하는 제제는 (예를 들어, 저장을 위해) 동결건조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 제제는 대상체에게 투여하기 위해 (예를 들어, 물로) 재구성될 수 있다. 이러한 제제는 대상체에게 표적 세포의 바로 옆 환경으로 또는 전신으로 투여되는 경우에, 충분한 양의 복합체가 표적 근육 세포에 진입하도록 적합하게 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 복합체 (즉, 복수의 복합체)를 포함하며, 각각의 복합체는 항체에 공유 연결된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하는 것인 제제가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 복합체를 포함하는 제제로서, 여기서 각각의 복합체는 항-TfR1 항체에 공유 연결된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하며, 임의로 여기서 이러한 복합체의 항체는 표 2에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 추가로 일부 실시양태에서, 여기서 복합체는 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘) 및 수크로스와 함께 제제화된 것인 제제가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-TfR1 항체이다.
일부 실시양태에서, 화학식: [R1]n1-R2의 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, PMO)를 포함하는 화합물을 포함하고, R2는 항체 (예를 들어, 항-TfR1 항체)를 포함하고, n1은 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수인 제제가 제공된다. 일부 실시양태에서, 복수의 복합체를 포함하며, 여기서 각각의 복합체는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, PMO)를 포함하는 화합물을 포함하고, R2는 항체 (예를 들어, 항-TfR1 항체)를 포함하고, 여기서 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수인 제제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 표 2에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 항체를 포함하는 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab이고, 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제제 중 각각의 복합체의 n1의 값은 독립적으로 및 임의로 1 내지 항체 (R2) 내의 접합이 요구되거나 표적화되는 아미노산 잔기의 수 (예를 들어, 리신 잔기의 수)까지의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 각각의 복합체의 n1의 값은 독립적으로 및 임의로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제제 중 각각의 복합체의 n1의 값은 독립적으로 및 임의로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제제 중 각각의 복합체의 n1의 값은 독립적으로 및 임의로 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3 범위의 정수로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제제의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 3, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 26 또는 1 내지 27의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 올리고뉴클레오티드에 접합되지 않은 항체 (예를 들어, 미량) 및 1개 이상의 올리고뉴클레오티드에 접합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드에 접합되지 않은 항체인 항체는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 화합물로서 지칭될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 화합물 (예를 들어, 복합체)을 포함하며, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기를 포함하고, R2는 항체를 포함하고, n1은 독립적으로 각각의 화합물 (예를 들어, 복합체)에서 R1의 경우의 개수를 반영하는 0 이상의 정수인 제제가 제공된다. 일부 실시양태에서, 제제 중 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 화합물의 분율은 제제 중 상기 구조에 대해 n1이 1 이상인 모든 화합물의 분율과 비교하여 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만 또는 0.01% 미만이다. 일부 실시양태에서, 제제의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원의 복합체 (예를 들어, 본원에 제공된 제제의 복합체)에서 각각의 경우의 R1은 항체의 상이한 아미노산 잔기에 접합된다. 일부 실시양태에서, 각각의 상이한 아미노산은 ε-아미노 기 (예를 들어, 리신, 아르기닌)를 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, R1이 공유 연결된 각각의 상이한 아미노산은 시스테인이다. 일부 실시양태에서, R1은 항체의 아미노산 잔기에 직접 공유 연결된다. 그러나, 일부 실시양태에서, R1은 항체의 아미노산에 간접적으로 공유 연결되며, 예를 들어 아미노산 상의 글리코실화 부위에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, R1이 항체의 CDR 영역에 존재하는 아미노산 잔기에 공유 연결된 것인 복합체가 단지 미량으로만 존재하거나 또는 검출불가능한 양으로 존재하거나 또는 전혀 존재하지 않는 것인 제제가 제공된다. 일부 실시양태에서, R1이 항체의 CDR 영역에 존재하는 아미노산 잔기에 공유 연결된 것인 복합체가 표준 검출 기술을 사용하여 제제에서 검출가능하지 않은 것인 제제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체를 포함하며, 여기서 본원에 제공된 제제의 복합체에서 각각의 경우의 R1은 독립적으로 화학식 (Ia)의 기를 포함한다:
Figure pct00028
여기서 R3은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하고; R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된다 (예를 들어, 간접적으로 또는 직접적으로 연결, 예를 들어 직접적으로 연결됨). 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 1 이상의) 정수이다. 일부 실시양태에서, R2는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R3은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 항체 Fab를 포함하고, 각각의 R1은 부착 지점 A에서 항체 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 정수 (예를 들어, 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 정수)이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체를 포함하며, 여기서 본원에 제공된 제제의 복합체에서 각각의 경우의 R1은 화학식 (Ib)의 기를 포함한다:
Figure pct00029
여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고; R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고 (예를 들어, 간접적으로 또는 직접적으로 연결, 예를 들어 직접적으로 연결됨), 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 1 이상의) 정수이고, 각각의 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, R2는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 정수 (예를 들어, 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 정수)이다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab를 포함하고, 각각의 R1은 부착 지점 A에서 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체를 포함하며, 여기서 본원에 제공된 제제의 복합체에서 각각의 경우의 R1은 화학식 (Ic)의 기를 포함한다:
Figure pct00030
여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된다 (예를 들어, 간접적으로 또는 직접적으로 연결, 예를 들어 직접적으로 연결됨).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체를 포함하며, 여기서 본원에 제공된 제제의 복합체에서의 각각의 경우의 R1은 하기와 같다:
Figure pct00031
여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된다 (예를 들어, 간접적으로 또는 직접적으로 연결, 예를 들어 직접적으로 연결됨). 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 1 이상의) 정수이다. 일부 실시양태에서, R2는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab 단편인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 정수 (예를 들어, 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 정수)이다. 일부 실시양태에서, R2는 Fab를 포함하고, 각각의 R1은 부착 지점 A에서 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하며 여기서 n1은 0인 복합체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 화학식 (Id)의 구조를 포함하는 복합체를 포함한다:
Figure pct00032
여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고; 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함하고; 여기서 R2는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 항체를 포함하고; 여기서 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 대괄호에 의해 둘러싸인 기의 경우의 개수를 나타내는 (예를 들어, 1 이상의) 정수이고, 여기서 대괄호에 의해 둘러싸인 각각의 경우의 기는 항체 (예를 들어, Fab)의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 (예를 들어, Fab)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 복합체에서 n1은 독립적으로 정수 (예를 들어, 1-27, 1-26, 1-10, 1-5 또는 1-3 범위의 정수)이다. 일부 실시양태에서, R2는 항체 (예를 들어, Fab)의 상이한 아미노산 잔기를 통해 공유 연결된 항체 (예를 들어, Fab)를 포함하며, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 n1이 0인 복합체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5 (예를 들어, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, 3-5, 1-4.6, 1-4.5, 1-4.4, 1-4.3, 1-4.2, 1-3.5, 1-2.5, 1.1-5, 1.1-4.5, 1.1-4, 1.1-3.5, 1.1-3, 1.1-2.5, 1.1-2.2, 1.2-5, 1.2-4.5, 1.2-4, 1.2-3.5, 1.2-3, 1.2-2.5, 1.2-2.2, 1.3-5, 1.3-4.5, 1.3-4, 1.3-3.5, 1.3-3, 1.3-2.5, 1.3-2.2, 1.4-5, 1.4-4.5, 1.4-4, 1.4-3.5, 1.4-3, 1.4-2.5, 1.4-2.2, 1.5-5, 1.5-4.5, 1.5-4, 1.5-3.5, 1.5-3, 1.5-2.5, 1.5-2.2, 1.6-3, 1.6-2.5, 1.6-2.2, 1.7-3, 1.7-2.5, 1.7-2.2, 1.8-3, 1.8-2.5 또는 1.8-2.2)의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제 중에 제공된 복합체는 화학식 (A)의 구조를 포함한다:
Figure pct00033
여기서 y는 0-15 (예를 들어, 3)이고, z는 0-15 (예를 들어, 4)이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-TfR1 항체 (예를 들어, 표 2에 제공된 항-TfR1 항체)이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 PMO이고, 서열식별번호: 21의 염기 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구조 (A)에서 항-TfR1 항체에 인접하여 제시된 아미드는 항체의 아민, 예컨대 리신 엡실론 아민과의 반응으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체는 항-TfR1 Fab를 포함하고, 이는 Fab의 리신을 통해 PMO의 5' 단부에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고/거나; 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/거나 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% (예를 들어, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복합체를 포함하는 제제가 제공되며, 여기서 제제 중 복합체의 농도는 복합체 1-50 mg/mL, 임의로 10-50 mg/ml 또는 20-35 mg/mL (예를 들어, 1-10 mg/mL, 10-15 mg/mL, 15-20 mg/mL, 20-22 mg/mL, 22-24 mg/ml, 24-26 mg/ml, 24-25 mg/ml, 25-26 mg/ml, 22-25 mg/mL, 25-27 mg/mL, 27-29 mg/mL, 29-30 mg/mL, 25-30 mg/mL, 29-31 mg/ml, 30-31 mg/ml, 31-32 mg/ml, 30-32 mg/mL, 32-33 mg/ml, 32-35 mg/mL, 30-35 mg/mL, 35-40 mg/mL, 40-45 mg/mL, 45-50 mg/mL), 임의로 대략 25 mg/mL (예를 들어, 25 mg/mL) 또는 대략 30 mg/mL (예를 들어, 30 mg/mL)이다.
일부 실시양태에서, 어느 하나 또는 복수의 본원에 기재된 복합체는 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘) 및 수크로스와 함께 동결건조된 형태 (예를 들어, 동결건조된 분말)로 제제화된다.
일부 실시양태에서, 어느 하나 또는 복수의 본원에 기재된 복합체는 수용액 중 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘) 및 수크로스와 함께 제제화된다. 일부 실시양태에서, 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘)은 수용액 중에 10-50 mM, 10-20 mM, 20 mM 내지 30 mM 또는 20 mM 내지 40 mM, 예를 들어 20-22 mM, 22-24 mM, 24-25 mM, 25-26 mM, 24-26 mM, 26-27 mM, 24-27 mM, 27-28 mM, 28-29 mM, 29-30 mM, 27-30 mM, 대략 22-27 mM, 대략 23-26 mM, 대략 24-26 mM, 대략 26-28 mM, 대략 28-30 mM, 대략 30-32 mM, 대략 32-35 mM, 대략 35-40 mM, 40-45 mM, 45-50 mM의 범위, 대략 25 mM 또는 임의로 25 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 수용액 중에 부피당 5 중량% 내지 15 중량% (w/v%), 예를 들어 8-15% w/v%, 9-15% w/v%, 9-11% w/v%, 9.5-11% w/v%의 범위, 또는 예를 들어 5-6 w/v%, 6-7 w/v%, 7-8 w/v%, 8-9 w/v%, 9-10 w/v%, 10-11 w/v%, 11-12% w/v%, 10-12 w/v%, 12-13% w/v%, 13-14% w/v%, 12-14 w/v%, 14-15 w/v% 또는 8-12 w/v% 범위의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 수용액 중에 8-12 w/v%의 범위 (예를 들어, 10 w/v%)의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 수용액은 5.0 내지 7.0, 예를 들어 5.0-5.2, 5.2-5.4, 5.4-5.6, 5.6-5.8, 5.8-6.0, 5.9-6.0, 5.9-6.1, 6.0-6.1; 예를 들어 5.5 내지 6.5 범위의 pH, 또는 예를 들어 5.5-5.8, 5.8-6.0, 5.9-6.1, 6.0-6.1, 6.0-6.2, 6.2-6.4, 6.4-6.5, 6.5-6.7, 6.7-6.8, 6.8-6.9, 6.9-7.0, 7.0-7.1 또는 5.8-6.2의 pH 범위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 수용액은 5.8-6.2 (예를 들어, 5.8-6.0, 5.8-6.1, 5.9-6.1) 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 수용액은 5.9-6.2 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 수용액은 6.0-6.1 범위 (예를 들어, 약 6.0 또는 6.0)의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 하나 또는 복수의 복합체, 히스티딘 및 수크로스를 포함하는 본원에 기재된 제제 (예를 들어, 수용액 중)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제 중 어느 하나는 수용액이며, 여기서 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘)은 수용액 중에 25 mM의 농도로 존재하고, 여기서 수크로스는 수용액 중에 10 w/v%의 농도로 존재하고, 여기서 수용액은 약 6.0 (예를 들어, 6.0, 5.9-6.1)의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 복수의 복합체, 히스티딘 및 수크로스를 포함하는 본원에 기재된 제제 (예를 들어, 수용액 중)로서, 여기서 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘)은 수용액 중에 25 mM의 농도로 존재하고, 수크로스는 수용액 중에 10 w/v%의 농도로 존재하고, pH는 약 6.0 (예를 들어, 6.0, 5.9-6.1)이고, 제제 중 복합체의 농도는 10-50 mg/ml 또는 20-35 mg/mL (예를 들어, 1-10 mg/mL, 10-15 mg/mL, 15-20 mg/mL, 20-22 mg/mL, 22-24 mg/ml, 24-26 mg/ml, 22-25 mg/mL, 25-27 mg/mL, 27-29 mg/mL, 29-31 mg/ml, 29-30 mg/mL, 30-31 mg/ml, 31-32 mg/ml, 25-30 mg/mL, 30-32 mg/mL, 32-35 mg/mL, 30-35 mg/mL, 35-40 mg/mL, 40-45 mg/mL, 45-50 mg/mL), 임의로 25 mg/mL 또는 30 mg/mL인 제제가 제공된다.
본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 수크로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 적어도 부분적으로 동결건조보호제로서의 역할을 한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 식물, 예를 들어 풀, 과실 또는 채소 (예를 들어, 뿌리 채소) 공급원 (예를 들어, 비트 (예를 들어, 사탕무, 예를 들어 사카룸 종(Saccharum spp.))), 사탕수수 (예를 들어, 베타 불가리스(Beta vulgaris)), 대추, 사탕 단풍나무, 단수수, 사과, 오렌지, 당근, 당밀, 단풍나무 시럽, 옥수수 감미제) 또는 동물 제품 (예를 들어, 꿀)으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 비트 또는 사탕수수 (예를 들어, 비트 수크로스, 사탕수수 수크로스)로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 수크로스 이외의 다른 동결건조보호제, 예를 들어 트레할로스, 만니톨, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐 피롤리돈이 사용될 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 붕괴 온도 조절제 (예를 들어, 덱스트란, 피콜 또는 젤라틴)가 제제 중에 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 어느 하나 또는 복수의 본원에 기재된 복합체는 히스티딘 및 수크로스와 함께 동결건조된 형태 (예를 들어, 동결건조된 분말)로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 형태 (예를 들어, 동결건조된 분말)는 본원에 기재된 수용액 중 어느 하나의 동결건조에 의해 수득된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제 (예를 들어, 수성 형태)의 수용액을 동결건조시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 생성물 (예를 들어, 본원에 기재된 동결건조 제제)이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 어느 하나 또는 복수의 복합체는 히스티딘 및 수크로스와 함께 동결된 형태 (예를 들어, 동결된 수성 고체)로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 동결된 형태 (예를 들어, 동결된 수성 고체)는 본원에 기재된 수용액 중 어느 하나의 동결에 의해 수득된다. 동결된 형태는 -20℃ 미만 (예를 들어, -20℃ 미만, -30℃ 미만, -40℃ 미만, -50℃ 미만, -60℃ 미만, -70℃ 미만, -80℃ 미만 또는 그 미만)의 온도로 동결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제 (예를 들어, 수성 형태)의 수용액을 동결시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 생성물 (예를 들어, 본원에 기재된 동결 제제)이 제공된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하 투여를 포함한다. 전형적으로, 투여 경로는 정맥내 또는 피하이다.
사용 / 치료 방법
본원에 기재된 바와 같은 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO))에 공유 연결된 항-TfR1 항체 (예를 들어, Fab)를 포함하는 복합체는 디스트로핀병증, 예를 들어 뒤시엔느 근육 이영양증을 갖는 대상체를 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 복합체는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 돌연변이된 DMD 대립유전자로부터 발현된 mRNA의 엑손 스킵핑을 용이하게 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 분자 페이로드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체, 비-인간 영장류 대상체, 설치류 대상체 또는 임의의 적합한 포유동물 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-인간 영장류 대상체는 시노몰구스 원숭이이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 2-60세 (예를 들어, 2-60, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-10세)인 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 5-30세 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30세)인 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 5-12세 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12세)인 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 4-16세 (예를 들어, 4-16, 5-16, 6-16, 7-16, 8-16, 9-16, 10-16, 11-16, 12-16, 13-16, 14-16, 15-16, 4-15, 5-15, 6-15, 7-15, 8-15, 9-15, 10-15, 11-15, 12-15, 13-15, 14-15, 4-14, 5-14, 6-14, 7-14, 8-14, 9-14, 10-14, 11-14, 12-14, 13-14, 4-13, 5-13, 6-13, 7-13, 8-13, 9-13, 10-13, 11-13, 12-13, 4-12, 5-12, 6-12, 7-12, 8-12, 9-12, 10-12, 11-12, 4-11, 5-11, 6-11, 7-11, 8-11, 9-16, 10-11, 4-10, 5-10, 6-10, 7-10, 8-10, 9-10, 4-9, 5-9, 6-9, 7-9, 8-9, 4-9, 5-9, 6-9, 7-9, 8-9, 4-8, 5-8, 6-8, 7-8, 4-7, 5-7, 6-7, 4-6, 5-6 또는 4-5세)인 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16세인 인간 대상체이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 뒤시엔느 근육 이영양증 또는 다른 디스트로핀병증을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 돌연변이된 DMD 대립유전자를 가지며, 이는 프레임시프트 돌연변이를 유발하고 부적절한 RNA 스플라이싱/프로세싱을 유도하는 DMD 엑손 내의 적어도 1개의 돌연변이를 임의로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 중증 디스트로핀병증의 증상, 예를 들어 근육 위축 또는 근육 손실을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 크레아틴 포스포키나제 (CK)의 혈청 농도의 무증상 증가 및/또는 (예를 들어, 및) 미오글로빈뇨를 동반한 근육 경련을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 진행성 근육 질환, 예컨대 뒤시엔느 또는 베커 근육 이영양증 또는 DMD-연관 확장성 심근병증 (DCM)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 디스트로핀병증의 증상을 앓고 있지 않다. 일부 실시양태에서, 대상체는 보행한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-보행한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 엑손 51 스킵핑이 적용가능한 DMD 유전자 내의 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 복합체는 엑손 51 스킵핑이 적용가능한 DMD 유전자 내의 돌연변이를 갖는 대상체를 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 복합체는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 돌연변이된 DMD 유전자 (예를 들어, 엑손 51 스킵핑이 적용가능한 돌연변이된 DMD 유전자)로부터 코딩되는 프리-mRNA에서와 같이, 프리-mRNA의 엑손 51의 스킵핑을 용이하게 하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시내용의 한 측면은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 복합체(들)를 포함하는 제제를 투여하는 것을 수반하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, PMO)에 공유 연결된 본원에 기재된 항체 (예를 들어, Fab)를 포함하는 복합체(들)를 포함하는 제약 조성물의 유효량이 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 전신으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 복합체(들)를 포함하는 제약 조성물은 정맥내 투여를 포함할 수 있는 적합한 경로에 의해, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내 또는 척수강내 경로에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 복합체(들)를 포함하는 제약 조성물은 주입 (예를 들어, 정맥내 주입)에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복수의 복합체를 포함하는 제약 조성물은 고체 형태, 수성 형태 또는 액체 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 수성 또는 액체 형태는 네뷸라이징되거나 동결건조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 형태는 수성 또는 액체 용액으로 재구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 뒤시엔느 근육 이영양증과 연관된 돌연변이된 DMD 대립유전자를 갖는 대상체에게, 본원에 기재된 복합체 또는 복수의 복합체를 유효량의 복합체(들)로 포함하는 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법 및/또는 그를 위한 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포를, 본원에 기재된 복수의 복합체를 유효량의 복합체(들)로 포함하는 제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 대상체에서 디스트로핀 단백질의 발현 또는 활성을 촉진하는 방법 및/또는 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 디스트로핀 단백질은 말단절단된 디스트로핀 단백질이다. 말단절단된 디스트로핀 단백질은 기능적이다 (예를 들어, 야생형 디스트로핀 단백질의 활성을 보유함). 일부 실시양태에서, 말단절단된 디스트로핀 단백질은 야생형 디스트로핀 단백질의 부분 기능을 보유한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 복수의 복합체를 포함하는 제제의 동결건조된 형태 (예를 들어, 동결건조된 분말)를 투여하는 것을 포함하며, 이는 제제의 동결건조된 형태를 수용액 중에 재구성하는 것 및 제제의 수용액을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복합체 또는 복수의 복합체를 포함하는 제제의 동결건조된 형태는 동결건조된 형태로 운송 및/또는 저장되고, 제제의 수용액을 투여하기 위한 장소 (예를 들어, 건강관리 제공자 장소)에서 재구성되고, 재구성된 형태로 (예를 들어, 수용액으로서) 주사에 의해 또는 정맥내로, 예를 들어 주입에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 엑손 51 스킵핑이 적용가능한 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 DMD 대립유전자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 DMD 대립유전자는 엑손 51 내의 프레임시프트 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 부위-특이적 또는 국부 전달 기술을 통해 투여된다. 이들 기술의 예는 복합체의 이식가능한 데포 공급원, 국부 전달 카테터, 부위 특이적 담체, 직접 주사 또는 직접 적용을 포함한다.
일부 실시양태에서, 분자 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO))에 공유 연결된 항-TfR1 항체 (예를 들어, Fab)를 포함하는 복합체를 포함하는 제약 조성물은 대상체에게 치료 효과를 부여하는 유효 농도로 투여된다. 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 질환의 중증도, 치료될 대상체의 고유한 특징, 예를 들어 연령, 신체 상태, 건강 또는 체중, 치료 지속기간, 임의의 공동 요법의 성질, 투여 경로 및 관련 인자에 따라 달라진다. 이들 관련 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 단지 상용에 지나지 않는 실험으로 다루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효 농도는 환자에게 안전한 것으로 간주되는 최대 용량이다. 일부 실시양태에서, 유효 농도는 최대 효능을 제공하는 최저 가능한 농도일 것이다.
경험적 고려사항, 예를 들어 대상체에서의 복합체(들)의 반감기는 일반적으로 치료에 사용되는 제약 조성물의 농도의 결정에 기여할 것이다. 투여 빈도는 치료 효능을 최대화하기 위해 실험적으로 결정되고 조정될 수 있다. 치료 효능은 임의의 적합한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 효능은 디스트로핀병증과 연관된 증상, 예를 들어 근육 위축 또는 근육 약화의 평가 또는 관찰에 의해, 대상체의 자기-보고된 결과, 예를 들어 이동성, 자기-관리, 통상의 활동, 통증/불편감 및 불안/우울증의 척도를 통해, 또는 삶의 질 지표, 예를 들어 수명에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 분자 페이로드에 공유 연결된 근육-표적화제를 포함하는 복합체를 포함하는 제약 조성물은 표적 유전자의 활성 또는 발현을, 대조군, 예를 들어 치료 전의 유전자 발현의 기준선 수준에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼 조정하는 데 충분한 유효 농도로 대상체에게 투여된다.
실시예
실시예 1. 뒤시엔느 근육 이영양증 환자 근관에서의 항-TfR1 접합체의 엑손-스킵핑 활성
본 연구는 DMD 엑손 51-스킵핑 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)에 발린-시트룰린 서열을 포함하는 링커를 통해 (리신 접합을 통해) 공유 연결된 표 2에 제시된 VH 및 VL 서열을 갖는 항-TfR1 Fab를 포함하는 항-TfR1 접합체의 엑손-스킵핑 활성을 평가하였다. DMD 엑손 51-스킵핑 ASO는 PMO이고, 서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 접합체는 하기의 구조를 포함한다:
Figure pct00034
여기서 R2는 표 2에 제시된 항-TfR1 Fab이고, 여기서 각각의 접합체에서 n1은 독립적으로 0 이상의 정수이다.
엑손 52 결실을 보유하는 불멸화된 인간 근모세포를 해동시키고, 프로모셀 골격 세포 성장 배지 (5% FBS 및 1x Pen-Strep 함유) 중에 넣어 1 x 106개 세포/플라스크의 밀도로 시딩하고, 전면생장률로 성장하도록 하였다. 전면생장되면, 세포를 트립신처리하고, 원심분리를 통해 펠릿화하고, 신선한 프로모셀 골격 세포 성장 배지 중에 재현탁시켰다. 세포 수를 계수하고, 세포를 매트리겔-코팅된 96-웰 플레이트에 50k개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 24시간 동안 회복되도록 하였다. 성장 배지를 흡인하고 혈청이 없는 분화 배지로 교체함으로써 세포가 분화되도록 유도하였다. 이어서, 세포를 10 μM 올리고뉴클레오티드의 농도의 DMD 엑손 51-스킵핑 올리고뉴클레오티드 (항체에 공유 연결되지 않음 - "네이키드")로 로 처리하거나 또는 최종 농도 10 μM 올리고뉴클레오티드 등가량의 접합체로 처리하였다. 세포를 시험 물품과 함께 10일 동안 인큐베이션한 다음, 96 웰 플레이트로부터 총 RNA를 수거하였다. 총 RNA 75 ng에 대해 cDNA 합성을 수행하고, 돌연변이 특이적 PCR을 수행하여 각각의 세포 유형에서 엑손 51 스킵핑의 정도를 평가하였다. 돌연변이-특이적 PCR 생성물을 4% 아가로스 겔 상에 전개시키고, SYBR 골드를 사용하여 가시화하였다. 밀도측정법을 사용하여 스킵핑된 앰플리콘 및 스킵핑되지 않은 앰플리콘의 상대량을 계산하고, 엑손 51 스킵핑된 앰플리콘을 존재하는 앰플리콘의 총량으로 나눈 비로서 엑손 스킵핑을 결정하였다:
Figure pct00035
결과는 환자 근관에서 접합체가 항체에 공유 연결되지 않은 동일한 DMD 엑손 51-스킵핑 올리고뉴클레오티드와 비교하여 증진된 엑손 스킵핑을 유발하였다는 것을 입증한다 (도 1). 이는 항-TfR1 Fab (예를 들어, 표 2에 제시된 바와 같은 서열을 가짐)가 접합체의 근육 세포 내로의 세포 내재화를 용이하게 하여 근육 세포에서 엑손 51-스킵핑 올리고뉴클레오티드의 활성을 유발하였다는 것을 나타낸다. 유사하게, 항-TfR1 항체는 다른 엑손 스킵핑 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 본원에 제공된 엑손 스킵핑 올리고뉴클레오티드, 예컨대 엑손 51 스킵핑 올리고뉴클레오티드)에 공유 연결된 항-TfR1 항체를 포함하는 접합체의 근육 세포 내로의 내재화를 용이하게 하고, 근육 세포에서 엑손 스킵핑 올리고뉴클레오티드의 활성을 용이하게 할 수 있다.
실시예 2. 시노몰구스 원숭이에서의 생체내 항-TfR1 Fab-ASO 접합체의 엑손 스킵핑 활성
실시예 1에 기재된 항-TfR1 올리고뉴클레오티드 접합체를 건강한 비-인간 영장류에서 생체내 그의 엑손 스킵핑 활성에 대해 시험하였다. 나이브 수컷 시노몰구스 원숭이 (군당 n= 4-5마리)에게 제1일 및 제8일에 2회 용량의 비히클, 30 mg/kg 네이키드 ASO (즉, 항체에 공유 연결되지 않음) 또는 DMD 엑손 51-스킵핑 올리고뉴클레오티드 (30 mg/kg ASO 등가량)에 공유 연결된 122 mg/kg 항-TfR1 Fab를 정맥내 주입을 통해 투여하였다. 동물을 희생시키고, 제1 용량이 투여된 지 2주 또는 4주 후에 조직을 수거하였다. 프로메가 맥스웰(Promega Maxwell)® RSC 기기를 사용하여 조직 샘플로부터 총 RNA를 수집하고, q스크립트 cDNA 슈퍼믹스를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 종점 PCR을 사용하여 엑손 51 스킵핑의 평가를 수행하였다.
PCR 생성물의 모세관 전기영동을 사용하여 엑손 스킵핑을 평가하고, % 엑손 51 스킵핑을 하기 식을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00036
계산된 엑손 51 스킵핑 결과가 표 4에 제시된다.
표 4. 시노몰구스 원숭이 DMD에서의 DMD의 엑손 51 스킵핑
aASO = 안티센스 올리고뉴클레오티드.
b접합체 용량은 항-TfR1 Fab-ASO 접합체의 mg/kg으로서 열거된다.
cASO 용량은 항-TfR1 Fab-ASO 용량의 mg/kg ASO 등가량으로서 열거된다.
d엑손 스킵핑 값은 괄호 안의 표준 편차를 갖는 평균 % 엑손 51 스킵핑 (n=5)이다.
ASO 서열에 대해 상보적인 프로브에 의한 혼성화 ELISA를 사용하여 조직 ASO 축적을 또한 정량화하였다. 표준 곡선을 생성하고, 표준 곡선의 선형 회귀로부터 ASO 수준 (ng/g)을 유도하였다. ASO는 비접합된 ASO (항체에 공유 연결되지 않음)의 투여와 비교하여 항-TfR1 Fab-ASO 접합체의 투여 후에 더 높은 수준으로, 평가된 모든 조직에 분포되었다. 비접합된 ASO의 정맥내 투여는 제1 용량이 투여된 지 2 및 4주 후에 평가된 모든 조직에서 배경 수준에 근접한 ASO의 수준을 유발하였다. 접합체의 투여는 제1 투여 2주 후에 심장>횡격막>이두근>사두근>비복근>전경골근의 순위 순서로, 평가된 조직에 걸친 ASO의 분포를 유발하였다. 조직 농도의 지속기간을 또한 평가하였다. ASO 수준은 모든 조직에서 투여 4주 후에 검출가능하였다 (표 5). 이는 표 2에 제시된 항-TfR1 Fab가 생체내에서 접합체의 근육 세포 내로의 세포 내재화를 가능하게 하여 근육 세포에서 엑손 스킵핑 올리고뉴클레오티드의 활성을 유발하였다는 것을 나타낸다.
표 5. 시노몰구스 원숭이에서의 DMD 엑손 51 스킵핑 ASO의 조직 분포
aASO = 안티센스 올리고뉴클레오티드.
b접합체 용량은 항-TfR1 Fab-ASO 접합체의 mg/kg으로서 열거된다.
cASO 용량은 항-TfR1 Fab-ASO 접합체 용량의 mg/kg ASO 또는 ASO 등가량으로서 열거된다.
dASO 값은 괄호 안의 표준 편차를 갖는 ng/g으로서의 조직 내 ASO의 평균 농도 (n=5)이다.
실시예 3. 상이한 예시적인 제제의 동결-해동 안정성 시험의 비교
하기 제제를 제조하였다. 제제는 DMD 엑손 51-스킵핑 ASO에 발린-시트룰린 서열을 포함하는 링커를 통해 (리신 접합을 통해) 공유 연결된 표 2에 제시된 VH/VL 서열을 갖는 항-TfR1 Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR1 Fab-ASO 접합체는 500 μL 충전 부피를 갖는 2 mL 유리 바이알에서 25 mg/ml의 농도였다. DMD 엑손 51-스킵핑 ASO는 PMO이고, 서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제제 1: 25 mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 6
제제 2: 25 mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 5.5
제제 3: 25 mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 6.5
제제 4: 25 mM 히스티딘, 10% 수크로스, 0.02% PS-80, pH 6
제제 5: 10 mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 6
제제 6: 50 mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 6
제제 7: 25 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6
제제 8: 25 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 7
제제를 -80℃에서 동결시키고 이어서 주위 온도 (예를 들어, 대략 20℃의 실온)에서 해동시키고 (5회 x F/T (동결/해동) 주기로), 분석 전에 2-8℃에서 3-4시간 동안 유지하였다.
제제 완충제를 제조하였다: 제제 약물 물질 (본원에 기재된 접합체를 갖는 제제)을 적절한 제제 완충제로 완충제-교환하였다. 사토리우스 비바스핀 필터를 사용하였다 (30kDa MWCO). 5회의 완충제 교환 후에, 항-TfR1 Fab-ASO를 25 mg/ml로 농축시켰다. 약물 생성물을 멸균 여과하고, 바이알 내로 로딩하였다 (700μL 충전물을 바이알에 사용함). 샘플 제제를 하기 시점에서 시각적으로 관찰하였다: T0 (제0주), T1 (제1주), T2 (제2주), T4 (제4주), T8 (제8주) 및 -20℃, 2-8℃, 25℃ 및 40℃의 온도.
시점 T0, T1, T2, T4 및 T8에서, 제제 1-6은 -20℃, 2-8℃, 25℃ 및 40℃를 포함한 모든 온도에서 투명하고 무색인 것으로 관찰되었다. 제제 7 및 8은 -20℃, 2-8℃, 25℃ 및 40℃를 포함한 모든 온도에서 유백광 및 입자로 침전을 나타내는 것으로 관찰되었다.
실시예 4. 예시적인 제제의 열 안정성의 분석
하기 제제를 제조하였다. 제제는 DMD 엑손 51-스킵핑 ASO (서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PMO)에 발린-시트룰린 서열을 포함하는 링커를 통해 (리신 접합을 통해) 공유 연결된 표 2에 제시된 VH/VL 서열을 갖는 표 2에 제시된 VH/VL 서열을 갖는 항-TfR1 Fab를 포함하며, 여기서 항-TfR1 Fab-ASO 접합체는 500 μL 충전 부피를 갖는 2 mL 유리 바이알에서 25 mg/ml의 농도였다. 이 제제 (제제 1)는 25 mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 6이었다.
제제 완충제를 제조하였다: 제제 약물 물질 (본원에 기재된 접합체를 갖는 제제)을 적절한 제제 완충제로 완충제-교환하였다. 사토리우스 비바스핀 필터를 사용하였다 (30kDa MWCO). 5회의 완충제 교환 후에, 항-TfR1 Fab-ASO를 25 mg/ml로 농축시켰다. 약물 생성물을 멸균 여과하고, 바이알 내로 로딩하였다 (700μL 충전물을 바이알에 사용함). 이어서, 상기 실시예 4에 기재된 제제 ("제제 1")의 열 안정성의 분석을 수행하였다. 이 분석은 T0 (제0주) 및 T8 (제8주)의 명시된 시점 및 명시된 온도에서의 항-TfR1 Fab-ASO 접합체의 접합체 농도를 보여준다. 도 2를 참조한다. 표준 BCA (비신코닌산) 분석을 사용하여 단백질 접합체 농도를 측정하였다. 표준 절차를 사용하여 BCA 검정을 수행하였다:
1) 작업 시약 (WR)을 제조한다. 마이크로플레이트 절차에서 각각의 샘플에 대해 100uL의 WR이 요구된다. 50:1 (BCA 시약 A: BCA 시약 B)을 철저히 혼합하여 WR을 제조한다. 전체 96 웰 플레이트에 10mL의 WR 시약이 필요하다. 따라서, 10mL의 시약 A를 200μL의 시약 B와 합하고, 완충제가 RT에 있고 혼합 90분 내에 사용되도록 보장한다. 새로 제조된 작업 용액을 사용하는 것이 권장된다.
2) 미지의 샘플에 대한 표준 곡선 및 희석 곡선을 작성한다. 10μL의 표준물 또는 미지의 샘플을 200μL의 WR에 첨가하고, 60℃에서 10분 동안 인큐베이션한다. 이를 플레이트의 제1 행에 첨가하고, 후속 열에서 100μL:100μL로 연속 희석한다, 96-웰 투명 플레이트: 표준물: 공지된 Fab: 15G11 (11mg/mL). 각각의 포인트에 대해 1:1 희석을 수행함으로써 8-포인트 표준 곡선 및 미지의 샘플 희석 곡선을 작성한다.
3) 5분 동안 인큐베이션한다.
4) 플레이트 판독기 상에서 480nM에서의 흡광도를 측정한다.
5) 표준 곡선을 사용하여 각각의 미지의 샘플의 단백질 농도를 결정한다 (6개의 희석물을 측정함).
제제 1에서, 상이한 용기 ("바이알"로 지칭되는 600 μL 충전 부피를 갖는 2 mL 유리 바이알; "플렉스"로 지칭되는 1 mL 충전 부피를 갖는 플라스틱 플렉스보이 백)에서 접합체 농도의 약간의 감소가 관찰되었으며, 이는 명시된 온도에서 및 명시된 용기에서 이 제제의 전체 안정성을 나타낸다. 제0주 (T0)에서 제8주 (T8)의 시점까지 온도 -20℃ 및 2-8℃에서 유리 바이알과 비교하여 플라스틱 플렉스보이 백 내의 제제에 대해 더 적은 접합체 농도 감소가 관찰되었다. 그러나, 시점 8 (T8)에서 40℃에서 유리 바이알 내의 제제 1의 경우 접합체 농도의 감소가 관찰되지 않았다.
실시예 5. 용기 유형에 대한 물질 부착의 분석
DMD 엑손 51-스킵핑 ASO (서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PMO)에 발린-시트룰린 서열을 포함하는 링커를 통해 (리신 접합을 통해) 공유 연결된 표 2에 제시된 VH/VL 서열을 갖는 예시적인 항-TfR1 Fab를 포함하는 제제의 다양한 플라스틱에 대한 가능한 부착을 평가하기 위해 부착을 통한 물질 손실을 분석하는 연구를 수행하였다. 실시예 3에 기재된 제제 1 (25mM 히스티딘, 10% 수크로스 완충제 (pH 6))로 제제화된 이 TfR1 Fab-ASO 접합체는 보다 적은 물질 손실을 나타냈다. 연구를 하기와 같이 수행하였다: 25 mg/mL에서 실시예 3의 이전 연구를 반복하고; 제제를 플라스틱에 첨가하고, 1회의 동결/해동 (F/T) 주기 (-80℃에서 밤새 동결, 2-8℃에서 4시간 동안 해동)를 수행하고; 육안검사, BCA, SEC-HPLC (SEC)를 포함한 표준 시험에 의해 분석하였다. 논의된 바와 같이 -80℃에서 1회의 동결-해동 주기 후에, 제제 1 중 접합체의 농도를 측정하였다. 표준 BCA (비신코닌산) 분석을 사용하여 실시예 4에 개시된 바와 같이 단백질 접합체 농도를 측정하였다.
SEC-HPLC 분석 방법은 하기와 같았다:
● HPLC 시스템 써모 얼티메이트-3000 UHPLC 시스템
● 샘플 농도: 1 mg/mL (HPLC-등급 물로 희석됨); 주입 부피: 10 μL
● 완충제: 100 mM 인산나트륨, 100 mM NaCl, 15% 아세토니트릴, pH 7.0
● 실행: 등용매, 0.25 mL/분, 20분
● 칼럼 오븐 온도: 주위. 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC 단백질 BEH SEC 칼럼 200Å, 1.7 μm, 4.6 x 300 mm (P/N: 186005226)
● 파장: 280 nm 및 260 nm 샘플을 이중으로 주입하고, 평균 값을 보고함.
접합체의 25 mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 6.0 제제를 사용한 상이한 플라스틱 용기 유형 (에틸렌 비닐 아세테이트 플라스틱 (EVA), 폴리카르보네이트 플라스틱 (PC), 고밀도 폴리에틸렌 플라스틱 (HDPE))에 대한 강한 안정성 및 표면 부착의 결여가 도 3 및 4에서 집합적으로 입증된다. 도 3 및 4는 유리 용기에 대한 제제 1 중 접합체의 보다 낮은 농도와 비교하여, 플라스틱 용기 유형에 대한 접합체의 보다 높은 농도에 의해 입증된, 우수한 안정성 및 표면 부착의 결여를 보여준다. 도 4는 SEC 분석을 통해, 10 mg/ml 유리 표준물을 갖는 샘플 (~10 mg/mL인 FDC 접합체를 유리에 저장하고, 1회의 동결 해동 주기에 적용함 (운송으로부터 동결시키고, 2-8℃에서 유지함)) 및 유리 또는 명시된 플라스틱 내의 25 mg/ml 샘플 (25 mg/mL 접합체를 스핀 필터에서 농축시킨 다음, 나타낸 플라스틱 또는 유리에 첨가하고, 1회의 F/T 주기에 적용함)을 포함한 모든 샘플에 걸쳐 HPLC 피크의 조성에 있어서 유의한 변화가 없었다는 것을 보여준다.
도 4의 결과는 제제 1의 우수한 안정성을 나타낸다.
추가의 실시양태
1. 항-트랜스페린 수용체 1 (TfR1) 항체에 공유 연결된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하는 복합체를 포함하는 제제로서, 여기서 항체는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하고, 여기서 복합체는 히스티딘 및 수크로스와 함께 제제화된 것인 제제.
2. 화학식: [R1]n1-R2의 복합체를 포함하는 제제로서, 여기서
각각의 R1은 독립적으로 하기 화학식의 기를 포함하고:
Figure pct00039
R2는 항체를 포함하고,
R3은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)이고;
여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고;
여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 항체의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이고;
여기서 복합체는 히스티딘 및 수크로스와 함께 제제화되고,
임의로 여기서 항체는 항-TfR1 항체이고, 임의로 여기서 제제 중 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5의 범위인 제제.
3. 실시양태 2에 있어서, 항체가
서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)
을 포함하는 것인 제제.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 동결건조된 형태인 제제.
5. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 수용액인 제제.
6. 실시양태 5에 있어서, 히스티딘이 수용액 중에 10 mM 내지 50 mM 범위의 농도로 존재하는 것인 제제.
7. 실시양태 5 또는 6에 있어서, 수크로스가 수용액 중에 부피당 5 중량% 내지 15 중량% (w/v%) 범위의 농도로 존재하는 것인 제제.
8. 실시양태 5 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 수용액이 5.0 내지 7.0 범위의 pH를 갖는 것인 제제.
9. 실시양태 5-8 중 어느 하나에 있어서, 히스티딘이 수용액 중에 25 mM의 농도로 존재하고/거나, 수크로스가 수용액 중에 10 w/v%의 농도로 존재하고/거나, 수용액이 pH 6.0인 제제.
10. 실시양태 1-9 중 어느 하나에 있어서, 항체가 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv인 제제.
11. 실시양태 10에 있어서, 항체가 Fab 단편인 제제.
12. 실시양태 1-11 중 어느 하나에 있어서, 항체가 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나; 항체가 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 임의로 여기서 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 제제.
13. 실시양태 1-12 중 어느 하나에 있어서, 항체가 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나; 항체가 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 임의로 여기서 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 제제.
14. 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, PMO가 15-35개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 제제.
15. 실시양태 1-14 중 어느 하나에 있어서, PMO가 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24 또는 서열식별번호: 22에 대해 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드 길이의 상보성 영역을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 제제.
16. 실시양태 1-15 중 어느 하나에 있어서, PMO가 서열식별번호: 21에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 임의로 여기서 PMO는 서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 제제.
17. 실시양태 2-16 중 어느 하나에 있어서, 각각의 R1이 하기 화학식을 포함하고:
Figure pct00040
여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고, R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 핵염기 서열을 갖는 것인 제제.
18. 실시양태 2-16 중 어느 하나에 있어서, 각각의 R1이 하기 화학식을 포함하는 것인 제제.
Figure pct00041
19. 실시양태 1-18 중 어느 하나에 있어서, 복합체가 제제 중에 10 mg/mL 내지 50 mg/mL 범위의 농도로 존재하는 것인 제제.
20. 대상체에서 디스트로핀 단백질의 발현 또는 활성을 촉진하는 방법으로서, 대상체에게 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나의 제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
21. 실시양태 20에 있어서, 디스트로핀 단백질이 말단절단된 디스트로핀 단백질인 방법.
22. 뒤시엔느 근육 이영양증과 연관된 돌연변이된 DMD 대립유전자를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 실시양태 1-19 중 어느 하나의 제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
23. 실시양태 22에 있어서, 돌연변이된 DMD 대립유전자가 엑손 51 스킵핑이 적용가능한 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
24. 실시양태 22 또는 실시양태 23에 있어서, 돌연변이된 DMD 대립유전자가 엑손 51 내의 프레임시프트 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
25. 화학식 [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체로서, 여기서
각각의 R1은 하기 화학식의 기를 포함하고:
Figure pct00042
여기서 R2는 Fab를 포함하고, 여기서 Fab는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 임의로 여기서 Fab는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 추가로 임의로 여기서 Fab는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고, 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, 올리고뉴클레오티드 PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 핵염기 서열을 갖고; 여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신인 복합체.
26. 화학식 [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체로서, 여기서
R1은 하기 화학식의 기를 포함하고:
Figure pct00043
여기서 R2는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 Fab를 포함하고, 임의로 여기서 R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 Fab를 포함하고, 추가로 임의로 여기서 R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab를 포함하고; 여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신인 복합체.
27. 실시양태 25 또는 실시양태 26의 복수의 복합체 및 25 mM 농도의 히스티딘 및 10 w/v% 농도의 수크로스를 포함하는 제제로서, 수용액이고, pH 6.0인 제제.
28. 실시양태 27의 제제의 동결건조된 형태.
29. 실시양태 27의 제제를 동결건조시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 생성물.
30. 실시양태 27의 제제의 동결된 형태.
31. 실시양태 27의 제제를 동결시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 생성물.
등가물 및 용어
본원에 예시적으로 기재된 본 개시내용은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원의 각각의 경우에서, 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진" 및 "로 이루어진" 중 임의의 용어는 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되었으며, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 제시 및 기재된 특색 또는 그의 부분의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 본 개시내용의 범주 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 개시내용이 바람직한 실시양태에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 임의적인 특색, 변형 및 변경이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경이 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 간주된다고 이해될 것이다.
추가로, 본 개시내용의 특색 또는 측면이 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 군의 면에서 기재되는 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 또한 마쿠쉬 군 또는 다른 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 면에서 기재된다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 서열 목록에 제시된 서열은 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산의 구조를 기재하는 데 언급될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 이러한 실시양태에서, 실제 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산은 명시된 서열과 본질적으로 동일하거나 유사한 상보적 특성을 보유하면서 명시된 서열과 비교하여 1개 이상의 대안적 뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 뉴클레오티드의 RNA 대응부 또는 RNA 뉴클레오티드의 DNA 대응부) 및/또는 (예를 들어, 및) 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 (예를 들어, 및) 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결 및/또는 (예를 들어, 및) 1개 이상의 다른 변형을 가질 수 있다.
본 발명을 기재하는 문맥에서 (특히 하기 청구범위의 문맥에서) 단수 용어 및 유사한 지시대상의 사용은 본원에 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석될 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함한" 및 "함유하는"은 달리 나타내지 않는 한 개방형 용어 (즉, "포함하나 이에 제한되지는 않음"을 의미함)로서 해석될 것이다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은 본원에 달리 나타내지 않는 한, 단지 상기 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 제공되는 것으로 의도되고, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 열거된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 어휘 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하는 것으로 의도되며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 제한을 부과하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 어휘도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것임을 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시양태가 본원에 기재된다. 이들 실시양태의 변경은 상기 설명을 읽으면 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명해질 수 있다.
본 발명자들은 통상의 기술자가 이러한 변경을 적절하게 사용할 것으로 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 달리 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같은 본원에 첨부된 청구범위에 언급된 대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변경에서 상기 기재된 요소들의 임의의 조합은 본원에 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한 본 발명에 의해 포괄된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 상용에 지나지 않는 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (27)

  1. 항-트랜스페린 수용체 1 (TfR1) 항체에 공유 연결된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하는 복합체를 포함하는 제제로서, 여기서 항체는 서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하고, 여기서 복합체는 히스티딘 및 수크로스와 함께 제제화된 것인 제제.
  2. 화학식: [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체를 포함하는 제제로서, 여기서
    각각의 R1은 독립적으로 화학식 (Ia)의 기를 포함하고:
    Figure pct00044

    여기서
    R2는 항체를 포함하고,
    R3은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하고;
    여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고;
    여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 항체의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신이고;
    여기서 복합체는 히스티딘 및 수크로스와 함께 제제화되고,
    임의로 여기서 항체는 항-TfR1 항체이고, 임의로 여기서 제제 중 복합체의 n1의 평균 값은 1 내지 5의 범위인 제제.
  3. 제2항에 있어서, 항체가
    서열식별번호: 1, 7 또는 12에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), 서열식별번호: 2, 8 또는 13에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2), 서열식별번호: 3, 9 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3), 서열식별번호: 4, 10 또는 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 5 또는 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) 및 서열식별번호: 6 또는 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)
    을 포함하는 것인 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 형태, 수용액 또는 동결된 고체 형태인 제제.
  5. 제4항에 있어서, 제제가 수용액이고, 히스티딘이 수용액 중에 10 mM 내지 50 mM 범위의 농도로 존재하는 것인 제제.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 제제가 수용액이고, 수크로스가 수용액 중에 부피당 5 중량% 내지 15 중량% (w/v%) 범위의 농도로 존재하는 것인 제제.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 수용액이고, 수용액이 5.0 내지 7.0 범위의 pH를 갖는 것인 제제.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 수용액이고, 히스티딘이 수용액 중에 25 mM의 농도로 존재하고/거나, 수크로스가 수용액 중에 10 w/v%의 농도로 존재하고/거나, 수용액이 pH 6.0인 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 Fab 단편, 전장 IgG, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 또는 Fv인 제제.
  10. 제9항에 있어서, 항체가 Fab 단편인 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 17에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고/거나; 항체가 서열식별번호: 18에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 임의로 여기서 항체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 19에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고/거나; 항체가 서열식별번호: 20에 대해 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 임의로 여기서 항체는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, PMO가 15-35개의 뉴클레오티드 길이의 핵염기 서열을 포함하는 것인 제제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, PMO가 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24 또는 서열식별번호: 22에 대해 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드 길이의 상보성 영역을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 제제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, PMO가 서열식별번호: 21에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 적어도 8개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며, 임의로 여기서 PMO는 서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 제제.
  16. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1이 화학식 (Ib)의 기를 포함하고:
    Figure pct00045

    여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고, 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 핵염기 서열을 갖고, 여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결된 것인 제제.
  17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1이 화학식 (Ic)의 기를 포함하는 것인 제제.
    Figure pct00046
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 제제 중에 10 mg/mL 내지 50 mg/mL 범위의 농도로 존재하는 것인 제제.
  19. 대상체에서 디스트로핀 단백질의 발현 또는 활성을 촉진하는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 디스트로핀 단백질이 말단절단된 디스트로핀 단백질인 방법.
  21. 뒤시엔느 근육 이영양증과 연관된 돌연변이된 DMD 대립유전자를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 돌연변이된 DMD 대립유전자가 엑손 51 스킵핑이 적용가능한 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 돌연변이된 DMD 대립유전자가 엑손 51 내의 프레임시프트 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  24. 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체로서, 여기서
    각각의 R1은 화학식 (Ia)의 기를 포함하고:
    Figure pct00047

    여기서 R3은 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함하고;
    여기서 R2는 Fab를 포함하고, 여기서 Fab는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고,
    임의로 여기서 Fab는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
    추가로 임의로 여기서 Fab는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고,
    여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 독립적으로 각각의 복합체에서 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신인 복합체.
  25. 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체로서, 여기서
    각각의 R1은 화학식 (Ib)의 기를 포함하고:
    Figure pct00048

    여기서 R2는 Fab를 포함하고, 여기서 Fab는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고,
    임의로 여기서 Fab는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
    추가로 임의로 여기서 Fab는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고,
    여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고, 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, 올리고뉴클레오티드 PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 핵염기 서열을 갖고;
    여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신인 복합체.
  26. 화학식 (I): [R1]n1-R2의 구조를 포함하는 복합체로서, 여기서
    각각의 R1은 화학식 (Ic)의 기를 포함하고:
    Figure pct00049

    여기서 R2는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 Fab를 포함하고,
    임의로 여기서 R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 Fab를 포함하고,
    추가로 임의로 여기서 R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab를 포함하고; 여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신인 복합체.
  27. 화학식 (Id)의 구조를 포함하는 복합체로서,
    Figure pct00050

    여기서 R2는 표 2로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 Fab를 포함하고,
    임의로 여기서 R2는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 Fab를 포함하고,
    추가로 임의로 여기서 R2는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab를 포함하고;
    여기서 -pN은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 염기 위치를 나타내고; 여기서 -p는 포스포로디아미데이트 연결을 반영하고, N은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)의 핵염기에 상응하여, PMO는 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG (서열식별번호: 21)의 염기 서열을 포함하고;
    여기서 R1은 부착 지점 A에서 R2에 공유 연결되고; 여기서 n1은 R1의 경우의 개수를 나타내는 1 이상의 정수이고, 여기서 각각의 경우의 R1은 Fab의 상이한 아미노산 잔기에 공유 연결되고, 임의로 여기서 각각의 상이한 아미노산 잔기는 리신인 복합체.
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