BR112015029009B1

BR112015029009B1 - Anticorpos, formulação farmacêutica e usos de um anticorpo

Info

Publication number: BR112015029009B1
Application number: BR112015029009-4A
Authority: BR
Inventors: Yin Zhang; Joy Yu Zuchero; Jasvinder Atwal; Jessica Couch; Mark Dennis; James Ernst; Ryan Watts; Gregory A. Lazar
Original assignee: Genentech, Inc
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2014-05-20
Publication date: 2024-03-26

Abstract

ANTICORPOS, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ANTICORPO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USOS DE UM ANTICORPO. A presente invenção refere-se a anticorpos receptores de antitransferrina e métodos de sua utilização.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos receptores de antitransferrina e métodos de sua utilização.

PEDIDOS RELACIONADOS

[002] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/825.477, depositado em 20 de maio de 2013, que é integralmente incorporado ao presente como referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] Uma listagem de sequências é apresentada simultaneamente com o relatório descritivo na forma de arquivo de texto formatado ASCII por meio de EFS-Web, com nome de arquivo “P5641R1- WO_SL.txt”, com data de criação de 16 de maio de 2014 e tamanho de 154.599 bytes. A listagem de sequências depositada via EFS-Web é parte do relatório descritivo e integralmente incorporada como referência ao presente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A penetração no cérebro de drogas de moléculas grandes é severamente limitada pela barreira entre o sangue e o cérebro (BBB), que é, em grande parte, impermeável. Dentre as muitas estratégias para superar este obstáculo, encontra-se a utilização de processos de tráfego transcitose de receptores endógenos expressos no endotélio capilar cerebral. Proteínas recombinantes tais como anticorpos monoclonais foram projetadas contra esses receptores para permitir o fornecimento mediado por receptor de moléculas grandes para o cérebro. Estratégias para maximizar a absorção cerebral, minimizando ao mesmo tempo a transcitose reversa de volta para o sangue, e também para maximizar a extensão do acúmulo após a abordagem de dosagem terapêutica com a descoberta de que anticorpos com baixa afinidade para receptores de BBB oferecem potencial de aumento substancial do transporte de BBB e retenção no SNC de moléculas/porções terapêuticas associadas com relação a anticorpos com alta afinidade típicos para esses receptores (Atwal et al, Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al, Sci. Transl. Med., 25 de maio de 2011: Vol. 3, Ed. 84, pág. 84ra44). Estes anticorpos não se ligam especificamente, entretanto, a TfR humano e de primatas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] Anticorpos monoclonais possuem vasto potencial terapêutico para o tratamento de doenças neurológicas ou do sistema nervoso central (SNC), mas sua passagem para o cérebro é restrita pela barreira entre o sangue e o cérebro (BBB). Estudos anteriores demonstraram que um percentual muito pequeno (cerca de 0,1%) de IgG em circulação no fluxo sanguíneo cruza a BBB para o SNC (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164 (1974)), em que a concentração do anticorpo no SNC pode ser insuficiente para permitir efeito robusto. Descobriu-se anteriormente que o percentual do anticorpo que é distribuído para o SNC poderá ser aprimorado por meio da exploração de receptores de BBB (ou seja, receptor de transferrina, receptor de insulina e similares) (vide, por exemplo, WO 9502421). O anticorpo antirreceptor de BBB, por exemplo, pode tornar-se multiespecífico para dirigir- se a um ou mais antígenos desejados no SNC ou uma ou mais moléculas heterólogas podem ser acopladas ao anticorpo antirreceptor de BBB; em qualquer dos casos, o anticorpo antirreceptor de BBB pode auxiliar no fornecimento de molécula terapêutica para o SNC através da BBB.

[006] Dirigir-se a um receptor de BBB com um anticorpo de alta afinidade específico tradicional geralmente resultou em aumento limitado do transporte de BBB. Os Depositantes descobriram posteriormente que a magnitude de absorção de anticorpo e sua distribuição no SNC é inversamente relacionada à sua afinidade de ligação para o receptor de BBB entre os anticorpos anti-BBB estudados. Anticorpo de baixa afinidade para receptor de transferrina (TfR) dosado em níveis de dosagem terapêutica, por exemplo, aumenta muito o transporte no BBB e a retenção no SNC do anticorpo anti-TfR com relação a um anticorpo anti-TfR com afinidade mais alta e possibilita atingir concentrações terapêuticas no SNC mais facilmente (Atwal et al, Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011)). Prova desse transporte de BBB foi atingida utilizando um anticorpo biespecífico que liga TfR e a a enzima divisora da proteína precursora de amiloide (APP), β-secretase (BACE1). Uma dose sistêmica isolada do anticorpo anti-TfR/BACE1 biespecífico elaborado utilizando a metodologia de acordo com a presente invenção não apenas resultou em absorção significativa do anticorpo no cérebro, mas também reduziu dramaticamente os níveis de Aβ1-40 no cérebro em comparação com anti-BACE1 monoespecífico isoladamente, o que sugere que a penetração de BBB afeta a potência de anti-BACE1 (Atwal et al, Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al, Sci. Transl. Med. 3, 84ra44 (2011)).

[007] Estes dados e experimentos ressaltaram diversos mecanismos causadores por trás do aumento da absorção de anticorpos no SNC utilizando uma abordagem de anticorpo com afinidade mais baixa. Em primeiro lugar, anticorpos antirreceptores de BBB (BBB-R) com alta afinidade (por exemplo, anti-TfRA de Atwal et al e Yu et al, acima) limitam a absorção cerebral por meio de rápida saturação do BBB-R na vasculatura cerebral, de forma a reduzir a quantidade total de anticorpo absorvida no cérebro e também restringir a sua distribuição para a vasculatura. Surpreendentemente, a redução da afinidade para o BBB-R aumenta a absorção e a distribuição cerebral, com alteração robusta observada na localização da vasculatura para neurônios e distribuição associada de neurópilos no SNC. Em segundo lugar, propõe-se a afinidade mais baixa do anticorpo para o BBB-R para eliminar a capacidade do anticorpo de retornar para o lado vascular do BBB por meio do BBB-R a partir do lado do SNC da membrana porque a afinidade geral do anticorpo para o BBB-R é baixa e a concentração local do anticorpo no lado do SNC do BBB não é saturadora devido à rápida dispersão do anticorpo para o compartimento do SNC. Em terceiro lugar, in vivo e conforme observado para o sistema TfR, anticorpos com menos afinidade para o BBB-R não são liberados do sistema com a mesma eficiência daqueles com maior afinidade para o BBB-R e, portanto, permanecem em concentrações em circulação mais alta que os seus parceiros com afinidade mais alta. Isso é vantajoso, pois os níveis de anticorpos em circulação do anticorpo com afinidade mais baixa são mantidos em níveis terapêuticos por período de tempo mais longo que o anticorpo com afinidade mais alta, o que consequentemente aumenta a absorção de anticorpo no cérebro por um período de tempo mais longo. Além disso, esse aumento da exposição ao plasma e ao cérebro pode reduzir a frequência de dosagem na clínica, o que teria benefício potencial não apenas para a aceitação e conveniência do paciente, mas também na redução de potenciais efeitos colaterais ou efeitos indesejados do anticorpo e/ou de um composto terapêutico a ele acoplado.

[008] Os anticorpos BBB-R com baixa afinidade descritos no trabalho indicado acima foram selecionados/elaborados para evitar interferência com a ligação natural entre transferrina e o TfR, de forma a evitar potenciais efeitos colaterais relativos ao transporte de ferro. Entretanto, mediante administração de alguns desses anticorpos em camundongos, foram observados alguns efeitos colaterais consideráveis. Os camundongos exibiram reação primária de forte esgotamento das populações de reticulócitos, acompanhado por sintomas clínicos agudos rapidamente estabelecidos. Embora os camundongos se recuperassem devidamente dos sintomas clínicos agudos e dos níveis reduzidos de reticulócitos, é claramente desejável eliminar ou reduzir de outra forma esse impacto sobre a reticulose para que um anticorpo anti-TfR possa ser utilizado com segurança como molécula terapêutica. Descobriu-se que a reação primária à administração de anti-TfR (forte esgotamento de reticulócitos e sinais clínicos agudos) é dirigida, em grande parte, pela atividade de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) do anticorpo, enquanto o efeito de esgotamento de reticulócitos residuais é mediado pelo processo complementar.

[009] Estes estudos anteriores utilizaram anticorpos de camundongos que se ligaram especificamente a TfR de camundongo, mas que não reconheceram especificamente TfR humano ou de primatas. Consequentemente, a presente invenção fornece anticorpos e suas partes funcionais, que reconhecem especificamente TfR humano e de primatas, a fim de possibilitar estudos de eficácia e segurança em primatas com os anticorpos antes do uso terapêutico ou em diagnóstico em seres humanos. Estudos in vitro utilizando uma linhagem de células de eritroblastas humanos e células de medula óssea primária tratadas com os anticorpos anti-TfR humanos de acordo com a presente invenção demonstraram que pode também ser observado forte esgotamento de células eritroides positivas para TfR em sistemas celulares de primatas/humanos bem como em camundongos (vide, por exemplo, o Exemplo 4). Consequentemente, são também fornecidas no presente modificações dos anticorpos de acordo com a presente invenção para reduzir em grande parte ou eliminar a redução indesejada da população de reticulócitos que expressam TfR mediante administração de anti-TfR, permitindo ainda ao mesmo tempo aumento do transporte de BBB, aumento da distribuição no SNC e da retenção no SNC fornecido pelos anticorpos anti-TfR humanos/de primatas administrados sob concentrações terapêuticas. São fornecidas no presente diversas abordagens gerais para reduzir o efeito observado dos anticorpos anti- TfR de acordo com a presente invenção sobre o esgotamento de reticulócitos primários e residuais, que podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação.

[0010] Em uma abordagem, a função efetora do anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus é reduzida ou eliminada, a fim de reduzir ou eliminar a atividade de ADCC. Em outra abordagem, a afinidade do anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus para TfR humano ou de primatas é adicionalmente reduzida, de forma que as interações do anticorpo com a população de reticulócitos sejam menos prejudiciais para a população. Uma terceira abordagem refere-se à redução da quantidade de anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus que está presente no plasma para reduzir a exposição da população de reticulócitos a concentrações potencialmente prejudiciais do anticorpo. Uma quarta abordagem busca proteger, estabilizar e/ou reabastecer populações de reticulócitos, de forma a evitar, reduzir ou mitigar qualquer potencial esgotamento da população de reticulócitos em circulação ou na medula óssea por meio de administração do anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus.

[0011] A eliminação ou redução da função efetora, conforme descrito no presente, pode ser atingida por meio de: (i) redução ou eliminação da glicosilação de mamíferos do tipo selvagem do anticorpo (por exemplo, por meio da produção do anticorpo em um ambiente no qual essa glicosilação não pode ocorrer, por meio de mutação de um ou mais pontos de ligação de carboidratos, de tal forma que o anticorpo não possa ser glicosilado, ou por meio de remoção química ou enzimática de um ou mais carboidratos do anticorpo após a sua glicosilação); (ii) por meio de redução ou eliminação da capacidade de ligação do receptor de Fc do anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus (por exemplo, por meio de mutação da região Fc, por meio de esgotamento na região Fc ou eliminação da região Fc); ou (iii) por meio da utilização de um isótipo de anticorpo que se sabe possuir função efetora mínima ou nenhuma (ou seja, incluindo, mas sem limitações, IgG4).

[0012] A redução da ativação de complemento de anticorpos, conforme descrito no presente, pode ser realizada por meio de redução ou eliminação da capacidade de ligação de C1q do anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus (por exemplo, por meio de mutação, deleção ou eliminação da região Fc ou por meio de modificação da porção não-Fc do anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus), ou por meio da supressão de outra forma da ativação ou da atividade do sistema de complemento (por exemplo, por meio da coadministração de um ou mais inibidores da atividade de processo de complemento ou ativação de processo de complemento).

[0013] Quando a ligação de anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus a TfR humano ou de cynomolgus sobre reticulócitos ou outros tipos celulares que expressam altos níveis de TfR aciona o seu esgotamento, bem como com os anticorpos anti-TfR humanos/de cynomolgus exemplificados no presente, a redução da ligação dos anticorpos ao TfR humano ou de cynomolgus sobre os reticulócitos ou outros tipos de células deverá, por sua vez, reduzir a quantidade de esgotamento de reticulócitos ou outros tipos celulares em circulação ou na medula óssea observada mediante administração de anticorpos. A afinidade do anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus para TfR humano ou de primatas pode ser modificada utilizando qualquer um dos métodos descritos no presente e conforme exibido nos Exemplos.

[0014] A redução da quantidade de anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus presente no plasma para reduzir a exposição da população de reticulócitos a concentrações potencialmente prejudiciais do anticorpo pode ser realizada de diversas formas. Um método é simplesmente reduzir a quantidade do anticorpo que é dosado, potencialmente também aumentando ao mesmo tempo a frequência de dosagem, de tal forma que a concentração máxima no plasma seja reduzida, mas nível em soro suficiente seja mantido para eficácia, embora ainda abaixo do limite do efeito colateral de esgotamento celular. Outro método, que pode ser combinado com modificações de dosagem, é a seleção ou elaboração de um anticorpo anti-TfR que possui ligação sensível ao pH a TfR, de forma que se ligue a TfR da superfície celular no plasma sob pH 7,4 com afinidade desejavelmente baixa conforme descrito no presente, mas mediante internalização em um compartimento endossomal, em que essa ligação a TfR é rápida e significativamente reduzida sob o pH relativamente mais baixo daquele compartimento (pH 5,5-6,0). Essa dissociação pode proteger o anticorpo contra liberação mediada por antígenos ou aumentar a quantidade de anticorpo que é fornecida para o SNC ou reciclada de volta através da BBB; em qualquer dos casos, a concentração efetiva do anticorpo aumenta com relação a um anticorpo anti-TfR que não compreende essa sensibilidade a pH, sem aumentar a dose administrada do anticorpo e, por sua vez, permitindo potencialmente uma dose mais baixa do anticorpo com risco simultaneamente menor de efeitos colaterais.

[0015] Pode-se realizar proteção, estabilização e/ou reabastecimento de populações de reticulócitos utilizando métodos físicos ou farmacêuticos. Além do anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus, pode ser coadministrado (simultânea ou sequencialmente) pelo menos um agente terapêutico adicional que reduz os efeitos colaterais negativos do anticorpo sobre as populações de reticulócitos. Exemplos desses agentes terapêuticos incluem, mas sem limitações, eritropoietina (EPO), suplementos de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12. A substituição física de glóbulos vermelhos do sangue (ou seja, reticulócitos) também é possível, por exemplo, por meio de transfusão com células similares, que podem ser de outro indivíduo com tipo sanguíneo similar ou podem haver sido extraídos anteriormente do paciente a quem é administrado o anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus.

[0016] Os técnicos comuns no assunto apreciarão que qualquer combinação dos métodos acima pode ser empregada para elaborar um anticorpo (e/ou regime de dosagem para ele) com o equilíbrio ideal entre (i) a afinidade desejavelmente baixa para TfR de primata ou humano que maximizará o transporte do anticorpo e quaisquer compostos conjugados para o SNC; (ii) a afinidade do composto conjugado (incluindo, como exemplo não limitador, especificidade de ligação a um segundo antígeno ou adicional no anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus) para o seu antígeno de SNC, pois isso é relevante para a quantidade do composto que necessita estar presente no SNC para apresentar efeito terapêutico; (iii) a velocidade de liberação do anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus; (iv) a instabilidade do composto conjugado/anti-TfR sob baixo pH para facilitar a liberação do composto conjugado sobre o lado do cérebro/SNC do BBB; e (v) o impacto sobre populações de reticulócitos.

[0017] Também se apreciará que o efeito de esgotamento de reticulócitos reconhecido no presente da administração de anticorpo anti-TfR pode ser útil no tratamento de qualquer doença ou distúrbio no qual a proliferação excessiva de reticulócitos seja problemática. Em policitemia congênita ou policitemia vera neoplástica, por exemplo, contagens elevadas de glóbulos vermelhos do sangue devido à hiperproliferação, por exemplo, de reticulócitos, resultam em espessamento do sangue e consequentes sintomas fisiológicos. A administração de um anticorpo anti-TfR humano/de cynomolgus de acordo com a presente invenção, em que função efetora ao menos parcial do anticorpo foi preservada, permitiria a remoção seletiva de populações de reticulócitos imaturos sem impacto ao transporte normal de transferrina para o SNC. A dosagem desse anticorpo poderá ser modulada de tal forma que sintomas clínicos agudos poderão ser minimizados (ou seja, por meio do fornecimento de dosagem muito baixa ou em intervalos amplamente espaçados), como é bem compreendido na técnica.

[0018] Anti-TfR/BACE1 e anti-TFR/Abeta são ambos possíveis produtos terapêuticos inovadores e promissores para o tratamento de mal de Alzheimer. Além disso, a tecnologia de direcionamento biespecífico com base no transporte mediado por receptor (RMT) abre as portas para uma ampla variedade de produtos terapêuticos potenciais para doenças do SNC. A presente invenção fornece métodos de elaboração de produtos terapêuticos penetrantes na BBB que aprimoram muito o transporte por meio de distribuição do produto terapêutico através do SNC e BBB sem esgotamento dos reticulócitos.

[0019] Consequentemente, em primeira realização, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que se liga a receptor de transferrina humana (TfR) e TfR de primatas, em que o anticorpo não inibe a ligação de transferrina a TfR. Em um aspecto, a ligação é ligação específica. Em outro aspecto, o anticorpo não inibe adicionalmente a ligação de proteína de hemacromatose humana (“HFE”) a TfR. Em um aspecto, a ligação é ligação específica. Em um aspecto, o anticorpo é anticorpo monoclonal. Em outro aspecto, o anticorpo é anticorpo humano. Em outro aspecto, o anticorpo é anticorpo humanizado. Em outro aspecto, o anticorpo é anticorpo quimérico. Em outro aspecto, o anticorpo é um fragmento de anticorpo que liga TfR humano e TfR de primata. Em outro aspecto, o TfR de primata é de macaco cynomolgus.

[0020] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 38 e 39. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 40 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, 43 e 44. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, 48 e 49. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, 54 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, 58 e 59. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, 63 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, 65 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, 69 e 70. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, 75 e 76. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, 81 e 82. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, 83 e 84. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 87, 89 e 90. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, 95 e 96. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, 101 e 102. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, 156 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, 157 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, 54 e 55.

[0021] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38 e 39. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 40 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 43 e 44. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, 48 e 49. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 54 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 58 e 59. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 63 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 65 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 69 e 70. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, 75 e 76. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 81 e 82. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 83 e 84. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, 89 e 90. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, 95 e 96. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, 101 e 102. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 156 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 157 e 55.

[0022] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 31. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 30 e 36. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, 30 e 42. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 31. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 30 e 46. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 51 e 52. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, 57 e 52. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, 61 e 62. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, 64 e 52. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 67 e 68. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, 72 e 73. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, 78 e 79. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, 86 e 87. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, 92 e 93. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, 98 e 99. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 127. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 51 e 155.

[0023] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 31 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 30 e 36 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38 e 39. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 30 e 36 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 40 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, 30 e 42 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 43 e 44. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 31 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 30 e 46 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, 48 e 49. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 51 e 52 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 54 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, 57 e 52 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 58 e 59. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, 61 e 62 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 63 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, 64 e 52 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 65 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 67 e 68 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 69 e 70. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, 72 e 73 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, 75 e 76. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, 78 e 79 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 81 e 82. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, 78 e 79 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 83 e 84. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, 86 e 87 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, 89 e 90. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, 92 e 93 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, 95 e 96. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, 98 e 99 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, 101 e 102. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 127 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 51 e 52 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 156 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 51 e 52 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 157 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 51 e 155 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 54 e 55.

[0024] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende pelo menos uma sequência de HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR- L1, HVR-L2 ou HVR-L3 selecionada a partir do grupo de sequências que consiste de uma sequência de HVR-H1 de SEQ ID NO: 47, 53 ou 100; uma sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO: 48, 69, 101, 156 ou 157; uma sequência de HVR-H3 de SEQ ID NO: 49, 76 ou 102; uma sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO: 45, 66 ou 97; uma sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO: 30, 67 ou 98; e uma sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO: 46, 68 ou 102.

[0025] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende (a) uma sequência de VH com identidade de sequências de pelo menos 95% com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 20, 25, 26, 27, 28, 108, 114, 120, 126, 153 or 154; (b) uma sequência de VL que possui identidade de sequências de pelo menos 95% com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 19, 21, 22, 23, 24, 105, 111, 117, 123 ou 151; ou (c) uma sequência de VH como em (a) e uma sequência de VL como em (b). Em um desses aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 4 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 5 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 8. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 5 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 9. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 6 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 10. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 11 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 15. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 16. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 13 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 17. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 14 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 18. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 19 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 20. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 21 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 25. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 26. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 23 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 27. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 24 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 28. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 105 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 108. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 111 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 114. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 117 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 120. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 123 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 126. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 105 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 153. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 105 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 154. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 151 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 108. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VH de (a) SEQ ID NO: 108, (b) SEQ ID NO: 114, (c) SEQ ID NO: 120 ou (d) SEQ ID NO: 126. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de (a) SEQ ID NO: 105, (b) SEQ ID NO: 111, (c) SEQ ID NO: 117 ou (d) SEQ ID NO: 123.

[0026] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste de anticorpos 7A4, 8A2, 15D2, 10D11, 7B10, 15G11, 16G5, 13C3, 16G4, 16F6, 7G7, 4C2, 1B12 e 13D4. Em um aspecto, o anticorpo é 7A4. Em outro aspecto, o anticorpo é 8A2. Em outro aspecto, o anticorpo é 15D2. Em outro aspecto, o anticorpo é 10D11. Em outro aspecto, o anticorpo é 7B10. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11. Em outro aspecto, o anticorpo é 16G5. Em outro aspecto, o anticorpo é 13C3. Em outro aspecto, o anticorpo é 16G4. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6. Em outro aspecto, o anticorpo é 7G7. Em outro aspecto, o anticorpo é 4C2. Em outro aspecto, o anticorpo é 1B12. Em outro aspecto, o anticorpo é 13D4.

[0027] Em um aspecto de qualquer um dos acima, o anticorpo é adicionalmente amadurecido por afinidade. Em um desses aspectos, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste de 15G11.v1, 15G11.v2, 15G11.v3, 15G11.v4, 15G11.v5, 7A4.v1; 7A4.v2, 7A4.v3, 7A4.v4, 7A4.v5, 7A4.v6, 7A4.v7, 7A4.v8, 7A4.v9, 7A4.v10, 7A4.v11, 7A4.v12, 7A4.v13, 7A4.v14, 7A4.v15, 7G7.v1, 16F6.v1, 16F6.v2, 16F6.v3, 16F6.v4, 15G11.N52A, 15G11.T53A e 15G11.W92A. Em um aspecto, o anticorpo é 15G11.v1. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.v2. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.v3. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.v4. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.v5. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v1. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v2. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v3. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v4. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v5. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v6. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v7. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v8. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v9. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v10. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v11. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v12. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v13. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v14. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v15. Em outro aspecto, o anticorpo é 7G7.v1. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v1. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v2. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v3. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v4. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.N52A. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.T53A. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.W92A.

[0028] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo é modificado em uma ou mais posições de aminoácidos no VH ou VL no aminoácido indicado para aquela posição nas Figuras 4E-1 e 4E-2. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende uma sequência ou uma ou mais sequências de HVR correspondentes à de uma ou mais das descritas para qualquer um dos clones nas Figuras 3 e 4 e Figuras 4E-1 e 4E-2. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende uma sequência de VH ou VL correspondente à descrita para um ou mais dos clones das Figuras 3 e 4 e das Figuras 4E-1 e 4E-2. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende uma ou mais sequências de HVR correspondentes à de uma ou mais das descritas para qualquer um dos clones das Figuras 3 e 4 e das Figuras 4E-1 e 4E-2.

[0029] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo é acoplado a um composto terapêutico. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo é acoplado a um agente de formação de imagens ou marca. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto terapêutico forma opcionalmente uma parte do anticorpo multiespecífico. Em um aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que liga TfR e um segundo local de ligação ao antígeno que liga um antígeno do cérebro. Em um aspecto, o antígeno do cérebro é selecionado a partir do grupo que consiste de: beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor de fator do crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator do crescimento epidérmico humano (HER2), tau, apolipoproteína E (ApoE), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase de repetição rica em leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama-secretase, receptor de morte 6 (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) e caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga a TfR e BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga a TfR e Abeta. Em outro aspecto, o composto terapêutico é uma droga de distúrbio neurológico.

[0030] Em um aspecto da realização acima, a presente invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica qualquer um dos anticorpos acima. Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de qualquer um dos anticorpos acima que compreende o cultivo dessa célula hospedeira de forma que o anticorpo seja produzido e que opcionalmente compreende ainda a recuperação do anticorpo da célula hospedeira.

[0031] Em um aspecto da realização acima, a presente invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos acima e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0032] Em um aspecto da realização acima, a presente invenção fornece qualquer um dos anticorpos acima para uso como medicamento. Em outro aspecto da realização acima, a presente invenção fornece o uso de qualquer um dos anticorpos acima na fabricação de medicamento para o tratamento de distúrbio neurológico. Em um aspecto, o distúrbio neurológico é selecionado a partir do grupo que consiste de distúrbio de neuropatia, doença neurodegenerativa, câncer, distúrbio de doença ocular, distúrbio convulsivo, doença de armazenagem lisossomal, amiloidose, doença viral ou microbiana, isquemia, distúrbio de comportamento e inflamação do SNC.

[0033] Em outro aspecto da realização acima, a presente invenção fornece qualquer um dos anticorpos acima para uso no tratamento de distúrbio neurológico. Em um aspecto, o distúrbio neurológico é selecionado a partir do grupo que consiste de distúrbio de neuropatia, doença neurodegenerativa, câncer, distúrbio de doença ocular, distúrbio convulsivo, doença de armazenagem lisossomal, amiloidose, doença viral ou microbiana, isquemia, distúrbio de comportamento e inflamação do SNC.

[0034] Em outro aspecto da realização acima, a presente invenção fornece qualquer um dos anticorpos acima para uso no transporte de um ou mais compostos através da BBB. Em outro aspecto da realização acima, é fornecido o uso de qualquer um dos anticorpos acima na fabricação de medicamento para o transporte de um ou mais compostos através da BBB.

[0035] Em um aspecto da realização acima, é fornecido um método de transporte de um composto através da BBB em pacientes, que compreende a exposição de qualquer um dos anticorpos acima à BBB, de tal forma que o anticorpo transporte o composto a ele acoplado através da BBB. Em outro aspecto, a BBB encontra-se em um paciente humano. Em outro aspecto, a quantidade de dosagem e/ou frequência de administração é modulada para reduzir a concentração de anticorpo ao qual são expostos glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a etapa de monitoramento do paciente para determinar o esgotamento de glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é saturadora de TfR. Em outro aspecto, a administração do anticorpo encontra-se em dose e/ou frequência de dosagem calibrada para minimizar os sintomas clínicos agudos da administração de anticorpos.

[0036] Em outro aspecto da realização acima, é fornecido um método de aumento da exposição do SNC do paciente a um composto, que compreende a exposição de qualquer um dos anticorpos acima à BBB, de tal forma que o anticorpo transporte o composto a ele acoplado através da BBB. Em outro aspecto, a BBB encontra-se em um paciente humano. Em outro aspecto, a quantidade de dosagem e/ou frequência de administração é modulada para reduzir a concentração de anticorpo ao qual são expostos glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a etapa de monitoramento do paciente para determinar o esgotamento de glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é saturadora de TfR. Em outro aspecto, a administração do anticorpo encontra-se em dose e/ou frequência de dosagem calibrada para minimizar os sintomas clínicos agudos da administração de anticorpos.

[0037] Em um aspecto da realização acima, é fornecido um método de aumento da retenção no SNC de um composto administrado ao paciente, que compreende a exposição de qualquer um dos anticorpos acima à BBB, de forma a aumentar a retenção no SNC do composto. Em outro aspecto, a BBB encontra-se em um paciente humano. Em outro aspecto, a quantidade de dosagem e/ou frequência de administração é modulada para reduzir a concentração de anticorpo ao qual são expostos glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a etapa de monitoramento do paciente para determinar o esgotamento de glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é saturadora de TfR. Em outro aspecto, a administração do anticorpo encontra-se em dose e/ou frequência de dosagem calibrada para minimizar os sintomas clínicos agudos da administração de anticorpos.

[0038] Em um aspecto da realização acima, é fornecido um método de tratamento de distúrbio neurológico em mamíferos, que compreende o tratamento do mamífero com qualquer dos anticorpos acima. Em um aspecto, o distúrbio neurológico é selecionado a partir do grupo que consiste de distúrbio de neuropatia, doença neurodegenerativa, câncer, distúrbio de doença ocular, distúrbio convulsivo, doença de armazenagem lisossomal, amiloidose, doença viral ou microbiana, isquemia, distúrbio de comportamento e inflamação do SNC. Em outro aspecto, o distúrbio neurológico encontra-se em um paciente humano. Em outro aspecto, a quantidade de dosagem e/ou frequência de administração é modulada para reduzir a concentração de anticorpo ao qual são expostos glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a etapa de monitoramento do paciente para determinar o esgotamento de glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é saturadora de TfR. Em outro aspecto, a administração do anticorpo encontra-se em dose e/ou frequência de dosagem calibrada para minimizar os sintomas clínicos agudos da administração de anticorpos.

[0039] Em outra realização, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que se liga a TfR humano e TfR de primata, em que o anticorpo não inibe a ligação de transferrina a TfR e uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir ou eliminar o impacto do anticorpo sobre reticulócitos e/ou reduzir a severidade ou a presença de sintomas clínicos agudos em pacientes ou mamíferos tratados com o anticorpo. Em um aspecto, a ligação é ligação específica. Em outro aspecto, o anticorpo não inibe adicionalmente a ligação de HFE a TfR. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em outro aspecto, o anticorpo é um anticorpo humano. Em outro aspecto, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em outro aspecto, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Em outro aspecto, o anticorpo é um fragmento de anticorpo que liga TfR humano e TfR de primata. Em outro aspecto, o TfR de primata é de macaco cynomolgus.

[0040] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 38 e 39. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 40 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, 43 e 44. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, 48 e 49. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, 54 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, 58 e 59. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, 63 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, 65 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, 69 e 70. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, 75 e 76. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, 81 e 82. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, 83 e 84. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 87, 89 e 90. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, 95 e 96. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, 101 e 102. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, 33 e 34.

[0041] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38 e 39. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 40 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 43 e 44. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, 48 e 49. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 54 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 58 e 59. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 63 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 65 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 69 e 70. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, 75 e 76. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 81 e 82. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 83 e 84. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, 89 e 90. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, 95 e 96. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR- H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, 101 e 102.

[0042] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 31. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 30 e 36. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, 30 e 42. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 31. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 30 e 46. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 51 e 52. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, 57 e 52. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, 61 e 62. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, 64 e 52. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 67 e 68. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, 72 e 73. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, 78 e 79. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, 86 e 87. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, 92 e 93. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, 98 e 99. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 127.

[0043] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 31 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 30 e 36 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38 e 39. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 30 e 36 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 40 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, 30 e 42 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 43 e 44. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 31 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 30 e 46 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, 48 e 49. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 51 e 52 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 54 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, 57 e 52 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 58 e 59. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, 61 e 62 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 63 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, 64 e 52 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 65 e 55. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 67 e 68 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, 69 e 70. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, 72 e 73 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, 75 e 76. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, 78 e 79 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 81 e 82. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, 78 e 79 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 83 e 84. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, 86 e 87 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, 89 e 90. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, 92 e 93 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, 95 e 96. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, 98 e 99 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, 101 e 102. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 30 e 127 e HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, que compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 33 e 34.

[0044] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende pelo menos uma sequência de HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR- L1, HVR-L2 ou HVR-L3 selecionada a partir do grupo de sequências que consiste de uma sequência de HVR-H1 de SEQ ID NO: 47, 53 ou 100; uma sequência de HVR-H2 de SEQ ID NO: 48, 69 ou 101; uma sequência de HVR- H3 de SEQ ID NO: 49, 76 ou 102; uma sequência de HVR-L1 de SEQ ID NO: 45, 66 ou 97; uma sequência de HVR-L2 de SEQ ID NO: 30, 67 ou 98; e uma sequência de HVR-L3 de SEQ ID NO: 46, 68 ou 102.

[0045] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo compreende (a) uma sequência de VH com identidade de sequências de pelo menos 95% com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 20, 25, 26, 27, 28, 108, 114, 120 ou 126; (b) uma sequência de VL que possui identidade de sequências de pelo menos 95% com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 19, 21, 22, 23, 24, 105, 111, 117 ou 123; ou (c) uma sequência de VH como em (a) e uma sequência de VL como em (b). Em um aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 4 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 5 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 8. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 5 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 9. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 6 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 10. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 11 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 15. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 16. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 13 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 17. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 14 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 18. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 19 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 20. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 21 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 25. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 26. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 23 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 27. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 24 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 28. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 105 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 108. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 111 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 114. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 117 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 120. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de SEQ ID NO: 123 e uma sequência de VH de SEQ ID NO: 126. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VH de (a) SEQ ID NO: 108, (b) SEQ ID NO: 114, (c) SEQ ID NO: 120 ou (d) SEQ ID NO: 126. Em outro aspecto, o anticorpo compreende uma sequência de VL de (a) SEQ ID NO: 105, (b) SEQ ID NO: 111, (c) SEQ ID NO: 117 ou (d) SEQ ID NO: 123.

[0046] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste de anticorpos 7A4, 8A2, 15D2, 10D11, 7B10, 15G11, 16G5, 13C3, 16G4, 16F6, 7G7, 4C2, 1B12 e 13D4. Em um aspecto, o anticorpo é 7A4. Em outro aspecto, o anticorpo é 8A2. Em outro aspecto, o anticorpo é 15D2. Em outro aspecto, o anticorpo é 10D11. Em outro aspecto, o anticorpo é 7B10. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11. Em outro aspecto, o anticorpo é 16G5. Em outro aspecto, o anticorpo é 13C3. Em outro aspecto, o anticorpo é 16G4. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6. Em outro aspecto, o anticorpo é 7G7. Em outro aspecto, o anticorpo é 4C2. Em outro aspecto, o anticorpo é 1B12. Em outro aspecto, o anticorpo é 13D4.

[0047] Em um aspecto de qualquer um dos acima, o anticorpo é adicionalmente amadurecido por afinidade. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste de 15G11.v1, 15G11.v2, 15G11.v3, 15G11.v4, 15G11.v5, 7A4.v1; 7A4.v2, 7A4.v3, 7A4.v4, 7A4.v5, 7A4.v6, 7A4.v7, 7A4.v8, 7A4.v9, 7A4.v10, 7A4.v11, 7A4.v12, 7A4.v13, 7A4.v14, 7A4.v15, 7G7.v1, 16F6.v1, 16F6.v2, 16F6.v3 e 16F6.v4. Em um aspecto, o anticorpo é 15G11.v1. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.v2. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.v3. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.v4. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.v5. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v1. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v2. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v3. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v4. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v5. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v6. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v7. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v8. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v9. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v10. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v11. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v12. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v13. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v14. Em outro aspecto, o anticorpo é 7A4.v15. Em outro aspecto, o anticorpo é 7G7.v1. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v1. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v2. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v3. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v4. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.N52A. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v4. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.T53A. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v4. Em outro aspecto, o anticorpo é 15G11.W92A. Em outro aspecto, o anticorpo é 16F6.v4.

[0048] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo é modificado em uma ou mais posições de aminoácidos no VH ou VL no aminoácido indicado para aquela posição nas Figuras 4E-1 e 4E-2. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende uma sequência ou uma ou mais sequências de HVR correspondentes à de uma ou mais das descritas para qualquer um dos clones nas Figuras 3 e 4 e Figuras 4E-1 e 4E-2. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende uma sequência de VH ou VL correspondente à descrita para um ou mais dos clones nas Figuras 3 e 4 e Figuras 4E-1 e 4E-2. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo compreende uma ou mais sequências de HVR correspondentes a uma ou mais das descritas para qualquer um dos clones nas Figuras 3 e 4 e Figuras 4E-1 e 4E-2.

[0049] Em um aspecto da realização acima, uma ou mais propriedades do anticorpo são selecionadas a partir da função efetora da região Fc de anticorpo, a função de ativação de complemento do anticorpo e a afinidade do anticorpo para TfR. Em um aspecto, a propriedade é a função efetora da região Fc de anticorpo. Em outro aspecto, a propriedade é a função de ativação de complemento do anticorpo. Em outro aspecto, a propriedade é a afinidade do anticorpo para TfR. Em um aspecto, a função efetora ou a função de ativação do complemento foi reduzida ou eliminada com relação a um anticorpo do tipo selvagem do mesmo isótipo. Em um aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por meio de um método selecionado a partir de redução da glicosilação do anticorpo, modificação do isótipo de anticorpo em um isótipo que possui função efetora naturalmente reduzida ou eliminada e modificação da região Fc.

[0050] Em um aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por meio de redução da glicosilação do anticorpo. Em um aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por meio de um método selecionado a partir de: produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação do tipo selvagem; remoção de grupos carboidratos já presentes sobre o anticorpo; e modificação do anticorpo de tal forma que não ocorra glicosilação do tipo selvagem. Em um aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida pela produção do anticorpo em ambiente que não permite a glicosilação do tipo selvagem, tal como a produção em um sistema de produção de células não de mamífero ou em que o anticorpo é produzido sinteticamente. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção de células não de mamífero. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por meio de modificação do anticorpo de tal forma que não ocorra glicosilação do tipo selvagem, tal como em que a região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de tal forma que o resíduo de asparagina do tipo selvagem naquela posição seja substituído por outro aminoácido que interfere com a glicosilação naquela posição.

[0051] Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por meio de pelo menos uma modificação da região Fc. Em um aspecto, a função efetora ou a função de ativação de complemento é reduzida ou eliminada por meio de deleção da região Fc, no todo ou em parte, ou da elaboração do anticorpo de tal forma que não inclua uma região Fc ou região não-Fc competente para função efetora ou função de ativação de complemento. Em outro aspecto, a pelo menos uma modificação da região Fc é selecionada a partir de: uma mutação pontual da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das posições a seguir: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439; uma mutação pontual da região Fc para prejudicar a ligação a C1q selecionada a partir das posições a seguir: 270, 322, 329 e 321; eliminação da região Fc, no todo ou em parte, e mutação pontual na posição 132 do domínio CH1. Em um aspecto, a modificação é uma mutação pontual da região Fc para prejudicar a ligação a C1q selecionada a partir das posições a seguir: 270, 322, 329 e 321. Em outro aspecto, a modificação é a eliminação da região Fc, no todo ou em parte. Em outro aspecto, a função de acionamento de complemento é reduzida ou eliminada por meio de deleção da região Fc, no todo ou em parte, ou por meio da elaboração do anticorpo de forma a não incluir uma região Fc que ativa o processo de complemento. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um anticorpo Fab ou de fita simples. Em outro aspecto, a região não- Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar a ativação do processo de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação pontual da região CH1 para prejudicar a ligação a C3. Em um aspecto, a mutação pontual encontra-se na posição 132 (vide, por exemplo, Vidarte et al (2001), J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223).

[0052] Em um aspecto, a meia vida do anticorpo é aumentada por meio de modificação da região de ligação de FcRn. Em um aspecto, a modificação é uma substituição em um aminoácido selecionado a partir das posições a seguir: 251, 256, 285, 290, 308, 314, 385, 389, 428, 434, 436, 238, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434. Em um aspecto, a modificação é uma substituição selecionada a partir das seguintes: M252Y, S254T, T256E, N434A e Y436I.

[0053] Em um aspecto, o anticorpo é combinado com um composto adicional que reduz ou contribui com a redução do impacto sobre os níveis de reticulócitos ou sintomas clínicos agudos. Em um aspecto, o composto adicional protege os reticulócitos contra o esgotamento de anticorpos ou sustenta o crescimento, desenvolvimento ou restabelecimento de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional é selecionado a partir de eritropoietina (EPO), suplemento de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12, ou são glóbulos vermelhos do sangue ou reticulócitos.

[0054] Em um aspecto da realização acima, a afinidade do anticorpo para TfR é reduzida, conforme medido com relação a um anticorpo do tipo selvagem do mesmo isótipo sem reduzir a afinidade para TfR. Em um aspecto, o anticorpo possui KD ou IC50 para TfR de cerca de 1 pM a cerca de 100 μM. Em outro aspecto, a quantidade de dosagem e/ou frequência de administração do anticorpo é modulada para reduzir a concentração do anticorpo ao qual são expostos glóbulos vermelhos do sangue.

[0055] Em um aspecto da realização acima, o anticorpo é acoplado a um composto terapêutico. Em outro aspecto da realização acima, o anticorpo é acoplado a um agente de formação de imagens ou marca. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto terapêutico forma opcionalmente uma parte do anticorpo multiespecífico. Em um aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que liga TfR e um segundo local de ligação ao antígeno que liga um antígeno do cérebro. Em um aspecto, o antígeno do cérebro é selecionado a partir do grupo que consiste de: beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor de fator do crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator do crescimento epidérmico humano (HER2), tau, apolipoproteína E (ApoE), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase de repetição rica em leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama-secretase, receptor de morte 6 (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) e caspase 6. Em outro aspecto, a anticorpo multiespecífico se liga a TfR e BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga a TfR e Abeta. Em outro aspecto, o composto terapêutico é uma droga de distúrbio neurológico.

[0056] Em um aspecto da realização acima, a presente invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica qualquer um dos anticorpos acima. Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de qualquer um dos anticorpos acima que compreende o cultivo dessa célula hospedeira de forma que o anticorpo seja produzido e que opcionalmente compreende ainda a recuperação do anticorpo da célula hospedeira.

[0057] Em um aspecto da realização acima, a presente invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos acima e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0058] Em um aspecto da realização acima, a presente invenção fornece qualquer um dos anticorpos acima para uso como medicamento. Em outro aspecto da realização acima, a presente invenção fornece o uso de qualquer um dos anticorpos acima na fabricação de medicamento para o tratamento de distúrbio neurológico. Em um aspecto, o distúrbio neurológico é selecionado a partir do grupo que consiste de distúrbio de neuropatia, doença neurodegenerativa, câncer, distúrbio de doença ocular, distúrbio convulsivo, doença de armazenagem lisossomal, amiloidose, doença viral ou microbiana, isquemia, distúrbio de comportamento e inflamação do SNC.

[0059] Em outro aspecto da realização acima, a presente invenção fornece qualquer um dos anticorpos acima para uso no tratamento de distúrbio neurológico. Em um aspecto, o distúrbio neurológico é selecionado a partir do grupo que consiste de distúrbio de neuropatia, doença neurodegenerativa, câncer, distúrbio de doença ocular, distúrbio convulsivo, doença de armazenagem lisossomal, amiloidose, doença viral ou microbiana, isquemia, distúrbio de comportamento e inflamação do SNC.

[0060] Em outro aspecto da realização acima, a presente invenção fornece qualquer um dos anticorpos acima para uso no transporte de um ou mais compostos através da BBB. Em outro aspecto da realização acima, é fornecido o uso de qualquer um dos anticorpos acima na fabricação de medicamento para o transporte de um ou mais compostos através da BBB.

[0061] Em um aspecto da realização acima, é fornecido um método de transporte de um composto através da BBB em pacientes, que compreende a exposição de qualquer um dos anticorpos acima à BBB, de tal forma que o anticorpo transporte o composto a ele acoplado através da BBB. Em outro aspecto, a BBB encontra-se em paciente humano. Em outro aspecto, a quantidade de dosagem e/ou frequência de administração é modulada para reduzir a concentração de anticorpo ao qual são expostos glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a etapa de monitoramento do paciente para determinar o esgotamento de glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é saturadora de TfR. Em outro aspecto, a administração do anticorpo encontra-se em dose e/ou frequência de dosagem calibrada para minimizar os sintomas clínicos agudos da administração de anticorpos.

[0062] Em outro aspecto da realização acima, é fornecido um método de aumento da exposição do SNC do paciente a um composto, que compreende a exposição de qualquer um dos anticorpos acima à BBB, de tal forma que o anticorpo transporte o composto a ele acoplado através da BBB. Em outro aspecto, a BBB encontra-se em um paciente humano. Em outro aspecto, a quantidade de dosagem e/ou frequência de administração é modulada para reduzir a concentração de anticorpo ao qual são expostos glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a etapa de monitoramento do paciente para determinar o esgotamento de glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é saturadora de TfR. Em outro aspecto, a administração do anticorpo encontra-se em dose e/ou frequência de dosagem calibrada para minimizar os sintomas clínicos agudos da administração de anticorpos.

[0063] Em um aspecto da realização acima, é fornecido um método de aumento da retenção no SNC de um composto administrado ao paciente, que compreende a exposição de qualquer um dos anticorpos acima à BBB, de forma a aumentar a retenção no SNC do composto. Em outro aspecto, o BBB encontra-se em um paciente humano. Em outro aspecto, a quantidade de dosagem e/ou frequência de administração é modulada para reduzir a concentração de anticorpo à qual são expostos glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a etapa de monitoramento do paciente para determinar o esgotamento de glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é saturadora de TfR. Em outro aspecto, a administração do anticorpo encontra-se em dose e/ou frequência de dosagem calibrada para minimizar os sintomas clínicos agudos da administração de anticorpos.

[0064] Em um aspecto da realização acima, é fornecido um método de tratamento de distúrbio neurológico em mamíferos, que compreende o tratamento do mamífero com qualquer dos anticorpos acima. Em um aspecto, o distúrbio neurológico é selecionado a partir do grupo que consiste de distúrbio de neuropatia, doença neurodegenerativa, câncer, distúrbio de doença ocular, distúrbio convulsivo, doença de armazenagem lisossomal, amiloidose, doença viral ou microbiana, isquemia, distúrbio de comportamento e inflamação do SNC. Em outro aspecto, o distúrbio neurológico encontra-se em um paciente humano. Em outro aspecto, a quantidade de dosagem e/ou frequência de administração é modulada para reduzir a concentração de anticorpo ao qual são expostos glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a etapa de monitoramento do paciente para determinar o esgotamento de glóbulos vermelhos do sangue. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é saturadora de TfR. Em outro aspecto, a administração do anticorpo encontra-se em dose e/ou frequência de dosagem calibrada para minimizar os sintomas clínicos agudos da administração de anticorpos.

[0065] Em outra realização, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que se liga ao mesmo epítopo sobre TfR na forma de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste dos anticorpos 7A4, 8A2, 15D2, 10D11, 7B10, 15G11, 16G5, 13C3, 16G4, 16F6, 7G7, 4C2, 1B12, 13D4, 15G11.v1, 15G11.v2, 15G11.v3, 15G11.v4, 15G11.v5, 7A4.v1; 7A4.v2, 7A4.v3, 7A4.v4, 7A4.v5, 7A4.v6, 7A4.v7, 7A4.v8, 7A4.v9, 7A4.v10, 7A4.v11, 7A4.v12, 7A4.v13, 7A4.v14, 7A4.v15, 7G7.v1, 16F6.v1, 16F6.v2, 16F6.v3, 16F6.v4, 15G11.N52A, 15G11.T53A e 15G11W92A.

[0066] Em outra realização, é fornecido um método de redução da liberação de um composto administrado a pacientes, em que o composto é acoplado a um anticorpo que se liga com baixa afinidade a TfR, de forma a reduzir a liberação do composto, em que a redução dos níveis de glóbulos vermelhos do sangue do paciente mediante administração de anticorpo acoplado a composto ao paciente é diminuída ou eliminada.

[0067] Em outra realização, é fornecido um método de otimização da farmacocinética e/ou farmacodinâmica de um composto para que seja eficaz no SNC de pacientes, em que o composto é acoplado a um anticorpo que se liga com baixa afinidade a TfR e o anticorpo é selecionado de tal forma que a sua afinidade para TfR após acoplamento ao composto resulte em quantidade de transporte do anticorpo conjugado ao composto através da BBB que otimiza a farmacocinética e/ou a farmacodinâmica do composto no SNC, em que a redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sangue do paciente mediante administração de anticorpo acoplada a composto ao paciente é diminuída ou eliminada.

[0068] Compreender-se-á que quaisquer dos métodos e composições de acordo com a presente invenção podem ser combinados entre si e/ou com os aspectos adicionais da presente invenção descritos no presente relatório descritivo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0069] A Figura 1 ilustra uma estrutura de cristal tridimensional de um dímero de TfR em complexo com Tf, com base no arquivo pdb 3SM9. A região apical não de ligação de Tf de TfR é marcada.

[0070] As Figuras 2A-2B ilustram análise de FACS de sobrenadantes de clones parentais de hibridoma de camundongo que se ligam a TfR humano e de cynomolgus expressos de forma transitória em células 293 na presença de 1 μM de holo-Tf humano. A menos que indicado em contrário, o traço cinza preenchido em cada gráfico é fundo do anticorpo de detecção, o traço cinza médio liga-se a células 293 que expressam de forma endógena os níveis básicos de TfR humano, o traço preto escuro representa a ligação a TfR humano expresso de forma transitória e o traço cinza fino representa ligação a TfR de cynomolgus expresso de forma transitória.

[0071] A Figura 2C ilustra os resultados de testes de competição de anticorpos com reação cruzada humanos/de cynomolgus conforme descrito no Exemplo 1. Concluiu-se que nove dos quatorze clones bloqueiam a ligação do anticorpo de ligação apical exibido sobre o fago.

[0072] As Figuras 3A-1, 3A-2, 3B-1, 3B-2, 3C-1, 3C-2, 3D-1 e 3D2 ilustram as sequências de região variável de cadeia leve e pesada de clones de hibridoma que se ligam a regiões apicais e não apicais de TfR. As sequências podem ser adicionalmente subdivididas por epítopo e similaridade de sequências em classe I a III (ligantes apicais) e classe IV (ligantes não apicais). As HVRs de acordo com Kabat são indicadas de forma sublinhada.

[0073] As Figuras 4A-1, 4A-2, 4B-1, 4B-2, 4C-1, 4C-2, 4D-1 e 4D2 ilustram alinhamentos de sequências humanizadas de (A) 15G11, (B) 7A4/8A2, (C) 7G7 e (D) 16F6. Cada sequência de domínio variável leve e pesado de camundongo (segunda linha) é alinhada à linhagem de germens ou domínio variável de consenso humano mais próxima (primeira linha). A versão humanizada de cada anticorpo é exibida no fundo (terceira linha). As diferenças entre as sequências de linhagem de germens ou consenso humano são sombreadas. As sequências de HVR que foram enxertadas na estrutura principal humana são colocadas em caixa. As definições de CDR de acordo com Kabat são indicadas.

[0074] As Figuras 4E-1 e 4E-2 demonstram que, para os grupos de anticorpos de classe I-III, formas variantes dos anticorpos com modificações em um ou mais resíduos de FR retiveram especificidade de ligação e afinidade.

[0075] A Figura 5 ilustra a ligação de hu7A4.v15, hu15G11.v5 e hu7G7.v1 a huTfR na presença de 6,3 μM de holo-Tf. A ligação de anticorpos a huTfR imobilizado é exibida na presença (símbolos abertos e linhas tracejadas) ou ausência (símbolos cheios e linhas sólidas) de 6,3 μM de holo-Tf.

[0076] As Figuras 6A-B ilustram os resultados da ligação de HFE - HuTfR e dos testes de bloqueio de HFE descritos no Exemplo 1. A Figura 6A exibe a ligação de anticorpo a concentrações crescentes de huTfR capturado por meio de HFE imobilizado. A Figura 6B exibe a ligação de huTfR a HFE imobilizado na presença de concentrações crescentes de anticorpo.

[0077] As Figuras 7A-B ilustram análises de ligação de variantes de Fab Ala e IgG 15G11.v5 e 7A4.v5 sobre TfR humano e de cynomolgus, que demonstram os efeitos sobre a afinidade de mutações de Ala em CDR-L3 e CDR-H3 de cada anticorpo determinado como IgG por meio de ligação de ELISA e IgG ou Fab por meio de análise de SPR a TfR humano ou de cynomolgus imobilizado, conforme descrito no Exemplo 2.

[0078] As Figuras 8A-B e as Figuras 9A-B ilustram os resultados de experimentos que determinam o impacto da situação de função efetora sobre a atividade de ADCC de anticorpos anti-TfR humano (“anti-hTFR”) em células mononucleares da medula óssea humana primária ou em uma linhagem celular de eritoblastas humanos, conforme descrito no Exemplo 4.

[0079] A Figura 10 ilustra o esquema de amostragem e dosagem para o estudo com primatas descrito no Exemplo 5.

[0080] As Figuras 11A e 11B ilustram os resultados farmacocinéticos dos experimentos descritos no Exemplo 5, especificamente concentrações em soro de anti-TfR1/BACE1, anti-TfR2/BACE1 e anti-gD médias de grupo e individuais, em comparação com o tempo após uma única administração de mistura IV a 30 mg/kg em macacos cynomolgus em soro (Figura 11A) e CSF (Figura 11B).

[0081] As Figuras 12A a 12E ilustram os resultados farmacodinâmicos dos experimentos descritos no Exemplo 5, especificamente concentrações em plasma (A) ou CSF (B-E) de anti-TfR1/BACE1, anti- TfR2/BACE1 e anti-gD individuais e médias de grupo em comparação com o tempo após uma única administração de mistura IV a 30 mg/kg em macacos cynomolgus. Os quadros superiores exibem os níveis de Abeta1-40 em plasma (Figura 12A) e CSF (Figura 12B), enquanto os quadros inferiores exibem os níveis de APPα solúveis (Figura 12C), níveis de APPβ solúveis (Figura 12D) e razão de sAPPβ/sAPPα (Figura 12E) ao longo do tempo.

[0082] As Figuras 13A-13D ilustram os resultados da amostragem hematológica realizada durante os estudos descritos no Exemplo 5. Em cada um dos momentos indicados, reticulócitos totais (Figura 13A), glóbulos vermelhos do sangue (Figura 13B), hemoglobina (Figura 13D) e o percentual de reticulócitos imaturos no conjunto de reticulócitos total (Figura 13C) foram medidos utilizando métodos padrão.

[0083] A Figura 14 ilustra o esquema de amostragem e dosagem para o estudo com primatas descrito no Exemplo 6.

[0084] As Figuras 15A-15B ilustram os resultados farmacodinâmicos (A) e concentrações de anticorpos no cérebro (B) dos experimentos descritos no Exemplo 6. Especificamente, a Figura 15A exibe razão em CSF de anti-TfR1/BACE1, anti-TfR2/BACE1, anti-gD e anti-BACE1 de sAPPβ/sAPPα individuais e médias de grupo em comparação com o tempo após uma única administração de mistura IV a 30 mg/kg em macacos cynomolgus. A Figura 15B exibe concentrações de anti-TfR1/BACE1, anti- TfR2/BACE1, anti-gD e anti-BACE1 individuais de anticorpo em várias regiões do cérebro 24 horas após a dosagem.

[0085] As Figuras 16A-B ilustram as sequências de aminoácidos de cadeia leve e pesada de clone anti-BACE1 YW412.8 obtidas a partir de uma seleção nativa da biblioteca de exibição de fagos com diversidade natural e formas amadurecidas por afinidade de YW412.8. A Fig. 16A ilustra os alinhamentos de sequência leve variável (VL) (SEQ ID NO: 132-137). A Fig. 16B ilustra os alinhamentos de sequência pesada variável (VH) (SEQ ID NO: 138-139). Nas duas figuras, as sequências de HVR para cada clone são indicadas pelas regiões em caixa, em que a primeira caixa indica HVR-L1 (Fig. 16A) ou HVR-H1 (Fig. 16B), a segunda caixa indica HVR-L2 (Fig. 16A) ou HVR-H2 (Fig. 16B) e a terceira caixa indica HVR-L3 (Fig. 16A) ou HVR-H3 (Fig. 16B).

[0086] As Figuras 17A-B ilustram as sequências de aminoácidos de cadeia leve e pesada de clone Fab12 de anticorpo anti-BACE1 obtidas a partir de uma seleção nativa de uma biblioteca de exibição de fagos com diversidade sintética e formas amadurecidas por afinidade de Fab12. A Fig. 17A ilustra os alinhamentos de sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 140- 143). A Fig. 17B ilustra os alinhamentos de sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 144). Nas duas figuras, as sequências de HVR para cada clone são indicadas pelas regiões em caixa, em que a primeira caixa indica HVR-L1 (Fig. 17A) ou HVR-H1 (Fig. 17B), a segunda caixa indica HVR-L2 (Fig. 17A) ou HVR-H2 (Fig. 17B) e a terceira caixa indica HVR-L3 (Fig. 17A) ou HVR-H3 (Fig. 17B).

[0087] As Figuras 18A-B ilustram a cadeia pesada (Fig. 18A; SEQ ID NO: 145) e cadeia leve (Fig. 18B; SEQ ID NO: 146) de um exemplo de anticorpo anti-Abeta.

[0088] A Figura 19 ilustra as propriedades farmacocinéticas de Anti-TfR1/BACE1, Anti-Tfr52A/BACE1 e Anti-TfR53A/BACE1 conforme descrito no Exemplo 5.

[0089] A Figura 20 ilustra as propriedades farmacocinéticas dos anticorpos IgG2a Anti-TfRD/BACE1 e Anti-gD murinos com as mutações LALAPG da função efetora de Fc conforme descrito no Exemplo 7.

[0090] A Figura 21 ilustra a contagem de reticulócitos totais e imaturos em camundongos 24 horas após a administração de uma dose de 50 mg/kg dos anticorpos IgG2a anti-TfrD/BACE1 murinos e anticorpos anti-gD com as mutações LLAPG de função efetora de Fc conforme descrito no Exemplo 7.

[0091] A Figura 22 ilustra a contagem de reticulócitos totais em camundongos 24 horas após administração de uma dose de 50 mg/kg dos anticorpos anti-TfR52A/BACE1 (N297G), anti-TfR52A/BACE1 (LALAPG), anti- TfR52A/BACE1 (LALAPG/YTE), TfR52A/BACE1 (LALAPG/AI) em camundongos knockin receptores de transferrina humana conforme descrito no Exemplo 8.

[0092] A Figura 23 ilustra os resultados de experimentos que determinam o impacto da situação de função efetora sobre a atividade de ADCC de anticorpos anti-TfR/gD, anti-TfR/BACE1 (N297G), anti-TfR/BACE1 (LALAPG), anti-TfR/BACE1 (N297G/434A/436I) e anti-TfR/BACE1 (LALAPG/YTE) em células mononucleares da medula óssea humana primárias ou em uma linhagem celular de eritoblastas humanos, conforme descrito no Exemplo 8.

[0093] A Figura 24 ilustra as sequências de região variável de cadeia leve e pesada de 1511Gv.5 (cadeia leve - SEQ ID NO: 105 e cadeia pesada - SEQ ID NO: 108) e variantes de afinidade 15G11.52A (cadeia leve - SEQ ID NO: 105 e cadeia pesada - SEQ ID NO: 153), 15G11.53A (cadeia leve - SEQ ID NO: 105 e cadeia pesada - SEQ ID NO: 154) e 15G11.92A (cadeia leve - SEQ ID NO: 151 e cadeia pesada - SEQ ID NO: 108). As HVRs de acordo com Kabat são indicadas de forma sublinhada.

[0094] A Figura 25 ilustra um teste de competição entre 15G11v.5 e anti-TfRC12 conforme descrito no Exemplo 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 1. Definições:

[0095] “Afinidade” designa a resistência da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (tal como um anticorpo) e seu parceiro de ligação (tal como um antígeno). A menos que indicado em contrário, da forma utilizada no presente, “afinidade de ligação” designa afinidade de ligação intrínseca que reflete interação 1:1 entre membros de um par de ligação (tais como anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (KD, que é a razão entre a constante de dissociação de X para Y (kd ou koff) e a constante de associação de X para Y (ka ou kon)). Uma medição substituta da afinidade de um ou mais anticorpos para o seu alvo é a sua meia concentração inibidora máxima (IC50), medida de quanto do anticorpo é necessário para inibir a ligação de um ligante conhecido ao alvo de anticorpo em 50%. A afinidade pode ser medida por meio de métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo os descritos no presente. Exemplos e ilustrações específicas de realizações de medição da afinidade de ligação são descritos no presente. A “barreira entre o sangue e o cérebro” ou “BBB” designa a barreira fisiológica entre a circulação periférica e o cérebro e a medula espinhal (ou seja, o SNC) que é formada por junções firmes dentro das membranas de plasma endotelial capilares do cérebro, criando uma barreira firme que restringe o transporte de moléculas para o cérebro, mesmo moléculas muito pequenas como ureia (60 Daltons). A barreira entre o sangue e o cérebro no interior do cérebro, a barreira entre o sangue e a medula espinhal dentro da medula espinhal e a barreira entre o sangue e a retina no interior da retina são barreiras capilares contíguas dentro do SNC e são denominadas coletivamente no presente barreira entre o sangue e o cérebro ou BBB. A BBB também engloba a barreira entre o sangue e CSF (plexo coroidal), em que a barreira é composta de células ependimais e não células endoteliais capilares.

[0096] As expressões “amiloide beta”, “beta-amiloide”, “Abeta”, “amiloide β” e “Aβ”, utilizadas de forma intercambiável no presente, designam o fragmento de proteína precursora de amiloide (“APP”) que é produzido mediante divisão com β-secretase 1 (“BACE1”) de APP, bem como modificações, fragmentos e quaisquer de seus equivalentes funcionais, incluindo, mas sem limitações, Aβ1-40 e Aβ1-42. Sabe-se que Aβ existe em forma monomérica e associa-se para formar oligômeros e estruturas de fibrilas, que podem ser encontradas como membros componentes de placa de amiloide. A estrutura e as sequências desses peptídeos Aβ são bem conhecidas dos técnicos comuns no assunto e métodos de produção dos mencionados peptídeos ou sua extração do cérebro e outros tecidos são descritos, por exemplo, em Glenner e Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129: 885-890 (1984). Além disso, os peptídeos Aβ também são disponíveis comercialmente em várias formas.

[0097] “Imunoglobulina anti-Abeta”, “anticorpo anti-Abeta" e “anticorpo que liga Abeta” são utilizados de forma intercambiável no presente e designam um anticorpo que se liga especificamente a Abeta humano. Um exemplo não limitador de um anticorpo anti-Abeta é crenezumab. Outros exemplos não limitadores de anticorpos anti-Abeta são solanezumab, bapineuzumab, gantenerumab, aducanumab, ponezumab e quaisquer anticorpos anti-Abeta descritos nas publicações a seguir: WO 2000162801, WO 2002046237, WO 2002003911, WO 2003016466, WO 2003016467, WO 2003077858, WO 2004029629, WO 2004032868, WO 2004108895, WO 2005028511, WO 2006039470, WO 2006036291, WO 2006066089, WO 2006066171, WO 2006066049, WO 2006095041 e WO 2009027105.

[0098] Os termos “crenezumab” e “MABT5102A” são utilizados de forma intercambiável no presente e designam um anticorpo anti-Abeta específico que se liga às formas monoméricas, oligoméricas e de fibrila de Abeta e é associado ao registro CAS n° 1095207. Em uma realização, esse anticorpo compreende sequências descritas nas Figuras 18A e 18B.

[0099] “Veículo de apolipoproteína E4” ou “veículo ApoE4”, utilizados de forma intercambiável no presente com “positivo para apolipoproteína E4” ou “positivo para ApoE4”, designam um indivíduo que possui pelo menos um alelo de apolipoproteína E4 (ou “ApoE4”). Um indivíduo com zero alelos de ApoE4 é designado no presente como sendo “negativo para ApoE4” ou “não veículo para ApoE4”. Vide também Prekumar et al, 1996, Am. J. Pathol. 148: 2083-95.

[00100] A expressão “edema vasogênico cerebral” designa excesso de acúmulo de proteína ou fluido intravascular nos espaços intracelulares ou extracelulares do cérebro. Edema vasogênico cerebral é detectável, por exemplo, por meio de MRI do cérebro, incluindo, mas sem limitações, MRI FLAIR, e pode ser assintomático (“edema vasogênico assintomático”) ou associado a sintomas neurológicos, tais como confusão, tontura, vômitos e letargia (“edema vasogênico sintomático”) (vide Sperling et al, Alzheimer’s & Dementia, 7: 367, 2011).

[00101] A expressão “macro-hemorragia cerebral” designa hemorragia intracraniana ou sangramento no cérebro de uma área que possui mais de cerca de 1 cm de diâmetro. A macro-hemorragia cerebral é detectável, por exemplo, por meio de MRI do cérebro, incluindo, mas sem limitações, GRE MRI com peso T2*, e pode ser assintomática ("macro-hemorragia assintomática") ou associada a sintomas tais como impedimento sensorial ou motor focal transitório ou permanente, ataxia, afasia e disartria (“macro- hemorragia sintomática”) (vide, por exemplo, Chalela, J. A., Gomes, J. Expert Rev. Neurother. 2004 4: 267, 2004 e Sperling et al, Alzheimer’s & Dementia, 7: 367, 2011).

[00102] A expressão “micro-hemorragia cerebral” designa hemorragia intracraniana ou sangramento no cérebro de uma área que possui menos de cerca de 1 cm de diâmetro. A micro-hemorragia cerebral é detectável, por exemplo, por meio de MRI do cérebro, incluindo, mas sem limitações, GRE MRI com peso T2*, e pode ser assintomática (“micro- hemorragia assintomática”) ou potencialmente associada a sintomas tais como impedimento sensorial ou motor focal transitório ou permanente, ataxia, afasia e disartria (“micro-hemorragia sintomática”). Vide, por exemplo, Greenberg et al, 2009, Lancet Neurol. 8: 165-74.

[00103] A expressão “efusão sulcal” designa efusão de fluido nas cavidades ou sulcos do cérebro. Efusões sulcais são detectáveis, por exemplo, por meio de MRI cerebral, incluindo, mas sem limitações, MRI FLAIR. Vide Sperling et al, Alzheimer’s & Dementia, 7: 367, 2011.

[00104] A expressão “siderose superficial do sistema nervoso central” designa sangramento ou hemorragia no espaço subaracnoide do cérebro e é detectável, por exemplo, por meio de MRI cerebral, incluindo, mas sem limitações, MRI GRE com peso T2*. Os sintomas indicativos de siderose superficial do sistema nervoso central incluem surdez sensorineural, ataxia cerebelar e sinais piramidais. Vide Kumara N., Am. J. Neuroradiol. 31: 5, 2010.

[00105] O termo “amiloidose”, da forma utilizada no presente, designa um grupo de doenças e distúrbios causados por amiloide ou proteínas similares a amiloide ou a elas associados e inclui, mas sem limitações, doenças e distúrbios causados pela presença ou atividade de proteínas similares a amiloide em estado monomérico, de fibrilas ou polimérico ou qualquer combinação dos três, incluindo por placas de amiloide. Essas doenças incluem, mas sem limitações, amiloidose secundária e amiloidose relativa à idade, tais como doenças que incluem, mas sem limitações, distúrbios neurológicos tais como Mal de Alzheimer (“AD”), doenças ou condições caracterizadas por perda da capacidade de memória cognitiva tal como impedimento cognitivo suave (MCI), demência de corpos Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês), complexo de demência de Guam Parkinson e outras doenças que são baseadas em proteínas similares a amiloide ou a elas associadas tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, mal de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relativa a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite de corpos de inclusão (IBM), diabete com início em adultos, tumor endócrino e amiloidose cardíaca senil, bem como várias doenças dos olhos, incluindo degeneração macular, neuropatia óptica relativa a drusas, glaucoma e catarata devido à deposição de beta-amiloide.

[00106] Glaucoma é um grupo de doenças do nervo óptico que envolvem a perda de células dos gânglios da retina (RGCs) em um padrão característico de neuropatia óptica. RGCs são as células nervosas que transmitem sinais visuais do olho para o cérebro. Caspase-3 e caspase-8, duas enzimas importantes no processo apoptótico, são ativadas no processo gerador de apoptose de RGCs. Caspase-3 divide proteína precursora de amiloide (APP) para produzir fragmentos neurotóxicos, incluindo Abeta. Sem o efeito protetor de APP, o acúmulo de Abeta na camada de células dos gânglios da retina resulta na morte de RGCs e perda irreversível da visão.

[00107] Glaucoma é frequentemente, mas nem sempre, acompanhada por aumento da pressão ocular, que pode ser resultado do bloqueio da circulação aquosa ou sua drenagem. Embora pressão intraocular elevada seja um fator de risco significativo para o desenvolvimento de glaucoma, nenhum limite de pressão intraocular pode ser definido, o que seria determinante para causar glaucoma. A lesão pode também ser causada por mau fornecimento de sangue para as fibras dos nervos ópticos vitais, fraqueza na estrutura do nervo e/ou problema na saúde das próprias fibras dos nervos. Glaucoma não tratado gera danos permanentes do nervo óptico e perda de campo visual resultante, que pode progredir até a cegueira.

[00108] A expressão “mal de Alzheimer suave” ou “AD suave”, da forma utilizada no presente (por exemplo, “paciente diagnosticado com AD suave”) designa um estágio de AD caracterizado por avaliação de MMSE de 20 a 26.

[00109] A expressão “mal de Alzheimer suave a moderado” ou “AD suave a moderado", da forma utilizada no presente, engloba AD suave e moderado e é caracterizada por avaliação de MMSE de 18 a 26.

[00110] A expressão “mal de Alzheimer moderado” ou “AD moderado”, da forma utilizada no presente (por exemplo, “paciente diagnosticado com AD moderado”), designa um estágio de AD caracterizado por avaliação de MMSE de 18 a 19.

[00111] O “sistema nervoso central” ou “SNC" designa o complexo de tecidos nervosos que controlam as funções do corpo e incluem o cérebro e a medula espinhal.

[00112] “Receptor da barreira entre o sangue e o cérebro” (abreviado “BBB-R" no presente) é uma proteína receptora de transmembrana expressa sobre células endoteliais cerebrais que é capaz de transportar moléculas através da barreira entre o sangue e o cérebro. Exemplos de BBB-R incluem, mas sem limitações: receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor de fator de crescimento similar à insulina (IGF-R), receptores de lipoproteína com baixa densidade, incluindo, sem limitações, proteína relativa a receptor de lipoproteína com baixa densidade 1 (LRP1) e proteína relativa a receptor de lipoproteína com baixa densidade 8 (LRP8), transportador de glicose 1 (Glut1) e fator de crescimento similar a fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF). Um exemplo de BBB-R no presente é receptor de transferrina (TfR).

[00113] A expressão “receptor de transferrina” ou “TfR”, da forma utilizada no presente, designa qualquer TfR nativo de qualquer fonte vertebrada, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos) e roedores (tais como ratos e camundongos), a menos que indicado em contrário. A expressão engloba “comprimento total", TfR não processado e qualquer forma de TfR que resulte do processamento na célula. A expressão também engloba variantes de TfR de ocorrência natural, tais como variantes divididas ou variantes alélicas. TfR é uma glicoproteína transmembrana (com peso molecular de cerca de 180.000) composta de duas subunidades ligadas por dissulfeto (cada uma com peso molecular aparente de cerca de 90.000) envolvidas na absorção de ferro em vertebrados. Em uma realização, TfR no presente é TfR humana ("hTfR") que compreende a sequência de aminoácidos descrita em Schneider et al, Nature 311: 675-678 (1984), por exemplo (SEQ ID NO: 1). Em outra realização, o TfR no presente é TfR de primata (“pTfR”) que compreende a sequência de aminoácidos descrita na referência Genbank AFD18260.1 (SEQ ID NO: 2). Para comparação, a sequência de TfR de camundongo pode ser encontrada na referência Genbank AAH54522.1 (SEQ ID NO: 3).

[00114] “Distúrbio neurológico”, da forma utilizada no presente, designa uma doença ou distúrbio que afeta o SNC e/ou que possui etiologia no SNC. Exemplos de doenças ou distúrbios do SNC incluem, mas sem limitações, neuropatia, amiloidose, câncer, doença ou distúrbio ocular, infecção viral ou microbiana, inflamação, isquemia, doença neurodegenerativa, mal súbito, distúrbios do comportamento e doença de armazenagem lisossomal. Para os propósitos do presente pedido, o SNC será compreendido como incluindo o olho, que normalmente é sequestrado do restante do corpo pela barreira entre o sangue e a retina. Exemplos específicos de distúrbios neurológicos incluem, mas sem limitações, doenças neurodegenerativas (que incluem, mas sem limitações, doença de corpos Lewy, síndrome pós- poliomielite, síndrome de Shy-Draeger, atrofia olivopontocerebelar, mal de Parkinson, atrofia de sistemas múltiplos, degeneração estriatonigral, tauopatias (que incluem, mas sem limitações, mal de Alzheimer e paralisia supranuclear), doenças de príon (que incluem, mas sem limitações, encefalopatia espongiforme bovina, tremor epizoótico, síndrome de Creutzfeldt-Jakob, kuru, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de perda crônica e insônia familiar fatal), paralisia dos bulbos, doenças neuronais motoras e distúrbios heterodegenerativos do sistema nervoso (que incluem, mas sem limitações, mal de Canavan, mal de Huntington, ceroidelipofuscinose neuronal, mal de Alexander, síndrome de Tourette, síndrome de pêlos encaracolados de Menkes, síndrome de Cockayne, síndrome de Halervorden-Spatz, mal de Iafora, síndrome de Rett, degeneração hepatolenticular, síndrome de Lesch- Nyhan e síndrome de Unverricht-Lundborg), demência (incluindo, mas sem limitações, mal de Pick e ataxia espinho-cerebelar) e câner (por exemplo, do SNC, incluindo metástases no cérebro resultantes de câncer em outras partes do corpo).

[00115] “Droga de distúrbio neurológico” é uma droga ou agente terapêutico que trata um ou mais distúrbios neurológicos. Drogas de distúrbios neurológicos de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitações, anticorpos, peptídeos, proteínas, ligantes naturais de um ou mais alvos do SNC, versões modificadas de ligantes naturais de um ou mais alvos do SNC, aptâmeros, ácidos nucleicos inibidores (ou seja, RNAs inibidores pequenos (siRNA) e RNAs de grampo de cabelo curtos (shRNA)), ribozimas e moléculas pequenas ou fragmentos ativos de quaisquer dos acima. Exemplos de drogas de distúrbios neurológicos de acordo com a presente invenção são descritos no presente e incluem, mas sem limitações: anticorpos, aptâmeros, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos inibidores e moléculas pequenas e fragmentos ativos de quaisquer dos acima que são, por si próprios, ou reconhecem especificamente e/ou agem (ou seja, inibem, ativam ou detectam) sobre uma molécula alvo ou antígeno do SNC, tal como, mas sem limitações, proteína precursora amiloide ou suas partes, amiloide beta, beta-secretase, gama- secretase, tau, alfa-sinucleina, parquina, huntingtina, DR6, presenilina, ApoE, glioma ou outros marcadores de câncer do SNC e neurotrofinas. Exemplos não limitadores de drogas para distúrbios neurológicos e os distúrbios para os quais podem ser utilizados são fornecidos na Tabela 1 a seguir.

TABELA 1

[00116] Exemplos não limitadores de drogas para distúrbios neurológicos e os distúrbios correspondentes:

[00117] “Agente formador de imagens” é um composto que possui uma ou mais propriedades que permitem a detecção direta ou indireta da sua presença e/ou localilzação. Exemplos desses agentes de formação de imagens incluem proteínas e compostos de moléculas pequenas que incorporam uma porção marcada que permite a detecção.

[00118] “Antígeno do SNC” ou “antígeno do cérebro” é um antígeno expresso no SNC, incluindo o cérebro, que pode ser dirigido com um anticorpo ou molécula pequena. Exemplos desses antígenos incluem, sem limitações: beta-secretase 1 (BACE1), amiloide beta (Abeta), receptor de fator do crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator do crescimento epidérmico humano 2 (HER2), tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase de repetição rica em leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama-secretase, receptor de morte 6 (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR), receptor de interleucina 6 (IL6R), receptor de TNF 1 (TNFR1), interleucina 1 beta (IL1β) e caspase 6. Em uma realização, o antígeno é BACE1.

[00119] O termo “BACE1”, da forma utilizada no presente, designa qualquer beta-secretase 1 nativa (também denominada enzima de divisão de proteína precursora de amiloide de local β 1, protease aspártica associada a membrana 2, memapsina 2, aspartil protease 2 ou Asp2) de qualquer fonte vertebrada, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos) e roedores (por exemplo, ratos e camundongos), a menos que indicado em contrário. O termo engloba BACE1 não processado com “comprimento total”, bem como qualquer forma de BACE1 que resulte de processamento na célula. O termo também engloba variantes de BACE1 de ocorrência natural, tais como variantes de divisão ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de um exemplo de polipeptídeo BACE1 é a sequência de BACE1 humano, isoforma A, conforme relatado em Vassar et al, Science 286: 735-741 (1999), que é integralmente incorporado ao presente como referência. Existem diversas outras isoformas de BACE1 humano, incluindo as isoformas B, C e D. Vide UniProtKB/Swiss-Prot n° P56817, que é incorporado integralmente ao presente como referência.

[00120] As expressões “anticorpo antibeta-scretase”, “anticorpo anti-BACE1”, “anticorpo que se liga a beta-secretase” e “anticorpo que se liga a BACE1” designam um anticorpo que é capaz de ligar BACE1 com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como agente de diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento a BACE1. Em uma realização, a extensão da ligação de um anticorpo anti-BACE1 a uma proteína não de BACE1 não relacionada é de menos de cerca de 10% da ligação do anticorpo a BACE1 conforme medido, por exemplo, por meio de radioimunoteste (RIA). Em certas realizações, um anticorpo que se liga a BACE1 possui constante de dissociação (Kd) de < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em certas realizações, um anticorpo anti-BACE1 liga-se a um epítopo de BACE1 que é conservado entre BACE1 de diferentes espécies e isoformas. Em uma realização, é fornecido um anticorpo que se liga ao epítopo sobre BACE1 ligado por anticorpo anti-BACE12 YW412.8.31. Em outras realizações, é fornecido um anticorpo que se liga a um exolocal em BACE1 localizado no domínio catalítico de BACE1. Em uma realização, é fornecido um anticorpo que concorre com os peptídeos identificados em Kornacker et al, Biochem. 44: 11567-11573 (2005), que é integralmente incorporado ao presente como referência (ou seja, peptídeos 1, 2, 3, 1-11, 110, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 2-12, 3-12, 4-12, 5-12, 6-12, 7-12, 8-12, 9-12, 10-12, 4, 5, 6, 5-10, 5-9, misturado, Y5A, P6A, Y7A, F8A, I9A, P10A e L11A) para ligação a BACE1. Exemplos de sequências de anticorpos BACE1 são ilustrados nas Figs. 15A-B e nas Figs. 16A-B. Um exemplo de anticorpo do presente compreende os domínios variáveis do anticorpo YW412.8.31 (por exemplo, nas Figs. 15A-B).

[00121] Proteína de “sequência nativa” no presente designa uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de uma proteína encontrada na natureza, incluindo variantes de ocorrência natural da proteína. A expressão, da forma utilizada no presente, inclui a proteína isolada da sua fonte natural ou produzida de forma recombinante.

[00122] O termo “anticorpo” é utilizado no presente no sentido mais amplo e engloba diversas estruturas de anticorpos, incluindo, mas sem limitações, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade de ligação de antígenos desejada.

[00123] “Fragmento de anticorpo” designa uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma parte de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual se liga o anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Nelson, MAbs (2010) 2 (1): 77-83) e incluem, mas sem limitações, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de fita simples, incluindo, mas sem limitações, fragmentos variáveis de fita simples (scFv), fusões de domínios de ligação de antígenos de cadeia leve e/ou pesada com ou sem ligante (e opcionalmente in tandem); e moléculas de ligação de antígenos monoespecíficos ou multiespecíficos formadas a partir de fragmentos de anticorpos (incluindo, mas sem limitações, anticorpos multiespecíficos construídos com diversos domínios variáveis que não contêm regiões Fc).

[00124] A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam o mesmo epítopo, exceto por possíveis variantes, por exemplo, que contêm mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, em que essas variantes estão geralmente presentes em quantidades menores. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpos monoclonais é dirigido a um único determinante sobre o antígeno. O adjetivo “monoclonal” indica a característica do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser considerado exigindo a produção do anticorpo por meio de nenhum método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados, por exemplo, por meio de uma série de métodos, que incluem, mas sem limitações, o método de hibridoma (vide, por exemplo, Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.816.567), métodos de exibição de fagos (utilizando, por exemplo, os métodos descritos em Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)) e métodos que utilizam animais transgênicos que contêm, no todo ou em parte, os locais de imunoglobulina humana, em que esses métodos e outros exemplos de métodos de elaboração de anticorpos monoclonais são descritos no presente. Exemplos específicos de anticorpos monoclonais no presente incluem anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos, incluindo seus fragmentos de ligação de antígenos.

[00125] Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamente anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas), nos quais uma parte da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes de anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente Norte-Americana n° 4.816.567; Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81: 6851-6855 (1984)).

[00126] “Cadeia principal humana receptora”, para os propósitos do presente, é uma cadeia principal que compreende a sequência de aminoácidos de uma cadeia principal de domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma cadeia principal de domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma cadeia principal de imunoglobulina humana ou uma cadeia principal de consenso humana, conforme definido abaixo. Cadeia principal humana receptora “derivada de” uma cadeia principal de imunoglobulina humana ou cadeia principal de consenso humana pode compreender a sua mesma sequência de aminoácidos ou pode conter alterações de sequência de aminoácidos. Em algumas realizações, a quantidade de alterações de aminoácidos é de dez ou menos, nove ou menos, oito ou menos, sete ou menos, seis ou menos, cinco ou menos, quatro ou menos, três ou menos ou duas ou menos. Em algumas realizações, a cadeia principal humana receptora VL possui sequência idêntica à sequência de cadeia principal de imunoglobulina humana VL ou sequência de cadeia principal de consenso humana.

[00127] “Cadeia principal de consenso humana” é uma cadeia principal que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de cadeia principal VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo tal como em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Publicação NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Em uma realização, para o VL, o subgrupo é subgrupo capa I como em Kabat et al, acima. Em uma realização, para o VH, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat et al, acima.

[00128] As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de anticorpos não humanos. Na maior parte, os anticorpos humanizados são anticorpos humanos (anticorpo receptor), nos quais os resíduos de uma região hipervariável do paciente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em certas realizações, por exemplo, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (tais como CDRs) correspondem às de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as regiões de cadeia principal (FRs) correspondem às de um anticorpo humano. Em alguns casos, os resíduos de FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essas modificações são realizadas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem às de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs são as de um anticorpo humano, exceto por substituição(ões) de FR conforme indicado acima. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante de anticorpo, tipicamente a de um anticorpo humano. “Forma humanizada” de anticorpo, tal como anticorpo não humano, designa um anticorpo que tenha sofrido humanização. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

[00129] “Anticorpo humano” no presente é um anticorpo que compreende uma estrutura de sequência de aminoácidos que corresponde à estrutura de sequência de aminoácidos de um anticorpo produzido por seres humanos ou células humanas, ou derivada de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências de codificação de anticorpos humanos. Esta definição de anticorpo humano exclui especificamente anticorpos humanizados que compreendem resíduos de ligação de antígenos não humanos. Esses anticorpos podem ser identificados ou elaborados por meio de uma série de métodos, que incluem, mas sem limitações: produção por animais transgênicos (tais como camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena (vide, por exemplo, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7: 33 (1993); e Patentes Norte-Americanas n° 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807)); seleção de bibliotecas de exibição de fago que expressam anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos (vide, por exemplo, McCafferty et al, Nature 348: 552-553 (1990); Johnson et al, Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993); Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Griffith et al, EMBO J. 12: 725-734 (1993); Patentes Norte-Americanas n° 5.565.332 e 5.573.905); geração por meio de células B ativadas in vitro (vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.567.610 e 5.229.275); e isolamento a partir de hibridomas produtores de anticorpos humanos.

[00130] “Anticorpo multiespecífico” no presente é um anticorpo que possui especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Exemplos de anticorpos multiespecíficos podem ligar um TfR e um antígeno do cérebro. Anticorpos multiespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (tais como anticorpos biespecíficos F(ab’)2). Anticorpos elaborados com dois, três ou mais (por exemplo, quatro) locais de ligação de antígenos funcionais também são contemplados (vide, por exemplo, Pedido de Patente Norte-Americano n° US 2002/0004587 A1, Miller et al). Anticorpos multiespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos com comprimento total ou fragmentos de anticorpos.

[00131] Anticorpos no presente incluem “variantes de sequências de aminoácidos” com atividade biológica ou de ligação de antígenos alterada. Exemplos dessas alterações de aminoácidos incluem anticorpos com maior afinidade para antígeno (por exemplo, anticorpos “amadurecidos por afinidade”) e anticorpos com região Fc alterada, quando presentes, por exemplo, com citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) alterada (aumentada ou reduzida) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (vide, por exemplo, WO 00/42072, Prestas, L. e WO 99/51642, Iduosogie et al); e/ou meia vida em soro aumentada ou reduzida (vide, por exemplo, WO 00/42072, Presta, L.).

[00132] “Variante modificada por afinidade” possui uma ou mais regiões hipervariáveis substituídas ou resíduos de cadeia principal de um anticorpo parental (por exemplo, de um anticorpo humano, humanizado ou quimérico parental) que alteram (aumentam ou reduzem) a afinidade. Uma forma conveniente de geração dessas variantes de substituição utiliza exibição de fagos. Resumidamente, vários locais de região hipervariável (tais como seis a sete locais) sofrem mutação para gerar todas as substituições amino possíveis em cada local. As variantes de anticorpos geradas desta forma são exibidas de maneira monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões ao produto de gene III de M13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas em fago são selecionadas em seguida pela sua atividade biológica (tal como afinidade de ligação). A fim de identificar possíveis locais de regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese de varrimento de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuem significativamente para a ligação de antígenos. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo de antígeno e anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e seu alvo. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente. Após a geração dessas variantes, o quadro de variantes é submetido a seleção e anticorpos com afinidade alterada podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

[00133] “Variante de anticorpo sensível a pH” é uma variante de anticorpo que possui afinidade de ligação diferente para um antígeno alvo em primeiro pH daquele antígeno alvo sob pH diferente. Como exemplo não limitador, um anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção pode ser selecionado ou elaborado para ter ligação sensível a pH a TfR, de forma a ligar-se com afinidade desejavelmente baixa (conforme descrito no presente) a TfR da superfície celular no plasma sob pH 7,4, mas, mediante internalização em um compartimento endossomal, dissocia-se rapidamente de TfR sob pH relativamente mais baixo (pH 5,5-6,0); essa dissociação pode proteger o anticorpo contra liberação mediada por antígeno e aumentar a quantidade de anticorpo que é fornecida para o SNC ou reciclada de volta através da BBB; em qualquer dos casos, a concentração eficaz do anticorpo aumenta com relação a um anticorpo anti-TfR que não compreende essa sensibilidade a pH (vide, por exemplo, Chaparro-Riggers et al, J. Biol. Chem. 287 (14): 11090-11097; Igawa et al, Nature Biotechnol. 28 (11): 1203-1208). A combinação desejada de afinidades no pH do soro e no pH do compartimento endossomal pode ser facilmente determinada para TfR e composto conjugado pelos técnicos comuns no assunto.

[00134] O anticorpo do presente pode ser conjugado a uma “molécula heteróloga”, por exemplo, para aumentar a meia vida, a estabilidade ou melhorar de outra forma o anticorpo. O anticorpo pode ser ligado, por exemplo, a um dentre uma série de polímeros não proteináceos, tais como polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. Fragmentos de anticorpos, tais como Fab’, ligados a uma ou mais moléculas de PEG são um exemplo de realização da presente invenção. Em outro exemplo, a molécula heteróloga é um composto terapêutico ou um agente de visualização (ou seja, uma marca detectável) e o anticorpo está sendo utilizado para transportar essa molécula heteróloga através da BBB. Exemplos de moléculas heterólogas incluem, mas sem limitações, um composto químico, peptídeo, polímero, lipídio, ácido nucleico e proteína.

[00135] O anticorpo do presente pode ser uma “variante de glicosilação”, de tal forma que qualquer carboidrato ligado à região Fc, quando presente, seja alterado, modificado na sua presença/ausência ou tenha seu tipo modificado. Anticorpos com estrutura de carboidrato madura que não contém fucose ligada a região Fc do anticorpo, por exemplo, são descritos no Pedido de Patente Norte-Americano n° US 2003/0157108 A1 (Presta, L.). Vide também US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Anticorpos com N- acetilglucosamina (GlcNAc) bisseccionada no carboidrato ligado a uma região Fc do anticorpo são indicados em WO 2003/011878, Jean-Mairet et al, e na Patente Norte-Americana n° 6.602.684, Umana et al. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado a uma região Fc do anticorpo são relatados em WO 1997/30087, Patel et al. Vide também WO 1998/58964 (Raju, S.) e WO 1999/22764 (Raju, S.), referentes a anticorpos com carboidrato alterado ligado à sua região Fc. Vide ainda US 2005/0123546 (Umana et al), que descreve anticorpos com glicosilação modificada. Mutação da sequência de glicosilação de consenso na região Fc (Asn-X-Ser/Thr nas posições 297-299, em que X não pode ser prolina), por exemplo, por meio de mutação do Asn dessa sequência em qualquer outro aminoácido, colocando-se Pro na posição 298 ou modificando-se a posição 299 por qualquer aminoácido diferente de Ser ou Thr, deverá eliminar a glicosilação naquela posição (vide, por exemplo, Fares Al-Ejeh et al, Clin. Cancer Res. (2007) 13: 5519s-5527s; Imperiali e Shannon, Biochemistry (1991) 30 (18): 4374-4380; Katsuri, Biochem. J. (1997) 323 (Parte 2): 415-419; Shakin-Eshleman et al, J. Biol. Chem. (1996) 271: 6363-6366).

[00136] A expressão “região hipervariável” ou “HVR”, da forma utilizada no presente, indica cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são de sequência hipervariável (“regiões de determinação da complementaridade” ou “CDRs”) e/ou formam circuitos definidos estruturalmente (“circuitos hipervariáveis”) e/ou contêm os resíduos de contato de antígenos (“contatos de antígenos”). Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs: três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). Exemplos de HVRs no presente incluem: (a) circuitos hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)); (c) contatos de antígenos que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) e 93101 (H3) (MacCallum et al, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) combinações de (a), (b) e/ou (c), incluindo resíduos de aminoácidos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).

[00137] Em uma realização, resíduos de HVR compreendem os identificados nas Figuras 3A-D ou 4A-D, Tabela 4 ou Tabela 5 ou em outros pontos do relatório descritivo.

[00138] A menos que indicado em contrário, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (tais como resíduos de FR) são numerados no presente de acordo com Kabat et al, acima.

[00139] Resíduos de “cadeia principal” ou “FR” são os resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido no presente. FR de um domínio variável consiste geralmente de quatro domínios de FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de FR e HVR geralmente aparecem na sequência a seguir em VH (ou VL): FR1- H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. Em certas realizações, um ou mais resíduos de FR podem ser modificados para modular a estabilidade do anticorpo ou modular o posicionamento tridimensional de uma ou mais HVRs do anticorpo, por exemplo, para aumentar a ligação.

[00140] “Anticorpo com comprimento local” é aquele que compreende uma região variável de ligação de antígenos, bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humanos) ou suas variantes de sequências de aminoácidos.

[00141] As expressões “anticorpo com comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo inteiro” são utilizadas no presente de forma intercambiável para designar um anticorpo que possui estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que possui cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido no presente.

[00142] “Anticorpo bruto” designa um anticorpo que não é conjugado a uma porção heteróloga (tal como uma porção citotóxica ou rádio marca). O anticorpo bruto pode estar presente em uma formulação farmacêutica.

[00143] “Anticorpos nativos” designam moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variáveis. Anticorpos de IgG nativos, por exemplo, são glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150.000 Daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por dissulfeto. Do terminal N ao C, cada cadeia pesada possui uma região variável (VH), também denominada domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguida por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). De forma similar, do terminal N ao C, cada cadeia leve possui uma região variável (VL), também denominada domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguida por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos, denominados capa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante.

[00144] “Funções efetoras” do anticorpo designam atividades biológicas de um anticorpo que resultam na ativação do sistema imunológico diferente da ativação do processo de complementos. Essas atividades são encontradas, em grande parte, na região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem, por exemplo, ligação de receptor Fc e citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC). Em uma realização, o anticorpo do presente essencialmente não possui função efetora. Em outra realização, o anticorpo do presente retém função efetora mínima. Métodos de modificação ou eliminação da função efetora são bem conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitações, eliminação, no todo ou em parte, da região Fc responsável pela função efetora (ou seja, utilizando um anticorpo ou fragmento de anticorpo em um formato que não contém, no todo ou em parte, a região Fc, tal como, mas sem limitações, fragmento de Fab, anticorpo de fita simples e similares, conforme descrito no presente e conhecido na técnica; modificação da região Fc em uma ou mais posições de aminoácidos para eliminar a função efetora (impacto de ligação de Fc: posições 238, 239, 248, 249, 252, 254, 256, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 311, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 436, 437, 438 e 439; e modificação da glicosilação do anticorpo (incluindo, mas sem limitações, produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação de mamíferos do tipo selvagem, remoção de um ou mais grupos de carboidratos de um anticorpo já glicosilado e modificação do anticorpo em uma ou mais posições de aminoácidos para eliminar a capacidade do anticorpo a ser glicosilado nessas posições (incluindo, mas sem limitações, N297G, N297A e D265A).

[00145] Funções de “ativação de complemento” de anticorpos ou propriedades de um anticorpo que permitem ou acionam a “ativação do processo de complemento” são utilizadas de forma intercambiável e designam as atividades biológicas de um anticorpo que acionam ou estimulam o processo de complemento do sistema imunológico dos pacientes. Essas atividades incluem, por exemplo, ligação de C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e podem ser mediadas pela parte Fc e pela parte não Fc do anticorpo. Métodos de modificação ou eliminação da função de ativação de complemento são bem conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitações, a eliminação, no todo ou em parte, da região Fc responsável pela ativação de complemento (utilizando, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo em formato que não contém, no todo ou em parte, a região Fc, tal como, mas sem limitações, fragmento de Fab, anticorpo de fita simples e similares conforme descrito no presente e conhecido na técnica, ou modificando a região Fc em uma ou mais posições de aminoácidos para eliminar ou reduzir as interações com componentes de complemento ou a capacidade de ativar componentes de complemento, tais como as posições 270, 322, 329 e 321, conhecidamente envolvidas na ligação de C1q) e modificando ou eliminando uma parte da região não-Fc responsável pela ativação de complemento (ou seja, modificando a região CH1 na posição 132 (vide, por exemplo, Vidarte et al (2001), J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223)).

[00146] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos com comprimento total podem ser atribuídos a “classes” diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos com comprimento total: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isótipos), tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de anticorpos são denominados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas na técnica.

[00147] A expressão “anticorpo recombinante”, da forma utilizada no presente, designa um anticorpo (tal como um anticorpo quimérico, humanizado ou humano ou seu fragmento de ligação de antígenos) que é expresso por uma célula hospedeira recombinante que compreende ácido nucleico que codifica o anticorpo.

[00148] As expressões “célula hospedeira”, “linhagem de células hospedeiras” e “cultivo de células hospedeiras” são utilizadas de forma intercambiável e designam células nas quais o ácido nucleico exógeno tenha sido introduzido, incluindo a prole dessas células. As células hospedeiras incluem “transformadores” e “células transformadas", que incluem a célula transformada primária e a prole delas derivada sem considerar o número de passagens. A prole pode não ter teor de ácido nucleico completamente idêntico a uma célula parental, mas pode conter mutações. Inclui-se no presente prole mutante que possui a mesma função ou atividade biológica conforme selecionado na célula transformada originalmente. Exemplos de “células hospedeiras” para a produção de anticorpos recombinantes incluem: (1) células de mamíferos, tais como ovário de hamster chinês (CHO), COS, células de mieloma (incluindo células Y0 e NS0), rim de filhote de hamster (BHK), células Hela e Vero; (2) células de insetos, tais como sf9, sf21 e Tn5; (3) células de plantas, tais como plantas pertencentes ao gênero Nicotiana (por exemplo, Nicotiana tabacum); (4) células de leveduras, tais como as pertencentes ao gênero Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae) ou ao gênero Aspergillus (por exemplo, Aspergillus niger); (5) células bacterianas, tais como células de Escherichia coli ou células de Bacillus subtilis etc.

[00149] Da forma utilizada no presente, “que se liga especificamente” ou “liga-se especificamente a” designa um anticorpo que se liga seletiva ou preferencialmente a um antígeno. A afinidade de ligação é determinada com um teste padrão, tal como análise de Scatchard ou método de ressonância de plasma de superfície (utilizando, por exemplo, BIAcore®).

[00150] “Anticorpo que se liga ao mesmo epítopo”, como anticorpo de referência, designa um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um teste de competição em 50% ou mais e, por outro lado, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um teste de competição em 50% ou mais. Em uma realização, um anticorpo anti-BACE1 que forma um dos anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos de acordo com a presente invenção liga-se ao epítopo BACE1 ligado por YW412.8.31. É fornecido no presente um exemplo de teste de competição.

[00151] A expressão “agente citotóxico”, da forma utilizada no presente, indica uma substância que inibe ou evita uma função celular e/ou causa destruição ou morte das células. Os agentes citotóxicos incluem, mas sem limitações, isótopos radioativos (tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu), drogas ou agentes quimioterapêuticos (tais como metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outros agentes intercalantes); agentes inibidores do crescimento; enzimas e seus fragmentos, tais como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem animal, vegetal, fúngica ou bacteriana, incluindo seus fragmentos e/ou variantes; e os diversos agentes antitumores ou anticancerígenos descritos abaixo.

[00152] “Quantidade eficaz” de um agente, tal como formulação farmacêutica, designa uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado.

[00153] A expressão “região Fc” no presente é utilizada para definir uma região C terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma parte da região constante. A expressão inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma realização, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana estende-se de Cys226 ou de Pro230 até o terminal carboxila da cadeia pesada. A lisina C terminal (Lys447) da região Fc, entretanto, pode ou não estar presente. A menos que especificado em contrário no presente, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD, 1991.

[00154] A expressão “receptor de FcRn” ou “FcRn”, da forma utilizada no presente, designa um receptor de Fc (“n” indica neonatal) que conhecidamente é envolvido na transferência de IgGs maternas para um feto por meio da placenta humana ou de primatas ou saco vitelino (coelhos) e para recém-nascidos por meio do colostro através do intestino delgado. Também se sabe que FcRn está envolvido na manutenção de níveis constantes de IgG no soro, por meio de ligação das moléculas de IgG e sua reciclagem para o soro. “Região de ligação de FcRn” ou “região de ligação de receptor de FcRn” designa a porção de um anticorpo que interage com o receptor de FcRn. Certas modificações da região de ligação de FcRn de anticorpos aumentam a afinidade do anticorpo ou seu fragmento, para o FcRn, e também aumentam a meia vida in vivo da molécula. Substituições de aminoácidos em uma ou mais das posições de aminoácidos 251, 256, 285, 290, 308, 314, 385, 389, 428, 434 e 436 aumentam a interação do anticorpo com o receptor de FcRn. Substituições nas seguintes posições também aumentam a interação de anticorpos com o receptor de FcRn: 238, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434; por exemplo, sua substituição (Patente Norte-Americana n° 7.371.826).

[00155] “Imunoconjugado” é um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas, incluindo, mas sem limitações, uma marca ou agente citotóxico. Opcionalmente, essa conjugação é realizada por meio de um ligante.

[00156] “Ligante”, da forma utilizada no presente, é uma estrutura que conecta de forma covalente ou não covalente o anticorpo anti-TfR a uma molécula heteróloga. Em certas realizações, o ligante é um peptídeo. Em outras realizações, o ligante é um ligante químico.

[00157] “Marca” é um marcador acoplado ao anticorpo no presente e utilizado para detecção ou formação de imagens. Exemplos dessas marcas incluem: radiomarca, fluoroforo, cromóforo ou marca de afinidade. Em uma realização, a marca é uma radiomarca utilizada para formação de imagens médicas, tal como tc99m ou I123, ou uma marca de centrifugação para formação de imagens por ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagens por ressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês, ferro etc.

[00158] “Indivíduo” ou “paciente” é mamífero. Os mamíferos incluem, mas sem limitações, animais domesticados (tais como vacas, carneiros, gatos, cães e cavalos), primatas (tais como seres humanos e primatas não humanos como macacos), coelhos e roedores (tais como ratos e camundongos). Em certas realizações, o indivíduo ou paciente é um ser humano.

[00159] Anticorpo “isolado” é aquele que tenha sido separado de um componente do seu ambiente natural. Em algumas realizações, um anticorpo é purificado até pureza de mais de 95% ou 99%, conforme determinado, por exemplo, por meio de métodos de eletroforese (tais como SDS-PAGE, concentração isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatografia (tal como HPLC de fase reversa ou troca de íons). Para análise dos métodos de determinação da pureza de anticorpos, vide, por exemplo, Flatman et al, J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).

[00160] “Ácido nucleico isolado” designa uma molécula de ácido nucleico que tenha sido separada de um componente do seu ambiente natural. Ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossômica ou em um local cromossômico que é diferente do seu local cromossômico natural.

[00161] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti- TfR” designa uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos que codificam cadeias leve e pesada de anticorpos (ou seus fragmentos), incluindo a(s) molécula(s) de ácido nucleico em um único vetor ou em vetores separados e essa(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) em um ou mais locais em uma célula hospedeira.

[00162] O termo “bula” é utilizado para designar instruções costumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou avisos referentes à utilização desses produtos terapêuticos.

[00163] “Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos”, com relação a uma sequência de polipeptídeos de referência, é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma possível sequência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para fins de determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, utilizando, por exemplo, software de computador disponível ao público, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados de alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código fonte foi depositado com a documentação do usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TUX510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público por meio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

[00164] Em situações nas quais ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode ser alternativamente expressa como uma dada sequência de aminoácidos A que possui ou compreende certo percentual de identidade de sequências de aminoácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculado conforme segue: 100 vezes a fração X/Y em que X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliados como coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos entre A e B não será igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos entre B e A. A menos que indicado especificamente em contrário, todos os valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, utilizando o programa de computador ALIGN-2.

[00165] A expressão “formulação farmacêutica” designa uma preparação que se encontra em uma forma que permita que a atividade biológica de um ingrediente ativo nela contido seja efetiva e não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para o paciente a quem a formulação seria administrada.

[00166] “Veículo farmaceuticamente aceitável” designa um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente de ingrediente ativo, que não é tóxico para pacientes. Veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas sem limitações, tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[00167] Da forma utilizada no presente, “tratamento” (e suas variações gramaticais tais como “tratar” ou “tratando”) indica intervenção clínica em tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado e pode ser realizado para profilaxia ou durante o transcurso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas sem limitações, a prevenção da ocorrência ou reincidência da doença, alívio dos sintomas, redução de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progressão da doença, melhoria ou redução do estado doentio e remissão ou prognóstico aprimorado. Em algumas realizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção são utilizados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a velocidade do progresso de uma doença.

[00168] A expressão “região variável” ou “domínio variável” indica o domínio de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente possuem estruturas similares, em que cada domínio compreende quatro regiões de cadeia principal (FRs) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVRs) (vide, por exemplo, Kindt et al, Kuby Immunology, sexta edição, W. H. Freeman & Co., pág. 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação de antígenos. Além disso, anticorpos que ligam um antígeno específico podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL de um anticorpo que liga o antígeno para selecionar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al, J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al, Nature 352: 624-628 (1991).

[00169] O termo “vetor”, da forma utilizada no presente, designa uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual é ligado. O termo inclui o vetor como estrutura de ácido nucleico autorreprodutora, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual tenha sido introduzido. Certos vetores são capazes de dirigir a expressão de ácidos nucleicos aos quais são ligados operativamente. Esses vetores são denominados no presente “vetores de expressão”.

2. Composições e métodos: A. Produção de anticorpos anti-TfR e seus conjugados:

[00170] Em um aspecto, a presente invenção é baseada, em parte, em anticorpos anti-TfR que podem ser utilizados para transportar moléculas desejadas através da BBB. Em certas realizações, são fornecidos anticorpos que se ligam a TfR humano. Em certas realizações, são fornecidos anticorpos que se ligam a TfR humano e TfR de primatas. Os anticorpos de acordo com a presente invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de doenças que afetam o cérebro e/ou o SNC.

A. Exemplos de anticorpos anti-TfR:

[00171] Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos isolados que se ligam a TfR. Em certas realizações, um anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção liga-se especificamente a TfR humano e TfR de primata. Em algumas dessas realizações, um anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção não inibe a ligação de transferrina ao TfR. Em algumas dessas realizações, um anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção liga-se a um domínio apical de TfR. Em outras dessas realizações, um anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção liga-se a um domínio não apical de TfR. Em alguns aspectos, os anticorpos anti-TfR podem ser utilizados para transportar um ou mais compostos terapêuticos ou de formação de imagens conjugados através da BBB.

[00172] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 7A4, conforme exibido na Figura 3A e na Tabela 3.

[00173] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 8A2, conforme exibido na Figura 3A e na Tabela 3.

[00174] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 15D2, conforme exibido na Figura 3A e na Tabela 3.

[00175] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (e) HVR-L2 que compreende a seqsuência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 10D11, conforme exibido na Figura 3A e na Tabela 3.

[00176] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 7B10, conforme exibido na Figura 3A e na Tabela 3.

[00177] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 15G11, conforme exibido na Figura 3A e na Tabela 3.

[00178] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 16G5, conforme exibido na Figura 3B e na Tabela 3.

[00179] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 13C3, conforme exibido na Figura 3B e na Tabela 3.

[00180] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 16G4, conforme exibido na Figura 3B e na Tabela 3.

[00181] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 16F6, conforme exibido na Figura 3A e na Tabela 3.

[00182] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 7G7, conforme exibido na Figura 3D e na Tabela 3.

[00183] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 4C2, conforme exibido na Figura 3D e na Tabela 3.

[00184] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 1B12, conforme exibido na Figura 3D e na Tabela 3.

[00185] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 13D4, conforme exibido na Figura 3A e na Tabela 3.

[00186] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 127. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima. Em outro aspecto, o anticorpo é o clone 7A4.v15, conforme exibido na Figura 4B e na Tabela 4.

[00187] Os clones acima se enquadram em quatro grupos complementares, com similaridade de sequências nas HVRs. Conforme exibido na Tabela 3, as sequências de consenso podem ser facilmente derivadas das sequências de anticorpos fornecidas para cada HVR. Como exemplo não limitador, as HVRs de consenso de anticorpo da classe I são as seguintes:

[00188] HVR-L1: Arg-Ala-Ser-Glu-Ser-Val-Asp-[Ser ou Asp]-Tyr- Gly-[Asn ou Pro]-Ser-Phe-Met-His (SEQ ID NO: 45);

[00189] HVR-L2: Arg-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser (SEQ ID NO: 30);

[00190] HVR-L3: Gln-[Gln ou His]-Ser-Asn-Glu-[Ala, Gly ou Asp]- Pro-Pro-Thr (SEQ ID NO: 46);

[00191] HVR-H1: Asp-Tyr-[Ala ou Gly]-Met-His (SEQ ID NO: 47);

[00192] HVR-H2: [Gly ou Val]-Ile-Ser-[Thr, Phe ou Pro]-Tyr-[Phe ou Ser]-Gly-[Arg ou Lys]-Thr-Asn-Tyr-[Asn ou Ser]-Gln-[Lys ou Asn]-Phe-[Lys ou Met]-Gly (SEQ ID NO: 48); e

[00193] HVR-H3: Gly-Leu-Ser-Gly-Asn-[Tyr ou Phe]-Val-[Met ou Val]-Asp-[Tyr ou Phe] (SEQ ID NO: 49) (vide Tabela 4). As sequências de consenso para as classes II e IV também são fornecidas na Tabela 3.

[00194] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima.

[00195] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima.

[00196] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99. Em um aspecto, o anticorpo compreende todas as seis sequências de HVR indicadas acima.

[00197] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências de HVR VH de qualquer um dos anticorpos descritos acima. Em uma realização, o anticorpo compreende a sequência de HVR-H3 de qualquer um dos anticorpos descritos acima. Em outra realização, o anticorpo compreende as sequências de HVR-H3 e HVR-L3 de qualquer um dos anticorpos descritos acima. Em realização adicional, o anticorpo compreende as sequências de HVR-H3, HVR-L3 e HVR-H2 de qualquer um dos anticorpos descritos acima. Em outra realização, o anticorpo compreende as sequências de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de qualquer um dos anticorpos descritos acima. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências de HVR VL de qualquer um dos anticorpos descritos acima. Em uma realização, o anticorpo compreende as sequências de HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 de qualquer um dos anticorpos descritos acima.

[00198] Em outro aspecto, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências de HVR VH selecionadas a partir das sequências de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de qualquer um dos anticorpos descritos acima; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências de HVR VL selecionadas a partir das sequências de HVR-L1, HVR-L2 e HVR- L3 de qualquer um dos anticorpos descritos acima.

[00199] Em qualquer das realizações acima, um anticorpo anti- TfR é humanizado. Em uma realização, um anticorpo anti-TfR compreende HVRs como em qualquer uma das realizações acima e compreende adicionalmente uma cadeia principal humana receptora, tal como uma cadeia principal de imunoglobulina humana ou uma cadeia principal de consenso humana. Em outra realização, um anticorpo anti-TfR compreende HVRs como em qualquer das realizações acima e compreende adicionalmente um VH ou VL que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma ou mais regiões FR. Segundo o Exemplo 2 do presente, os Depositantes realizaram varrimento de alanina sobre certos anticorpos selecionados a partir dos acima e determinaram que foi obtida ligação similar ou aprimorada, apesar das modificações de aminoácidos em posições de FR selecionadas. Conforme exibido nas Figuras 6-1 e 6-2 e no Exemplo 2 do presente, para os grupos de anticorpos de classe I-III, formas variantes dos anticorpos com modificações em um ou mais resíduos de FR retiveram especificidade de ligação e afinidade. Para o anticorpo 15G11, por exemplo, as posições 43 e 48 na FR2 de cadeia leve, a posição 48 na FR2 de cadeia pesada e as posições 67, 69, 71 e 73 na FR3 de cadeia pesada puderam ser modificadas conforme exibido nas Figuras 6-1 e 6-2 e o anticorpo resultante manteve ainda especificidade e forte afinidade de ligação para TfR humano/de primatas. Em outro exemplo, para o anticorpo 7A4, as posições 58 e 68 da FR3 de cadeia leve, a posição 24 na FR1 de cadeia pesada e a posição 71 na FR3 de cadeia pesada puderam ser modificadas conforme exibido nas Figuras 6-1 e 6-2 e o anticorpo resultante ainda reteve especificidade e forte afinidade de ligação para TfR humano/de primatas. Em um terceiro exemplo, para o anticorpo 16F6, as posições 43 e 44 da FR2 de cadeia leve e as posições 71 e 78 da FR3 de cadeia pesada puderam ser modificadas conforme exibido nas Figuras 6-1 e 6-2 e o anticorpo resultante manteve ainda especificidade e forte afinidade de ligação para TfR humano/de primatas. Em outro aspecto, um anticorpo anti-TfR compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) que possui identidade de sequências de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com a sequência de aminoácidos de qualquer um dentre SEQ ID NO: 7-10, 15-18, 20, 25-28, 108, 114, 120 e 126. Em certas realizações, uma sequência de VH que possui identidade de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% contém substituições (tais como substituições conservadoras), inserções ou exclusões com relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-TfR que compreende aquela sequência retém a capacidade de ligar-se a TfR. Em certas realizações, ao todo, de um a dez aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou excluídos em qualquer um dentre SEQ ID NO: 7-10, 15-18, 20, 25-28, 108, 114, 120 e 126. Em certas realizações, substituições, inserções ou exclusões ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-TfR compreende a sequência de VH de qualquer um dentre SEQ ID NO: 7-10, 1518, 20, 25-28, 108, 114, 120 e 126, incluindo modificações pós-tradução daquela sequência. Em uma realização específica, a VH para um anticorpo específico compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir das HVRs definidas acima e na Tabela 3 ou 4 para aquele anticorpo específico. As sequências de VH para os anticorpos de acordo com a presente invenção são exibidas nas Figuras 3 e 4 do presente.

[00200] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-TfR, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) que possui identidade de sequências de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com a sequência de aminoácidos de qualquer um dentre SEQ ID NO: 4-6, 11-14, 19, 21-24, 105, 111, 117 e 123. Em certas realizações, uma sequência de VL que possui identidade de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% contém substituições (tais como substituições conservadoras), inserções ou exclusões com relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-TfR que compreende aquela sequência retém a capacidade de ligar-se a TfR. Em certas realizações, ao todo, de um a dez aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou excluídos em qualquer um dentre SEQ ID NO: 4-6, 11-14, 19, 21-24, 105, 111, 117 e 123. Em certas realizações, as substituições, inserções ou exclusões ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-TfR compreende a sequência de VL em qualquer um dentre SEQ ID NO: 4-6, 11-14, 19, 21-24, 105, 111, 117 e 123, incluindo modificações daquela sequência após a tradução. Em realização específica, VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir das HVRs selecionadas acima e na Tabela 4 ou 5 para aquele anticorpo específico. As sequências de VL para os anticorpos de acordo com a presente invenção são exibidas nas Figuras 3 e 4 do presente.

[00201] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-TfR, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer das realizações fornecidas acima e uma VL como em qualquer das realizações fornecidas acima. Em uma realização, o anticorpo compreende as sequências de VL e VH, respectivamente, em SEQ ID NO: 4 e 7; 5 e 8; 5 e 9; 6 e 10; 4 e 7; 11 e 15; 12 e 16; 13 e 17; 14 e 18; 19 e 20; 21 e 25; 22 e 26; 23 e 27; 24 e 28; 105 e 108; 111 e 114; 117 e 120; e 123 e 126, incluindo modificações pós-tradução dessas sequências.

[00202] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo de um anticorpo anti-TFR fornecido no presente. Em certas realizações, por exemplo, é fornecido um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-TfR que compreende sequências de VL e VH, respectivamente, de SEQ ID NO: 4 e 7; 5 e 8; 5 e 9; 6 e 10; 4 e 7; 11 e 15; 12 e 16; 13 e 17; 14 e 18; 19 e 20; 21 e 25; 22 e 26; 23 e 27; 24 e 28; 105 e 108; 111 e 114; 117 e 120; ou 123 e 126. Em um aspecto, o anticorpo concorre com qualquer dos anticorpos da Classe I (ou seja, clones 7A4, 8A2, 15D2, 10D11 ou 7B10, ou versões amadurecidas por afinidade de qualquer um desses anticorpos) pela ligação a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo concorre com qualquer um dos anticorpos da Classe II (ou seja, clones 15G11, 16G5, 13C3 ou 16G, ou versões amadurecidas por afinidade de qualquer um desses anticorpos) pela ligação a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo concorre com o clone 16F6 ou suas versões amadurecidas por afinidade pela ligação a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo concorre com qualquer um dos anticorpos da Classe IV (ou seja, clones 7G7, 4C2, 1B12 ou 13D4, ou suas versões amadurecidas por afinidade) pela ligação a TfR.

[00203] Em um aspecto adicional da presente invenção, um anticorpo anti-TfR de acordo com qualquer das realizações acima é um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em uma realização, um anticorpo anti-TfR é um fragmento de anticorpo, tal como um Fv, Fab, Fab’, scFv, diacorpo ou fragmento de F(ab’)2. Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo com comprimento total, tal como anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 intacto ou qualquer outra classe de anticorpo ou isótipo conforme definido no presente.

[00204] Em um aspecto adicional, um anticorpo anti-TfR de acordo com qualquer das realizações acima pode incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, conforme descrito nos Capítulos 1-7 abaixo:

1. Afinidade de anticorpos:

[00205] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente possui uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo de 10-8 M a 10-13 M, tal como de 10-9 M a 10-13 M).

[00206] Em certos aspectos da presente invenção, anticorpo anti-TfR com “baixa afinidade” de acordo com a presente invenção é selecionado, por exemplo, com base nos resultados do Exemplo 5 e em Atwal et al, Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011) e Yu et al, Sci. Transl. Med., 25 de maio de 2011; Vol. 3, Ed. 84, pág. 84ra44, que demonstra que esses anticorpos com afinidade mais baixa para TfR exibem melhor absorção no SNC (por exemplo, no cérebro) e/ou persistência no cérebro/SNC. A fim de identificar esses anticorpos com baixa afinidade, são disponíveis vários testes de medição da afinidade de anticorpos, que incluem, sem limitações: teste de Scatchard e método de ressonância de plasma na superfície (por exemplo, utilizando BIACORE®). Segundo uma realização da presente invenção, o anticorpo possui afinidade para TfR humano ou de primatas de cerca de 5 nM, cerca de 20 nM, cerca de 100 nM até cerca de 50 μM, cerca de 30 μM, cerca de 10 μM, cerca de 1 μM ou cerca de 500 nM. Portanto, a afinidade pode estar na faixa de cerca de 5 nM a cerca de 50 μM, na faixa de cerca de 20 nM a cerca de 30 μM, na faixa de cerca de 30 nM a cerca de 30 μM, na faixa de cerca de 50 nM a cerca de 1 μM ou na faixa de cerca de 100 nM a cerca de 500 nM, por exemplo, conforme medido por meio de análise de Scatchard ou BIACORE®. Em outra realização da presente invenção, o anticorpo possui meia vida de dissociação de TfR de menos de um minuto, menos de dois minutos, menos de três minutos, menos de quatro minutos, menos de cinco minutos ou menos de dez minutos até cerca de vinte minutos ou cerca de trinta minutos, conforme medido por meio de análise de ligação de competição ou BIACORE®.

[00207] Portanto, a presente invenção fornece um método de elaboração de anticorpos úteis para o transporte de drogas contra distúrbios neurológicos através da barreira entre o sangue e o cérebro, que compreende a seleção de um anticorpo a partir de um quadro de anticorpos contra TfR por possuir afinidade para TfR que se encontra na faixa de cerca de 5 nM, cerca de 20 nM ou cerca de 100 nM até cerca de 50 μM, cerca de 30 μM, cerca de 10 μM, cerca de 1 μM ou cerca de 500 mM. Portanto, a afinidade pode estar na faixa de cerca de 5 nM a cerca de 50 μM, na faixa de cerca de 20 nM a cerca de 30 μM, na faixa de cerca de 30 nM a cerca de 30 μM, na faixa de cerca de 50 nM a cerca de 1 μM ou na faixa de cerca de 100 nM a cerca de 500 nM, por exemplo, conforme medido por meio de análise de Scatchard ou BIACORE®. Como compreenderão os técnicos comuns no assunto, a conjugação de uma molécula/composto heterólogo a um anticorpo frequentemente reduzirá a afinidade do anticorpo para o seu alvo, devido, por exemplo, à obstrução estérica ou mesmo à eliminação de um braço de ligação caso o anticorpo torne-se multiespecífico com um ou mais braços que se ligam a um antígeno diferente do alvo original do anticorpo. Em uma realização, um anticorpo com baixa afinidade de acordo com a presente invenção específico para TfR conjugado a anti-BACE1 apresentou Kd para TfR conforme medido por meio de BIACORE de cerca de 30 nM. Em outra realização, um anticorpo com baixa afinidade de acordo com a presente invenção específico para TfR conjugado a BACE1 apresentou Kd para TfR conforme medido por meio de BIACORE de cerca de 600 nM. Em outra realização, um anticorpo com baixa afinidade de acordo com a presente invenção específico para TfR conjugado a BACE1 apresentou Kd para TfR conforme medido por meio de BIACORE de cerca de 20 μM. Em outra realização, um anticorpo com baixa afinidade de acordo com a presente invenção específico para TfR conjugado a BACE1 apresentou Kd para TfR conforme medido por meio de BIACORE de cerca de 30 μM.

[00208] Em uma realização, Kd é medido por meio de um teste de ligação de antígeno radiomarcado (RIA). Em uma realização, realiza-se RIA com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno. Afinidade de ligação de solução de Fabs para antígeno, por exemplo, é medida por meio do equilíbrio de Fab com concentração mínima de antígeno marcado por I125 na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado e captura em seguida de antígeno ligado com uma placa revestida por anticorpo anti-Fab (vide, por exemplo, Chen et al, J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)). Para estabelecer condições para o teste, placas com múltiplas cavidades MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas por uma noite com 5 μg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e bloqueadas em seguida com 2% (p/v) de albumina de soro bovino em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em uma placa não adsorvente (Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno I125 são misturados com diluições em série de Fab de interesse (por exemplo, consistente com a determinação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al, Cancer Res. 57: 4593-4599 (1977)). O Fab de interesse é incubado em seguida por uma noite; a incubação pode prosseguir, entretanto, por um período mais longo (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é removida em seguida e a placa foi lavada por oito vezes com 0,1% de polissorbato 20 (TWEEN 20®) em PBS. Após a secagem das placas, adiciona-se 150 μl/cavidade de cintilante (MICROSCINT-20®, Packard) e as placas são contadas sobre um contador gama TOPCOUNT® (Packard) por dez minutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de ligação máxima são selecionadas para uso em testes de ligação competitiva.

[00209] Em um aspecto, o RIA é análise de Scatchard. O anticorpo anti-TfR de interesse pode ser iodado, por exemplo, utilizando o método de lactoperoxidase (Bennett e Horuk, Methods in Enzymology, 288, págs. 134-148 (1997)). Um anticorpo anti-TfR radiomarcado é purificado a partir de I125-Na livre por meio de filtragem de gel utilizando uma coluna de NAP-5 e sua atividade específica é medida. Misturas de reação de competição de 50 μl contendo concentração fixa de anticorpo iodado e concentrações reduzidas de anticorpo não marcado diluído em série são colocadas em placas com 96 cavidades. Células que expressam TfR de forma transitória são cultivadas em meios de crescimento, que consistem de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) (Genentech) suplementado com FBS a 10%, 2 mM de L- glutamina e 1 x penicilina-estreptomicina a 37 °C em CO2 a 5%. As células são separadas das placas utilizando Solução de Dissociação Celular Sigma e lavadas com tampão de ligação (DMEM com 1% de albumina de soro bovino, 50 mM de HEPES, pH 7,2 e 0,2% de azida de sódio). As células lavadas são adicionadas em densidade aproximada de 200.000 células em 0,2 ml de tampão de ligação às placas com 96 cavidades contendo 50 μl de misturas de reação de competição. A concentração final do anticorpo não marcado na reação de competição com células varia a partir de 1000 nM, reduzindo em diluição de 1:2 vezes por dez concentrações e incluindo uma amostra somente de tampão com adição zero. Reações de competição com células para cada concentração de anticorpo não marcado são testadas em três cópias. Reações de competição com células são incubadas por duas horas à temperatura ambiente. Após a incubação por duas horas, as reações de competição são transferidas para uma placa de filtro e lavadas por quatro vezes com tampão de ligação para separar o anticorpo iodado livre do ligado. Os filtros são contados por meio de contador gama e os dados de ligação são avaliados utilizando o algoritmo de enquadramento de Munson e Rodbard (1980) para determinar a afinidade de ligação do anticorpo.

[00210] Um exemplo de análise BIACORE® utilizando as composições de acordo com a presente invenção pode ser realizado conforme segue. Kd foi medido utilizando testes de ressonância de plasma da superfície utilizando BIACORE® 2000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C utilizando o kit anti-Fc humano (BiAcore Inc., Piscataway NJ). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) foram ativadas com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC) e N- hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Anticorpo anti-Fc humano é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,0, até 50 μg/ml antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μl/min para atingir cerca de 10000 unidades de reação (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de anticorpo, injeta-se 1 M de etanolamina para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, variantes de anticorpos anti-TfR mono ou multiespecíficos foram injetadas em HBS-P para atingir cerca de 220 RU e, em seguida, diluições em série duas vezes de MuTfR-His (0,61 nM a 157 nM) foram injetadas em HBS-P a 25 °C em velocidade de fluxo de cerca de 30 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) foram calculadas utilizando um modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3. 2) por meio de enquadramento simultâneo dos sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen et al, J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999).

[00211] Segundo outra realização, Kd é medido utilizando testes de ressonância de plasma da superfície com um dispositivo BIACORE® 2000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C utilizando o kit anti-Fc humano (BiAcore Inc., Piscataway NJ). Resumidamente, chips biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIACORE Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N’- (3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Anticorpo anti-Fc humano é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,0, até 50 μg/ml antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μl/min para atingir cerca de 10000 unidades de reação (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de anticorpo, injeta-se 1 M de etanolamina para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, variantes de anticorpos anti-TfR são injetadas em HBS-P para atingir cerca de 220 RU e, em seguida, diluições em série duas vezes de TfR-His (0,61 nM a 157 nM) são injetadas em HBS-P a 25 °C sob velocidade de fluxo de cerca de 30 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIACORE® versão 3.2) por meio de enquadramento simultâneo dos sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen et al, J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999).

[00212] Diversos métodos de determinação de IC50 para um dado composto são conhecidos na técnica; uma abordagem comum é a realização de um teste de ligação de competição, tal como o descrito no presente. Geralmente, IC50 alto indica que mais anticorpo é necessário para inibir a ligação do ligante conhecido e, portanto, a afinidade do anticorpo para aquele ligante é relativamente baixa. Por outro lado, IC50 baixo indica que menos anticorpo é necessário para inibir a ligação do ligante conhecido e, portanto, a afinidade do anticorpo para aquele ligante é relativamente alta.

[00213] Um exemplo de teste ELISA competitivo para medir IC50 é aquele em que concentrações crescentes de anticorpos variantes de antígeno anti-TfR ou anti-TfR/cérebro (ou seja, anti-TfR/BACE1, anti-TfR/Abeta e similares) são utilizados para competir com um anticorpo anti-TfR conhecido biotinilado pela ligação a TfR. Realizou-se ELISA de competição anti-TfR em placas Maxisorp (Neptune, NJ) revestidas com 2,5 μg/ml de domínio extracelular TfR murino purificado em PBS a 4 °C por uma noite. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e bloqueadas utilizando tampão de bloqueio Superblock em PBS (Thermo Scientific, Hudson NH). Titulação de cada antígeno anti-TfR ou anti-TfR/cérebro individual (ou seja, anti-TfR/BACE1 ou anti-TfR/Abeta) (diluição em série 1:3) foi combinada com anti-TfR conhecido biotinilado (concentração final de 0,5 nM) e adicionada à placa por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e HRP-estreptavidina (Southern Biotech, Birmingham) foi adicionada à placa e incubada por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e anticorpo anti-TfR biotinilado ligado à placa foi detectado utilizando substrato TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills).

2. Fragmentos de anticorpos:

[00214] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpos incluem, mas sem limitações, fragmentos de Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv e scFv, bem como outros fragmentos descritos abaixo. Para análise de certos fragmentos de anticorpos, vide Hudson et al, Nat. Med. 9: 129-134 (2003). Para análise de fragmentos de scFv, vide, por exemplo, Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore Eds. (Springer-Verlag, Nova Iorque), págs. 269-315 (1994); vide também WO 93/16185; e Patentes Norte-Americanas n° 5.571.894 e 5.587.458. Para discussão de fragmentos de Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopos de ligação de receptores salvos e possuem maior meia vida in vivo, vide a Patente Norte-Americana n° 5.869.046.

[00215] Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação de antígenos que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al, Nat. Med. 9: 129-134 (2003); e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al, Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

[00216] Anticorpos com domínio simples são fragmentos de anticorpos que compreendem, no todo ou em parte, o domínio variável de cadeia pesada ou, no todo ou em parte, o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo com domínio simples é um anticorpo com domínio simples humano (Domantis, Inc., Waltham MA; vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 6.248.516 B1).

[00217] Podem ser elaborados fragmentos de anticorpos por meio de diversos métodos, incluindo, mas sem limitações, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (tais como E. coli ou fago), conforme descrito no presente.

3. Anticorpos quiméricos e humanizados:

[00218] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (tal como uma região variável derivada de camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como macaco) e uma região constante humana. Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem anticorpos “primatizados”, que compreendem sequências de ligação de antígenos de domínio variável derivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, tal como babuíno, rhesus ou macaco cynomolgus) e sequências de região constante humana (Patente Norte-Americana n° 5.693.780). Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo com “classe trocada” no qual a classe ou subclasse foi alterada com relação ao anticorpo parental. Anticorpos quiméricos incluem seus fragmentos de ligação de antígenos.

[00219] Em certas realizações, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para seres humanos, mantendo ao mesmo tempo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais HVRs, tais como CDRs (ou suas partes), são derivadas de um anticorpo não humano e FRs (ou suas partes) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (tal como o anticorpo do qual são derivados os resíduos de HVR), por exemplo, para restaurar ou aumentar a especificidade ou afinidade de anticorpos.

[00220] Anticorpos humanizados e os métodos de sua elaboração são analisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci., 13: 16191633 (2008) e são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033 (1989); e Patentes Norte-Americanas n° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al, Methods 36: 25-34 (2005) (que descreve enxerto de região de determinação da especificidade (SDR); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (que descreve “nova formação de superfície”); Dall’Acqua et al, Methods 36: 43-60 (2005) (que descreve “mudança de FR”); e Osbourn et al, Methods 36: 61-68 (2005) e Klimka et al, Br. J. Cancer, 83: 252260 (2000) (que descreve a abordagem de “seleção orientada” para troca de FR).

[00221] As regiões de cadeia principal humana que podem ser utilizadas para humanização incluem, mas sem limitações: regiões de cadeia principal selecionadas utilizando o método de "melhor adequação" (vide, por exemplo, Sims et al, J. Immunol. 151: 2296 (1993)); regiões de cadeia principal derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89: 4285 (1992); e Presta et al, J. Immunol., 151: 2623 (1993)); regiões de cadeia principal maduras humanas (que sofreram mutação somática) ou regiões de cadeia principal de linhagem de germens humanos (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci., 13: 1619-1633 (2008)); e regiões de cadeia principal derivadas de bibliotecas de FR de seleção (vide, por exemplo, Baca et al, J. Biol. Chem. 272: 1067810684 (1997); e Rosok et al, J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).

4. Anticorpos humanos:

[00222] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando diversos métodos conhecidos na técnica. Anticorpos humanos são descritos de forma geral em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).

[00223] Anticorpos humanos podem ser preparados por meio da administração de imunogenes a animais transgênicos que tenham sido modificados para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta a desafio antigênico. Esses animais contêm tipicamente, no todo ou em parte, os locais de imunoglobulina humana, que substituem os locais de imunoglobulina endógenos ou que estão presentes de forma extracromossômica ou são integrados aleatoriamente aos cromossomos do animal. Nesses camundongos transgênicos, os locais de imunoglobulina endógenos foram, de forma geral, desativados. Para análise de métodos de obtenção de anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Vide também, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 6.075.181 e 6.150.584, que descrevem tecnologia XENOMOUSE®; Patente Norte-Americana n° 5.770.429, que descreve a tecnologia HuMab®; Patente Norte-Americana n° 7.041.870, que descreve a tecnologia K-M MOUSE®; e o Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VelociMouse®). Regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, por meio de combinação com uma região constante humana diferente.

[00224] Anticorpos humanos podem também ser elaborados por meio de métodos com base em hibridoma. Também foram descritas linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos para a produção de anticorpos monoclonais humanos (vide, por exemplo, Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); e Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al, J. Immunol., 147: 86 (1991)). Os anticorpos humanos gerados por meio da tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 103: 3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem os descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais de linhagens de células de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265-268 (2006) (que descreve hibridomas humanos- humanos). Tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3): 185-91 (2005).

[00225] Anticorpos humanos podem também ser gerados por meio do isolamento de sequências de domínio variável de clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fagos derivadas de seres humanos. Essas sequências de domínios variáveis podem ser combinadas em seguida com um domínio constante humano desejado. Métodos de seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritos abaixo.

5. Anticorpos derivados de bibliotecas:

[00226] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser isolados por meio da seleção de bibliotecas combinatórias em busca de anticorpos com a(s) atividade(s) desejada(s). Diversos métodos são conhecidos na técnica, por exemplo, para gerar bibliotecas de exibição de fagos e selecionar essas bibliotecas em busca de anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Esses métodos são analisados, por exemplo, em Hoogenboom et al em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e adicionalmente descritos, por exemplo, em McCafferty et al, Nature 348: 552-554; Clackson et al, Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks e Bradbury em Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al, J. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al, J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004).

[00227] Em certos métodos de exibição de fagos, repertórios de genes VH e VL são clonados separadamente por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR) e novamente combinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem ser pesquisadas em seguida em busca de fago de ligação de antígenos conforme descrito em Winter et al, Ann. Rev. Immunol., 12: 433455 (1994). Fago tipicamente exibe fragmentos de anticorpos, seja na forma de fragmentos de Fv de fita simples (scFv) ou de fragmentos de Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade para o imunogene sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório nativo pode ser clonado (por exemplo, de seres humanos) para fornecer uma única fonte de anticorpos para uma ampla variedade de antígenos próprios e não próprios sem nenhuma imunização, conforme descrito por Griffiths et al, EMBO J., 12: 725-734 (1993). Por fim, bibliotecas nativas podem também ser elaboradas sinteticamente por meio de clonagem dos segmentos de genes V não redispostos a partir de células haste, utilizando primers de PCR que contêm sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e realizar redisposição in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patente Norte-Americana n° 5.750.373 e Patentes Norte- Americanas publicadas n° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360.

[00228] Anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos no presente.

6. Anticorpos multiespecíficos:

[00229] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois locais diferentes. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é para TfR e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois epítopos diferentes de TfR. Anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressem TfR. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos.

[00230] Os métodos de elaboração de anticorpos multiespecíficos incluem, mas sem limitações, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina que possuem especificidades diferentes (vide Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 e Traunecker et al, EMBO J. 10: 3655 (1991)) e engenharia “botão no orifício” (vide, por exemplo, Patente Norte-Americana n° 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos podem também ser preparados por meio da realização de efeitos de direcionamento eletrostático para elaborar moléculas heterodiméricas de Fc de anticorpos (WO 2009/089004A1); retícula de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente Norte-Americana n° 4.676.980 e Brennan et al, Science, 229: 81 (1985)); utilizando fechos de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny et al, J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)); utilizando tecnologia de “diacorpos” para elaborar fragmentos de anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 6444-6448 (1993)); e utilizando dímeros Fv de fita simples (sFv) (vide, por exemplo, Gruber et al, J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al, J. Immunol. 147: 60 (1991).

[00231] O anticorpo ou fragmento do presente também inclui um “FAb de Ação Dupla” ou “DAF” que compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a TfR, bem como outro antígeno diferente (vide, por exemplo, US 2008/0069820).

[00232] Segundo uma realização da presente invenção, o “acoplamento” é atingido por meio da geração de um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico). Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos ou epítopos diferentes. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que liga TfR e um segundo local de ligação ao antígeno que liga um antígeno do cérebro, tal como beta-secretase 1 (BACE1) ou Abeta e os outros antígenos do cérebro descritos no presente.

[00233] Um exemplo de antígeno do cérebro ligado por esse anticorpo biespecífico/multiespecífico é BACE1 e um exemplo de anticorpo que se liga a ele é o anticorpo YW412.8.31 nas Figs. 16A-B do presente.

[00234] Em outra realização, o antígeno do cérebro é Abeta e exemplos desses anticorpos são descritos em WO 2007068412, WO 2008011348, WO 20080156622 e WO 2008156621, expressamente incorporados ao presente como referência, em que um exemplo de anticorpo Abeta compreende o anticorpo de IgG4 MABT5102A que compreende as sequências de aminoácidos de cadeia leve e pesada das Figs. 11A e 11B, respectivamente.

[00235] Os métodos de elaboração de anticorpos multiespecíficos incluem, mas sem limitações, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina que possuem especificidades diferentes (vide Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 e Traunecker et al, EMBO J. 10: 3655 (1991)) e engenharia “botão no orifício” (vide, por exemplo, Patente Norte-Americana n° 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos podem também ser preparados por meio da realização de efeitos de direcionamento eletrostático para elaborar moléculas heterodiméricas de Fc de anticorpos (WO 2009/089004A1); retícula de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente Norte-Americana n° 4.676.980 e Brennan et al, Science, 229: 81 (1985)); utilizando fechos de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny et al, J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)); utilizando tecnologia de “diacorpos” para elaborar fragmentos de anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 6444-6448 (1993)); e utilizando dímeros Fv de fita simples (sFv) (vide, por exemplo, Gruber et al, J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecífcos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al, J. Immunol. 147: 60 (1991).

[00236] São também incluídos no presente anticorpos elaborados com três ou mais locais de ligação de antígenos funcionais, incluindo “anticorpos Octopus” ou “imunoglobulinas de domínios variáveis duplos” (DVDs) (vide, por exemplo, US 2006/0025576A1 e Wu et al, Nature Biotechnology (2007)).

7. Variantes de anticorpos:

[00237] Em certas realizações, são contempladas variantes de sequências de aminoácidos dos anticorpos fornecidos no presente. Pode ser desejável, por exemplo, aumentar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequências de aminoácidos de anticorpos podem ser preparadas por meio da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por meio de síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusões e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de amionácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, tais como ligação de antígenos.

a. Variantes de substituição, inserção e deleção:

[00238] Em certas realizações, são fornecidas variantes de anticorpos que possuem uma ou mais substituições de aminoácidos. Locais de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 2 sob o título “substituições preferidas”. Alterações mais substanciais são fornecidas na Tabela 2 com o título “exemplos de substituições” e conforme descrito adicionalmente abaixo com referência às classes de cadeia lateral de aminoácidos. Substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados por atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno retida/aprimorada, redução da imunogenicidade ou ADCC ou CDC aprimorada. TABELA 2

[00239] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades de cadeia lateral comuns: 1. hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2. hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3. ácidos: Asp, Glu; 4. básicos: His, Lys, Arg; 5. resíduos que influenciam a orientação de cadeias: Gly, Pro; 6. aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[00240] Substituições não conservadoras implicam a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[00241] Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para estudo adicional conterá(ão) modificações (tais como melhorias) em certas propriedades biológicas (tais como aumento da afinidade e redução da imunogenicidade) com relação ao anticorpo parental e/ou possuirão certas propriedades biológicas substancialmente retidas do anticorpo parental. Um exemplo de variante de substituição é um anticorpo amadurecido por afinidade, que pode ser gerado convenientemente, utilizando, por exemplo, métodos de amadurecimento por afinidade com base em exibição de fagos, tais como os descritos no presente. Resumidamente, um ou mais resíduos de HVR sofrem mutação e os anticorpos variantes são exibidos sobre fago e selecionados por uma atividade biológica específica (tal como afinidade de ligação).

[00242] Podem ser elaboradas alterações (tais como substituições) em HVRs, por exemplo, para aumentar a afinidade de anticorpo. Essas alterações podem ser realizadas em “pontos quentes” de HVR, ou seja, resíduos codificados por códons que sofrem mutação sob alta frequência durante o processo de amadurecimento somático (vide, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)) e/ou resíduos que entram em contato com antígeno, em que a variante resultante VH ou VL é testada para determinar a afinidade de ligação. O amadurecimento por afinidade por meio da construção e nova seleção de bibliotecas secundárias foi descrito, por exemplo, em Hoogenboom et al em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al, Ed., Human Press, Totowa NJ (2001)). Em algumas realizações de amadurecimento por afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis selecionados para amadurecimento por qualquer um dentre uma série de métodos (tais como PCR à prova de erros, alteração de cadeias ou mutagênese dirigida a oligonucleotídeos). É criada em seguida uma biblioteca secundária. A biblioteca é selecionada em seguida para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Outro método de introdução da diversidade envolve abordagens dirigidas a HVR, nas quais diversos resíduos de HVR (tais como quatro a seis resíduos de cada vez) são aleatorizados. Resíduos de HVR envolvidos na ligação de antígenos podem ser especificamente identificados, utilizando, por exemplo, modelagem ou mutagênese de varrimento de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 são particularmente dirigidos com frequência.

[00243] Em certas realizações, substituições, inserções ou exclusões podem ocorrer em até uma ou mais HVRs, desde que essas alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de ligar antígeno. Alterações conservadoras, por exemplo (tais como substituições conservadoras conforme fornecido no presente), que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser elaboradas em HVRs. Essas alterações podem, por exemplo, ficar fora de resíduos de contato de antígenos nas HVRs. Em certas realizações das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é inalterada ou contém não mais de uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[00244] Um método útil de identificação de resíduos ou regiões do anticorpo que podem ser dirigidos para mutagênese é denominado “mutagênese de varrimento de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells (1989), Science, 244: 1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos desejados (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) é identificado e substituído por um aminoácido neutro ou com carga negativa (tal como alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com antígeno é afetada. Substituições adicionais podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativa ou adicionalmente, uma estrutura de cristal de um complexo de antígeno e anticorpo identifica pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser dirigidos ou eliminados para possível substituição. Variantes podem ser selecionadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[00245] As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminais carboxila e/ou amino cujo comprimento varia de um resíduo a polipeptídeos que contêm cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo em soro.

b. Variantes de glicosilação:

[00246] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é alterado para aumentar ou reduzir a extensão de glicosilação do anticorpo. A adição ou deleção de locais de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada por meio de alteração da sequência de aminoácidos, de tal forma que sejam criados ou removidos um ou mais locais de glicosilação.

[00247] Quando o anticorpo compreender uma região Fc, o carboidrato a ele ligado pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos compreendem tipicamente um oligossacarídeo biantenário ramificado que geralmente é ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al, TIBTECH 15: 26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, tais como manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a GlcNAc na “haste” da estrutura de oligossacarídeo biantenário. Em algumas realizações, podem ser elaboradas modificações do oligossacarídeo em um anticorpo de acordo com a presente invenção, a fim de criar variantes de anticorpos com certas propriedades aprimoradas.

[00248] Em uma realização, são fornecidas variantes de anticorpos que possuem uma estrutura de carboidrato que não contém fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. A quantidade de fucose nesse anticorpo pode ser, por exemplo, de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada por meio de cálculo da quantidade média de fucose na cadeia de açúcar em Asn297, com relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn 297 (tais como estruturas com alto teor de manose híbridas e complexas) conforme medido por meio de espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito, por exemplo, em WO 2008/077546. Asn297 designa o resíduo de asparagina localizado perto da posição 297 na região Fc (numeração EU de resíduos de região Fc); Asn297 pode também estar localizado, entretanto, a cerca de três aminoácidos acima ou abaixo no fluxo da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a variações menores de sequências de anticorpos. Essas variantes de fucosilação podem possuir função de ADCC aprimorada. Vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas publicadas n° US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relativas a variantes de anticorpos “desfucosilados” ou “com deficiência de fucose” incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al, J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); e Yamane- Ohnuki et al, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos desfucosilados incluem células CHO de Lec13 com deficiência na fucosilação de proteínas (Ripka et al, Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Pedido de Patente Norte-Americano n° US 2003/0157108 A1, Presta, L.; e WO 2004/056312 A1, Adams et al, especialmente no Exemplo 11) e linhagens de células knockout, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células de CHO knockout (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al, Biotechnol. Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006); e WO 2003/085107).

[00249] Variantes de anticorpos possuem adicionalmente oligossacarídeos bisseccionados, tais como em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bisseccionado por GlcNAc. Essas variantes de anticorpos podem possuir fucosilação reduzida e/ou função de ADCC aprimorada. Exemplos dessas variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, em WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al); Patente Norte-Americana n° 6.602.684 (Umana et al); e US 2005/0123546 (Umana et al). Também são fornecidas variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Essas variantes de anticorpos podem possuir função CDC aprimorada. Essas variantes de anticorpos são descritas, por exemplo, em WO 1997/30087 (Patel et al); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).

c. Variantes de região Fc:

[00250] Em certas realizações, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido no presente, de forma a gerar uma variante de região Fc. A variante de região Fc pode compreender uma sequência de região Fc humana (tal como região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácidos (tal como substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.

[00251] Em certas realizações, a presente invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas, mas não todas as funções efetoras, o que o torna candidato desejável para aplicações nas quais a meia vida do anticorpo in vivo é importante, mas certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Podem ser conduzidos testes de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo para confirmar a redução/esgotamento de atividades de CDC e/ou ADCC. Testes de ligação de receptores Fc (FcR), por exemplo, podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não apresente ligação de FcyR (portanto, propenso a não apresentar atividade de ADCC), mas retenha a capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FCYRIII, enquanto monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991). Exemplos não limitadores de testes in vitro para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83: 70597063 (1986)) e Hellstrom, I. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82: 1499-1502 (1985); 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al, J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)). Alternativamente, podem ser empregados métodos de teste não radioativos (vide, por exemplo, teste de citotoxicidade não radioativo ACTI® para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc., Mountain View CA; e teste de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison WI). Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o descrito em Clynes et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95: 652-656 (1998). Testes de ligação de C1q podem também ser conduzidos para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar C1q e, portanto, não apresenta atividade de CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M. S. et al, Blood 101: 1045-1052 (2003); e Cragg, M. S. e M. J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). Determinações de meia vida/liberação in vivo e ligação de FcRn podem também ser realizadas utilizando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova, S. B. et al, Intl. Immunol. 18 (12): 1759-1769 (2006)).

[00252] Exemplos não limitadores de anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente Norte-Americana n° 6.737.056). Esses mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em duas ou mais das posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente Norte-Americana n° 7.332.581).

[00253] São descritas certas variantes de anticorpos com maior ou menor ligação a FcRs (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 6.737.056; WO 2004/056312 e Shields et al, J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001)).

[00254] Em certas realizações, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam ADCC, tais como substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).

[00255] Em algumas realizações, são realizadas alterações na região Fc que resultam em ligação de C1q e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) alterada (ou seja, aumentada ou reduzida), conforme descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie et al, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[00256] Anticorpos com maiores meias vidas e ligação aprimorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976); e Kim et al, J. Immunol. 24: 249 (1994)), são descritos em US 2005/0014934A1 (Hinton et al). Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que aumentam a ligação da região Fc a FcRn. Essas variantes de Fc não limitadoras incluem aquelas com substituições em um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, tais como substituição do resíduo da região Fc 434 (Patente Norte-Americana n° 7.371.826).

[00257] Vide também Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988); Patente Norte-Americana n° 5.648.260; Patente Norte-Americana n° 5.624.821; e WO 94/29351 com referência a outros exemplos de variantes da região Fc.

d. Variantes de anticorpos elaboradas com cisteína:

[00258] Em certas realizações, pode ser desejável criar anticorpos elaborados com cisteína, tais como “tioMAbs”, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em realizações específicas, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis do anticorpo. Substituindo esses resíduos por cisteína, grupos tiol reativos são posicionados, portanto, em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras porções, tais como porções de droga ou porções de droga e ligante, para criar um imunoconjugado, conforme descrito adicionalmente no presente. Em certas realizações, qualquer um ou mais dos resíduos a seguir podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc de cadeia pesada. Anticorpos elaborados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 7.521.541.

e. Derivados de anticorpos:

[00259] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pode ser adicionalmente modificado para que contenha porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e facilmente disponíveis. As porções apropriadas para derivação do anticorpo incluem, mas sem limitações, polímeros hidrossolúveis. Exemplos não limitadores de polímeros hidrossolúveis incluem, mas sem limitações, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetilcelulose, dextran, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, póli-1,3-dioxolano, póli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno e anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextran ou póli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno e óxido de etileno, polióis polioxietilados (tais como glicerol), álcool polivinílico e suas misturas. Propionaldeído de polietileno glicol pode apresentar vantagens de fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. A quantidade de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, caso mais de um polímero seja ligado, eles podem ser moléculas idênticas ou diferentes. Geralmente, a quantidade e/ou o tipo de polímeros utilizados para derivação podem ser determinados com base em considerações que incluem, mas sem limitações, as propriedades ou funções específicas do anticorpo a ser aprimorado, se o derivado de anticorpo será utilizado em terapia sob condições definidas etc.

[00260] Em outra realização, são fornecidos conjugados de um anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecidos por meio de exposição à radiação. Em uma realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e inclui, mas sem limitações, comprimentos de onda que não prejudicam células comuns, mas que aquecem a porção não proteinácea a uma temperatura na qual células próximas da porção não proteinácea de anticorpos são mortas.

B. Composições e métodos recombinantes:

[00261] Anticorpos podem ser produzidos utilizando composições e métodos recombinantes, tais como conforme descrito na Patente Norte- Americana n° 4.816.567. Em uma realização, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-TFR descrito no presente. Esse ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de VL e/ou de aminoácidos que compreende o VH do anticorpo (tais como as cadeias leve e/ou pesada do anticorpo). Em uma realização adicional, são fornecidos um ou mais vetores (tais como vetores de expressão) que compreendem esse ácido nucleico. Em uma realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Em uma dessas realizações, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende o VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende o VH do anticorpo; ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende o VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende o VH do anticorpo. Em uma realização, a célula hospedeira é eucariótica, tal como uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (tal como célula Y0, NS0, Sp20). Em uma realização, é fornecido um método de elaboração de um anticorpo anti-TFR, em que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condições apropriadas para a expressão do anticorpo, e recuperação opcional do anticorpo da célula hospedeira (ou meio de cultivo de células hospedeiras).

[00262] Para produção recombinante de um anticorpo anti-TfR, ácido nucleico que codifica um anticorpo, tal como conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo).

[00263] Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células eucarióticas ou procarióticas descritas no presente. Anticorpos podem ser produzidos, por exemplo, em bactérias, particularmente quando não forem necessárias glicosilação e função efetora de Fc. Para expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, as Patentes Norte- Americanas n° 5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523 (vide também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa NJ, 2003), págs. 245-254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli). Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e adicionalmente purificado.

[00264] Além de procariotes, micróbios eucarióticos tais como leveduras ou fungos filamentosos são hospedeiros de expressão ou clonagem apropriados para vetores codificadores de anticorpos, incluindo linhagens de fungos e leveduras cujos processos de glicosilação tenham sido “humanizados”, o que resulta na produção de um anticorpo com padrão de glicosilação total ou parcialmente humano. Vide Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) e Li et al, Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006).

[00265] As células hospedeiras apropriadas para a expressão de anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (vertebrados e invertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de insetos e plantas. Foram identificadas numerosas linhagens bacilovirais que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[00266] Cultivos de células vegetais podem também ser utilizados como hospedeiros. Vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (que descrevem tecnologia PLANTIBODIES® de produção de anticorpos em plantas transgênicas).

[00267] Células de vertebrados podem também ser utilizadas como hospedeiros. Podem ser úteis, por exemplo, linhagens de células de mamíferos que são adaptadas para crescimento em suspensão. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 conforme descrito, por exemplo, em Graham et al, J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK); células sertoli de camundongos (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma da cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK; células do fígado de ratos búfalo (BRL 3A); células do pulmão humano (W138); células do fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongos (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al, Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77: 4216 (1980)); e linhagens de células de mieloma tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para análise de certas linhagens de células de hospedeiros mamíferos apropriadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa NJ), págs. 255-268 (2003).

C. Testes:

[00268] Anticorpos anti-TfR fornecidos no presente podem ser identificados, selecionados ou caracterizados pelas suas propriedades físico- químicas e/ou atividades biológicas por meio de vários testes conhecidos na técnica. 1. Testes de ligação e outros testes: b. Diversos métodos são disponíveis para determinar a ligação do anticorpo ao TfR. Um desses testes é um teste imunossorvente ligado por enzimas (ELISA) para confirmar a capacidade de ligação a TfR humano (e antígeno do cérebro). Segundo este teste, as placas revestidas com antígeno (por exemplo, TfR recombinante) são incubadas com uma amostra que compreende o anticorpo anti-TfR e é determinada a ligação do anticorpo ao antígeno de interesse.

[00269] Em um aspecto, um anticorpo de acordo com a presente invenção é testado para determinar a sua atividade de ligação de antígenos, por exemplo, por meio de métodos conhecidos tais como ELISA, Western Blot etc.

[00270] Em outro aspecto, testes de competição podem ser utilizados para identificar um anticorpo que concorre com qualquer um dos anticorpos de acordo com a presente invenção pela ligação a TfR. Em certas realizações, esse anticorpo concorrente liga-se ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou de conformação que é ligado por qualquer um dos anticorpos de acordo com a presente invenção, mais especificamente, qualquer um dos epítopos especificamente ligados por anticorpos na classe I, classe II, classe III ou classe IV, conforme descrito no presente (vide, por exemplo, o Exemplo 1 e a Tabela 4). Exemplos de métodos detalhados de mapeamento de epítopo ao qual se liga um anticorpo são fornecidos em Morris (1996), Epitope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa NJ).

[00271] Em um exemplo de teste de competição, TfR imobilizado é incubado em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga a TfR (tal como um ou mais dos anticorpos descritos no presente) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado para determinar a sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo pela ligação a TfR. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, TfR imobilizado é incubado em uma solução que compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação sob condições que permitam a ligação do primeiro anticorpo a TfR, o excesso de anticorpo não ligado é removido e é medida a quantidade de marca associada a TfR imobilizado. Se a quantidade de marca associada a TfR imobilizado for substancialmente reduzida na amostra de teste com relação à amostra controle, isso indica que o segundo anticorpo está concorrendo com o primeiro anticorpo pela ligação a TfR. Vide Harlow e Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY).

2. Testes de atividade:

[00272] Em um aspecto, são fornecidos testes de identificação de anticorpos anti-TfR que possuem atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, transporte de um composto associado/conjugado ao anticorpo através da BBB para o cérebro e/ou SNC. São também fornecidos anticorpos que possuem essa atividade biológica in vivo e/ou in vitro.

[00273] Em certas realizações, um anticorpo de acordo com a presente invenção é testado para determinar essa atividade biológica.

D. Imunoconjugados:

[00274] A presente invenção também fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-TfR do presente conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterapêuticos ou drogas, agentes inibidores do crescimento, toxinas (tais como toxinas de proteínas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos) ou isótopos radioativos.

[00275] Em uma realização, o anticorpo anti-TfR do presente é acoplado a uma droga para distúrbios neurológicos, um agente quimioterapêutico e/ou agente de formação de imagens, a fim de transportar com mais eficiência a droga, agente quimioterapêutico e/ou o agente de formação de imagens através da BBB.

[00276] A conjugação covalente pode ser direta ou por meio de um ligante. Em certas realizações, a conjugação direta é realizada por meio da construção de uma fusão de proteína (ou seja, por meio de fusão genética dos dois genes que codificam o anticorpo anti-TfR e, por exemplo, a droga para distúrbio neurológico e expressão como uma única proteína). Em certas realizações, a conjugação direta é realizada por meio da formação de uma ligação covalente entre um grupo reativo sobre uma das duas partes do anticorpo anti-TfR e um grupo ou receptor correspondente, por exemplo, sobre a droga neurológica. Em certas realizações, a conjugação direta é realizada por meio de modificação (ou seja, modificação genética) de uma das moléculas a serem conjugadas para incluir um grupo reativo (como exemplos não limitadores, um grupo sulfidrila ou um grupo carboxila) que forma ligação covalente à outra molécula a ser conjugada sob condições apropriadas. Como um exemplo não limitador, uma molécula (ou seja, um aminoácido) com um grupo reativo desejado (ou seja, um resíduo de cisteína) pode ser introduzida no anticorpo anti-TfR e uma ligação de dissulfeto formada, por exemplo, com a droga neurológica. Métodos de conjugação covalente de ácidos nucleicos a proteínas também são conhecidos na técnica (ou seja, fotorretícula; vide, por exemplo, Zatsepin et al (2005), Russ. Chem. Rev., 74: 77-95 (2005))

[00277] A conjugação não covalente pode ser qualquer meio de ligação não covalente, incluindo ligações hidrofóbicas, ligações iônicas, interações eletrostáticas e similares, como será facilmente compreendido pelos técnicos comuns no assunto.

[00278] A conjugação pode também ser realizada utilizando uma série de ligantes. Um anticorpo anti-TfR e uma droga neurológica podem ser conjugados, por exemplo, utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bisazido (tais como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-di- isocianato de tolueno) e compostos de flúor bisativo (tais como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito em Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil- 3-metildietileno triaminopenta-acético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026. Podem também ser utilizados ligantes de peptídeos, compostos de um a vinte aminoácidos ligados por ligações de peptídeos. Em algumas dessas realizações, os aminoácidos são selecionados a partir dos vinte aminoácidos de ocorrência natural. Em algumas outras dessas realizações, um ou mais dos aminoácidos são selecionados a partir de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. O ligante pode ser um “ligante divisível” que possibilita a liberação da droga neurológica mediante fornecimento para o cérebro. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante instável em ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotoinstável, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al, Cancer Res. 52: 127-131 (1992); Pedido de Patente Norte-Americana n° 5.208.020).

[00279] A presente invenção contempla expressamente, mas sem limitações, os conjugados preparados com reagentes reticulantes, que incluem, mas sem limitações, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato de succinimidil-(4-vinilsulfona)) que são disponíveis comercialmente (por exemplo, por meio da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos).

[00280] Em uma realização, um imunoconjugado é um conjugado de droga e anticorpo (ADC) no qual um anticorpo é conjugado a uma ou mais drogas, que incluem, mas sem limitações, um maitansinoide (vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.208.020, 5.416.064 e a Patente Europeia EP 0.425.235 B1); uma auristatina tal como porções de droga de monometilauristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (vide as Patentes Norte- Americanas n° 5.635.483, 5.780.588 e 7.498.298); dolastatina; uma caliqueamicina ou seu derivado (vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296; Hinman et al, Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993); e Lode et al, Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998)); uma antraciclina tal como daunomicina ou doxorubicina (vide Kratz et al, Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006); Jeffrey et al, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006); Torgov et al, Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005); Nagy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 829-834 (2000); Dubowchik et al, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529- 1532 (2002); King et al, J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002); e Patente Norte- Americana n° 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; tricoteceno; e CC1065.

[00281] Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou seu fragmento, incluindo, mas sem limitações, cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de ligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfassarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

[00282] Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente, conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma série de isótopos radioativos é disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado for utilizado para detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, tal como tc99m ou I123, ou marca de centrifugação para formação de imagens por meio de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagens por ressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio- 111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

E. Métodos e composições de diagnóstico e detecção:

[00283] Em certas realizações, qualquer um dos anticorpos anti- TfR fornecidos no presente é útil para detectar a presença de TfR em amostras biológicas. O termo “detecção”, da forma utilizada no presente, engloba detecção qualitativa ou quantitativa. Em certas realizações, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tal como sangue (ou seja, glóbulos vermelhos do sangue imaturos), CSF e tecido contendo BBB.

[00284] Em uma realização, é fornecido um anticorpo anti-TfR para uso em um método de detecção ou diagnósico. Em um aspecto adicional, é fornecido um método de detecção da presença de TfR em uma amostra biológica. Em certas realizações, o método compreende o contato da amostra biológica com um anticorpo anti-TfR conforme descrito no presente sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-TfR a TfR e detecção se é formado um complexo entre o anticorpo anti-TfR e TfR. Este método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma realização, um anticorpo anti-TfR é utilizado para selecionar pacientes que podem receber terapia com anticorpo anti-TfR, tal como em que TfR é um biomarcador para seleção de pacientes.

[00285] Exemplos de distúrbios que podem ser diagnosticados utilizando um anticorpo de acordo com a presente invenção incluem distúrbios que envolvem glóbulos vermelhos do sangue imaturos, devido ao fato de que TfR é expresso em reticulócitos e, portanto, é detectável por qualquer um dos anticorpos de acordo com a presente invenção. Esses distúrbios incluem anemia e outros distúrbios decorrentes de níveis reduzidos de reticulócitos, policitemia congênita ou policitemia vera neoplástica, em que contagens elevadas de glóbulos vermelhos do sangue devido à hiperproliferação, por exemplo, de reticulócitos, resultam em espessamento do sangue e consequentes sintomas fisiológicos.

[00286] Em certas realizações, são fornecidos anticorpos anti-TFR marcados. As marcas incluem, mas sem limitações, marcas ou porções que são detectadas diretamente (tais como marcas fluorescentes, cromofóricas, densas em elétrons, quimioluminescentes e radioativas), bem como porções, tais como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, por exemplo, por meio de reação enzimática ou interação molecular. Exemplos dessas marcas incluem, mas sem limitações, os radioisótopos P32, C14, I125, H3 e I131, fluoroforos tais como quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, tais como luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (Patente Norte-Americana n° 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, peroxidase de rabanete silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeos, tais como oxidase de glicose, oxidase de galactose e desidrogenase 6-fosfato de glicose, oxidases heterocíclicas tais como uricase e oxidase de xantina, acopladas a uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de tintura tal como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcas de centrifugação, marcas de bacteriófagos, radicais livres estáveis e similares.

[00287] Em uma realização, o anticorpo intacto não possui função efetora. Em outra realização, o anticorpo intacto possui função efetora reduzida. Em outra realização, o anticorpo intacto é elaborado para possuir função efetora reduzida. Em um aspecto, o anticorpo é Fab. Em outro aspecto, o anticorpo possui uma ou mais mutações Fc que reduzem ou eliminam a função efetora. Em outro aspecto, o anticorpo possui glicosilação modificada devido, por exemplo, à produção do anticorpo em um sistema que não possui enzimas de glicosilação humanas normais. Em outro aspecto, a cadeia principal de Ig é modificada em uma que possua naturalmente função efetora limitada ou ausente.

[00288] Diversos métodos são disponíveis para determinar a ligação do anticorpo ao TfR. Um desses testes é um teste imunossorvente ligado por enzimas (ELISA) para confirmar a capacidade de ligação a TfR humano (e antígeno do cérebro). Segundo este teste, as placas revestidas com antígeno (por exemplo, TfR recombinante) são incubadas com uma amostra que compreende o anticorpo anti-TfR e é determinada a ligação do anticorpo ao antígeno de interesse.

[00289] Testes de avaliação da absorção de anticorpo administrado de forma sistêmica e outra atividade biológica do anticorpo podem ser realizados conforme descrito nos exemplos ou conforme conhecido para o anticorpo de antígeno anti-SNC de interesse.

[00290] Em um aspecto, são fornecidos testes para identificar anticorpos anti-TfR conjugados (de forma covalente ou não covalente) a anticorpos anti-BACE1 que possuem atividade biológica. Atividade biológica pode incluir, por exemplo, inibição da atividade de aspartil protease de BACE1. Também são fornecidos anticorpos que possuem essa atividade biológica in vivo e/ou in vitro, por exemplo, conforme avaliado por meio de teste de fluorescência resolvida no tempo homogênea HTRF ou um teste eletroforético capilar microfluídico (MCE) utilizando peptídeos de substratos sintéticos ou in vivo em linhagens celulares que expressam substratos BACE1 tais como APP.

F. Formulações farmacêuticas:

[00291] Formulações farmacêuticas de um anti-TfR conforme descrito no presente são preparadas por meio da mistura desse anticorpo que possui o grau desejado de pureza com um ou mais veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A., Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis são geralmente atóxicos para os pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas sem limitações: tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabens tais como metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos com baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, tre-halose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de proteína e Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como polietileno glicol (PEG). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis no presente incluem ainda agentes de dispersão de drogas intersticiais tais como glicoproteínas de hialuronidase ativas neutras solúveis (sHASEGP), tais como glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certos exemplos de sHASEGPs e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Patentes Norte-Americanas publicadas n° 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, um sHASEGP é combinado com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[00292] Exemplos de formulações de anticorpos liofilizados encontram-se descritos na Patente Norte-Americana n° 6.267.958. Formulações de anticorpos aquosas incluem as descritas na Patente Norte- Americana n° 6.171.586 e em WO 2006/044908, em que estas últimas formulações incluem um tampão de acetato de histidina.

[00293] A formulação do presente pode também conter mais de um ingrediente ativo conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Pode ser desejável, por exemplo, fornecer adicionalmente um ou mais ingredientes ativos para tratar um distúrbio de neuropatia, doença neurodegenerativa, câncer, distúrbio de doença ocular, distúrbio convulsivo, doença de armazenagem lisossomal, amiloidose, doença viral ou microbiana, isquemia, distúrbio do comportamento ou inflamação do SNC. Exemplos desses medicamentos são discutidos abaixo. Esses ingredientes ativos encontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[00294] Os ingredientes ativos podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por métodos de aglutinação ou por polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de póli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Esses métodos são descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. (Ed.) (1980). Um ou mais ingredientes ativos podem ser encapsulados em lipossomos que são acoplados a anticorpos anti-TfR descritos no presente (vide, por exemplo, o Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 20020025313).

[00295] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo, em que essas matrizes encontram-se na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos não limitadores de matrizes com liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como metacrilato de póli(2-hidroxietila) ou álcool (póli)vinílico, polilactídeos (Patente Norte-Americana n° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L- glutamato de Y—etila, etileno vinil acetato não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tais como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido póli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

[00296] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

G. Composições e métodos terapêuticos:

[00297] Qualquer um dos anticorpos anti-TfR fornecidos no presente pode ser utilizado em métodos terapêuticos. Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-TfR para uso como medicamento. A presente invenção fornece, por exemplo, um método de transporte de composto terapêutico através da barreira entre o sangue e o cérebro com impacto reduzido ou eliminado sobre populações de glóbulos vermelhos do sangue, que compreende a exposição do anticorpo anti-TfR acoplado a um composto terapêutico (por exemplo, um anticorpo multiespecífico que liga o TfR e um antígeno do cérebro) à BBB, de tal forma que o anticorpo transporte o composto terapêutico acoplado através da BBB. Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método de transporte de uma droga de distúrbio neurológico através da barreira entre o sangue e o cérebro, que compreende a exposição de um anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção acoplado a uma droga de distúrbio do cérebro (por exemplo, um anticorpo multiespecífico que liga o TfR e um antígeno do cérebro) à BBB, de tal forma que o anticorpo transporte a droga de distúrbio neurológico acoplada através da BBB sem redução nem eliminação do impacto sobre populações de glóbulos vermelhos do sangue. Em uma realização, a BBB encontra-se em mamífero (por exemplo, ser humano), por exemplo, que possui distúrbio neurológico, incluindo, sem limitações: mal de Alzheimer (AD), apoplexia, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, mal de Parkinson, mal de Pick, mal de Paget, câncer, lesão cerebral traumática etc.

[00298] Em uma realização, o distúrbio neurológico é selecionado a partir de: neuropatia, amiloidose, câncer (por exemplo, que envolve o SNC ou cérebro), doença ou distúrbio ocular, infecção viral ou microbiana, inflamação (por exemplo, do SNC ou cérebro), isquemia, doença neurodegenerativa, convulsão, distúrbio do comportamento, doença de armazenagem lisossomal etc. Os anticorpos de acordo com a presente invenção são particularmente apropriados para o tratamento desses distúrbios neurológicos devido à sua capacidade de transportar um ou mais ingredientes ativos associados/compostos terapêuticos acoplados através da BBB e para o SNC/cérebro, onde esses distúrbios encontram sua base molecular, celular ou viral/microbiana.

[00299] Distúrbios neuropáticos são doenças ou anormalidades do sistema nervoso caracterizadas por sinalização nervosa inadequada, descontrolada ou inexistente e incluem, mas sem limitações, dores crônicas (incluindo dor nociceptiva), dor causada por lesão a tecidos do corpo, incluindo dor relativa a câncer, dor neuropática (dor causada por anormalidades nos nervos, medula espinhal ou cérebro) e dor psicogênica (relativa completamente ou na maior parte a um distúrbio psicológico), dor de cabeça, enxaqueca, neuropatia e sintomas e síndromes que acompanham frequentemente esses distúrbios neuropáticos, tais como vertigens ou náuseas.

[00300] Para distúrbio de neuropatia, pode ser selecionada uma droga neurológica que seja analgésico, incluindo, mas sem limitações, um analgésico narcótico/opioide (ou seja, morfina, fentanil, hidrocodona, meperidina, metadona, oximorfona, pentazocina, propoxifeno, tramadol, codeína e oxicodona), droga anti-inflamatória não esteroide (NSAID) (ou seja, ibuprofen, naproxen, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, flurbiprofen, indometacin, quetorolac, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, oxaprozin, piroxicam, sulindac e tolmetin), corticoesteroide (ou seja, cortisona, prednisona, prednisolona, dexametasona, metilprednisolona e triancinolona), agente antienxaqueca (ou seja, sumatriptin, almotriptan, frovatriptan, sumatriptan, rizatriptan, eletriptan, zolmitriptan, di-hidroergotamina, eletriptan e ergotamina), acetaminofen, salicilato (ou seja, aspirina, salicilato de colina, salicilato de magnésio, diflunisal e salsalato), anticonvulsivo (ou seja, carbamazepina, clonazepam, gabapentina, lamotrigina, pregabalina, tiagabina e topiramato), anestésico (ou seja, isoflurano, tricloroetileno, halotano, sevoflurano, benzocaína, cloroprocaína, cocaína, ciclometicaína, dimetocaína, propoxicaína, procaína, novocaína, proparacaína, tetracaína, articaína, bupivacaína, carticaína, cinchocaína, etidocaína, levobupivacaína, lidocaína, mepivacaína, piperocaína, prilocaína, ropivacaína, trimecaína, saxitoxina e tetrodotoxina) e um inibidor de cox-2 (ou seja, celecoxib, rofecoxib e valdecoxib). Para distúrbio neuropático com envolvimento de vertigem, pode ser selecionada uma droga neurológica que seja um agente antivertigem, incluindo, mas sem limitações, meclizina, difenidramina, prometazina e diazepam. Para distúrbio neuropático com envolvimento de náusea, pode ser selecionada uma droga neurológica que seja um agente antináuseas que inclui, mas sem limitações, prometazina, clorpromazina, proclorperazina, trimetobenzamida e metoclopramida.

[00301] Amiloidoses são um grupo de doenças e distúrbios associados a depósitos proteináceos extracelulares no SNC, incluindo, mas sem limitações, amiloidose secundária, amiloidose relativa à idade, mal de Alzheimer (AD), impedimento cognitivo suave (MCI), demência de corpos Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês), complexo de demência de Parkinson e Guam, angiopatia amiloide cerebral, mal de Huntington, paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; mal de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, encefalopatia espongiforme transmissível, demência relativa a HIV, esclerose lateral amiotrófica (ALS), miosite de corpos de inclusão (IBM) e doenças oculares relativas à deposição beta-amiloide (ou seja, degeneração macular, neuropatia ótica relativa a drusas e catarata).

[00302] Para amiloidose, pode ser selecionado um composto ativo que inclui, mas sem limitações, um anticorpo ou outra molécula de ligação (incluindo, mas sem limitações, uma molécula pequena, peptídeo, aptâmero ou outro aglutinante de proteína) que se liga especificamente a um alvo selecionado a partir de: beta secretase, tau, presenilina, proteína precursora da amiloide ou suas porções, peptídeo beta amiloide ou seus oligômeros ou fibrilas, receptor da morte 6 (DR6), receptor de produtos finais de glicação avançada (RAGE), parquina e huntingtina; inibidor da colinesterase (ou seja, galantamina, donepezil, rivastigmina e tacrina); antagonista receptor de NMDA (ou seja, memantina), esgotador de monoamina (ou seja, tetrabenazina); mesilato ergoloide; agente antiparkinsonismo anticolinérgico (ou seja, prociclidina, difenidramina, tri-hexilfenidila, benzotropina, biperiden e tri- hexifenidila); agente antiparkinsonismo dopaminérgico (ou seja, entacapone, selegilina, pramipexol, bromocriptina, rotigotina, selegilina, ropinirol, rasagilina, apomorfina, carbidopa, levodopa, pergolida, tolcapona e amantadina); tetrabenazina; anti-inflamatório (incluindo, mas sem limitações, droga anti- inflamatória não esteroide (ou seja, indometicina e outros compostos relacionados acima); hormônio (ou seja, estrogênio, progesterona e leuprolida); vitamina (ou seja, folato e nicotinamida); dimebolina; homotaurina (ou seja, ácido 3-aminopropanossulfônico; 3APS); modulador da atividade receptora de serotonina (ou seja, xaliproden); interferona e glucocorticoide.

[00303] Os cânceres do SNC são caracterizados pela proliferação aberrante de uma ou mais células do SNC (ou seja, uma célula neural) e incluem, mas sem limitações, glioma, glioblastoma multiforme, meningioma, astrocitoma, neuroma acústico, condroma, oligodendroglioma, meduloblastomas, ganglioglioma, Schwannoma, neurofibroma, neuroblastoma e tumores extradurais, intramedulares ou intradurais.

[00304] Para câncer, pode ser selecionada uma droga neurológica que seja um agente quimioterapêutico. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetra-hidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); betalapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodicti-ina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enedi-ina (tais como caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 1I e caliqueamicina ômega I1 (vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de cromoproteína enedi-ina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene OR); razoxano; rizoxin; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); tiotepa; taxoides, tais como paclitaxel TAXOL® (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton NJ), ABRAXANE® livre de Cremophor, formulação de nanopartículas de paclitaxel elaborada com albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tais como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®); sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima, tais como CHOP, abreviação de terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, abreviação de regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN®) combinada com 5-FU e leucovovina.

[00305] Também são incluídos nesta definição de agentes quimioterapêuticos os agentes anti-hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento do câncer e apresentam-se frequentemente na forma de tratamento sistêmico ou do corpo todo. Eles próprios podem ser hormônios. Exemplos incluem antiestrógenos e moduladores de receptores de estrógenos seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifen (incluindo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; antiprogesteronas; reguladores de receptores de estrógenos (ERDs); agentes que funcionam para suprimir ou desconectar os ovários, tais como agonistas de hormônios liberadores de hormônios leutinizantes (LHRH) tais como acetato de leuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros antiandrógenos, tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógenos nas glândulas adrenais, tais como 4 (5)- imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®. Além disso, essa definição de agentes quimioterapêuticos inclui bifosfonatos tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, zoledronato/ácido zoledrônico ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® ou risedronato ACTONEL®; bem como troxacitabina (análogo de citosina de nucleosídeo 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos sem sentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em processos de sinalização relacionados à proliferação de células aberrantes, tais como PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas de terapia genética, tais como vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (inibidor de moléculas pequenas tirosino quinase duplo EGFR e ErbB-2 também conhecido como GW572016); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.

[00306] Outro grupo de compostos que podem ser selecionados como drogas neurológicas para tratamento ou prevenção de câncer são imunoglobulinas anticâncer (incluindo, mas sem limitações, trastuzumab, pertuzumab, bevacizumab, alentuxumab, cetuximab, gentuzumab, ozogamicina, ibritumomab, tiuxetan, panitumumab e rituximab). Em alguns casos, anticorpos em conjunto com um conjugado ou marca tóxica podem ser utilizados para dirigir e matar células desejadas (ou seja, células de câncer), incluindo, mas sem limitações, tositumomab com uma rádio marca I131 ou trastuzumab entansina.

[00307] Doenças ou distúrbios oculares são doenças ou distúrbios dos olhos que, para os propósitos do presente, são considerados órgãos do SNC segregados pela BBB. Doenças ou distúrbios oculares incluem, mas sem limitações, distúrbios de esclera, córnea, íris e corpo ciliar (ou seja, esclerite, queratite, úlcera da córnea, abrasão da córnea, cegueira na neve, olho em arco, queropatia de punção superficial de Thygeson, neovascularização da córnea, distrofia de Fuchs, queratocono, queratoconjuntivite seca, irite e uveíte), distúrbios do cristalino (ou seja, catarata), distúrbios da coroide e da retina (ou seja, descolamento de retina, retinosquisia, retinopatia hipertensiva, retinopatia diabética, retinopatia, retinopatia do prematuro, degeneração macular relativa à idade, degeneração macular (úmida ou seca), membrana epirretinal, retinite pigmentosa e edema macular), glaucoma, flutuantes, distúrbios do nervo óptico e processos visuais (ou seja, neuropatia ótica hereditária de Leber e drusas do disco óptico), distúrbios dos músculos oculares/acomodação/refração do movimento binocular (ou seja, estrabismo, oftalmoparese, oftalmoplegia externa progressiva, esotropia, exotropia, hipermetropia, miopia, astigmatismo, anisometropia, presbiopia e oftalmoplegia), distúrbios visuais e cegueira (ou seja, ambliopia, amaurose congênita de Lever, escotoma, cegueira das cores, acromatopsia, nictalopia, cegueira, cegueira do rio e micro-oftalmia/coloboma), olhos vermelhos, pupila de Argyll Robertson, queratomicose, xeroftalmia e andaniridia.

[00308] Para doença ou distúrbio ocular, pode ser selecionada uma droga neurológica que seja um agente oftálmico antiangiogênico (ou seja, bevacizumab, ranibizumab e pegaptanib), um agente de glaucoma oftálmico (ou seja, carbacol, epinefrina, brometo de demecário, apraclonidina, brimonidina, brinzolamida, levobunolol, timolol, betaxolol, dorzolamida, bimatoprost, carteolol, metipranolol, dipivefrina, travoprost e latanoprost), um inibidor da anidrase carbônico (ou seja, metazolamida e acetazolamida), anti- histamínico oftálmico (ou seja, nafazolina, fenilefrina e tetra-hidrozolina), lubrificante ocular, esteroide oftálmico (ou seja, fluorometolona, prednisolona, loteprednol, dexametasona, difluprednato, rimexolona, fluocinolona, medrisona e triancinolona), anestésico oftálmico (ou seja, lidocaína, proparacaína e tetracaína), anti-infeccioso oftálmico (ou seja, levofloxacina, gatifloxacina, ciprofloxacina, moxifloxacina, cloranfenicol, bacitracina/polimixina b, sulfacetamida, tobramicina, azitromicina, besifloxacina, norfloxacina, sulfisoxazol, gentamicina, idoxuridina, eritromicina, natamicina, gramicidina, neomicina, ofloxacina, trifluridina, ganciclovir, vidarabina), agente anti- inflamatório oftálmico (ou seja, nepafenac, cetorolac, flurbiprofen, suprofen, ciclosporina, triancinolona, diclofenac e bromofenac) e um anti-histamínico ou descongestionante oftálmico (ou seja, quetotifen, olopatadina, epinastina, nafazolina, cromolina, tetra-hidrozolina, pemirolast, bepotastina, nafazolina, fenilefrina, nedocromil, lodoxamida, fenilefrina, emedastina e azelastina).

[00309] Infecções virais ou microbianas do SNC incluem, mas sem limitações, infecções por vírus (ou seja, influenza, HIV, poliovírus, rubéola), bactérias (ou seja, Neisseria sp, Streptococcus sp, Pseudomonas sp, Proteus sp, E. coli, S. aureus, Pneumococcus sp, Meningococcus sp, Haemophilus sp e Mycobacterium tuberculosis) e outros micro-organismos tais como fungos (ou seja, leveduras, Cryptococcus neoformans), parasitas (ou seja, Toxoplasma gondii) ou amebas, resultando em patofisiologias do SNC, incluindo, mas sem limitações, meningite, encefalite, mielite, vasculite e abscessos, que podem ser agudos ou crônicos.

[00310] Para doenças virais ou microbianas, pode ser selecionada uma droga neurológica que inclui, mas sem limitações, um composto antiviral (incluindo, mas sem limitações, um antiviral adamantano (ou seja, rimantadina e amantadina), interferona antiviral (ou seja, peginterferona alfa-2b), antagonista receptor de quemoquina (ou seja, maraviroc), inibidor da transferência de cordões de integrase (ou seja, raltegravir), inibidor da neuraminidase (ou seja, oseltamivir e zanamivir), inibidor da transcriptase reversa não de nucleosídeos (ou seja, efavirenz, etravirina, delavirdina e nevirapina), inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeos (tenofovir, abacavir, lamivudina, zidovudina, estavudina, entecavir, entricitabina, adefovir, zalcitabina, telbivudina e didanosina), inibidor da protease (ou seja, darunavir, atazanavir, fosamprenavir, tipranavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir, indinavir e saquinavir), nucleosídeo de purina (ou seja, valaciclovir, fanciclovir, aciclovir, ribavirina, ganciclovir, valganciclovir e cidofovir) e um antiviral diverso (ou seja, enfuvirtida, foscarnet, palivizumab e fomivirsen), antibiótico (incluindo, mas sem limitações, aminopenicilina (ou seja, amoxicilina, ampicilina, oxacilina, naficilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucoxacilina, temocilina, azlocilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina, piperacilina e bacampicilina), cefalosporina (ou seja, cefazolina, cefalexina, cefalotina, cefamandol, ceftriaxona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, cefadroxil, cefradina, loracarbef, cefotetan, cefuroxima, cefprozil, cefaclor e cefoxitina), carbapenem/penem (ou seja, imipenem, meropenem, ertapenem, faropenem e doripenem), monobactama (ou seja, aztreonam, tigemonam, norcardicina A e tabtoxinina-betalactama, inibidor da betalactamase (ou seja, ácido clavulânico, tazobactama e sulbactama) em conjunto com outro antibiótico betalactama, aminoglicosídeo (ou seja, amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina e paromomicina), ansamicina (ou seja, geldanamicina e herbimicina), carbacefem (ou seja, loracarbef), glicopeptídeos (ou seja, teicoplanina e vancomicina), macrolida (ou seja, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina e espectinomicina), monobactama (ou seja, aztreonam), quinolona (ou seja, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina, grepafloxacina, esparfloxacina e temafloxacina), sulfonamida (ou seja, mafenida, sulfonamidocrisoidina, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfametizol, sulfanilamida, sulfassalazina, sulfisoxazol, trimetoprim e sulfametoxazol), tetraciclina (ou seja, tetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, minociclina e oxitetraciclina), antineoplástico ou antibiótico citotóxico (ou seja, doxorubicina, mitoxantrona, bleomicina, daunorubicina, dactinomicina, epirubicina, idarubicina, plicamicina, mitomicina, pentostatina e valrubicina) e um composto antibactericida diverso (ou seja, bacitracina, colistina e polimixina B), antifúngico (ou seja, metronidazol, nitazoxanida, tinidazol, cloroquina, iodoquinol e paromomicina) e um antiparasítico (incluindo, mas sem limitações, quinina, cloroquina, amodiaquina, pirimetamina, sulfadoxina, proguanil, mefloquina, atovaquona, primaquina, artemesinina, halofantrina, doxiciclina, clindamicina, mebendazol, pamoato de pirantel, tiabendazol, dietilcarbamazina, ivermectina, rifampina, anfotericina B, melarsoprol, efornitina e albendazol).

[00311] Inflamações do SNC incluem, mas sem limitações, inflamações que são causadas por lesões ao SNC, que podem ser lesões físicas (ou seja, devido a acidentes, cirurgia, trauma cerebral, lesões da medula espainhal, concussão) e lesões devido ou relacionadas a uma ou mais doenças ou distúrbios do SNC (ou seja, abscesso, câncer, infecções virais ou microbianas).

[00312] Para inflamação do SNC, pode ser selecionada uma droga neurológica que aborda a própria inflamação (ou seja, um agente anti- inflamatório não esteroide tal como ibuprofen ou naproxen) ou um que trate a causa subjacente da inflamação (ou seja, um agente antiviral ou anticancerígeno).

[00313] Isquemia do SNC, da forma utilizada no presente, designa um grupo de distúrbios relativos ao comportamento vascular ou fluxo sanguíneo aberrante no cérebro ou suas causas e inclui, mas sem limitações: isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global, apoplexia (ou seja, hemorragia subaracnoide e hemorragia intracerebral) e aneurisma.

[00314] Para isquemia, pode ser selecionada uma droga neurológica que inclui, mas sem limitações, um trombolítico (ou seja, uroquinase, alteplase, reteplase e tenecteplase), inibidor da agregação de plaquetas (ou seja, aspirina, cilostazol, clopidogrel, prasugrel e dipiridamol), estatina (ou seja, lovastatina, pravastatina, fluvastatina, rosuvastatina, atorvastatina, sinvastatina, cerivastatina e pitavastatina) e um composto para aumentar o fluxo sanguíneo ou a flexibilidade vascular, incluindo, por exemplo, medicações para a pressão sanguínea.

[00315] Doenças neurodegenerativas são um grupo de doenças e distúrbios associados à perda de função ou morte das células neurais no SNC e incluem, mas sem limitações: adrenoleucodistrofia, mal de Alexander, mal de Alper, esclerose lateral amiotrófica, ataxia telangiectasia, mal de Batten, síndrome de Cockayne, degeneração corticobasal, degeneração causada ou associada a uma amiloidose, ataxia de Friedriech, degeneração lobular frontotemporal, mal de Kennedy, atrofia de múltiplos sistemas, esclerose múltipla, esclerose lateral primária, paralisia supranuclear progressiva, atrofia muscular espinhal, mielite transversal, mal de Refsum e ataxia espinhocerebelar.

[00316] Para doenças neurodegenerativas, pode ser selecionada uma droga neurológica que é um hormônio do crescimento ou fator neurotrófico; exemplos incluem, mas sem limitações, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento dos nervos (NGF), neurotrofina 4/5, fator de crescimento de fibroblastas (FGF)-2 e outros FGFs, neurotrofina (NT)- 3, eritropoietina (EPO), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de transformação (TGF) alfa, TGF-beta, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), antagonista receptor de interleucina 1 (IL-1ra), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator neurotrófico derivado de glial (GDNF), neurturina, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), herregulina, neurregulina, artemina, persefina, interleucinas, fator neurotrófico derivado de linhagens de células gliais (GFR), fator estimulante de colônia de granulócitos (CSF), CSF de macrófagos e granulócitos, netrinas, cardiotrofina 1, Hedgehogs, fator inibidor de leucemia (LIF), Midkine, pleiotrofina, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), netrinas, saposinas, semaforinas e fator de células tronco (SCF).

[00317] Doenças e distúrbios convulsivos do SNC envolvem a condução de eletricidade anormal e/ou inadequada no SNC e incluem, mas sem limitações, epilepsia (ou seja, males súbitos de ausência, males súbitos atônicos, epilepsia rolândica benigna, ausência infantil, males súbitos clônicos, males súbitos parciais complexos, epilepsia do lobo frontal, males súbitos febris, espasmos infantis, epilepsia mioclônica juvenil, epilepsia da ausência juvenil, síndrome de Lennox-Gastaut, síndrome de Landau-Kleffner, síndrome de Dravet, síndrome de Otahara, síndrome de West, males súbitos mioclônicos, distúrbios mitocôndricos, epilepsias mioclônicas progressivas, males súbitos psicogênicos, epilepsia reflexa, síndrome de Rasmussen, males súbitos parciais simples, males súbitos generalizados secundários, epilepsia do lobo temporal, males súbitos toniclônicos, males súbitos tônicos, males súbitos psicomotores, epilepsia límbica, males súbitos de início parcial, males súbitos de início generalizado, estado epiléptico, epilepsia abdominal, males súbitos acinéticos, males súbitos autonômicos, myoclonus bilateral massivo, epilepsia catamenial, males súbitos de queda, males súbitos emocionais, males súbitos focais, males súbitos gelásticos, marcha jacksoniana, mal de Lafora, males súbitos motores, males súbitos multifocais, males súbitos noturnos, males súbitos fotossensíveis, pseudomales súbitos, males súbitos sensoriais, males súbitos tênues, males súbitos de Sylvan, males súbitos de retirada e males súbitos de reflexos visuais).

[00318] Para distúrbio convulsivo, pode ser selecionada uma droga neurológica que seja um anticonvulsivo ou antiepiléptico, incluindo, mas sem limitações, anticonvulsivos de barbiturato (ou seja, primidona, metarbital, mefobarbital, alobarbital, amobarbital, aprobarbital, alfenal, barbital, bralobarbital e fenobarbital), anticonvulsivos de benzodiazepina (ou seja, diazepam, clonazepam e lorazepam), anticonvulsivos de carbamato (ou seja, felbamato), anticonvulsivos inibidores da anidrase carbônica (ou seja, acetazolamida, topiramato e zonisamida), anticonvulsivos de dibenzazepina (ou seja, rufinamida, carbamazepina e oxocarbazepina), anticonvulsivos derivados de ácidos graxos (ou seja, divalproex e ácido valproico), análogos de ácido gama-aminobutírico (ou seja, pregabalina, gabapentina e vigabatrina), inibidores da reabsorção de ácido gama-aminobutírico (ou seja, tiagabina), inibidores da transaminase de ácido gama-aminobutírico (ou seja, vigabatrina), anticonvulsivos de hidantoína (ou seja, fenitoína, etotoína, fosfenitoína e mefenitoína), anticonvulsivos diversos (ou seja, lacosamida e sulfato de magnésio), progestinas (ou seja, progesterona), anticonvulsivos de oxazolidinodiona (ou seja, parametadiona e trimetadiona), anticonvulsivos de pirrolidina (ou seja, levetiracetam), anticonvulsivos de succinimida (ou seja, etossuximida e metossuximida), anticonvulsivos de triazina (ou seja, lamotrigina) e anticonvulsivos de ureia (ou seja, fenacemida e feneturida).

[00319] Distúrbios do comportamento são distúrbios do SNC caracterizados por comportamento aberrante da parte do paciente afligido e incluem, mas sem limitações: distúrbios do sono (ou seja, insônia, parassônia, terrores noturnos, distúrbios do sono do ritmo circadiano e narcolepsia), distúrbios do humor (ou seja, depressão, depressão suicida, ansiedade, distúrbios afetivos crônicos, fobias, ataques de pânico, distúrbio obsessivo- compulsivo, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH), transtorno de déficit de atenção (TDA), síndrome de fadiga crônica, agorafobia, distúrbio de tensão pós-traumática, distúrbio bipolar), distúrbios da alimentação (ou seja, anorexia ou bulimia), psicoses, distúrbios do desenvolvimento do comportamento (ou seja, autismo, síndrome de Rett, síndrome de Asperger), distúrbios da personalidade e distúrbios psicóticos (ou seja, esquizofrenia, distúrbios de delírios e similares).

[00320] Para distúrbios do comportamento, uma droga neurológica pode ser selecionada a partir de um composto modificador do comportamento que inclui, mas sem limitações, um antipsicótico atípico (ou seja, risperidona, olanzapina, apripiprazol, quetiapina, paliperidona, asenapina, clozapina, iloperidona e ziprasidona), antipsicótico de fenotiazina (ou seja, proclorperazina, clorpromazina, flufenazina, perfenazina, trifluoperazina, tioridazina e mesoridazina), tioxanteno (ou seja, tiotixeno), antipsicótico diverso (ou seja, pimozida, lítio, molindona, haloperidol e loxapina), inibidor da reabsorção de serotonina seletivo (ou seja, citalopram, escitalopram, paroxetina, fluoxetina e sertralina), inibidor da reabsorção de serotonina- norepinefrina (ou seja, duloxetina, venlafaxina, desvenlafaxina, antidepressivo tricíclico (ou seja, doxepina, clomipramina, amoxapina, nortriptilina, amitriptilina, trimipramina, imipramina, protriptilina e desipramina), antidepressivo tetracíclico (ou seja, mirtazapina e maprotilina), antidepressivo de fenilpiperazina (ou seja, trazodona e nefazodona), inibidor da oxidase de monoamina (ou seja, isocarboxazid, fenelzina, selegilina e tranilcipromina), benzodiazepina (ou seja, alprazolam, estazolam, flurazeptam, clonazepam, lorazepam e diazepam), inibidor da reabsorção de norepinefrina-dopamina (ou seja, bupropion), estimulante do SNC (ou seja, fentermina, dietilpropion, metanfetamina, dextroanfetamina, anfetamina, metilfenidato, dexometilfenidato, lisdexanfetamina, modafinil, pemolina, fendimetrazina, benzofetamina, fendimetrazina, armodafinil, dietilpropion, cafeína, atomoxetina, doxapram e mazindol), ansiolítico/sedativo/hipnótico (incluindo, mas sem limitações, barbiturato (ou seja, secobarbital, fenobarbital e mefobarbital), benzodiazepina (conforme descrito acima) e um ansiolítico/sedativo/hipnótico diverso (ou seja, difenidramina, oxibato de sódio, zaleplon, hidroxizina, hidrato cloral, aolpidem, buspirona, doxepina, eszopiclona, ramelteon, meprobamato e etclorvinol), secretina (vide, por exemplo, Ratliff-Schaub et al, Autism 9: 256-265 (2005)), peptídeo opioide (vide, por exemplo, Cowen et al, J. Neurochem. 89: 273-285 (2004)) e um neuropeptídeo (vide, por exemplo, Hethwa et al, Am. J. Physiol. 289, E301-305 (2005)).

[00321] Distúrbios da armazenagem lisossomal são distúrbios metabólicos que, em alguns casos, são associados ao SNC ou possuem sintomas específicos do SNC; esses distúrbios incluem, mas sem limitações: mal de Tay-Sachs, mal de Gaucher, mal de Fabry, mucopolissacaridose (tipos I, II, III, IV, V, VI e VII), mal de armazenagem de glicogenes, gangliosidose GM1, leucodistrofia metacromática, mal de Farber, leucodistrofia de Canavan e lipofuscinoses ceroides neuronais tipos 1 e 2, mal de Niemann-Pick, mal de Pompe e mal de Krabbe.

[00322] Para doença de armazenagem lisossomal, pode ser selecionada uma droga neurológica que é por si própria ou imita de outra forma a atividade da enzima que é impedida na doença. Exemplos de enzimas recombinantes para o tratamento de distúrbios de armazenagem lisossomal incluem, mas sem limitações, as descritas, por exemplo, no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2005/0142141 (ou seja, alfa-L-iduronidase, iduronato-2-sulfatase, N-sulfatase, alfa-N-acetilglucosaminidase, N- acetilgalactosamina-6-sulfatase, betagalactosidase, arilsulfatase B, betaglucuronidase, alfaglucosidase ácida, glucocerebrosidase, alfagalactosidase A, hexosaminidase A, esfingomielinase ácida, betagalactocerebrosidase, betagalactosidase, arilsulfatase A, ceramidase ácida, aspartoacilase, palmitoilproteína tioesterase 1 e tripeptidil aminopeptidase 1).

[00323] Em outra realização, doenças relacionadas ou causadas pela sobreprodução inadequada de glóbulos vermelhos do sangue ou em que a sobreprodução de glóbulos vermelhos do sangue é um efeito da doença podem ser evitadas ou tratadas pelo efeito de esgotamento dos reticulócitos reconhecido no presente de anticorpos anti-TfR que retêm função efetora ao menos parcial. Em policitemia vera congênita ou neoplástica, por exemplo, contagens elevadas de glóbulos vermelhos do sangue devido à hiperproliferação, por exemplo, de reticulócitos, resultam em espessamento do sangue e consequentes sintomas fisiológicos (d’Onofrio et al, Clin. Lab. Haematol. (1996), Supl. 1: 29-34). A administração de um anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção, em que função efetora ao menos parcial do anticorpo foi preservada, permitiria a remoção seletiva de populações de reticulócitos imaturos sem impacto ao transporte normal de transferrina para o SNC. A dosagem desse anticorpo poderá ser modulada de tal forma que sintomas clínicos agudos poderão ser minimizados (por exemplo, por meio do fornecimento de dosagem muito baixa ou em intervalos amplamente espaçados), como é bem compreendido na técnica.

[00324] Em um aspecto, utiliza-se um anticorpo de acordo com a presente invenção para detectar um distúrbio neurológico antes do início dos sintomas e/ou para determinar a severidade ou a duração da doença ou distúrbio. Em um aspecto, o anticorpo permite a detecção e/ou a formação de imagens do distúrbio neurológico, incluindo a formação de imagens por meio de radiografia, tomografia ou formação de imagens por ressonância magnética (MRI).

[00325] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-TfR com baixa afinidade de acordo com a presente invenção para uso como medicamento. Em aspectos adicionais, é fornecido um anticorpo anti-TfR com baixa afinidade para uso no tratamento de distúrbios ou doenças neurológicas (por exemplo, mal de Alzheimer) sem esgotar os glóbulos vermelhos do sangue (ou seja, reticulócitos). Em certas realizações, é fornecido um anticorpo anti- TfR com baixa afinidade modificado para uso em um método de tratamento conforme descrito no presente. Em certas realizações, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR com baixa afinidade modificado para aumentar a sua segurança para uso em um método de tratamento de indivíduos portadores de distúrbio ou doença neurológica que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-TfR (opcionalmente acoplado a uma droga de distúrbio neurológico). Em uma dessas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Em realizações adicionais, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TfR modificado para aumentar sua segurança para uso na redução ou inibição da formação de placas amiloides em pacientes com risco ou que sofrem de doença ou distúrbio neurológico (por exemplo, mal de Alzheimer). Um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima é opcionalmente um ser humano. Em certos aspectos, o anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção para uso nos métodos de acordo com a presente invenção aumenta a absorção da droga para distúrbio neurológico à qual é acoplado.

[00326] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-TfR com baixa afinidade de acordo com a presente invenção na fabricação ou preparação de medicamentos. Em uma realização, o medicamento destina-se ao tratamento de uma doença ou distúrbio neurológico. Em uma realização adicional, o medicamento destina-se a uso em um método de tratamento de doença ou distúrbio neurológico que compreende a administração a um indivíduo portador de doença ou distúrbio neurológico de uma quantidade eficaz do medicamento. Em uma dessas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional.

[00327] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de tratamento de mal de Alzheimer. Em uma realização, o método compreende a administração a indivíduos portadores de mal de Alzheimer de uma quantidade eficaz de um anticorpo multiespecífico de acordo com a presente invenção que liga BACE1 e TfR ou Abeta e TfR. Em uma dessas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima pode ser um ser humano.

[00328] Os anticorpos anti-TfR de acordo com a presente invenção podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outros agentes em terapia. O anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas realizações, um agente terapêutico adicional é um agente terapêutico eficaz para tratar um distúrbio neurológico idêntico ou diferente daquele que o anticorpo anti-TfR é empregado para tratar. Exemplos de agentes terapêuticos adicionais incluem, mas sem limitações: as várias drogas neurológicas descritas acima, inibidores da colinesterase (tais como donepezil, galantamina, rovastigmina e tacrina), antagonistas receptores de NMDA (tais como memantina), inibidores da agregação de peptídeos beta amiloide, antioxidantes, moduladores da Y-secretase, imitadores do fator do crescimento dos nervos (NGF) ou terapia de gene NGF, agonistas de PPARY, inibidores da HMS-CoA reductase (estatinas), ampaquinas, bloqueadores de canais de cálcio, antagonistas receptores de GABA, inibidores da sintase quinase de glicogenes, imunoglobulina intravenosa, agonistas receptores muscarínicos, moduladores receptores nicrotínicos, imunização de peptídeos beta amiloide ativos ou passivos, inibidores da fosfodiesterase, antagonistas receptores de serotonina e anticorpos antipeptídeo beta amiloide. Em certas realizações, o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado pela sua capacidade de reduzir um ou mais efeitos colaterais da droga neurológica.

[00329] Conforme exemplificado no presente, certos anticorpos anti-TfR podem possuir efeitos colaterais que apresentam impacto negativo sobre populações de reticulócitos em pacientes tratados com o anticorpo anti- TfR. Em certas realizações, portanto, pelo menos um agente terapêutico adicional selecionado pela sua capacidade de reduzir esse efeito colateral negativo sobre as populações de reticulócitos é coadministrado com um anticorpo anti-TfR de acordo com a presente invenção. Exemplos desses agentes terapêuticos incluem, mas sem limitações, agentes para aumentar as populações de glóbulos vermelhos do sangue (ou seja, reticulócitos), agentes para sustentar o crescimento e o desenvolvimento de glóbulos vermelhos do sangue (ou seja, reticulócitos) e agentes de proteção de populações de glóbulos vermelhos do sangue contra os efeitos do anticorpo anti-TfR; esses agentes incluem, mas sem limitações, eritropoietina (EPO), suplementos de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12, bem como a substituição física de glóbulos vermelhos do sangue (ou seja, reticulócitos), por exemplo, por meio de transfusão com células similares, que podem ser de outro indivíduo com tipo sanguíneo similar ou podem haver sido extraídos anteriormente do paciente ao qual é administrado o anticorpo anti-TfR. Os técnicos comuns no assunto compreenderão que, em alguns casos, agentes destinados a proteger os glóbulos vermelhos do sangue existentes (ou seja, reticulócitos) são preferencialmente administrados ao paciente antes ou simultaneamente à terapia com anticorpo anti-TfR, enquanto os agentes destinados a sustentar ou iniciar o novo crescimento/desenvolvimento de glóbulos vermelhos do sangue ou populações de glóbulos do sangue (ou seja, reticulócitos ou populações de reticulócitos) são preferencialmente administrados simultaneamente ou depois da terapia com anticorpos anti-TfR, de tal forma que esses glóbulos sanguíneos possam ser reabastecidos após o tratamento com anticorpo anti- TfR.

[00330] Em algumas outras realizações, o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado pela sua capacidade de inibir ou evitar a ativação do processo de complemento mediante administração do anticorpo anti-TfR. Exemplos desses agentes terapêuticos incluem, mas sem limitações, agentes que interferem com a capacidade do anticorpo anti-TfR de ligar-se ao processo de complemento ou ativá-lo e agentes que inibem uma ou mais interações moleculares no processo de complemento e são descritos, de forma geral, em Mollnes e Kirschfink (2006), Molec. Immunol. 43: 107-121, cujo teor é expressamente incorporado ao presente como referência.

[00331] Essas terapias de combinação indicadas acima e no presente incluem administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas) e administração separada, caso em que a administração do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou depois da administração do agente terapêutico e/ou adjuvante adicional. Em uma realização, a administração do anticorpo anti-TfR e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem em até cerca de um mês, em até cerca de uma, duas ou três semanas ou em até cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias entre si. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem também ser utilizados em combinação com outras terapias de intervenção, tais como, mas sem limitações, terapia de radiação, terapia comportamental ou outras terapias conhecidas na técnica e apropriadas para a doença neurológica a ser tratada ou evitada.

[00332] Um anticorpo anti-TFR de acordo com a presente invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio apropriado, incluindo administração parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser fornecida por qualquer via apropriada, tal como por meio de injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte, se a administração é rápida ou crônica. São contemplados no presente diversos cronogramas de dosagem, que incluem, mas sem limitações, administrações isoladas ou múltiplas ao longo de diversos momentos, administração de mistura e infusão de pulso.

[00333] Os anticorpos de acordo com a presente invenção seriam formulados, dosados e administrados de forma consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio específico sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de fornecimento do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes da medicina. O anticorpo não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para evitar ou tratar o distúrbio em questão ou para evitar, reduzir ou melhorar um ou mais efeitos colaterais da administração de anticorpos. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito no presente ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer meio que seja determinado empírica ou clinicamente como apropriado.

[00334] Para a prevenção ou o tratamento de doenças, a dosagem apropriada de um anticorpo de acordo com a presente invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de anticorpo, da severidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente, reação ao anticorpo e do critério do médico atendente. O anticorpo é administrado adequadamente ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a cerca de 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem inicial possível para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou de infusão contínua. Dosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até a ocorrência de supressão desejada de sintomas da doença. Um exemplo de dosagem do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 40 mg/kg. Portanto, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg ou 40 mg/kg (ou qualquer de suas combinações) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Pode-se também administrar uma dose de carregamento inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Apreciar-se-á que um método de redução do impacto sobre populações de reticulócitos por meio da administração de anticorpos anti-TfR é a modificação da quantidade ou do tempo das doses, de forma que quantidades gerais menores de anticorpo em circulação estejam presentes no fluxo sanguíneo para interagir com reticulócitos. Em um exemplo não limitador, uma dose mais baixa dos anticorpos anti-TfR pode ser administrada com maior frequência que uma dose mais alta. A dose utilizada pode ser equilibrada entre a quantidade de anticorpo necessária para fornecimento para o SNC (ela própria relacionada à afinidade da parte específica do antígeno do SNC do anticorpo), a afinidade daquele anticorpo para TfR e se o(s) composto(s) protetor(es) dos glóbulos vermelhos do sangue (ou seja, reticulócitos), estimulante(s) do crescimento e do desenvolvimento ou inibidor(es) do processo de complemento estão sendo coadministrados ou administrados em série com o anticorpo. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e testes convencionais, conforme descrito no presente e conhecido na técnica.

[00335] Compreende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima pode ser conduzido utilizando um imunoconjugado de acordo com a presente invenção no lugar ou além de um anticorpo anti-TfR.

H. Artigos industrializados:

[00336] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um artigo industrializado que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo industrializado compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas, sacos de solução intravenosa etc. Os recipientes podem ser formados com uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que, isoladamente ou em combinação com outra composição, é eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, uma ampola ou saco de solução intravenosa que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo da composição é um anticorpo de acordo com a presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição escolhida. Além disso, o artigo industrializado pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo de acordo com a presente invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agente citotóxico ou outro terapêutico adicional. O artigo industrializado desta realização da presente invenção pode compreender adicionalmente uma bula que indica que as composições podem ser utilizadas para o tratamento de uma condição específica. Alternativa ou adicionalmente, o artigo industrializado pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[00337] Compreende-se que qualquer um dos artigos industrializados acima pode incluir um imunoconjugado de acordo com a presente invenção no lugar ou além de um anticorpo anti-TfR.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[00338] Geração, caracterização e humanização de anticorpos anti-TfR com reação cruzada humanos/de cynomolgus:

[00339] Inicialmente, um processo de combinação de fagos de anticorpos nativos foi realizado em tentativa de identificar anticorpos com reação cruzada com TfR humano e TfR de macacos cynomolgus (“cyno”) que adicionalmente não competiram com Tf pela ligação a TfR (Lee et al, JMB (2004) 1073-1093). Nenhum clone com reação cruzada que não compete por Tf foi identificado por meio deste processo de combinação de fagos. Foram identificados, entretanto, dois anticorpos que foram úteis na caracterização de genes de hibridoma gerados em seguida.

[00340] Foi identificado um anticorpo com reação cruzada de espécies que concorre com Tf pela ligação a TfR humano ou de cynomolgus (anticorpo concorrente de Tf). O epítopo de outro clone, específico para TfR humano, foi mapeado no domínio apical de huTfR utilizando receptores de TfR quiméricos humanos/de camundongo (Figura 1). Este clone de ligação de domínio apical perdeu a ligação a huTfR quando a sequência de TfR de camundongo no domínio apical foi substituída por huTfR.

[00341] Foi realizada em seguida uma abordagem com base em imunização para gerar anticorpos anti-TfR humanos/de cynomolgus com reação cruzada. Domínio extracelular (“ecd”) de TfR humano que contém uma marca His N-terminal e proteína de hemacromatose humana (“HFE”) foram expressos e purificados conforme descrito (Bennet et al, Nature (2000), 403, 46-53). Foi também elaborada uma construção de ecd de TfR de cynomolgus análoga. TfR de cynomolgus foi expresso e purificado de forma similar. Anticorpos de TfR com reação cruzada humanos e de cynomolgus foram gerados por meio da imunização de cinco camundongos Balb/C na almofada da pata com seis doses (duas vezes por semana) contendo 2 μg de ecd de cynoTfR e huTfR cada. Todos os soros de camundongos foram positivos para FACS e todos os camundongos foram fundidos. De 1632 hibridomas selecionados, 111 foram positivos para ELISA para ligação a TfR humano e de cynomolgus.

[00342] Os hibridomas positivos para ELISA resultantes foram selecionados por meio de FACS na presença de 1 μM de holo-Tf humano para ligação a células 293 que expressam de forma transitória TfR humano ou de cynomolgus. Resumidamente, realizou-se análise de FACS utilizando células 293 que sofreram transfecção com TfR humano ou de cynomolgus com comprimento humano utilizando lipofectamina 2000 plus (Invitrogen) 48 a 72 horas antes da análise de FACS. Células 293 que sofreram transfecção e que não sofreram transfecção (controle) foram lavadas duas vezes com tampão FACS (PBS contendo 1% de BSA) e 50 μl de sobrenadante de hibridoma (normalizado a 10 μg/ml) foram adicionados a células 293 na presença de 1 μM de holo-Tf humano e incubados sobre gelo por trinta minutos. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS, 50 μl de anti-FcY murino de cabra e PE (Jackson ImmunoResearch) foram adicionados às células e elas foram incubadas sobre gelo por trinta minutos. As células foram lavadas com tampão FACS e novamente suspensas em 100 μl de tampão FACS para análise.

[00343] Quatorze clones foram positivos para ligação a TfR humano e de cynomolgus (Figuras 2A e 2B). Estes clones foram adicionalmente subclonados e avaliados para determinar a ligação a TfR humano e de cynomolgus por meio de ELISA e o epítopo foi mapeado sobre huTfR utilizando o clone de fago de ligação apical identificado acima. Resumidamente, realizou-se ELISA de competição de fagos de domínio apical em placas Maxisorp revestidas com 2 μg/ml de TfR humano ou de cynomolgus purificado em PBS a 4 °C por uma noite. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e bloqueadas utilizando Superblock com caseína (Thermo Scientific, Hudson NH). Uma parcela de 30 μl de sobrenadante de hibridoma (normalizada a 10 μg/ml) foi adicionada a cada cavidade por 45 minutos. Isso foi seguido pela adição de 30 μl de fago de ligação de domínio apical sob OD 0,05 por quinze minutos. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e HRP-camundongo-anti-M13 (GE Healthcare) diluído a 1:1000 foi adicionado à placa e incubado por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e fago ligado foi detectado utilizando substrato de TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills). Concluiu-se que nove dos quatorze clones bloqueiam a ligação do anticorpo de ligação apical exibido sobre o fago (vide a Figura 2C).

[00344] As afinidades de anticorpos foram medidas utilizando ressonância de plasma da superfície (“SPR”) (Biacore®, GE Healthcare). Anticorpo anti-His (Qiagen) foi acoplado a quatro células de fluxo diferentes de um chip sensor BIACORE® CM5 (Biacore, Inc., Piscataway NJ) a 6000 e 8000 RU. Atingiu-se imobilização por meio de acoplamento aleatório através de grupos amino utilizando um protocolo fornecido pelo fabricante. 10X HBS-P (Biacore, Inc., Piscataway NJ) foi diluído em água e serviu de tampão de diluição e condução. TfR humano ou de cynomolgus purificado foi capturado, seguido por uma série de três diluições de IgG ou Fab que foi injetada em velocidade de fluxo de 30 ml/min utilizando o método de cinética de ciclo único. As constantes de afinidade foram determinadas utilizando um modelo de ligação de Langmuir 1:1 simples ou utilizando um modelo em estado estável quando kon ou koff ultrapassasse o limite de detecção. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão entre a constante de taxa de associação (kon) e a constante de taxa de dissociação (koff). Os resultados são exibidos na Figura 2C.

[00345] Cada hibridoma foi clonado. RNA total foi isolado de hibridoma utilizando um minikit RNeasy (Qiagen) e cDNA foi gerado utilizando um kit de amplificação de cDNA SMART 5’ RACE (Clontech) com base nas instruções do fabricante. A região variável de cada anticorpo foi amplificada utilizando UPM (5’ oligo) fornecido no kit e 3’ oligo que se combina à região constante. O produto de PCR completo foi clonado em seguida em vetor pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) para sequenciamento. Após análise de sequências, os hibridomas poderão ser adicionalmente subdivididos em quatro grupos (Figuras 3A-3D). Os clones que competiram com o anticorpo de ligação apical se enquadraram em três classes de sequências relacionadas (Figuras 3A-C). Os quatro clones não apicais (Figura 3D) consistiram de dois clones relacionados e duas outras sequências exclusivas. As CDRs de cadeia leve e pesada de cada clone são fornecidas na Tabela 3.

TABELA 3

[00346] CDRs de cadeia leve e pesada de anticorpos anti-TFR de cynomolgus/humano com reação cruzada:

[00347]Clones representativos de cada classe (15G11, 7A4, 16F6 e 7G7) são exemplificados no presente para humanização e caracterização adicional. Atingiu-se humanização utilizando enxertos de HVR em conjunto com a inclusão de posições vernier selecionadas conforme descrito abaixo e as Figuras 4A-4E. 15G11 foi humanizado por meio de enxerto das HVRs nos domínios variáveis humanos IGKV1-NL1*01 e IGHV1-3*01. Combinações de posições Vernier de camundongo diferentes foram incluídas nas variantes humanizadas conforme descrito na Figura 4E. A variante de 15G11 humanizado 15G11.v5 contém posições Vernier selecionadas em VL (posições 43 e 48) e VH (posições 48, 67, 69, 71 e 73), conforme descrito na Figura 4A. Além disso, o terminal N de VH foi alterado de Q para E. Para humanização de 7A4, foi elaborado um enxerto de HVR utilizando HVRs de cadeia pesada 7A4 e cadeia leve 8A2 (7A4 e 8A2 são clones relacionados, Figura 3A). HVRs foram enxertadas nos domínios variáveis humanos IGKV4-1*01 e IGHV1-2*02. Combinações de posições Vernier de camundongo diferentes foram incluídas nas variantes humanizadas conforme descrito na Figura 4E. A variante de 7A4 humanizaa, 7A4.v15, contém posições Vernier selecionadas em VL (posição 68) e VH (posições 24 e 71) e a alteração de CDR-L3 G94A, conforme descrito na Figura 4B. 7G7 foi humanizado por meio de enxerto das HVRs nos domínios variáveis de consenso humano do subgrupo I e capa 4 em conjunto com posições Vernier selecionadas em VH (posição 93) conforme descrito na Figura 4C. Essa variante humanizada é denominada 7G7.v1. 16F6 foi humanizado por meio de enxerto das HVRs nos domínios variáveis humanos IGKV1-9*01 e IGHV4-59*01. Combinações de posições Vernier de camundongo diferentes foram incluídas nas variantes humanizadas conforme descrito na Figura 4E. A variante 16F6 humanizado 16F6.v4 contém duas alterações em VL (I48L e F71Y), bem como posições Vernier selecionadas em VL (posições 43 e 44) e VH (posições 71 e 78), conforme descrito na Figura 4D.

TABELA 4

[00348] CDRs de cadeia leve e pesada de anticorpos humanizados/Fabs:

[00349] A afinidade de variantes humanizadas para TfR humano e de cynomolgus foi determinada por meio de SPR na forma de IgG (Figura 4E). Clones selecionados foram também analisados por meio de SPR como Fab para determinar a afinidade de monovalentes (Tabela 7). Nos dois casos, os experimentos de SPR foram realizados conforme descrito acima.

TABELA 5

[00350] Dados de ligação de Biacore para variantes com Fab formatado selecionadas:

[00351] O epítopo de ligação dos anticorpos foi novamente confirmado conforme segue. Realizou-se ELISA de bloqueio de Tf-TfR em placas Maxisorp revestidas com 2 μg/ml de TfR humano purificado em PBS a 4 °C por uma noite. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e bloqueadas utilizando tampão de bloqueio Superblock em PBS (Thermo Scientific, Hudson NH). 50 μl de 12,5 μM de holo-Tf humano (R&D Systems, Mineápolis MN) foram adicionados às placas por quarenta minutos. 50 μl de titulação de hu7A4.v15, hu15G11.v5, anticorpo de competição de Tf e hu7G7.v1 (começando a 10 μg/ml, diluição em série 1:3) foram adicionados à placa e incubados por vinte minutos. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e anti-FcY humano-cabra-HRP diluído a 1:1000 (Jackson ImmunoResearch) foi adicionado à placa e incubado por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e detectadas utilizando substrato de TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills).

[00352] Realizou-se ELISA de ligação de HFE-TfR em placas Maxisorp revestidas com 1 μg/ml de HFE em PBS a 4 °C por uma noite. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e bloqueadas utilizando tampão de bloqueio Superblock em PBS (Thermo Scientific, Hudson NH). Adicionou-se titulação de TfR humano (a partir de 100 μg/ml, diluição em série 1:3) à placa e incubou-se por uma hora. Adicionou-se em seguida 1 μg/ml de hu15G11.v5, hu7A4.v15 ou hu7G7.v1 à placa por uma hora. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e anti-FcY humano-cabra-HRP diluído a 1:1000 (Jackson ImmunoResearch) foi adicionado à placa e incubado por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e detectadas utilizando substrato de TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills). Realizou-se ELISA de bloqueio de HFE-TfR em placas Maxisorp revestidas com 1 μg/ml de HFE em PBS a 4 °C por uma noite. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e bloqueadas utilizando tampão de bloqueio Superblock em PBS (Thermo Scientific, Hudson NH). Em uma placa NUNC®, titulação de hu7A4.v15, hu15G11.v5, anticorpo de competição de Tf, holo-Tf humano e IgG controle (400 μg para todo o anticorpo, 8000 μg/ml para holo transferrina, diluição em série 1:3) foi combinado com 2 μg/ml de TfR humano biotinilado e incubado por uma hora. A mistura foi adicionada em seguida à placa revestida com HFE por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e HRP-estreptavidina diluída a 1:1000 (Southern Biotech, Birmingham) foi adicionada à placa e incubada por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e anticorpo anti-TfR humano biotinilado ligado à placa foi detectado utilizando substrato TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills).

[00353] A ligação dessas variantes humanizadas a TfR não foi afetada pela presença de 6,3 μM de holo-Tf, enquanto a ligação do anticorpo concorrente por Tf que se liga ao local de ligação Tf sobre TfR foi inibida (Figura 5). Além disso, 7A4.v15, 15G11.v5 e 7G7.v1 poderão ainda ligar huTfR capturado por HFE, o que indica que eles não afetaram a ligação de huTfR a HFE imobilizado (Figura 6A). Em experimento relacionado, 7A4.v15 e 15G11.v5 não bloquearam a ligação de TfR biotinilado a HFE imobilizado. Por outro lado, essa interação foi bloqueada pelo anticorpo concorrente por Tf e holo Tf (Figura 6B). Sabe-se que HFE e Tf compartilham epítopo similar sobre TfR (Bennet et al, Nature (2000) 403, 46-53).

[00354] 15G11v.5 imobilizado e anti-TfRC12 foram avaliados para determinar a ligação a ECD de TfR humano biotinilado ou fago M13 monovalente que exibe o domínio apical de TfR humano. Anti-TfRC12 foi derivado de uma biblioteca de fagos de anticorpos sintéticos que foi combinada com ECD de TfR humano e liga-se a um local sobre o TfR humano que concorre com a ligação de transferrina. Anticorpos foram revestidos a 1 μg/ml em PBS sobre placas Maxisorp. ECD de TfR humano biotinilado ligado ou fago de domínio apical-TfR foram detectados com HRP- estreptavidina (GE Healthcare, RPN 4401V) ou HRP-anti-M13 (GE Healthcare, 27-9421-01), respectivamente. A Figura 25 demonstra que 15G11v.5 liga-se ao domínio apical de TfR humano. O local de ligação ao 15G11v.5 foi mapeado no domínio apical, um local distante dos locais de ligação de ligante TfR.

EXEMPLO 2

[00355] Elaboração por afinidade de anticorpos anti-TFR com reação cruzada humanos/de cynomolgus:

[00356] Além das variantes humanizadas descritas acima, foram elaboradas variantes elaboradas por afinidade adicionais. É exemplificada no presente a elaboração por afinidade de 15G11.v5 e 7A4.v15. Foram geradas variantes de afinidade por meio de elaboração de substituições de alanina individuais em CDR-L3 ou CDR-H3 utilizando métodos padrão. Essas variantes foram selecionadas como IgG por meio de ELISA e SPR para identificar posições importantes para ligação a TfR humano e de cynomolgus; também foi determinada a afinidade monovalente de variantes selecionadas como Fab. Fab ou IgGs variantes com varrimento Ala foram expressos em células 293 e a ligação a TfR humano ou de cynomolgus foi quantificada por meio de ELISA em placas Maxisorp revestidas com 1,8 μg/ml de anti-FcY humano de cabra (Jackson ImmunoResearch) em PBS a 4 °C por uma noite. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e bloqueadas utilizando tampão de bloqueio Superblock em PBS (Thermo Scientific, Hudson NH). Sobrenadantes contendo IgG expresso foram diluídos em série a 1:5 e adicionados à placa por uma hora. hu15G11.v5 ou hu7A4.v15 purificados foram utilizados como padrões (diluídos a 1:5 a partir de 1 μg/ml). As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e HRP-cabra-anti capa diluído a 1:1000 (Southern Biotech) foi adicionado à placa e incubado por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e detectadas utilizando substrato de TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills). A ligação também foi determinada por meio de SPR, conforme descrito acima. Os resultados são exibidos nas Figuras 7A (variantes 15G11.v5) e 7B (variantes 7A4.v15).

[00357] Variantes adicionais de 15G11.v5 com substituições de alanina individuais nas posições em CDR-L1, CDR-L2, CDR-H1 e CDR- H2 também foram geradas, expressas e primeiramente selecionadas pela ligação a TfR humano e de cynomolgus por meio de ELISA (Tabela 6). Realizou-se ELISA de ligação de Hu/Cy em placas Maxisorp revestidas com 2 μg/ml de TfR humano ou de cynomolgus purificado em PBS a 4 °C por uma noite. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e bloqueadas utilizando tampão de bloqueio Superblock em PBS (Thermo Scientific, Hudson NH). Sobrenadantes de cultivo celular contendo os IgGs variantes com varrimento Ala expressos foram diluídos em série a 1:5 e adicionados às cavidades por uma hora. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e anti-FcY humano-cabra-HRP diluído a 1:1000 (Jackson ImmunoResearch) foi adicionado à placa e incubado por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween 20 e detectadas utilizando substrato de TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills).

TABELA 6

[00358] Análise de ELISA de variantes Ala de IgG hu15G11.v5:

[00359] Variantes selecionadas foram purificadas em seguida e sua afinidade monovalente para TfR humano ou de cynomolgus determinada por meio de SPR (Tabela 7).

TABELA 7

[00360] Análise de SPR monovalente de variantes de alanina de Fab 15G11.v5 selecionadas:

EXEMPLO 3

[00361] Construção de anticorpo anti-TfR humano biespecífico e análise in vitro:

[00362] Algumas das variantes de anticorpos acima foram reformatadas como anticorpos biespecíficos com um segundo braço que se liga especificamente a BACE1. Os anticorpos anti-TfR humanos Hu5G11.v5, Hu15G11.LC92A, Hu15G11.HC52A e Hu15G11.HC53A foram utilizados para elaborar o braço de ligação de TfR do biespecífico utilizando tecnologia de construção de anticorpo biespecífico de “botão em orifício” (Carter, P. (2001), J. Immunol. Methods 248, 7-15; Ridgway, J. B., Presta, L. G. e Carter, P. (1996), Protein Eng. 9, 617-621; Merchant, A. M., Zhu, Z., Yuan, J. Q., Goddard, A., Adams, C. W., Presta, L. G., e Carter, P. (1998), Nat. Biotechnol. 16, 677-681; Atwell, S., Ridgway, J. B., Wells, J. A. e Carter, P. (1997), J. Mol. Biol. 270, 2635). Além das mutações de botão e orifício no Fc para anti-TfR (orifício) e anti- BACE1 (botão), todos os meios anticorpos continham mutações na região Fc que eliminaram a função efetora (N297G) e Hu15G11.v5 e Hu15G11.LC92A continham uma mutação Fc adicional que eliminou a função efetora (D265A). Os meios anticorpos de botão e orifício foram purificados separadamente a partir de E. coli e combinados em razão 1:1,1 de anti-TfR para evitar a formação de homodímeros anti-TfR. A montagem do anticorpo biespecífico foi realizada por meio de combinação redutiva por pelo menos três dias à temperatura ambiente em tampão contendo glutationa reduzida em razão 100x com anticorpo e 200 mM de arginina, pH 8,0. Após a montagem, anticorpos biespecíficos foram purificados por meio de cromatografia por interação hidrofóbica. A montagem foi confirmada por meio de espectroscopia de massa por cromatografia de líquidos e SDS-PAGE. Confirmou-se que os anticorpos purificados são homogêneos e monodispersos por meio de exclusão de tamanho e espectroscopia por radiação laser multiangular.

[00363] Os anticorpos biespecíficos resultantes foram denominados 15G11.v5 (anti-TfR1), 15G11.W92A (15G11.LC92A ou anti-TfR2), Hu15G11.N52A (anti-TfR52A) e Hu15G11.T53A (anti-TfR53A). A afinidade monovalente e a cinética para TfR humano e de cynomolgus foram determinadas para 115G11.v5 e 115G11.W92A por meio de SPR, conforme acima (vide a Tabela 9). Anti-TfR1 e anti-TfR2 possuem afinidades de ligação monovalente similares a anti-TfRA e anti-TfRD para ligação a TfR de camundongo (vide Atwal et al, Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al, Sci. Transl. Med., 25 de maio de 2011: Vol. 3, Ed. 84, pág. 84ra44).

TABELA 8

[00364] Análise de SPR monovalente de 15G11.v5 (TfR1) e 15G11.W92A (LC92A, TfR2):

[00365] Além disso, a afinidade de ligação dos anticorpos biespecíficos anti-TfR1, anti-TfR2, Hu15G11.N52A e Hu15G11.T53A foi medida em comparação com TfR humano e de cynomolgus por meio de SPR, conforme descrito anteriormente. Conforme exibido na Tabela 9 abaixo, anti- TfR52A e anti-TfR53A possuem afinidades de ligação para TfR humano e de cynomolgus entre TfR1h15G11.v5 e TfR2LC92A. TABELA 9

EXEMPLO 4

[00366] Impacto de anticorpos monoespecíficos e biespecíficos que contêm efetor e sem efetor sobre uma linhagem de células de eritroleucemia humana e células mononucleares da medula óssea primária:

[00367] Estudos anteriores em camundongos haviam determinado que anticorpos que ligam TfR murino com função efetora e/ou capacidades de ligação de complemento esgotaram seletivamente os reticulócitos que expressam TfR. Para determinar se o esgotamento observado nos estudos com camundongos foi exclusivo para um sistema murino, foram realizados experimentos adicionais utilizando anti-TfR que se liga a TfR humano.

[00368] Testes de ADCC foram conduzidos utilizando células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores humanos saudáveis como células efetores. Linhagem celular de eritroleucemia humana (HEL, ATCC) e células mononucleares da medula óssea humana primária (AllCells, Inc.) foram utilizadas como células alvo. Para minimizar a viabilidade entre doadores que poderá potencialmente surgir de diferenças alotípicas na posição 158 residual em FCYRIIIA, doadores de sangue foram limitados aos portadores do genótipo RCYRIIIA heterozigótico (F/V158) no primeiro conjunto de experimentos (Figuras 8A-B). Para o segundo conjunto de experimentos (Figuras 9A-B), foram apenas utilizadas células HEL como células alvo, com PBMCs de doadores humanos saudáveis que conduzem o genótipo F/V158 ou o genótipo V/V158 de FCYRIIIA. O genótipo V/V158 também foi incluído neste teste, devido à associação conhecida com o aumento da atividade de ADCC mediada por células NK, bem como a capacidade de ligar anticorpos IgG4 (Bowles e Weiner, 2005; Bruhns et al, 2008). As células foram contadas e determinou-se a viabilidade por meio de Vi-CELL® (Beckman Coulter; Fullerton, CA) seguindo as instruções do fabricante.

[00369] As PBMCs foram isoladas por meio de centrifugação de gradientes de densidade utilizando tubos de separação do sangue Uni-Sep® (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury NY). Células alvo em 50 μl de meio de teste (RPMI-1640 com 1% de BSA e 100 unidades/ml de penicilina e estreptomicina) foram semeadas em uma placa com fundo abaulado e 96 cavidades a 4 x 104/cavidade. Diluições em série de anticorpos de teste e controle (50 μl/cavidade) foram adicionadas às placas que contêm as células alvo, seguidas por incubação a 37 °C com CO2 a 5% por trinta minutos para permitir a opsonização. As concentrações finais de anticorpos variaram de 0,0051 a 10.000 ng/ml após diluições em série por cinco vezes para um total de dez pontos de dados. Após a incubação, 1,0 x 106 células efetoras de PBMC em 100 μl de meio de teste foram adicionados a cada cavidade para gerar razão de 25:1 de células efetoras:alvo e as placas foram incubadas por quatro horas adicionais. As placas foram centrifugadas ao final da incubação e os sobrenadantes foram testados para determinar a atividade de lactato desidrogenase (LDH) utilizando um Kit de Detecção da Citotoxicidade® (Roche Applied Science, Indianápolis IN). A mistura de reação de LDH foi adicionada aos sobrenadantes e as placas foram incubadas à temperatura ambiente por quinze minutos com agitação constante. A reação foi encerrada com 1 M de H3PO4 e a absorção foi medida a 490 nm (o fundo, medido a 650 nm, foi subtraído para cada cavidade) utilizando um leitor de microplacas SpectraMax Plus. A absorção de cavidades contendo apenas as células alvo serviu como controle para o fundo (baixo controle), enquanto as cavidades que contêm células alvo lisadas com Triton-X100 forneceram o sinal máximo disponível (alto controle). A citotoxicidade celular independente de anticorpos (AICC) foi medida em cavidades contendo células efetoras e alvo sem a adição de anticorpo. A extensão de ADCCs específicas foi calculada conforme segue:

[00370] Valores de ADCC de diluições de amostras foram plotados contra a concentração de anticorpos e as curvas de reação à dosagem foram enquadradas em um modelo de quatro parâmetros utilizando SoftMax Pro.

[00371] Em um primeiro conjunto de experimentos, a atividade de ADCC de diversas construções anti-TfR humano foi determinada utilizando uma linhagem de células de eritroleucemia humana (células HEL) ou células mononucleares da medula óssea humana primária como células alvo. Anticorpo anti-TfR1 humano competente para função efetora de IgG1 bivalente 15G11 e uma forma biespecífica desse anticorpo com um braço anti-BACE1 em formato de IgG1 humano contendo mutações D265A e N297G para eliminar a função efetora (vide Exemplo 3) foram testados em várias concentrações no teste de ADCC, utilizando IgG1 do tipo selvagem anti-gD como controle negativo e anti-HLA humano murino (classe I) como controle positivo. Os resultados são exibidos nas Figuras 8A e 8B. Com as células HEL como alvos (Fig. 8A) ou as células mononucleares da medula óssea como alvos (Fig. 8B), o anticorpo anti-TfR humano positivo para efetores monoespecífico 15G11 permitiu atividade de ADCC significativa. Esta atividade foi similar à dos anticorpos anti-HLA humanos controle positivos sobre as células HEL em nível robusto mas inferior com relação ao controle positivo sobre as células mononucleares da medula óssea. O nível um pouco mais baixo observado no experimento com células mononucleares da medula óssea deve-se principalmente ao fato de que somente uma parte da mistura heterogênea de células PBMC de linhagem eritroide e mieloide utilizadas no experimento expressa altos níveis de TfR, em que as células de HEL possuem expressão de TfR consistentemente alta ao longo de toda a população de células clonais. Em marcado contraste, o anticorpo anti-TfR humano/BACE1 sem efetor biespecífico não exibiu nenhuma atividade de ADCC em células mononucleares de HEL ou medula óssea, de forma similar ao controle negativo.

[00372] Em um segundo conjunto de experimentos, foi determinado o impacto da alteração do isótipo de anticorpo neste sistema de teste. O procedimento de teste ADCC foi idêntico ao descrito acima, com exceção de que todas as células alvo foram células HEL e as células efetoras foram PBMCs de doadores humanos saudáveis que conduzem o genótipo FcYRIIIa-V/F158 heterozigótico ou o genótipo FcYRIIIa-V/F158 homozigótico. Todo o anti-TfR humano testado era biespecífico com anti-Gd, sobre três cadeias principais de Ig diferentes: IgG1 humano do tipo selvagem, IgG1 humano com a mutação N297G e IgG4 humano. Também foi testado um anticorpo anti-Abeta com cadeia principal de IgG4 humano e anti-HLA humano de camundongo (classe I) serviu de controle positivo. Os resultados são exibidos nas Figuras 9A e 9B. Como antecipado com base na associação conhecida entre a ativação da célula efetora e o genótipo V/V158 (Bowles e Weiner, 2005), a atividade de ADCC foi permitida de forma mais robusta por PBMCs doadoras V/V158 (cerca de 45% das células alvo sofreram impacto) com relação a doadores F/V158 (cerca de 25% das células alvo sofreram impacto) (compare a Fig. 9A com a Fig. 9B). Anti-TfR/gD com o IgG1 do tipo selvagem induziu forte ADCC em células HEL, enquanto anti-TfR/gD com o IgG1 sem efetor não exibiu nenhuma atividade de ADCC em células HEL, reproduzindo os resultados do primeiro conjunto de experimentos. Notadamente, em concentrações de 100 ng/ml ou mais altas, anti-TfR/gD do isótipo IgG4 exibiu suave atividade de ADCC. Esta atividade não foi observada nos resultados de IgG4 anti-Abeta, o que indica que a ligação de TfR foi necessária para atividade de ADCC. Esta descoberta é correlacionada com relatos anteriores de que IgG4 apresentou função efetora mínima, mas mensurável (Adolffson et al, J. Neurosci. 32 (28): 9677-9689 (2012); van der Zee et al, Clin. Exp. Immunol. 64: 415-422 (1986)); Tao et al, J. Exp. Med. 173: 1025-1028 (1991)).

EXEMPLO 5

[00373] Determinação de anticorpos biespecíficos anti-TfR humano/BACE1 biespecíficos in vivo:

A. Estudo farmacocinético, farmacodinâmico e de segurança:

[00374] Para avaliar as concentrações de droga, efeitos farmacodinâmicos e a segurança dos anticorpos anti-TfR humano biespecíficos in vivo, macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) receberam dose de anticorpos biespecíficos utilizando o clone de anticorpo anti-TfR 15G11 emparelhado com o mesmo braço anti-BACE1 utilizado nos exemplos anteriores (anti-TfR1/BACE1) ou o clone 15G11.LC92A emparelhado com o mesmo braço anti-BACE1 utilizado nos exemplos anteriores (anti-TfR2/BACE1) ou Hu15G11.N52A (anti-TfR52A/BACE1) e Hu15G11.T53A (anti-TfR53A/BACE1). Estes anticorpos biespecíficos encontravam-se em formato IgG1 humano com N297G ou D265A e mutações N297G eliminando a função efetora, conforme descrito anteriormente. Como controle, utilizou-se uma molécula anti-gD sobre IgG1 humano. Este estudo foi realizado em primatas não humanos, pois a reatividade cruzada desses anticorpos anti-TfR é limitada a primatas não humanos e seres humanos. Além disso, estudos demonstraram que os mecanismos de transporte de droga entre o fluido cerebroespinhal (CSF) e compartimentos de plasma podem ser similares entre seres humanos e primatas (Poplack et al, 1977). Os anticorpos foram administrados por meio de injeção de mistura intravenosa (IV) isolada na veia de safena em dose de 30 mg/kg para macacos cynomolgus conscientes com cateteres residentes na cisterna magna. Em diversos momentos até 60 dias após a dosagem, plasma, soro e CSF foram amostrados. Análise de amostras incluiu hematologia (sangue integral), química clínica (soro), concentrações de anticorpos (soro e CSF) e reação farmacodinâmica ao anticorpo (plasma e CSF). Vide a Figura 10 para um esquema de amostragem detalhado.

[00375] As concentrações dos anticorpos dosados em soro de macaco cynomolgus e CSF foram medidas com ELISA utilizando um revestimento de anticorpo absorvido de macaco anti-IgG humano de carneiro, seguido pela adição de amostras de soro a partir de diluição de 1:100 e encerrado pela adição de um anticorpo anti-IgG humano de cabra conjugado a macaco de peroxidase de rabanete silvestre adsorvido para detecção. O teste tinha faixa de curva padrão de 0,78 a 50 ng/ml e limite de detecção de 0,08 μg/ml. Resultados abaixo deste limite de detecção foram relatados como abaixo do relatável (LTR).

[00376] As Figuras 11A-B exibem os resultados da análise farmacocinética para anti-TfR1/BACE1 e anti-TfR2/BACE1. O perfil farmacocinético para anti-gD foi conforme esperado para um anticorpo IgG1 humano típico em macaco cynomolgus com liberação média de 3,98 ml/dia/kg. Os dois anticorpos anti-TfR/BACE1 foram liberados mais rapidamente que anti- gD, provavelmente devido à liberação mediada por alvo periférico. Anti- TfR1/BACE1 apresentou a liberação mais rápida, consistente com a afinidade de ligação mais alta a TfR, enquanto anti-TfR2/BACE1 exibiu perfil farmacocinético aprimorado (ou seja, exposição prolongada em soro) em comparação com anti-TfR1/BACE1, provavelmente devido à sua afinidade reduzida para TfR. A liberação para anti-TfR1/BACE1 e anti-TfR2/BACE1 foi de 18,9 ml/dia/kg e de 8,14 ml/dia/kg, respectivamente. Todos os anticorpos foram detectados no CSF a cerca de um milésimo da concentração em soro. Houve, entretanto, alta variabilidade e, de forma geral, não houve diferença detectável nas concentrações de anticorpo CSF nas moléculas.

TABELA 10

[00377] Estimativas médias (± desvio padrão) de parâmetro PK para todos os anticorpos de teste após uma única administração de dose de mistura intravenosa a 30 mg/kg em macacos cynomolgus (n = 5):

[00378] SD = desvio padrão; IV = intravenosa; AUCtodos = área sob a curva tempo-concentração do momento 0 até o momento da última concentração mensurável; AUCinf = área sopb a curva tempo-concentração extrapolada ao infinito; Cmax = concentração máxima observada em soro; CL = liberação; Vss = volume de distribuição em estado estável; Min = mínimo; Max = máximo.

[00379] A Figura 19 exibe os resultados da análise farmacocinética para anti-TfR1/BACE1, anti-TfR52A/BACE1 e anti- TfR53A/BACE1. Todos os anticorpos anti-TfR/BACE1 foram liberados mais rapidamente que anti-gD, provavelmente devido à liberação mediada por alvo periférico. Anti-TfR1/BACE1 apresentou a liberação mais rápida, consistente com a afinidade de ligação mais alta a TfR, enquanto anti-TfR52A/BACE1 e anti- TfR53A/BACE1 exibiram perfil farmacocinético aprimorado (ou seja, exposição prolongada em soro) em comparação com anti-TfR1/BACE1, provavelmente devido à sua afinidade reduzida para TfR de anti-TfR52A/BACE1 e anti- TfR53A/BACE1.

[00380] Para observar o efeito farmacodinâmico em resposta à dosagem de anti-TfR/BACE1, medimos os níveis de Abeta1-40, sAPPα e sAPPβ em CSF e plasma de macaco cynomolgus. Abeta1-40 foi medido com ELISA utilizando revestimento de anticorpo policlonal específico anti-Abeta1-40, seguido pela adição de amostras e encerrado pela adição de um anticorpo monoclonal anti-Abeta1-40 humano de camundongo conjugado a peroxidase de rabanete silvestre para detecção. O teste possui limite de detecção de 60 pg/ml para plasma e 140 pg/ml para CSF. Resultados abaixo desta concentração foram relatados como abaixo do relatável (LTR). As concentrações de CSF de sAPPα e sAPPβ foram determinadas utilizando o teste Multispot de sAPPα/sAPPβ (Mesoscale Discovery (Gaithersburg MD)). CSF foi descongelado sobre gelo e diluído em seguida a 1:10 em BSA a 1% em TBS-T (10 mM de tampão Tris, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20). O teste foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. O teste possuía limite inferior de valores de quantificação de 0,05 ng/ml para sAPPα e 0,03 ng/ml para sAPPβ.

[00381] As Figuras 12A-E resumem o comportamento farmacodinâmico dos anticorpos. Na periferia, os níveis de Abeta1-40 em plasma permaneceram inalterados após a administração de anti-gD, mas foram temporariamente reduzidos após a administração de anti-TfR/BACE1. As duas variantes reduziram os níveis de Abeta1-40 em plasma, com inibição máxima de 50% atingida em um dia após a dosagem. Os níveis de Abeta1-40 em plasma recuperaram-se gradualmente, com os animais que receberam anti- TfR1/BACE1 retornando aos níveis de linha base de Abeta1-40 cerca de quatorze dias após a dosagem. Os níveis de Abeta1-40 retornaram aos níveis de liha base em 21 a 30 dias após a dosagem em animais tratados com anti- TfR2/BACE1. Os dois anticorpos anti-TFR/BACE1 reduziram os níveis de Abeta1-40 em CSF, sem alteração observada em animais que receberam dose de anti-gD. Administração de anti-TfR1/BACE1 resultou em redução mais significativa dos níveis de Abeta1-40 em CSF (inibição máxima média de 50% da linha base) que a de anti-TfR2/BACE1 (inibição máxima média de 20% da linha base). A produção de sAPPβ foi inibida em animais tratados com anti- TfR/BACE1, mas não em animais que receberam anti-gD. De forma similar aos resultados para Aβ40, anti-TfR1/BACE1 apresentou efeito inibidor mais forte sobre a produção de sAPPβ que anti-TfR2/BACE1. A produção de sAPPα foi estimulada durante a inibição de BACE1 por antiTfR1/BACE1 e anti- TfR2/BACE1 e a reação foi inversamente proporcional ao nível de inibição observado para sAPPβ e Abeta1-40. sAPPα e sAPPβ são os produtos de processamento primários de proteína precursora de amiloide (APP) e seus níveis são altamente correlacionados. A razão de sAPPβ/sAPPα normaliza os resultados em alterações potenciais da expressão de APP básica ou potenciais diferenças pré-analíticas na coleta e manipulação de CSF ao longo do estudo. A razão de CSF sAPPβ/sAPPα com anti-TfR1/BACE1 demonstrou efeito de PD mais robusto que anti-TfR2/BACE1. Portanto, estes resultados sustentam o engajamento de alvo (ou seja, BACE1) pelos anticorpos anti-TfR/BACE1.

[00382] A reação de PD para anti-TfR52A/BACE1 e anti- TfR53A/BACE1 também se correlaciona com a duração da exposição de anticorpos e um braço de TfR com afinidade reduzida exibe aumento da redução de Aβ40 (dados não exibidos). Estes dados também sustentam o engajamento de alvo por estes anticorpos biespecíficos.

[00383] Ao todo, estes resultados sugerem que um anticorpo anti- TfR/BACE1 biespecífico com afinidade para TfR humano entre o anti- TfR1/BACE1 e anti-TfR2/BACE1 provavelmente teria equilíbrio farmacocinético/farmacodinâmico desejável.

[00384] Nenhum sinal de segurança foi observado neste estudo. Não houve efeitos evidentes sobre nenhum parâmetro de hematologia ou química clínica de macacos que receberam 30 mg/kg de qualquer anticorpo biespecífico administrado até sessenta dias após a dosagem. De forma importante, os níveis de reticulócitos não foram afetados por tratamento com anti-TfR1/BACE1 ou anti-TfR2/BACE1 (Figura 13), como esperado, pois esses anticorpos tiveram sua função efetora impedida e o nível geral de reticulócitos iniciais em circulação com altos níveis de TfR é muito baixo em primatas normais (vide o Exemplo 4).

EXEMPLO 6

[00385] Determinação de anticorpos anti-TfR humano/BACE1 biespecíficos in vivo:

[00386] Para examinar a relação entre a farmacodinâmica de anticorpos em CSF e farmacocinéticos no cérebro, macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) receberam dose de anticorpos biespecíficos anti- TfR1/BACE1 ou anti-TfR2/BACE1, como no exemplo anterior. Estes anticorpos biespecíficos encontravam-se em formato de IgG1 humano com mutações de N297G e D265A eliminando a função efetora. Como controle, utilizou-se uma molécula anti-gD sobre IgG1 humano. Para comparação, também dosamos com anticorpo anti-BACE1 bivalente, que é o mesmo clone utilizado para os anticorpos biespecíficos. Os anticorpos foram administrados por meio de uma única injeção de mistura intravenosa (IV) na veia de safena em dose de 30 mg/kg para macacos cynomolgus conscientes com cateteres residentes na cisterna magna. Amostras de CSF de linha básica foram coletadas em 24 e 48 horas antes da dosagem e outra amostra de CSF foi coletada em 24 horas após a dosagem (conforme exibido esquematicamente na Figura 14). Após a coleta de CSF 24 horas após a dosagem, os animais sofreram perfusão com solução salina e os cérebros foram colhidos para análise das concentrações de anticorpos. Diferentes regiões do cérebro foram homogeneizadas em NP-40 a 1% (Cal-Biochem) em PBS contendo minipastilhas de coquetel inibidor da protease livre de EDTA completas (Roche Diagnostics). Amostras do cérebro homogeneizadas sofreram rotação a 4 °C por uma hora antes da centrifugação a 14.000 rpm por vinte minutos. O sobrenadante foi isolado para medição dos anticorpos no cérebro, utilizando o método ELISA descrito no exemplo anterior. Sangue também foi coletado para confirmar a exposição periférica e as reações farmacodinâmicas, que foram similares às nossas observações no Exemplo 5.

[00387] Os efeitos farmacodinâmicos de anti-TfR1/BACE1 e anti- TfR2/BACE1 conforme determinado em CSF também foram similares aos observados no exemplo anterior. A Figura 15 demonstra que a razão de CSF sAPPβ/sAPPα sofreu forte redução após a dosagem com anti-TfR1/BACE1. Anti-TfR2/BACE1 não exibiu redução evidente 24 horas após a dosagem neste estudo. Anti-BACE1 também não exibiu efeito. Análise de concentrações de anticorpo no cérebro revelou que o IgG controle e o anticorpo anti-BACE1 apresentaram absorção limitada no cérebro, em níveis pouco acima da detecção em nosso teste (média de cerca de 670 pM). Anti-TfR2/BACE1 apresentou aumento de cerca de três vezes da absorção no cérebro sobre IgG controle (média de cerca de 2 nM) e anti-TfR1/BACE1 apresentou a melhor absorção no cérebro, cerca de quinze vezes mais que IgG controle (média de cerca de 10 nM). As concentrações de anticorpos no cérebro para os diferentes anticorpos correlacionaram-se à reação farmacodinâmica observada em CSF nos nossos estudos, em que anti-TfR1/BACE1 possui a melhor absorção no cérebro e o efeito farmacodinâmico mais robusto e anti-TfR2/BACE1 possui menos absorção no cérebro e efeito mais modesto.

[00388] Estes resultados ampliam nossas descobertas anteriores para demonstrar que anticorpos biespecíficos de ligação de TfR aumentam a absorção no cérebro de primatas não humanos. Em primatas, como em camundongos, existe provavelmente afinidade ideal para TfR que equilibra melhor a absorção no cérebro e a liberação mediada por TfR. No nosso exemplo, anti-TfR1/BACE1 com afinidade mais alta demonstra boa absorção no cérebro e é afetado por liberação mediada por alvo periférico. A afinidade reduzida de TfR2/BACE1 melhorou as propriedades de liberação, mas aparentemente possui ligação de TfR tão baixa que não permite seu transporte eficiente por TfR (de forma muito similar àquela em que o anticorpo anti-TfR com afinidade mais baixa TfRE em US 2012/0171120 ultrapassa algum limite de afinidade além do qual a afinidade é baixa demais para permitir interação suficiente entre o anticorpo e TfR, de tal forma que o anticorpo permaneceria associado a TfR à medida que TfR começa o processo de translocação). A partir dos resultados deste experimento, prever-se-ia que um anticorpo biespecífico de anti-TfR/BACE1 humano/de cynomolgus que possui afinidade para TfR entre a de TfR1 e a de TfR2 aumentou as propriedades de absorção e liberação sobre anti-TfR1/BACE1 ou anti-TfR2/BACE1 neste sistema.

EXEMPLO 7

[00389] Criação de mutações sem efetor adicionais no contexto de um anticorpo receptor de transferrina biespecífico:

[00390] Outras mutações na região Fc, que eliminam a função efetora além de N297G e D265A foram testadas para determinar sua capacidade de reduzir ou evitar o esgotamento de reticulócitos que expressam TfR. Especificamente, as mutações de Fc L234A, L235A e P329G (“LALAPG”), que são descritas no Pedido Norte-Americano publicado n° 2012/0251531, que é incorporado ao presente como referência, foram incorporadas ao anticorpo anti-TfRD/BACE1 (que é descrito no Pedido Internacional publicado n° WO 2013/177062, que é integralmente incorporado ao presente como referência).

[00391] Análise farmacocinética e contagem de reticulócitos após uma única administração de anticorpo em camundongos foram realizadas conforme segue. Fêmeas de camundongos C57B do tipo selvagem com idades de seis a oito semanas foram utilizadas para todos os estudos. O cuidado com os animais estava de acordo com instruções institucionais. Os camundongos receberam dose intravenosa com uma única dose de 50 mg/kg de anticorpo anti-gD (IgG2a murinho) com as mutações de LALAPG, um anticorpo anti- TfRD/BACE1 (quimera de rato/murina) com as mutações de LALAPG. O volume total de injeção não excedeu 250 μl e os anticorpos foram diluídos em D-PBS quando necessário (Invitrogen). Após 24 horas, sangue integral foi recolhido antes da perfusão em tubos Microtainer EDTA (BD Diagnostics), mantido em repouso por trinta minutos à temperatura ambiente e centrifugado a 5000x g por dez minutos. A camada superior de plasma foi transferida para tubos novos para medições de anticorpos.

[00392] As concentrações totais de anticorpos em plasma de camundongo foram medidas utilizando ELISA de anti-IgG2a de camundongo (alótipo a)/anti-IgG2a de camundongo (alótipo A). Imunoplacas Maxisorp com 384 cavidades NUNC (Neptune NJ) foram revestidas com anti-IgG2a de camundongo alótipo A, anticorpo específico de alótipo A (BD/Pharmingen, San Jose CA), por uma noite a 4 °C. Placas foram bloqueadas com PBS, 0,5% de BSA por uma hora a 25 °C. Cada anticorpo (anti-gD e as variantes biespecíficas anti-TfR/BACE1) foi utilizado como padrão para quantificar as concentrações de anticorpos correspondentes. As placas foram lavadas com PBS, 0,05% de Tween 20 utilizando um lavador de microplacas (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski VT) e padrões e amostras diluídas em PBS contendo 0,5% de BSA, 0,35 M de NaCl, 0,25% de CHAPS, 5 mM de EDTA, 0,2% de BgG, 0,05% de Tween 20 e 15 ppm de Proclin® (Sigma-Aldrich) foram adicionadas por duas horas a 25 °C. Anticorpo ligado foi detectado com alótipo A de anti-IgG2a de camundongo conjugado a biotina, um anticorpo específico de alótipo A (BD/Pharmigen, San Jose CA). Anticorpo conjugado a biotina ligado foi detectado com estreptavidina conjugada a peroxidase de rabanete silvestre (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh PA). Amostras foram desenvolvidas utilizando 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina (TMB) (KPL, Inc., Gaithersburg MD) e absorção medida a 450 nm em um leitor Multiskan Ascent (Thermo Scientific, Hudson NH). As concentrações foram determinadas a partir da curva padrão utilizando um programa de regressão não linear com quatro parâmetros. O teste apresentou valores de limite de quantificação mais baixos (LLOQ) de 78,13 ng/ml em plasma. Análise estatística de diferenças entre os grupos experimentais foi realizada utilizando um teste t não emparelhado bilateral.

[00393] Mediante administração dos anticorpos anti-TfRD/BACE1 contendo as mutações de Fc LALAPG, os camundongos não exibiram sintomas clínicos conforme havia sido observado anteriormente utilizando anticorpos com função efetora total. Vide Couch et al, Sci. Trans. Med. 5: 183ra57 (2013). A Figura 20 exibe os resultados da análise farmacocinética.

[00394] Além disso, contagens de reticulócitos totais e imaturos foram determinadas utilizando o Sysmex XT2000iV (Sysmex, Kobe, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Em 24 horas após a dosagem, não houve diferença observada na fração de reticulócito imatura ou na contagem de reticulócitos total com um anticorpo testado conforme observado na Figura 21. Estes resultados sugerem que a mutação LALAPG não apenas elimina a função efetora de anticorpo, mas também reduz a ligação de complemento e a liberação de reticulócitos mediada por complemento observada até com uma cadeia principal de anticorpo sem efetor (Couch et al, 2013). Isso é consistente com outro relato de que a incorporação da mutação de LALA sobre IgG1 humano pode limitar a ligação de complemento (Hessell et al, Nature 449: 101104 (2007)).

EXEMPLO 8

[00395] Criação de variantes biespecíficas de FcRnALTO:

[00396] A fim de aumentar a meia vida dos anticorpos biespecíficos e, portanto, aumentar potencialmente a concentração do anticorpo no cérebro, foram elaboradas variantes biespecíficas que contêm mutações no domínio constante de IgG e especificamente no domíno de ligação de receptor de Fc em recém-nascidos (FcRn) (mutações FcRnALTO). O domínio de ligação de FcRn foi implicado na transferência de anticorpos da mãe para o feto. Vide Story et al, J. Exp. Med., 180: 2377-2381, 1994. As substituições de aminoácidos no domínio de ligação de FcRn aumentam a afinidade do domínio constante para o FcRn, de forma a aumentar a meia vida do anticorpo.

[00397] Descreveu-se que as mutações do domínio de ligação de FcRn M252Y, S254T e T256E (YTE) aumentam a ligação de FcRn e, portanto, aumentam a meia-vida de anticorpos. Vide o Pedido de Patente Norte- Americano Publicado n° 2003/0190311 e Dall’Acqua et al, J. Biol. Chem. 281: 23514-23524 (2006). Além disso, descreveu-se que mutações de domínio de ligação de FcRn N434A e Y436I (AI) também aumentam a ligação de FcRn. Vide Yeung et al, J. Immunol. 182: 7663-7671 (2009). As mutações YTE (M252Y/S254T/T256E) e AI (N434/Y436I) foram incorporadas aos anticorpos biespecíficos anti-TfR52A/BACE1 e anti-TfR2/BACE1 que contêm IgG1 humano do tipo selvagem ou mutações LALAPG ou N297G sem efetor. Além disso, mutações de FcRnALTO foram elaboradas no anticorpo hIgG1 anti-gD como controle. Foram elaboradas mutações utilizando mutagênese de Kunkel, os anticorpos foram expressos de forma transitória em células de CHO e as proteínas foram purificadas utilizando cromatografia de proteína A seguida por cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC).

[00398] A ligação de anticorpos variantes de FcRnALTO para FcRn foi medida utilizando BIAcore. Proteínas FcRn humanas e de macacos cynomolgus foram expressas em CHO e purificadas utilizando cromatografia de afinidade de IgG. Os dados foram obtidos em um instrumento BIAcore T200. Um chip sensor série S CM5 (GE Healthcare, Cat. BR100530) foi ativado com reagentes EDC e NHS de acordo com as instruções do fornecedor e anticorpo anti-Fab (kit de captura de Fab humano, GE Healthcare Bioscience, AB SE- 75184, Upsala, Suécia) foi acoplado para atingir cerca de 10.000 unidades de resposta (RU), seguido pelo bloqueio de grupos não reagidos com 1 Metanolamina. Para medições de afinidade, os anticorpos foram injetados em primeiro lugar em velocidade de fluxo de 10 μl/min para capturar cerca de 1000 RU sobre três células de fluxo (FC) diferentes, exceto por FC1 (referência) e, em seguida, foram injetadas diluições em série por duas vezes de FcRn humano (ou FcRn de cynomolgus) em tampão sob pH 6 (0,1 M de fosfato de sódio) de baixo (1 nM) até alto (25 μM) (velocidade de fluxo: 30 μl/min), um após o outro no mesmo ciclo sem regeneração entre as injeções. Os sensogramas foram registrados e submetidos à subtração de referência e tampão antes da avaliação utilizando software de avaliação BIAcore T200 (versão 2.0). As afinidades foram determinadas por meio de análise do nível de ligação em estado estável com base em um modelo de ligação 1:1. As afinidades de ligação para as variantes LALAPG, N297G, LALAPG.YTE e LALAPG.AI de anti-TfR52A/BACE1 são exibidas na Tabela 11 abaixo. Os dados demonstram que as variantes de FcRnALTO aumentam a afinidade endossomal (pH 6) a FcRn humano e de cynomolgus. TABELA 11

[00399]Variantes de FcRnALTO selecionadas serão testadas em macacos cynomolgus para determinar se o aumento da afinidade de FcRn pode aprimorar as propriedades farmacocinéticas e/ou aumentar a exposição ao cérebro dos anticorpos anti-TfR/BACE1.

[00400] Para avaliar a segurança das mutações sem efetor e FcRnALTO, certos anticorpos biespecíficos foram administrados a camundongos knock-in receptores de transferrina humana que expressam o receptor de transferrina humana. Os camundongos knock-in huTfR foram gerados conforme segue. A construção para dirigir cDNA de TFRC humano para o local TfrC de C57BL/6 em células ES foi elaborada utilizando uma combinação de recombinação (Warming et al, Molecular and Cellular Biology, vol. 26 (18), págs. 6913-22 2006; Liu et al, Genome Research (2003), vol. 13 (3), págs. 476-84) e métodos padrão de clonagem molecular.

[00401] Resumidamente, um conjunto (cDNA de TFRC humano, SV40 pA e frt-PGK-em7-Neo-BGHpA-frt) ladeado por homologias curtas ao gene Tfrc de camundongo foi utilizado para modificar C57BL/6J BAC de Tfrc (biblioteca de RP23 BAC) por meio de recombinação. O conjunto de cDNA de TFRC humano foi inserido no ATG endógeno e o restante de Tfrc exon 2 mais o início de intron foi excluído. A região dirigida no BAC foi recuperada em seguida em pBlight-TK (Warming et al, Molecular and Cellular Biology, vol. 26 (18), págs. 6913-22, 2006) em conjunto com sequências de Tfrc genômicas laterais como braços de homologia para direcionamento de células ES. Especificamente, o braço de homologia 5’ de 2950 bp corresponde a (conjunto NCBI37/mm9): chr.16:32.610.333-32.613.282 e o braço de homologia 3’ de 2599 bp corresponde a chr.16:32.613.320-32.615.918. O vetor final foi confirmado por meio de sequenciamento de DNA.

[00402] O vetor Tfrc/TFRC KI foi linearizado com NotI e células C57BL/6N C2 ES foram dirigidas utilizando métodos padrão (positivo para G418 e seleção negativa de ganciclovir). Clones positivos foram identificados utilizando PCR e análise Taqman e confirmados por meio de sequenciamento do local modificado. Células ES dirigidas corretamente foram transfectadas com um plasmídeo Flpe para remover Neo e células ES foram injetadas em seguida em blastocistos utilizando métodos padrão. A transmissão de linha de germens foi obtida após o cruzamento das quimeras resultantes com fêmeas C57BL/6N.

[00403] Especificamente, os anticorpos relacionados na tabela abaixo foram administrados a camundongos knock-in huTfR em uma única dose de 50 mg/kg e, 24 horas depois, foi retirado sangue e reticulócitos huIg1, N297G. TABELA 12

[00404] Após a administração dos anticorpos anti-TfR52A/BACE1 LALAPG, LALAPG/YTE ou LALAPG/AI (Grupos 3-5 da Tabela 12), camundongos knock-in TfR humanos não exibiram sintomas clínicos nem perda de reticulócitos (Figura 22), conforme observado anteriormente utilizando anticorpos anti-TfR com função efetora total (Couch et al, 2013). Estes resultados indicam que a incorporação da mutação LALAPG sobre a cadeia principal de IgG1 humano também elimina a função efetora e sugerem ainda que a adição das mutações YTE ou AI FcRnALTO não interfere com as propriedades desejadas das mutações LALAPG para tornar o anticorpo sem efetor.

[00405] Testes de ADCC foram também conduzidos para confirmar a situação sem efetor de combinações de mutação LALAPG, LALAPG/YTE e LALAPG/AI em uma linhagem celular derivada de seres humanos. Como anteriormente, utilizou-se linhagem de células de eritroleucemia humana (HEL, ATCC) como células alvo com PBMCs de doadores humanos saudáveis que conduzem o genótipo F/V158 ou o genótipo FCYRIIIA V/V158. O genótipo V/V158 também foi incluído neste teste, devido à associação conhecida com o aumento da atividade de ADCC mediada por células NK, bem como a capacidade de ligar anticorpos IgG4 (Bowles e Weiner, 2005; Bruhns et al, 2008). As células foram contadas e determinou-se a viabilidade por meio de Vi-CELL® (Beckman Coulter; Fullerton, CA) seguindo as instruções do fabricante.

[00406] As PBMCs foram isoladas por meio de centrifugação de gradientes de densidade utilizando tubos de separação do sangue Uni-Sep® (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury NY). Células alvo em 50 μl de meio de teste (RPMI-1640 com 1% de BSA e 100 unidades/ml de penicilina e estreptomicina) foram semeadas em uma placa com fundo abaulado e 96 cavidades a 4 x 104/cavidade. Diluições em série de anticorpos de teste e controle (50 μl/cavidade) foram adicionadas às placas que contêm as células alvo, seguidas por incubação a 37 °C com CO2 a 5% por trinta minutos para permitir a opsonização. As concentrações finais de anticorpos variaram de 0,0051 a 10.000 ng/ml seguindo diluiçlões em série por cinco vezes para um total de dez pontos de dados. Após a incubação, 1,0 x 106 células efetoras de PBMC em 100 μl de meio de teste foram adicionadas a cada cavidade para gerar razão de 25:1 células efetoras:alvo e as placas foram incubadas por quatro horas adicionais. As placas foram centrifugadas ao final da incubação e os sobrenadantes foram testados para determinar a atividade de lactato desidrogenase (LDH) utilizando um Kit de Detecção da Citotoxicidade® (Roche Applied Science, Indianápolis IN). A mistura de reação de LDH foi adicionada aos sobrenadantes e as placas foram incubadas à temperatura ambiente por quinze minutos com agitação constante. A reação foi encerrada com 1 M de H3PO4 e a absorção foi medida a 490 nm (o fundo, medido a 650 nm, foi subtraído para cada cavidade) utilizando um leitor de microplacas SpectraMax Plus. A absorção de cavidades contendo apenas as células alvo servidas como controle para o fundo (baixo controle), enquanto as cavidades que contêm células alvo lisadas com Triton-X100 forneceram o sinal máximo disponível (alto controle). A citotoxicidade celular independente de anticorpos (AICC) foi medida em cavidades contendo células efetoras e alvo sem a adição de anticorpo. A extensão de ADCCs específicas foi calculada conforme segue: A490 (Alto Controle) - A490 (Baixo Controle)

[00407] Valores de ADCC de diluições de amostras foram plotados contra a concentração de anticorpos e as curvas de reação à dosagem foram enquadradas em um modelo de quatro parâmetros utilizando SoftMax Pro.

[00408] Os resultados dos testes de ADCC são exibidos na Figura 23. Conforme esperado, o anticorpo anti-TfR humano positivo para efetor (anti- TfR1/gD IgG1 do tipo selvagem) permitiu atividade de ADCC significativa sobre as células HEL. Por outro lado, as variantes de anticorpos anti-TfR52A/BACE1 contendo mutações de LALAPG, LALAPG/YTE ou LALAPG/AI não exibiram nenhuma atividade de ADCC em células HEL, de forma similar ao anticorpo N297G anti-TfR52A/gD controle negativo.

[00409] Embora a presente invenção tenha sido descrita com alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, as descrições e os exemplos não deverão ser interpretados como limitando o escopo da presente invenção. As descrições de todas as literaturas científicas e patentes mencionadas no presente são expressamente incorporadas integralmente como referência.

Claims

1. ANTICORPO isolado, que se liga a receptor de transferrina (TfR) humano e TfR de primata, caracterizado pelo anticorpo compreender HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, e HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos de: SEQ ID NOs: 53, 156 e 55, e SEQ ID NOs: 50, 51 e 52.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal.

3. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por ser um anticorpo humanizado ou quimérico.

4. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser um fragmento de anticorpo que se liga a TfR humano e TfR de primata.

5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo anticorpo compreender: (a) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 153; ou (b) uma sequência de VL de SEQ ID NO: 105; ou (c) uma sequência de VH como em (a) e uma sequência de VL como em (b).

6. ANTICORPO, caracterizado por compreender uma sequência de VH de SEQ ID NO: 153 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 105.

7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região Fc compreender uma modificação selecionada a partir N297G; D265A e N297A; ou D265A e N297G; ou L234A, L235A e P329G.

8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela meia vida do anticorpo ser aumentada por uma modificação no domínio de ligação de FcRn do anticorpo, em que dita modificação é M252Y, S254T e T256E; ou N434A e Y436I.

9. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo anticorpo ser acoplado a um composto terapêutico.

10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo biespecífico que compreende: (a) um anticorpo que se liga a BACE1, em que dito anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOs: 138 e 139, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOs: 132 a 137; ou (b) um anticorpo que se liga a Abeta, em que dito anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 e uma região variável de cadeia leve compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 146.

11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo composto terapêutico ser uma droga contra distúrbio neurológico.

12. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para transporte de um composto para tratar um distúrbio neurológico em um mamífero através da BBB em pacientes, em que o anticorpo está acoplado ao composto.

14. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para aumento da exposição do SNC de paciente a um composto para tratar um distúrbio neurológico em um mamífero, em que o anticorpo está acoplado ao composto.

15. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para aumento da retenção no SNC de um composto para tratar um distúrbio neurológico em um mamífero.

16. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratamento de distúrbio neurológico em um mamífero.

17. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo distúrbio neurológico ser selecionado a partir do grupo que consiste em distúrbio de neuropatia, doença neurodegenerativa, câncer, distúrbio de doença ocular, distúrbio convulsivo, doença de armazenagem lisossomal, amiloidose, doença viral ou microbiana, isquemia, distúrbio de comportamento, e inflamação do SNC.