KR20130136494A - 효소 민감성 결합을 갖는 Ｉｎ Ｖｉｖｏ 폴리뉴클레오티드 전달 컨쥬게이트 - Google Patents

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데이비드 엘. 루이스
대런 에이치. 웨이크필드
에릭 에이. 키타스
필립 하드위게르
존 에이. 울프
인고 로엘
피터 모어
토르스텐 호프만
케르스틴 얀-호프만
한스 마틴 뮐러
귄터 오트
안드레이 브이. 블로킨
제프리 씨. 칼슨
조나단 디. 벤슨
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Abstract

본 발명은 RNA 간섭 (RNAi) 폴리뉴클레오티드의 세포로의 in vivo 전달을 위한 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 효소 절단가능한 디펩티드-아미도벤질-카보네이트 차폐제로 가역적으로 변형된 양극성 막활성 폴리아민을 포함한다. 변형은 고분자의 막 활성을 차폐하는 반면 가역성은 생리적 반응성을 제공한다. 가역적으로 변형된 폴리아민 (역동적 폴리컨쥬게이트 또는 DPC)는 RNAi 폴리뉴클레오티드에 더 공유결합되거나 또는 표적된 RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 분자 컨쥬게이트와 함께 병용투여 된다.

Description

효소 민감성 결합을 갖는 Ｉｎ Ｖｉｖｏ 폴리뉴클레오티드 전달 컨쥬게이트 {In vivo polynucleotide delivery conjugates having enzyme sensitive linkages}
폴리뉴클레오티드 및 기타 실질적인 세포막 불투과성 화합물의 살아있는 세포로의 전달은 세포의 복잡한 막 시스템에 의해 매우 제한된다. 안티센스, RNAi (RNA 간섭), 및 유전자 치료에 사용되는 약물은 상대적으로 큰 친수성 고분자이고, 흔히 매우 높게 음전하된다. 이러한 물리적 특성 모두 세포막을 통한 이들의 직접 확산을 현저히 방해한다. 이러한 이유로, 폴리뉴클레오티드 전달의 주요 장벽은 세포막을 통해 세포의 세포질 또는 핵으로 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것이다.
in vivo에서 작은 핵산을 전달하는데 사용되었던 하나의 수단은 작은 표적 분자, 또는 지질 또는 스테롤에 핵산을 결합한 것이었다. 이러한 컨쥬게이트에서 일부 전달 및 활성이 관찰되는 반면, 이러한 방법에서 요구되는 핵산의 용량은 엄청나게 컸다.
in vitro에서 세포로 폴리뉴클레오티드의 상당히 효율적인 전달을 달성하는 많은 형질감염 시약이 개발되었다. 그러나, 이러한 동일한 형질감염 시약을 이용한 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달은 복잡하고, in vivo 독성, 반대 혈청 상호작용, 및 좋지 못한 표적에 의해 비효율적이 된다. in vitro에서 잘 작용한 형질감염 시약, 양이온성 고분자 및 지질은, 일반적으로 큰 양이온성 정전기 입자를 형성하고 세포막을 불안정화시킨다. in vitro 형질감염 시약의 양전하는 전하-전하(정전기) 상호작용을 통해 핵산과의 결합을 가능하게 함으로써 핵산/형질감염 시약 복합체를 형성한다. 또한, 양전하는 비히클의 세포에의 비특이적 결합 및 막 융합, 불안정화, 또는 파괴에 유익하다. 막의 불안정화는 실질적인 세포막 불투과성 폴리뉴클레오티드의 세포막을 통한 전달을 가능하게 한다. 이러한 특성은 in vitro에서 핵산 이동을 가능하게 하는 반면, in vivo에 독성 및 비효율적 표적화를 야기한다. 양이온성 전하는 혈청 성분과 상호작용을 하고, 폴리뉴클레오티드-형질감염 시약 상호작용의 불안정화, 좋지 못한 생체이용률 및 좋지 못한 표적을 야기한다. in vitro에서 효율적일 수 있는 형질감염 시약의 막 활성은, 종종 in vivo에서 독성으로 이어진다.
in vivo 전달을 위하여, 비히클(핵산 및 결합된 전달제)은 직경 100㎚ 미만, 바람직하게는 50㎚ 미만으로 작아야 한다. 20㎚ 미만 또는 10㎚ 미만의, 더 작은 복합체도 여전히 더 유용할 것이다. 100㎚ 보다 더 큰 전달 비히클은 in vivo에서 혈관 세포외의 세포에 거의 접근하지 않는다. 정전기적 상호작용에 의해 형성된 복합체는 생리적 식염수 농도 또는 혈청 성분에 노출되었을 때 응집하거나 분해되는 경향이 있다. 또한, in vivo 전달 비히클의 양전하는 반대 혈청 상호작용을 야기함으로써 좋지 못한 생체이용률로 이어진다. 흥미롭게도, 높은 음전하도 표적에 필요한 상호작용, 즉 표적하는 리간드의 세포 수용체로의 결합에 간섭함으로써 표적된 in vivo 전달을 억제할 수 있다. 따라서, 중성에 가까운 비히클이 in vivo 분포 및 표적에 요구된다. 주의 깊은 조절 없이, in vivo에서 사용될 때 막 파괴 또는 불안정화의 활성은 독성이다. 비히클 독성과 핵산 전달간의 균형은 in vivo 보다 in vitro 에서 더 쉽게 이루어진다.
Rozema 등은 미국특허공개 제 20080152661호에서, 이 치환된 말레익 무수물 변형을 이용한 막 활성 폴리아민의 막 파괴 활성을 가역적으로 조절하는 방법을 제공하였다. 말레익 무수물과 아민의 반응에 의해 형성된, 말레아메이트 (maleamate) 결합 (linkage)은 in vivo 전달에 적합한 pH 범위 내에서 pH 불안정하다. 이러한 과정은 막 활성 고분자가 in vivo 전달 또는 핵산에 사용될 수 있도록 한다. 본 발명자는 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 (dipeptide-amidobenzyl-carbamate) 결합을 갖는 변형된 막 활성 고분자를 제공하다. 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합은 가역적이며, 생리적으로 반응성이다. 이 치환된 말레익 무수물의 변형으로부터의 pH-불안정한 말레아메이트 결합과는 상이하게, 본 발명에서 기술되는 고분자 변형제 결합은 in vivo 환경에서 더 안정적인 효소적으로 절단가능한 결합을 형성한다.
발명의 개요
바람직한 구체예에서, 본 발명에서 디펩티드 차폐제 (masking agent) 또는 프로테아제 절단가능한 차폐제로 언급되는, 디펩티드-아미도벤질-카보네이트 (dipeptide-amidobenzyl-carbonate)에 결합된 입체적 안정화제 (steric stabilizer) 또는 표적 리간드를 포함하는, 양극성 (amphipathic) 막 활성 폴리아민의 막 활성을 가역적으로 변형하고 억제하기 위한 차폐제 (masking agent)를 기술한다. 디펩티드 차폐제는 일반식을 갖는다:
R-A1A2-아미도벤질-카르보네이트.
여기서 R은 입체적 안정화제 또는 표적 리간드이고, A1은 아미노산이며, A2는 아미노산이다. 차폐제 카보네이트와 고분자 아민의 반응은 카바메이트 (carbamate) 결합을 생성한다. 차폐제는 디펩티드가 in vivo에서 내인성 프로테아제에 의하여 절단됨으로써, 입체적 안정화제 또는 표적 리간드가 폴리아민으로부터 절단될 때까지 안정하다. 디펩티드 뒤의 효소적 절단 (A2와 아미도벤질 간)에 뒤이어, 아미도벤질-카바메이트는 자발적인 재배열을 받음으로써 고분자 아민의 재형성을 야기한다. 바람직하게 R은 중성이다. 더욱 바람직하게, R은 비하전 (uncharged)이다. 바람직한 입체적 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)이다. 표적 리간드는 디곡시제닌 (digoxigenin)과 같은 합텐 (hapten), 비오틴과 같은 비타민, 항체, 모노클로날 항체, 및 세포 표면 수용체 리간드를 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다. 표적 리간드는 PEG 링커와 같은 링커를 통하여 디펩티드에 결합될 수 있다. 바람직한 세포 표면 수용체 리간드는 아시알로당단백질 수용체 (asialoglycoprotein receptor, ASGPr)리간드이다. 바람직한 ASGPR 리간드는 N-아세틸갈락토사민 (N-Acetylgalactosamine, NAG)이다. 바람직한 디펩티드는 아미드 결합을 통하여 친수성 비하전 (uncharged) 아미노산에 결합된 소수성 아미노산으로 이루어진다. 바람직한 아미도벤질기는 p-아미도벤질기이다. 바람직한 카보네이트는 활성화된 아민 반응성 카보네이트이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 디펩티드 차폐제를 이용한 가역적 변형에 의하여 차폐된 폴리아민인, 차폐된 양극성 막 활성 폴리아민 (전달 고분자)과 RNAi 폴리뉴클레오티드를 포함하는, RNAi 폴리뉴클레오티드를 세포로 in vivo 전달하기 위한 조성물을 특징으로 한다. 전달 고분자는 RNAi 폴리뉴클레오티드에 공유 결합될 수 있다. 전달 고분자의 RNAi 폴리뉴클레오티드로의 공유 결합을 위한 바람직한 결합은 생리적으로 불안정한 결합이다. 일 구체예에서, 이 결합은 디펩티드 차폐제 결합에 직교 (orthogonal)이다. 대안적으로, 전달 고분자는 RNAi 폴리뉴클레오티드에 공유 결합되지 않으며, RNAi 폴리뉴클레오티드가 표적 분자에 공유 결합된다.
바람직한 구체예에서, a) 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합을 통하여 다수의 표적 리간드 또는 입체적 안정화제; 및, b) 하나 이상의 가역적인 결합을 통하여 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 공유결합된 양극성 막 활성 폴리아민을 포함하는 조성물을 기술한다. 일 구체예에서, 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합은 폴리뉴클레오티드 가역적인 공유 결합에 직교이다. 폴리뉴클레오티드-고분자 컨쥬게이트는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포유동물에 투여된다.
바람직한 구체예에서, a) 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합을 통하여 다수의 표적 리간드 또는 입체적 안정화제에 공유결합된 양극성 막 활성 폴리아민; 및, b) 20개 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기 및 갈라토오스 클러스터로 이루어진 목록으로부터 선택된 표적 기에 공유결합된 RNAi 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 기술한다. 이 구체예에서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 변형된 양극성 막 활성 폴리아민에 공유결합되지 않는다. 변형된 폴리아민 및 RNAi 폴리뉴클레오티드 표적 기 컨쥬게이트는 별도로 합성되고, 분리된 용기 또는 단일 용기에 공급될 수 있다. 변형된 폴리아민 및 RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 기 컨쥬게이트는 함께 또는 각각 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포유동물에 투여된다.
바람직한 디펩티드 차폐제는 프로테아제 (펩티다아제) 절단가능한 디펩티드-p-아미도벤질 아민-반응성 카보네이트 유도체를 포함한다. 본 발명의 프로테아제 절단가능한 차폐제는 아미도벤질 활성화된 카보네이트 모이어티에 연결된 디펩티드를 이용한다. 표적 리간드 또는 입체적 안정화제는 디펩티드의 아미노 말단에 결합된다. 아미도벤질 활성화된 카보네이트 모이어티는 디펩티드의 카르복시 말단에 결합된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 프로테아제 절단가능한 링커는 일반 구조를 가진다:
Figure pct00001
여기서 R4는 표적 리간드 또는 입체적 안정화제를 포함하고, R3는 아민 반응성 카보네이트 모이어티를 포함하며, R1 및 R2는 아미노산 곁사슬이다. 바람직한 활성화된 카보네이트는 파라-니트로페놀 (para-nitrophenol)이다. 그러나, 기술분야에서 알려진 기타 아민 반응성 카보네이트가 파라-니트로페놀을 용이하게 대체할 수 있다. 활성화된 카보네이트와 아민의 반응은 펩티다아제 절단가능한 디펩티드-아미도벤질 카바메이트 결합을 통하여 표적 리간드 또는 입체적 안정화제를 막 활성 폴리아민에 연결한다. 아미노산과 아미도벤질기 간의, 디펩티드의 효소 절단은 고분자로부터 R4를 제거하고 제거반응 (elimination reaction)을 유발함으로써 고분자 아민의 재형성을 야기한다.
본 발명의 디펩티드 차폐제는 양극성 막활성 폴리아민의 가역적인 변형/억제에 유용하다. 공유결합은 디펩티드 차폐제의 활성화된 카보네이트와 고분자 아민, 특히 일차 아민 기와의 반응에 의해 생성된다. 그러므로 본 명세서에서 제공되는 것은 본 명세서에서 기술된 디펩티드-아미도벤질-카보네이트 차폐제 및 양극성 막 활성 폴리아민을 포함하는 컨쥬게이트이다:
Figure pct00002
본 발명에 따른 화합물은 일반적으로 유기 또는 의약 화학의 기술분야의 기술자에게 알려진 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 또한 발명의 목적, 특징, 및 장점은 수반하는 도면과 함께 받아들여질 때 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1는 디펩티드 차폐제의 구조를 나타낸 도이다:
여기서 R1 및 R2는 아미노산의 R기이고,
R4는 표적 리간드 또는 입체적 안정화제이며,
X는 -NH-, -O-, 또는 -CH2-이고,
Y는 -NH- 또는 -O-이며,
R5는 2, 4, 또는 6의 위치에서, -CH2-O-C(O)-O-Z이며, 여기서 Z는 카보네이트이며,
R6은 R5에 의해 점유된 위치를 제외한 2, 3, 4, 5, 또는 6의 각각의 위치에서 독립적으로 수소, 알킬 또는 할로겐화물이다.
도 2는 폴리아민에 결합된 디펩티드 차폐제의 구조를 나타낸 도이다: 여기서 R1 및 R2는 아미노산의 R기이고, R4는 표적 리간드 또는 입체적 안정화제이며, X는 -NH-, -O-, 또는 -CH2- 이고, Y는 -NH- 또는 -O-이다.
도 3은 다양한 디펩티드 차폐제의 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 2개의 상이한 말레익 무수물 기초 차폐제와 디펩티드 차폐제로 변형된 고분자의 순환 시간을 설명한 그래프이다.
본 발명은 양극성 막 활성 폴리아민의 가역적인 변형 및 억제에 유용한 차폐제 및 디펩티드 차폐제에 의한 폴리아민의 변형에 의해 형성된 전달 고분자를 기술한다. 펩티다아제 절단가능한 결합은 효소가 없을 때 가수분해에 안정적이고, 전기적으로 중성이며, 저장 및 in vivo 환경에서 확장된 DPC 안정성을 제공한다. 환경에서의 개선된 (더 긴) 반감기는 조직, 예를 들어 종양 조직에서의 리간드-매개 축적의 기회의 창을 넓히는 것을 가능하게 한다. 전달 고분자는 RNAi 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달에 특히 유용하다. RNAi 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달은 유전자 발현의 치료용 억제 (녹다운, knockdown)에 유용하다.
디펩티드 차폐제는 일반식을 가진다:
R-A1A2-아미도벤질-카보네이트.
여기서 R은 입체적 안정화제 또는 표적 리간드이고, A1은 아미노산이며, A2는 아미노산이고, 카보네이트는 활성화된 아민-반응성 카보네이트이다. R은 바람직하게는 비하전 (uncharged)이다. 차폐제 카보네이트와 고분자 아민의 반응은 카바메이트 결합을 생성한다. 디펩티드가 in vivo에서 내인성 프로테아제에 의해 절단됨으로써, 폴리아민으로부터 입체적 안정화제 또는 표적 리간드가 절단될 때까지 차폐제는 안정하다. 디펩티드 뒤의 효소적 절단 (A2와 아미도벤질 간)에 뒤이어, 아미도벤질-카바메이트는 자발적인 재배열을 받음으로써 고분자 아민의 재형성을 야기한다. 바람직한 입체적 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)이다. 간 전달을 위한 바람직한 표적 리간드는 ASGPr 리간드이다. 바람직한 ASGPr 리간드는 N-아세틸갈락토사민 (N-Acetylgalactosamine, NAG)이다. 바람직한 아미도벤질기는 p-아미도벤질기이다.
A1A2 (또는 AA)로 표시된, 디펩티드 차폐제의 디펩티드는 아미드 결합을 통하여 연결된 아미노산의 이량체이다. α및 β 아미노산을 포함하는, 아미노산은 생물학 및 화학에서 잘 알려져 있으며, 아민기, 카르복실산기 및 상이한 아미노산 간에 차이가 나는 곁사슬을 포함하는 분자이다. 바람직한 아미노산은 H2NCHRCOOH의 일반식을 가진 α-아미노산이고, 여기서 R은 유기 치환기이다. 바람직한 α아미노산은 자연적으로 발생하는 비하전 아미노산이다. 바람직한 디펩티드에서, A1은 소수성 아미노산이고 A2는 비하전 친수성 아미노산이다. 바람직한 소수성 아미노산은 페닐알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 알라닌, 또는 트립토판이다. 바람직한 비하전 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 또는 시트룰린이다. 더 바람직한 소수성 아미노산은 페닐알라닌 또는 발린이다. 더 바람직한 비하전 친수성 아미노산은 시트룰린이다. 디펩티드가 바람직하지만, A1과 R 간에 추가적인 아미노산을 삽입하는 것이 가능하다. 또한, 아미노산 A1의 제거로 디펩티드 대신 단일 아미노산을 사용하는 것도 가능하다. 본 발명에서 사용되는 어떤 천연 아미노산은 본 명세서에서 그들의 공통 약어로 나타낸다. 하전된 (chaged) 아미노산이 사용될 수 있지만, 차폐제는 비하전인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 막 비활성 전달 고분자를 생성하기 위하여 양극성 막 활성 폴리아민은 본 발명의 디펩티드-아미도벤질-카보네이트 차폐제와의 반응에 의해 가역적으로 변형된다. 디펩티드 차폐제는 비-특이적 상호작용으로부터 고분자를 보호하고, 순환 시간을 증가시키며, 특이적 상호작용을 향상시키고, 독성을 억제하거나, 고분자의 전하를 변경할 수 있다.
본 발명의 가역적으로 차폐된 고분자는 구조를 포함한다:
Figure pct00003
여기서:
X는 -NH-, -O-, 또는 -CH2-이고
Y는 -NH- 또는 -0-이며
R1은 바람직하게는
-(CH2)k-페닐 (k는 1, 2, 3, 4, 5, 6; k = 1 페닐알라닌),
-CH-(CH3)2 (발린),
-CH2-CH-(CH3)2 (류신),
-CH(CH3)-CH2-CH3 (이소류신),
-CH3 (알라닌),
-(CH2)2-COOH (글루탐산),
또는
Figure pct00004
(트립토판)이고;
R2는 바람직하게는
수소 (글리신)
-(CH2)3-NH-C(O)-NH2 (시트룰린),
-(CH2)4-N-(CH3)2 (리신(CH3)2),
-(CH2)k -C(O)-NH2; (k는 1, 2, 3, 4, 5, 6),
-CH2-C(O)-NH2 (아스파라긴),
-(CH2)2-C(O)-NH2 (글루타민),
-CH2-C(O)-NR1R2 (아스파르트산 아미드),
-(CH2)2-C(O)-NR1R2 (글루탐산 아미드),
-CH2-C(O)-OR1 (아스파르트산 에스테르), 또는
-(CH2)2-C(O)-OR1 (글루탐산 에스테르)이며,
R1 및 R2 는 알킬기이고
R4 는 폴리에틸렌 글리콜 또는 표적 리간드를 포함하고;
폴리아민은 양극성 막 활성 폴리아민이다.
상기 구조는 고분자에 결합된 단일 디펩티드 차폐제를 표시하지만, 본 발명의 실시에서는, 50 % 내지 90 % 또는 그 이상의 고분자 아민이 디펩티드 차폐제에 의해서 변형된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 가역적으로 차폐된 고분자는 구조를 포함한다:
Figure pct00005
여기서 R1, R2, R4 및 폴리아민은 상기 기술한 바와 같다.
본 발명의 가역적으로 차폐된 고분자는 본 발명의 디펩티드 차폐제와 고분자의 아민과의 반응으로 형성된다. 본 발명의 디펩티드 차폐제는 구조를 갖는다:
Figure pct00006
여기서:
X, Y, R1, R2, 및 R4는 상기 기술한 바와 같으며
R5는 2, 4, 또는 6의 위치에서 -CH2-O-C(O)-O-Z이며 여기서 Z는
-할로겐화물 (halide),
Figure pct00007
,
Figure pct00008
,
Figure pct00009
, 또는
Figure pct00010
이고;
R6는 R5에 의해 점유된 위치를 제외한 2, 3, 4, 5, 또는 6의 각각의 위치에서 독립적으로, 수소, 알킬, -(CH2)n-CH3 (여기서 n = 0-4), -(CH2)-(CH3)2, 또는 할로겐화물이다.
바람직한 구체예에서, 하기에 나타난 바와 같이 X는 -NH-, Y는 -NH-, R4는 비하전이며, R5는 4의 위치이고, R6은 수소이다:
Figure pct00011

다른 구체예에서, R4는:
R-(O-CH2-CH2)s-O-Y1-, 여기서
R은 수소, 메틸, 또는 에틸이고; s 는 1부터 150까지의 정수이며,
Y1은
-O-Y2-NH-C(O)-(CH2)2-C(O)-, 여기서 Y2는
-(CH2)3-
-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2- (p는 1 부터 20 까지의 정수), 및
-O-
를 포함하는 목록으로부터 선택된 링커이다.
표적 리간드는 합텐, 비타민, 항체, 모노클로날 항체, 및 세포 표면 수용체 리간드를 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다. 표적 리간드는 PEG 링커와 같은 링커를 통하여 디펩티드에 결합될 수 있다.
본 발명에서의 사용에 적합한 막 활성 고분자의 비-제한적인 예는 미국 특허 공개 20080152661, 20090023890, 20080287630, 및 20110207799에 이미 기술되어 있다. 적합한 양극성 막 활성 폴리아민은 또한 멜리틴 펩티드와 같은 작은 펩티드일 수 있다.
고분자 아민은 본 명세서에 기술된 효소 절단가능한 링커를 이용하여 가역적으로 변형되었다. 변형기 (modifying group)의 절단이 아민의 재형성을 야기시키는 경우 아민은 가역적으로 변형된다. 차폐제의 활성화된 카보네이트와 고분자 아민의 반응은 하기에 나타난 바와 같이 펩티다아제 절단가능한 디펩티드-아미도벤질 카바메이트 결합을 통하여 표적 리간드 또는 입체적 안정화제를 고분자에 연결한다:
Figure pct00012
R1은 표적 리간드 (보호 기를 가지거나 또는 가지지 않은) 또는 PEG를 포함하고,
R2는 양극성 막 활성 폴리아민이며,
AA는 디펩티드 (보호 기를 가지거나 또는 가지지 않은)이고,
Z는 아민-반응성 카보네이트이다.
보호 기는 디펩티드 차폐제의 합성 중에 사용될 수 있다. 존재하는 경우, 보호 기는 양극성 막 활성 폴리아민의 변형 전 또는 후에 제거될 수 있다.
디펩티드 차폐제에 의한 폴리아민의 충분한 퍼센트의 가역적인 변형은 막 활성 폴리아민의 막 활성을 억제한다. 또한 바람직하게는 디펩티드 차폐제에 의한 고분자 아민의 변형은 아민의 전하를 중화시킨다. 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합은 프로테아제 (또는 펩티다아제) 절단에 민감하다. 프로테아제의 존재 하에, 아닐리드 (anilide) 결합이 절단되어, 1, 6 제거 반응을 즉시 받는 중간체를 야기시켜 유리 고분자를 방출한다:
Figure pct00013
상기 반응식에서, AA는 디펩티드이고, R1 은 표적 리간드 또는 입체적 안정화제를 포함하며, R2는 양극성 막 활성 폴리아민이다. 중요하게, 유리 고분자는 변형되지 않으며 따라서 막 활성이 회복된다.
차폐된 상태에서, 가역적으로 차폐된 막 활성 폴리아민은 막 파괴 활성을 나타내지 않는다. 디펩티드 차폐제에 의한 폴리아민 상의 아민의 50 % 이상, 55 % 이상, 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 또는 90 % 이상의 가역적인 변형은 막 활성의 억제 및 세포 표적 기능의 제공, 즉 가역적으로 차폐된 막 활성 고분자 (전달 고분자)의 형성에 필요할 수 있다.
또한 본 발명은 생물학적 활성 물질을 세포 내로 전달하는 방법을 제공한다. 더 상세하게는, 본 발명은 포유류 세포에서 RNAi 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달에 유용한 화합물, 조성물, 및 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 생리적으로 불안정한 공유 결합을 통하여 본 발명의 전달 고분자에 결합된다. 생리적으로 불안정한 결합의 사용에 의해, 폴리뉴클레오티드는 고분자로부터 절단되어, 폴리뉴클레오티드를 방출하여 세포 성분과의 기능적 상호작용에 관여하게 할 수 있다.
본 발명은 일반 구조의 컨쥬게이트 전달 시스템을 포함한다:
Figure pct00014
여기서 N은 RNAi 폴리뉴클레오티드이고, L 1 은 생리적으로 불안정한 결합이며, P는 양극성 막 활성 폴리아민이고, M 1 은 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합을 통하여 P에 결합된 표적 리간드이며, M 2 은 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합을 통하여 P에 결합된 입체적 안정화제이다. y 및 z 는 어떠한 차폐제 없이 P 위에 있는 아민의 양에 의해 결정된 대로, y + z가 폴리아민 P 상의 일차 아민의 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 또는 90 % 이상의 값을 갖는 것을 제공하는 영 이상의 각각의 정수이다. 이의 변형되지 않은 상태에서, P는 막 활성 폴리아민이다. 전달 고분자 M 1 y -P- M 2 z 는 막 활성이 아니다. M 1 및/또는 M 2 의 결합에 의한, P 일차 아민의 가역적 변형은, P의 막 활성을 가역적으로 억제 또는 불활성화시킨다. 멜리틴 펩티드와 같은, 일부 작은 양극성 막 활성 폴리아민은, 겨우 3 내지 5개의 일차 아민을 함유한다는 것은 잘 알려져 있다. 아민의 퍼센트의 변형은 고분자 집단 중 아민의 퍼센트의 변형을 반영함을 의미한다. M 1 및 M 2 의 절단 동안, 폴리아민의 아민은 P를 그의 변형되지 않은, 막 활성 상태로 복귀시킴으로써 재형성된다.
또 다른 구체예에서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 전달 고분자와 함께 in vivo 에서 병용투여 (co-administer) 된다. 따라서, 본 발명은 일반 구조의 조성물을 포함한다:
Figure pct00015
여기서 N 은 RNAi 폴리뉴클레오티드이고, T 는 표적 기 (targeting group)이며, P 는 양극성 막 활성 폴리아민이고, M 1 은 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합을 통해 P 에 결합된 표적 리간드이며, M 2 은 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합을 통해 P 에 결합된 입체적 안정화제이다. y 및 z 는 어떠한 차폐제 없이 P 위에 있는 아민의 양에 의해 결정된 대로, y + z가 폴리아민 P 상의 일차 아민의 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 또는 90 % 이상의 값을 갖는 것을 제공하는 0 이상의 각각의 정수이다. 이의 변형되지 않은 상태에서, P는 막 활성 폴리아민이다. 전달 고분자 M 1 y -P- M 2 z 는 막 활성이 아니다. M 1 및/또는 M 2 의 결합에 의한, P 일차 아민의 가역적 변형은, P의 막 활성을 가역적으로 억제 또는 불활성화시킨다. 멜리틴 펩티드와 같은, 일부 작은 양극성 막 활성 폴리아민은, 겨우 3 내지 5개의 일차 아민을 함유한다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 아민의 퍼센트의 변형은 고분자 집단 중 아민의 퍼센트의 변형을 반영함을 의미한다. M 1 및 M 2 의 절단 동안, 폴리아민의 아민은 P 를 그의 변형되지 않은, 막 활성 상태로 복귀시킴으로써 재형성된다. N 은 기술분야의 일반적인 방법을 이용하여 RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 기 컨쥬게이트를 형성하기 위하여 공유결합을 통하여 T 에 결합된다. 바람직한 공유결합은 생리적으로 불안정한 결합 N-T이다. 전달 고분자 및 N-T은 별도로 합성 또는 제조된다. T 및 N 모두 P, M 1 또는 M 2 에 직접적 또는 간접적으로 공유적으로 결합되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트와 차폐된 또는 차폐되지 않은 고분자의 정전기적 또는 소수성 결합은 폴리뉴클레오티드의 in vivo 간 전달에 필요하지 않다. 차폐된 고분자 및 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 동일한 용기 또는 별도의 용기에서 공급될 수 있다. 이들은 투여, 병용투여, 또는 순차적 투여 전에 혼합될 수 있다.
간세포 전달을 위하여, RNAi 폴리뉴클레오티드가 공유결합을 통하여 전달 고분자에 결합되든지 또는 전달 고분자와 병용투여되든지, y는 고분자 P 상의 일차 아민의 50 % 이상이고 100 % 이하인 값을 갖는다. 따라서 z 는 고분자 P 상의 일차 아민의 0 퍼센트 (0 %) 이상이거나 50 % 미만의 값을 가진다.
간 종양 세포로의 전달을 위하여, z 는 고분자 P 상의 일차 아민의 100 % 이하의 더 높은 값을 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 종양세포로의 전달을 위하여, z 는 고분자 P 상의 일차 아민의 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상 또는 90 % 이상의 값을 가지며, y는 0이다.
막 활성 폴리아민은 형질막 또는 리소좀/세포내 이입 막 (lysosomal/endocytic membrane)을 파괴할 수 있다. 이 막 활성은 폴리뉴클레오티드의 세포 전달에 대한 본질적인 특징이다. 그러나, 고분자가 in vivo 투여될 때 막 활성은 독성을 일으킨다. 또한 폴리아민은 in vivo에서 많은 음이온성 성분과 즉시 반응하여, 원하지 않는 체내 분포(bio-distribution)를 이끈다. 따라서, 폴리아민의 막 활성의 가역적인 차폐는 in vivo 사용에 필수적이다.
차폐는 막 활성 폴리아민에 기술된 디펩티드 차폐제의 가역적인 결합을 통하여 이루어져 가역적으로 차폐된 막 활성 고분자, 즉 전달 고분자를 형성한다. 막 활성의 억제 뿐만 아니라, 차폐제는 비-특이적 상호작용으로부터 고분자를 보호하고, 혈청 상호작용을 감소시키며, 양전하를 감소하고 중성에 가까운 전하 고분자를 형성하기 위해 폴리아민을 중화하고, 순환시간을 증가시키며, 및/또는 세포-특이적 상호작용, 즉 표적을 제공한다.
전체적으로, 고분자의 막 활성을 억제하는 것이 차폐제의 본질적인 특징이다. 차폐제는 비-특이적 상호작용으로부터 고분자를 보호 (혈청 상호작용 감소, 순환시간 증가)할 수 있다. 막 활성 폴리아민은 변형되지 않은 (차폐되지 않은) 상태에서 막 활성적이고, 변형된 (차폐된) 상태에서 막 활성적이지 않다 (불활성적이다). 차폐제의 충분한 수가 고분자에 결합되어 원하는 수준의 불활성화를 이룬다. 차폐제의 결합에 의한 고분자의 원하는 수준의 변형은 적절한 고분자 활성 어세이를 이용하여 즉시 결정될 수 있다. 예를 들어, 고분자가 정해진 어세이에서 막 활성을 갖는 경우, 충분한 수준의 차폐제가 고분자에 결합되어 그 어세이에서 원하는 수준의 막 활성의 억제를 이룬다. 어떠한 차폐제 없이 고분자 상의 일차 아민의 양에 의해 결정된 대로, 차폐는 고분자 집단 상의 일차 아민 기의 ≥50 %, ≥60 %, ≥70 %, 또는 ≥80 %의 변형을 필요로 한다. 또한 차폐제의 바람직한 특성은 이들의 고분자에의 결합이 고분자의 양전하를 감소시킴으로써, 더 중성의 전달 고분자를 형성하는 것이다. 차폐된 고분자는 수용성 용해도를 유지하는 것이 바람직하다.
막 활성 폴리아민은 과량의 차폐제의 존재하에 차폐제에 컨쥬게이트될 수 있다. 과량의 차폐제는 전달 고분자의 투여 전에 컨쥬게이트된 전달 고분자로부터 제거될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "입체적 안정화제 (steric stabilizer)"는 입체적 안정화제를 함유하지 않은 고분자에 비해 결합된 고분자의 분자내 또는 분자간 상호작용을 막거나 억제하는 비-이온성 친수성 고분자(천연, 합성, 또는 비-천연)이다. 입체적 안정화제는 정전기적 상호작용에 관여하는 것으로부터 결합된 고분자를 방해한다. 정전기적 상호작용은 양전하 및 음전하 사이의 인력(attractive forces)에 기인한 2 이상의 물질의 비-공유 결합이다. 입체적 안정화제는 혈액 성분과의 상호작용을 억제할 수 있고, 그에 따라 식균작용증가 (opsonization), 식세포작용(phagocytosis), 및 세망내피계(reticuloendothelial system)에 의해 흡수할 수 있다. 따라서 입체적 안정화제는 이들이 결합된 분자의 순환시간을 증가시킬 수 있다. 또한 입체적 안정화제는 고분자의 응집을 억제할 수 있다. 바람직한 입체적 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG 유도체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 바람직한 PEG는 약 1-500 에틸렌 글리콜 모노머, 또는 2-25를 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 바람직한 PEG는 약 85-20,000 달톤(Da), 약 85-1000 Da의 평균 분자량을 가질 수도 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 입체적 안정화제는 수용액에서 입체적 안정화제를 함유하지 않은 고분자에 비하여 결합된 고분자의 분자내 또는 분자간 상호작용을 막거나 또는 억제한다.
"표적 리간드 (targeting ligand)"는 이들이 결합된 컨쥬게이트의 약동학적 또는 체내 분포 특성을 향상시켜 컨쥬게이트의 세포- 또는 조직-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선시킨다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 명확성을 위하여, 용어 '표적 리간드'는 디펩티드 차폐제에 결합된 표적 리간드를 의미하는 것으로 사용되며, '표적 기'는 RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 기 컨쥬게이트 중 RNAi 폴리뉴클레오티드에 결합된 표적 리간드이다. 표적 리간드는 분자의 표적 세포로의 결합을 향상시킨다. 따라서, 표적 리간드는 이들이 결합된 컨쥬게이트의 약동학적 또는 체내 분포 특성을 향상시킬 수 있어 컨쥬게이트의 세포 분포 및 세포 흡수를 개선시킨다. 표적 리간드의 세포 또는 세포 수용체에의 결합은 세포내 이입을 개시할 수 있다. 표적 리간드는 일가, 이사, 삼가, 사가 또는 그 이상의 원자가일 수 있다. 표적 리간드는 세포 표면 분자에 친화도를 갖는 화합물, 세포 수용체 리간드, 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 및 세포 표면 분자에 친화도를 갖는 항체 모방체를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 표적 리간드는 세포 수용체 리간드를 포함한다. 다양한 리간드는 세포 및 특이적 세포 수용체에 약물 및 유전자를 표적하기 위해 사용되어왔다. 세포 수용체 리간드는 탄수화물, 글리칸, 당류 (갈락토오스, 갈락토오스 유도체, 만노오스, 및 만노오스 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는), 비타민, 폴레이트, 비오틴, 압타머, 및 펩티드 (RGD-함유 펩티드, 인슐린, EGF, 및 트랜스페린을 포함하나 이에 한정되지 않는)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
간의 간세포 표적을 위하여, 바람직한 표적 리간드는 아시알로당단백질-수용체(ASGPr)에 친화도를 가진 당류이다. 갈락토오스 및 갈락토오스 유도체는 그들의 간세표 포면에 발현된 ASGPr에의 결합을 통하여 in vivo 간세포에 대한 표적 분자로서 사용되어왔다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "ASGPr 표적 리간드"는 갈락토오스 및 갈락토오스와 동일하거나 더 높은 ASGPr에 대한 친화도를 갖는 갈락토오스 유도체를 포함한다. 갈락토오스 표적 리간드의 ASGPr에의 결합은 전달 고분자의 간세포로의 세포-특이적 표적 및 전달 고분자의 간세포 내로의 세포내 이입을 가능하게 한다.
ASGPr 표적 리간드는 락토오스, 갈락토오스, N-아세틸갈락토사민(NAG), 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸-갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민, 및 N-이소-부타노일-갈락토사민을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다 (Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686). ASGPr 표적 모이어티는 모노머 (예를 들어, 단일 갈락토사민을 갖는) 또는 다량체 (예를 들어, 다수의 갈락토사민을 갖는) 일 수 있다.
일 구체예에서, 막 활성 폴리아민은 폴리아민 상의 일차 아민의 ≥ 50 %, ≥ 60 %, ≥ 70 %, ≥ 80 % 또는 ≥ 90 % 까지 ASGPr 표적 리간드 차폐제의 결합에 의하여 가역적으로 차폐된다. 또 다른 구체예에서, 막 활성 폴리아민은 폴리아민 상의 일차 아민의 ≥ 50 %, ≥ 60 %, ≥ 70 %, ≥ 80 % 또는 ≥ 90 % 까지 ASGPr 표적 리간드 차폐제 및 PEG 차폐제의 결합에 의하여 가역적으로 차폐된다. ASGPr 표럭 리간드 차폐제 및 PEG 차폐제의 경우, PEG와 ASGPr 표적리간드의 비율은 약 0-4:1, 더 바람직하게는 약 0.5-2:1이다.
"양극성 (amphipathic)", 또는 "양친매성(amphiphilic)", 고분자는 기술분야에서 잘 알려져 있고 잘 인식되며, 친수성 (극성, 수용성) 및 소수성 (비-극성, 지용성, 불수용성) 기 또는 일부를 갖는다.
"친수성 기 (Hydrophilic group)"는 화학적 모이어티가 물-선호인 질적 용어를 가리킨다. 일반적으로, 이러한 화학적 기는 수용성이고, 물과 함께 수소결합 주개(donors) 또는 받개 (acceptors)이다. 친수성 기는 하전 (charged) 또는 비하전 (uncharged) 일 수 있다. 하전 기는 양전하 (음이온성(anionic)) 또는 음전하 (양이온성(cationic)) 또는 모두 (양쪽이온성)일 수 있다. 친수성기의 예는 하기 화학적 모이어티를 포함한다: 탄수화물, 폴리옥시에틸렌, 특정 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 아민, 아미드, 알콕시 아미드, 카복실산, 황, 및 히드록실.
"소수성 기 (Hydrophobic group)"는 화학적 모이어티가 물-회피인 질적 용어를 가리킨다. 일반적으로, 이러한 화학적 기는 수 불용성이고, 수소결합을 형성하지 않는 경향이 있다. 지용성 기는 지방, 오일, 지질, 및 비-극성 용매에 녹고, 수소 결합을 형성하는 능력을 거의 가지고 있지 않다. 둘(2) 이상의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소, 특정 치환된 탄화수소, 콜레스테롤, 및 콜레스테롤 유도체는 소수성 기 및 화합물의 예이다.
소수성 기는 바람직하게는 탄소 및 수소 원자만을 함유하는, 탄화수소이다. 그러나, 소수성을 유지하는 비-극성 치환 또는 비-극성 헤테로원자, 예를 들어 불소를 포함하는 것이 허용될 수 있다. 상기 용어는 지방족 기, 방향족 기, 아실기, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 및 아르알키닐기를 포함하며, 각각은 선형, 분기, 또는 고리일 수 있다. 또한 용어 소수성 기는 스테롤, 스테로이드, 콜레스테롤, 및 스테로이드 및 콜레스테롤 유도체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 양극성 고분자에 관하여, 일부는 하나의 공유결합이 깨지고 수소로 대체될 때 유도된 분자로서 정의된다. 예를 들어, 부틸아민에서, 탄소와 질소 결합 사이의 파괴, 및 수소로 대체는, 암모니아 (친수성) 및 부탄(소수성)으로 된다. 만일 1,4-디아미노부탄이 질소-탄소 결합에서 절단되고 수소로 대체되면, 결과로 생긴 분자는 다시 암모니아(2×) 및 부탄이다. 그러나, 소수성 일부의 형성이 2개 결합의 파괴를 요구하므로 1,4-디아미노부탄은 양극성으로 간주되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 표면 활성 고분자는 물의 표면 장력 및/또는 다른 상과 함께 계면 장력을 더 낮추고, 따라서, 액체/기체 계면에서 확실하게 흡착된다. 표면 활성의 특성은 일반적으로 물질의 분자가 양극성 또는 양친매성이라는 사실에 기인한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "막 활성" 고분자는 생물학적 막에 하나 이상의 하기의 효과를 유발할 수 있는 표면 활성, 양극성 고분자이다: 막을 투과할 수 없는 분자를 세포로 들어가거나 또는 막을 통과하도록 허용하는 막의 변경 또는 파괴, 막에서의 공극 형성, 막의 분열, 또는 막의 파괴 또는 용해. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 막, 또는 세포막은 지질 이중층을 포함한다. 막의 변경 또는 파괴는 하나 이상의 하기 분석에서 고분자의 활성에 의해 기능적으로 정의될 수 있다: 적혈구 용해 (red blood cell lysis, 용혈(hemolysis)), 리포좀 누출 (liposome leakage), 리포좀 융합, 세포융합, 세포 용해, 및 엔도좀 방출. 세포막의 용해를 야기시킬 수 있는 막 활성 고분자는 막 용해 고분자 (membrane lytic polymers)라고도 한다. 형질막 (plasma membrane)을 통해 엔도좀 또는 리소좀의 파괴를 우선적으로 일으키는 고분자는 엔도좀 분해용 (endosomolytic)으로 간주된다. 막 활성 고분자가 세포막에 미치는 영향은 일시적일 수 있다. 막 활성은 막에 대해 친화도를 가지고, 이중층 구조의 변성 (denaturation) 또는 변형 (deformation)을 일으킨다. 막 활성 고분자는 합성 또는 비-천연 양극성 고분자일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 막 활성 고분자는 HIV TAT 단백질로부터 유래된 아르기닌-풍부 펩티드, 안텐나페디아 펩티드(antennapedia peptide), VP22 펩티드, 트랜스포르탄(transportan), 아르기닌-풍부 인공 펩티드, 작은 구아니디늄-풍부 인공 고분자 등과 같은 화합물로 표시되는 세포 투과 펩티드 또는 고분자로 불리우는 고분자의 종류와 다르다. 세포 투과 화합물이 명백히 세포내 이입 (endocytosis)요구 없이 및 막의 온전함을 방해하지 않으면서, 지질 이중층의 한쪽으로부터 지질 이중층의 다른쪽으로 막을 통해 몇몇 분자를 수송함에도 불구하고, 이들의 메커니즘은 이해되지 않는다.
폴리뉴클레오티드의 세포로의 전달은 막의 공극을 형성하고, 또는 엔도좀 또는 리소좀 소포체를 파괴하는 것을 포함하여, 형질막 또는 내부 소포체 막 (엔도좀 또는 리소좀과 같은)을 파괴 또는 불안정화하는 막 활성 고분자에 의해 조정되고, 이로써 세포질로 소포체의 내용물의 방출을 허여한다.
본 발명의 양극성 막 활성 폴리아민 공중합체는 2 이상의 모노머 종의 공중합의 산물이다. 일 구체예에서, 본 발명의 양극성 막 활성 이종중합체 (heteropolymer)는 일반식을 갖는다:
Figure pct00016
여기서, A 는 펜던트 일차 또는 이차 아민 작용기를 함유하고 B 는 펜던트 소수성기를 함유한다. a 및 b 는 >0 의 정수이다. 고분자는 랜덤, 블록, 또는 교호 (alternating) 일 수 있다. 추가적 모노머의 결합이 허용된다.
"엔도좀 분해용 (endosomolytic) 고분자"는 용해 효소 (lytic enzyme)의 존재와 같은 엔도좀-특이적 환경 요인에 대하여, 엔도좀의 파괴 또는 용해를 일으킬 수 있거나, 또는 엔도좀 또는 리소좀과 같은, 세포 내부 막으로 쌓인 소포체(membrane-enclosed vesicle)로부터, 폴리뉴클레오티드와 같은 일반적으로 세포막 불투과성 화합물의 방출을 제공할 수 있는 고분자이다. 엔도좀 분해용 고분자는 엔도좀 내에서 이들의 물리화학적 특성의 변화를 겪는다. 이러한 변화는 전하, 소수성, 또는 친수성의 변화의 결과로서 고분자의 용해도 또는 다른 화합물 또는 막과 상호작용하는 능력의 변화일 수 있다. 본 발명의 가역적으로 차폐된 막 활성 폴리아민은 엔도좀 분해용 고분자로 간주된다.
멜리틴은 봉독에서 자연적으로 발생하는 작은 양극성 막 활성 펩티드이다. 멜리틴은 생물학적 자원으로부터 분리될 수 있거나 또는 합성될 수 있다. 합성 고분자는 "인간에 의해(by man)" 화학적 방법에 의해 제형화되거나 제조되고 자연적으로 발생하는 생물학적 방법에 의해 제조되지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 멜리틴은 하기 종의 독에서 발견될 수 있는 멜리틴 과의 자연적으로 발생하는 봉독 펩티드를 포함한다: 양봉꿀벌 (Apis mellifera), 한국토종꿀벌 (Apis cerana), 땅벌송장벌레 (Vespula maculifrons), 장수말벌 (Vespa magnifica), 등검은말벌 (Vespa velutina nigrithorax), 쌍살벌 (Polistes sp.) HQL-2001, 인도 최소종 꿀벌 (Apis florea), 인도 최대종 꿀벌 (Apis dorsata), 재래꿀벌 (Apis cerana cerana), 땡비 (Polistes hebraeus). 본 명세서에 사용된 바와 같이, 멜리틴은 자연적으로 발생하는 멜리틴 펩티드와 동일한 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드도 포함한다. 상세하게는, 멜리틴 아미노산 서열은 표 1에 나타낸 것을 포함한다. 합성 멜리틴 펩티드는 자연적으로 발생하는 L 형 아미노산 또는 거울상이성질체(enantiomeric) D 형 아미노산(역(inverso))을 함유할 수 있다. 그러나, 멜리틴 펩티드는 본질적으로 모든 L 형 또는 모든 D 형 아미노산을 함유해야 하지만 아미노 또는 카복시 말단에 첨부된 반대 (opposite) 입체중심 (stereocenter)의 아미노산을 가질 수 있다. 멜리틴 아미노산 서열은 반대((reverse)(reverso))일 수 있다. 반대 (reverso) 멜리틴은 L 형 아미노산 또는 D 형 아미노산 (레트로인버소(retroinverso))을 가질 수 있다. 또한 두 멜리틴 펩티드는 공유결합하여 멜리틴 이량체를 형성할 수 있다. 멜리틴은 차폐제 외에, 조직 표적을 향상시키거나 in vivo 순환을 가능하게 하는, 아미노 말단 또는 카복시 말단 끝에 결합된 변형기를 가질 수 있다.
결합 또는 "링커 (linker)"는 하나 이상의 공유 결합을 통하여 목적하는 하나의 화학적 기 또는 조각(segment)을 목적하는 다른 화학적 기 또는 조각에 결합하는 2개의 원자 사이의 연결이다. 예를 들어, 결합은 고분자에 차폐제 또는 폴리뉴클레오티드를 연결할 수 있다. 불안정한 결합 (linkage)은 불안정한 결합 (bond)를 함유한다. 결합은 2개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 결합에 유연성 및/또는 길이를 더 가할 수 있다. 스페이서는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 아르알키닐기를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않으며; 각각은 하나 이상의 헤테로원자, 헤테로고리, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 당류(saccharides)를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 선행 목록이 발명의 범위를 한정하는 것으로 의미하지 않는다.
"불안정한 결합"은 동일한 분자에서 다른 공유결합을 파괴 또는 절단하지 않을 조건 하에 선택적으로 파괴 또는 절단될 수 있는 수소 원자의 공유결합 외의 공유결합이다. 더 상세하게는, 불안정한 결합은 적절한 조건 하에 동일한 분자에서 다른 불안정하지 않은 공유결합보다 덜 안정하거나 (열역학적으로) 또는 더 빠르게 파괴되는 (동력학적으로) 공유결합이다. 분자 내 불안정한 결합의 절단은 2개의 분자 형성을 야기할 수 있다. 기술분야에서 숙련된 자에게, 결합의 절단 또는 불안정성은 일반적으로 결합 절단의 반감기(t1 /2) (결합의 반을 절단하는데 요구되는 시간) 면에서 논의된다. 따라서, 불안정한 결합은 분자의 다른 결합보다 더 빠르게 선택적으로 절단될 수 있는 결합을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "생리적으로 불안정한 결합"은 일반적으로 포유동물 신체 내에서 접하는 조건 또는 이와 유사한 조건 하에 절단 가능한 불안정한 결합이다. 생리적으로 불안정한 결합 기는 이들이 특정 생리적 조건에 존재할 때 화학적 변형(예를 들어, 절단)을 겪는 것으로 선택된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포의 생리적으로 불안정한 결합은 포유동물 세포내 조건 하에서 절단가능한 불안정한 결합이다. 포유동물 세포내 조건은 포유동물 세포에서 확인된 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 물질, 및 염 농도와 같은 화학적 조건 또는 포유동물 세포에서 접하는 것과 유사한 조건을 포함한다. 또한 포유동물 세포내 조건은 단백질 가수분해 또는 가수분해 효소와 같은 포유동물 세포에 일반적으로 존재하는 효소 활성의 존재를 포함한다. 또한 세포의 생리적으로 불안정한 결합은 약학적으로 허용가능한 외인성 물질의 투여에 반응하여 절단될 수 있다.
RNAi 간섭 - 표적 기 컨쥬게이트: 표적 기는 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 결합될 수 있다. siRNA 폴리뉴클레오티드의 경우, 비록 센스 가닥이 바람직하지만, 표적 모이어티는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 표적 기는 소수성 기로 이루어진다. 더 상세하게는, 표적 기는 20개 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기로 이루어진다. 폴리뉴클레오티드 표적 모이어티로 사용되는 소수성 기는 본 명세서에서 소수성 표적 모이어티로 나타낸다. 예시적인 적합한 소수성 기는 콜레스테롤 (cholesterol), 디콜레스테롤 (dicholesterol), 토코페롤 (tocopherol), 디토코페롤 (ditocopherol), 디데실 (didecyl), 디도데실 (didodecyl), 디옥타데실 (dioctadecyl), 이소프레노이드 (isoprenoid) 및 콜레아미드 (choleamide)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 6 개 또는 더 적은 탄소 원자를 가지는 소수성 기는 폴리뉴클레오티드 표적 모이어티로 효과적이지 않은 반면, 8 내지 18 개의 탄소 원자를 갖는 소수성 기는 소수성 기의 증가된 크기 (즉, 탄소 원자 수의 증가)와 함께 증가되는 폴리뉴클레오티드 전달을 제공한다. 소수성 표적 기의 RNAi 폴리뉴클레오티드에의 결합은 전달 고분자의 병용투여 없이는 RNAi 폴리뉴클레오티드의 효과적이고 기능적인 in vivo 전달을 제공하지 않는다. in vivo 간세포로 siRNA (siRNA-콜레스테롤)를 전달하기 위한 siRNA-콜레스테롤 컨쥬게이트가 타인에 의해 보고되었으나, 어떠한 추가적인 전달 비히클 없이는, 높은 농도의 siRNA가 요구되며 전달 효과가 좋지 못하다. 본 명세서에 기술된 전달 고분자와 조합되는 경우, 폴리뉴클레오티드의 전달은 현저히 개선된다. siRNA-콜레스테롤을 본 발명의 전달 고분자와 함께 제공함으로써, siRNA-콜레스테롤의 효과는 약 100 배 증가된다.
폴리뉴클레오티드 표적 모이어티로 유용한 소수성 기는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 및 아르알키닐기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 각각은 선형, 분기, 또는 고리, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 스테롤, 스테로이드, 및 스테로이드 유도체일 수 있다. 소수성 표적 기는 바람직하게는 탄소 및 수소 원자만을 함유하는, 탄화수소이다. 그러나, 소수성을 유지하는 치환 또는 헤테로원자, 예를 들어 불소는 허용될 수 있다. 소수성 표적 기는 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 결합될 수 있다. siRNA와 같은, 2 가닥을 갖는 RNAi 폴리뉴클레오티드의 경우, 소수성기는 어느 하나의 가닥에 결합될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 표적 기는 갈락토오스 클러스터 (갈락토오스 클러스터 표적 모이어티)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "갈락토오스 클러스터"는 2 내지 4 말단 갈락토오스 유도체를 갖는 분자를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 갈락토오스 유도체는 갈락토오스 및 갈락토오스보다 크거나 같은 ASGPr에 대한 친화도를 갖는 갈락토오스 유도체를 포함한다. 말단 갈락토오스 유도체는 이의 C-1 탄소를 통해 분자에 결합된다. 바람직한 갈락토오스 클러스터는 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 갖는 각 3개의 말단 갈락토사민 또는 갈락토사민 유도체를 가진다. 더 바람직한 갈락토오스 클러스터는 3개의 말단 N-아세틸갈락토사민을 가진다. 기술분야에서 다른 공통적 용어는 3-촉각(tri-antennary) 갈락토오스, 3가(tri-valent) 갈락토오스 및 갈락토오스 삼량체(trimer)를 포함한다. 3-촉각 갈락토오스 유도체 클러스터는 이(bi)-촉각 또는 일(mono)-촉각 갈락토오스 유도체 구조보다 더 큰 친화도로 ASGPr에 결합된다고 알려져 있다 (Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). nM 친화도를 이루기 위해 다가성(multivalency)이 요구된다. 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 가진 단일 갈락토오스 유도체의 결합은 전달 고분자와 함께 병용 투여될 때 in vivo 간세포로 RNAi 폴리뉴클레오티드의 기능적 전달을 가능하지 않게 한다.
갈락토오스 클러스터는 2 내지 4, 바람직하게는 3 개의 중심 분기점에 각각 결합된 갈락토오스 유도체를 포함한다. 갈락토오스 유도체는 당류의 C-1 탄소를 통하여 중심 분기점에 결합된다. 갈락토오스 유도체는 바람직하게는 링커 또는 스페이서를 통해 분기점에 결합된다. 바람직한 스페이서는 유연한 친수성 스페이서이다 (미국특허 제 5885968호; Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). 바람직한 유연한 친수성 스페이서는 PEG 스페이서이다. 바람직한 PEG 스페이서는 PEG3 스페이서이다. 분기점은 3개의 갈락토오스 유도체의 결합을 허용하고 RNAi 폴리뉴클레오티드에 분기점의 결합을 더 허용하는 어느 작은 분자일 수 있다. 예시적인 분기점 기는 디-리신(di-lysine)이다. 디-리신 분자는 3개의 갈락토오스 유도체가 결합될 수 있는 것을 통해 3개의 아민기, 및 디-리신이 RNAi 폴리뉴클레오티드에 결합될 수 있는 것을 통해 카복실 반응성 기를 함유한다. 분기점의 RNAi 폴리뉴클레오티드에의 결합은 링커 또는 스페이서를 통해 발생할 수 있다. 바람직한 스페이서는 유연한 친수성 스페이서이다. 바람직한 유연한 친수성 스페이서는 PEG 스페이서이다. 바람직한 PEG 스페이서는 PEG3 스페이서이다 (3개의 에틸렌 단위). 갈락토오스 클러스터는 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 결합될 수 있다. siRNA와 같이, 2 가닥을 갖는 RNAi 폴리뉴클레오티드의 경우, 갈락토오스 클러스터는 둘 중 하나의 가닥에 결합될 수 있다. 적절한 갈락토오스 클러스터는 미국 특허 공개 20110207799에 기술된다.
용어 "폴리뉴클레오티드", 또는 핵산 또는 폴리 핵산은 2개 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 고분자를 나타낸 기술분야의 용어이다. 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 고분자의 모노머 단위이다. 120 모노머 단위 미만의 폴리뉴클레오티드는 종종 올리고뉴클레오티드라 불린다. 천연 핵산은 데옥시리보오스- 또는 리보오스-포스페이트 백본을 가진다. 비-천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드는 in vitro 또는 세포 자유 시스템에서 중합되는 폴리뉴클레오티드이고, 동일 또는 유사한 염기를 함유하나 천연 리보오스 또는 데옥시리보오스-포스페이트 백본 이외의 유형의 백본을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 기술분야에서 어느 알려진 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 기술분야에서 알려진 폴리뉴클레오티드 백본은 PNAs(펩티드 핵산), 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트, 모폴리노 및 천연 핵산의 포스페이트 백본의 다른 이형을 포함한다. 염기는 퓨린 및 피리미딘을 포함하고, 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체를 더 포함한다. 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체는 아민, 알콜, 티올, 카복실레이트, 및 알킬할라이드와 같으나, 이에 한정되지 않는, 뉴클레오티드상의 새로운 반응성 기를 배치한 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용어 염기는 DNA 및 RNA의 알려진 염기 유사체 중 어느 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드, 또는 어느 적절한 조합을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 in vitro에서 중합될 수 있고, 이들은 재조합일 수 있으며, 키메릭 서열, 또는 이들 기의 유도체를 함유한다. 폴리뉴클레오티드는 5'-말단, 3'-말단, 또는 5' 및 3' 말단 모두에서 말단 캡 모이어티를 포함할 수 있다. 캡 모이어티는 역 데옥시 염기가 결여된 모이어티 (inverted deoxy abasic moiety), 역 데옥시 티미딘 모이어티, 티미딘 모이어티, 또는 3' 글리세릴 변형일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
"RNA 간섭(RNAi) 폴리뉴클레오티드"는 서열 특이적 방법으로 트랜스유전자 (transgene)의 메신저 RNA(mRNA) 전사체의 번역을 저하 또는 억제하기 위해 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 조직과 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도할 수 있는 분자이다. 2개의 일차 RNAi 폴리뉴클레오티드는 작은 (또는 짧은) 간섭 RNAs(siRNAs) 및 microRNAs(miRNAs)이다. RNAi 폴리뉴클레오티드는 siRNA, microRNA, 이중-가닥 RNA(dsRNA), 짧은 머리핀 RNA(shRNA), 및 RNA 간섭을 유도할 수 있는 RNA를 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. siRNA는 일반적으로 15-50 염기쌍, 바람직하게는 21-25 염기쌍을 함유하고 세포 내에서 발현된 표적 유전자 또는 RNA의 코딩 서열에 동일한 (완전히 상보성) 또는 거의 동일한 (부분적 상보성) 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중 가닥 구조를 포함한다. siRNA는 디뉴클레오티드 3' 돌출물(overhangs)을 가질 수 있다. siRNA는 2개의 어닐링된(annealed) 폴리뉴클레오티드 또는 머리핀 구조를 형성하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함한다. 일 구체예에서, 컨쥬게이트의 siRNA는 2개의 올리고뉴클레오티드 단편으로부터 조립되며, 하나의 단편은 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 두번째 단편은 siRNA 분자의 센스 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 센스 가닥은 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커와 같은, 링커 분자를 통해 안티센스 가닥에 연결된다. microRNAs(miRNAs)는 이의 mRNA 표적의 파괴 또는 번역 억제(translational repression)를 지시하는 약 22 뉴클레오티드 길이의 작은 비코딩(noncoding) RNA 유전자 산물이다. miRNA와 표적 mRNA 사이의 상보성이 부분적인 경우, 표적 mRNA의 번역은 억제된다. 상보성이 광범위한 경우, 표적 mRNA는 절단된다. miRNAs의 경우, 복합체는 일반적으로 miRNA와 부분적 상동성만 공유하는 mRNA의 3' UTR에 통상 위치된 표적 위치에 결합한다. "씨드 영역(seed region)"은 - 이의 표적과 함께 완전한 염기쌍을 형성하는 miRNA의 5' 말단 위의 약 일곱(7)의 연속적인 뉴클레오티드의 신장(stretch) - miRNA 특이성에서 중요한 역할을 수행한다. RISC/miRNA 복합체의 mRNA에의 결합은 단백질 번역의 억제 또는 mRNA의 절단 및 분해를 이끌 수 있다. 최근 자료는 씨딩 영역에서 단지 완전한 염기쌍을 보이는 것 대신 miRNA 및 이의 표적의 전체 길이를 따라 완전한 상동성이 있는 경우 mRNA 절단이 우선적으로 일어난다는 것을 나타낸다 (Pillai et al. 2007).
RNAi 폴리뉴클레오티드 발현 카세트는 세포에서 전사하여 siRNA, 별도의 센스 및 안티-센스 가닥 선형 siRNAs, 또는 miRNA로서 기능할 수 있는 작은 머리핀 RNAs를 생성할 수 있다. RNA 폴리머라아제 Ⅲ 전사된 DNAs는 U6 프로모터, H1 프로모터, 및 tRNA 프로모터를 포함하는 목록으로부터 선택된 프로모터를 함유한다. RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터는 U1, U2, U4 및 U5 프로모터, snRNA 프로모터, microRNA 프로모터, 및 mRNA 프로모터를 포함한다.
알려진 miRNA 서열의 목록은 그 중에서 특히, Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 및 European Molecule Biology Laboratory와 같은 연구 기관에 의해 유지되는 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 또한 알려진 효과적인 siRNA 서열 및 동족(cognate) 결합 좌위는 관련 문헌에서 잘 나타난다. RNAi 분자는 기술분야에서 알려진 기술에 의해 즉시 디자인되고 생성된다. 또한, 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 찾는 기회를 증가시키는 실험 도구(computational tools)가 있다 (Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004).
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 화학적 변형의 비-제한적인 예는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합 (phosphorothioate internucleotide linkages), 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시 리보뉴클레오티드, "유니버셜 염기 (universal base)" 뉴클레오티드, 5-C-메틸 뉴클레오티드, 및 역 데옥시 염기가 결여된 잔기 결합을 포함한다. 이러한 화학적 변형은, 다양한 폴리뉴클레오티드 구조체에서 사용될 때, 세포에서 폴리뉴클레오티드 활성을 보존함과 동시에 이러한 화합물의 혈청 안정성을 증가시키는 것으로 나타난다. 또한 화학적으로 변형된 siRNA는 인간에서 인터페론 활성을 활성화하는 가능성을 최소화시킬 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 화학적으로-변형된 RNAi 폴리뉴클레오티드는 2개의 가닥을 갖는 듀플렉스(duplex)를 포함하고, 이들 중 하나 또는 모두는 화학적으로-변형될 수 있으며, 여기서 각 가닥은 약 19 내지 약 29 뉴클레오티드이다. 일 구체예에서, 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 재구성된 in vitro 시스템 내부에서 RNAi를 조정하는 능력을 유지하는 동안 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. RNAi 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있고, 여기서 화학적 변형은 하나 이상 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상)의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오티드는 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수의 퍼센트로서 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 약 5 내지 약 100%의 뉴클레오티드 위치의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다 (예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 뉴클레오티드 위치). 정해진 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 변형된 뉴클레오티드의 실제 퍼센트는 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수에 의존한다. RNAi 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥인 경우, 퍼센트 변형은 단일 가닥 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수를 기준으로 할 수 있다. 마찬가지로, RNAi 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥인 경우, 퍼센트 변형은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 모두에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수를 기준으로 할 수 있다. 또한, 정해진 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 변형된 뉴클레오티드의 실제 퍼센트도 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 총 수에 의존할 수 있다. 예를 들어, RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 모든 피리미딘 뉴클레오티드 및/또는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 변형된다.
RNAi 폴리뉴클레오티드는 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 조절한다. 다수의 유전자들은 상호 서열 상동성의 어느 정도를 공유할 수 있기 때문에, RNAi 폴리뉴클레오티드는 충분한 서열 상동성을 갖는 유전자의 종류를 표적하도록 디자인될 수 있다. 따라서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 다른 유전자 표적 사이에서 공유되거나 또는 특정 유전자 표적에 독특한 서열에 상보성을 갖는 서열을 함유할 수 있다. 따라서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 여러 유전자들 사이에서 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존된 영역을 표적하도록 디자인될 수 있고, 이로써 유전자 과 (family)(예를 들어, 다른 유전자 아형 (isoform), 스플라이스 변이체 (splice variants), 돌연변이체 유전자 등)에서 여러 유전자를 표적한다. 또 다른 구체예에서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 단일 유전자의 특이적 RNA 서열에 독특한 서열을 표적하도록 디자인될 수 있다.
용어 "상보성 (complementarity)"은 전통적 Watson-Crick 또는 다른 비-전통적 유형에 의해 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 수소결합을 형성하는 폴리뉴클레오티드의 능력을 나타낸다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에 관하여, 이의 표적(효과기(effector) 결합 위치) 또는 상보적 서열과 함께 폴리뉴클레오티드 분자의 결합 자유 에너지는 효소적 mRNA 절단 또는 번역 억제를 진행하는 폴리뉴클레오티드의 관련 기능을 허여하기에 충분하다. 핵산 분자의 결합 자유 에너지의 측정은 기술분야에서 잘 알려져 있다 (Frier et al. 1986, Turner et al. 1987). 퍼센트 상보성은, 인접한 가닥에서, 두번째 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 10 중 5, 6, 7, 8, 9, 10은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보적)과 함께 수소결합을 형성할 수 있는 첫번째 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, Watson-Crick 염기쌍)에서의 염기의 퍼센트를 나타낸다. 완전하게 상보적은 폴리뉴클레오티드 서열의 인접한 가닥에서의 모든 염기가 두번째 폴리뉴클레오티드 서열에서 인접한 염기의 동일한 수와 함께 수소 결합일 것임을 의미한다.
유전자 발현을 억제, 하향-조절(down-regulate), 또는 녹다운시킴으로써, 유전자로부터 전사된 RNA의 수준 또는 폴리펩티드, 단백질 또는 RNA로부터 번역된 단백질 서브유닛의 수준에 의해 측정된대로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트를 차단함 없이 관찰된 유전자의 발현이 아래로 감소된다는 것을 의미한다. 대조 불활성화 핵산, 스크램블된 서열 또는 불활성화 부조화(mismatch)를 갖는 핵산의 존재 하에, 또는 차폐된 고분자에 폴리뉴클레오티드의 결합 없이 관찰된 본 발명의 조성물에 의해 전달된 폴리뉴클레오티드와 함께 유전자 발현의 억제, 하향-조절, 또는 녹다운의 수준은 바람직하게는 아래이다.
DNAse II와 같은 엔도좀/리소좀-편재 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 siRNA 안정화가 표적 녹다운을 강력하게 개선한다는 것이 확인되었다. 이와 같은 안정화는 세포의 RNAi 조직이 위치하는 세포질 내로 방출되는 siRNA의 양에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. 세포질 내에서 이용가능한 siRNA 일부 만이 RNAi 효과를 촉발할 수 있을 것이다.
좋지 않은 약동학적 특징뿐만 아니라, 보호 전달 비히클 없이 순환 내로 투여되는 경우 생물학적 환경내에서 siRNA는 뉴클레아제에 민감하다. 따라서, 많은 siRNA가 조직 및 혈관 중 세포외 또는 세포내 흡수 후(엔도좀) 빠르게 분해된다. 뉴클레아제 절단은 첫번째 뉴클레오티드간의 결합에서, 2'-데옥시, 2'-O-메틸 (2'-OMe) 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'-F) 뉴클레오티드와 같은 2'-OH 기가 결핍된 뉴클레오티드 및 콜레스테롤, 아미노알킬-링커 또는 포스포티오에이트 (phosphothioate)와 같은, 폴리뉴클레오티드 5'-말단 비-뉴클레오티드 모이어티에 의해 억제될 수 있다. 바람직하게, RNAi 폴리뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 (PTO) 결합에 의하여 두번째 뉴클레오티드와 연결된 5'-말단에서의 2'-OMe 뉴클레오티드로 시작하는, 가닥에서 어떠한 2'-OH 뉴클레오티드도 없다.
siRNA는 하기의 디자인을 이용하는 경우 상당히 안정화될 수 있다, 올리고뉴클레오티드는 변형 패턴 : 5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'의 안티센스 가닥 및 변형 패턴 5'-(Z3)ns-3'의 센스 가닥을 제공하고, 여기서
w 는 독립적으로 5'-포스페이트 또는 5'-포스포티오에이트 또는 H이고,
Z1 는 독립적으로 2'-변형된 뉴클레오시드 (nuleoside)이고,
Z2는 독립적으로 2'-데옥시 뉴클레오시드 또는 2'-플로오로-변형된 뉴클레오시드이고,
Z3는 독립적으로 2'-변형된 뉴클레오시드이며,
na 은 8 내지 23 이고, ns 는 8 내지 25이다.
바람직한 일 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 변형 패턴: 5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'의 안티센스 가닥 및 변형 패턴 5'-(Z3)ns-3'의 센스 가닥을 제공하며, 여기서 Z1는 2'-플르오로-변형된 뉴클레오시드 또는 2-데옥시-뉴클레오시드이며, 변수 na 및 ns 와 더불어 모든 남은 물질은 상기에 주어진 의미를 갖는다.
바람직한 일 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 변형 패턴: 5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'의 안티센스 가닥 및 변형 패턴 5'-(Z3)ns-3'의 센스 가닥을 제공하며, 여기서 Z3는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오시드, 2'-플루오로-변형된 뉴클레오시드 또는 2-데옥시-뉴클레오시드이며, 변수 na 및 ns 와 더불어 모든 남은 물질은 상기에 주어진 의미를 갖는다.
바람직한 일 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 변형 패턴: 5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'의 안티센스 가닥 및 변형 패턴 5'-(Z3)ns-3'의 센스 가닥을 제공하며, 여기서 Z1은 2'-플루오로-변형된 뉴클레오시드 또는 2-데옥시-뉴클레오시드이고, Z3는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오시드, 2'-플루오로-변형된 뉴클레오시드 또는 2-데옥시-뉴클레오시드이며, 변수 na 및 ns 와 더불어 모든 남은 물질은 상기에 주어진 의미를 갖는다.
신규한 변형 패턴의 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotice)의 핵산 서열 중 뉴클레오시드는 5'-3' 인산디에스테르 (phosphodiester) 또는 5'-3' 포스포로티오에이트 (phosphorothioate)로 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "안티-센스"가닥은 표적 mRNA에 상보적인 siRNA 가닥이고 siRNA가 풀리자마자 mRNA에 결합할 것이다. 신규한 변형 패턴을 포함하는 상기 siRNA의 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적이다.
원칙적으로 RNAi 폴리뉴클레오티드와 표적 모이어티 또는 공유 결합된 전달 고분자 간의, 뉴클레아제 절단 좌위는 센스 또는 안티센스 가닥에 1 이상의 2'-OH 뉴클레오티드를 함유하는 3'- 또는 5'- 돌출물 (overhage)에 의해 도입될 수 있다. 최종 활성 siRNA 종은 세포내 뉴클레아제 과정에 의해 발생된다. 또한, 염기 쌍을 이룬 부분에서 2'-OH 뉴클레오티드에 의하여 시행된 명확한 절단 좌위의 이용이 가능하다. 이는 반대 가닥에 대한 하나 이상의 2'-OH 뉴클레오티드 상보성을 이용하여 또는 하나 이상의 부조화된 (mismatched) 2'-OH 뉴클레오티드 또는 하나 이상의 2'-OH 뉴클레오티드를 포함하는 머리핀/벌지 (bulge)의 도입에 의해 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 전달 고분자에의 결합
일 구체예에서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 생리적으로 불안정한 결합 또는 링커를 통하여 전달 고분자에 결합된다.생리적으로 불안정한 링커는 이들이 특정 생리적 조건 (예를 들어, 세포질의 환원 환경에서 절단되는 이황화 결합)에 존재할 때 화학적 변형(예를 들어, 절단)을 수행하도록 선택된다. 생리적으로 불안정한 결합의 절단에 의한, 고분자로부터의 폴리뉴클레오티드의 방출은, 활성을 위해 폴리뉴클레오티드와 적절한 세포 성분과의 상호작용을 촉진시킨다.
폴리뉴클레오티드-고분자 컨쥬게이트는 고분자에 폴리뉴클레오티드의 공유 결합에 의하여 형성된다. 고분자는 반응성 기 A를 함유하도록 중합되거나 변형된다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 반응성 기 B를 함유하도록 중합되거나 변형된다. 반응성 기 A 및 B는 이들이 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 가역적인 공유결합을 통해 결합될 수 있도록 선택된다.
고분자에 폴리뉴클레오티드의 결합은 과량의 고분자 존재 하에 수행될 수 있다. 결합 동안 폴리뉴클레오티드와 고분자는 반대의 전하일 수 있기 때문에, 과량의 고분자의 존재는 컨쥬케이트의 응집을 감소시키거나 제거할 수 있다. 대안적으로, 다가양이온과 같은, 과량의 담체 고분자가 사용될 수 있다. 과량의 고분자는 컨쥬게이트의 동물 또는 세포 배양으로의 투여 전에 결합된 (conjugated) 고분자로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, 과량의 고분자는 동물 또는 세포 배양으로 컨쥬케이트와 함께 병용투여될 수 있다.
In Vivo 투여
약리학 및 독성학에서, 투여 경로는 약물, 체액, 독, 또는 다른 물질이 신체와 접촉하게 되는 경로이다. 일반적으로, 포유동물의 치료를 위한 약물 및 핵산의 투여 방법은 기술분야에서 잘 알려져 있고, 본 발명의 조성물의 투여로 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 어느 적합한 경로, 가장 바람직하게는 비경구적으로 경로에 적절하게 만든 제제로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 주사, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피내(intracutaneously), 피하(subcutaneously), 또는 복강내로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 또한 제공한다.
비경구 투여 경로는 주사기 및 바늘 또는 카테터를 사용하는 혈관내 (정맥내, 동맥내), 근육내, 뇌실질내 (intraparenchymal), 피부내 (intradermal), 피하 (subdermal), 피하 (subcutaneous), 종양내, 복강내, 척수강내 (intrathecal), 경막하 (subdural), 경막외 (epidural), 및 림프관내 (intralymphatic) 주사를 포함한다. 본 명세서에서 혈관내는 신체 내 조직 또는 기관에 연결된 도관이라 불리우는 관 구조 내를 의미한다. 관 구조의 공동(cavity) 내에 체액은 신체 일부로 또는 신체 일부로부터 흐른다. 체액의 예는 혈액, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid, CSF), 림프액, 또는 담즙을 포함한다. 도관의 예는 동맥 (arteries), 소동맥 (arterioles), 모세관 (capillaries), 세정맥 (venules), 동양혈관 (sinusoids), 정맥 (veins), 림프 (lymphatics), 담관 (bile ducts), 및 침 또는 다른 외분비샘(exocrine glands)의 관을 포함한다. 혈관내 경로는 동맥 또는 정맥과 같은 혈관을 통한 전달을 포함한다. 혈액 순환계는 의약품의 전신 확산을 제공한다.
기술된 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 용액에 주입된다. 약학적으로 허용가능한은 약리학적/독성학적 관점으로부터 포유동물에 허용가능한 특성 및/또는 물질을 나타낸다. 문구 약학적으로 허용가능한은 생리적으로 용인될 수 있고 포유동물에 투여될 때 일반적으로 알레르기 또는 기타 바람직하지 않은 또는 독성 반응을 생성하지 않는 분자 독립체, 조성물 및 특성을 나타낸다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 약학적으로 허용가능한은 동물, 특히 인간에서 사용하기 위해 연방의 규제 기관 또는 주 정부의 승인이나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정된 약전에 열거된 것을 의미한다.
또한 이러한 담체는 방부제, 습윤제, 유화제, 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 멸균 절차, 앞에, 및 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페닐, 소르브산 등의 포함에 의하여 보장될 수 있다. 또한 당, 염화나트륨과 같은 등장제 (isotonic agent)를 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 장기적인 흡수는 알부민 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함함으로써 유발될수 있다.
일 구체예에서, RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 기 컨쥬게이트는 본 발명의 전달 고분자와 함께 병용 투여 된다. 병용 투여에 의하여 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트와 전달 고분자는 두개가 동시에 포유동물에 존재하도록 포유동물에 투여된다는 것을 의미한다. RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 기 컨쥬게이트 및 전달 고분자는 동시에 투여될 수 있거나 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 동시 투여의 경우, 이들은 투여 전에 혼합될 수 있다. 순차적 투여의 경우, RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 기 컨쥬게이트 또는 전달 고분자가 먼저 투여될 수 있다.
치료 효과
RNAi 폴리뉴클레오티드는 연구 목적 또는 치료하는 세포의 변화를 생성하기 위해 전달될 수 있다. RNAi 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달은 연구 시약으로 유용하고, 다양한 치료, 진단, 표적 검증, 게놈 발견, 유전공학 및 약물유전체학 (pharmacogenomics) 적용에 유용하다. 우리는 간세포에서 내인성 유전자 발현의 억제를 가져오는 RNAi 폴리뉴클레오티드를 개시하였다. 폴리뉴클레오티드의 전달 후에 측정된 리포터 (마커) 유전자 발현의 수준은 다른 폴리뉴클레오티드의 전달 후에 유전자 발현의 유사한 수준의 적정한 기대를 나타낸다. 기술분야에서 숙련된 자에 의해 유익하다고 간주되는 치료수준은 질병으로부터 질병까지 다르다. 예를 들어, 혈우병 A 및 B는 각각 X-결합된 응고 인자 Ⅷ 및 Ⅸ의 결핍에 의해 야기된다. 이들의 임상과정은 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ의 정상 혈청 수준의 퍼센트에 의해 크게 영향을 받는다: < 2 %, 중증 (severe); 2-5 %, 중간 (moderate); 및 5-30 % 경증 (mild). 따라서, 중증 환자의 순환 인자의 정상 수준의 1 % 내지 2 %의 증가는 유익한 것으로 생각될 수 있다. 6 %보다 더 큰 수준은 자발적인 출혈을 막을 수 있으나 수술 또는 부상에 대한 이차 출혈은 막을 수 없다. 유사하게, 유전자의 억제는 치료 혜택을 제공하기 위해 100 %일 필요는 없다. 유전자 치료의 기술분야에서 통상의 기술자는 마커 유전자 결과의 충분한 수준을 기초로 질병에 대해 특이적인 유전자 발현의 유익한 수준을 적정하게 예상할 것이다. 혈우병 예에서, 만일 마커 유전자가 인자 Ⅷ의 정상 수준의 2 %의 부피의 비교 수준에서 단백질을 생성하기 위해 발현되었다면, 인자 Ⅷ의 유전자 코딩 또한 유사한 수준에서 발현될 것이라고 적당하게 예상할 수 있다. 따라서, 수용체 또는 마커 유전자는 일반적으로 세포내 단백질의 발현에 대해 유용한 범례(paradigm) 역할을 한다.
간은 대사작용 (예를 들어, 다양한 고콜레스테롤혈증 (hypercholesterolemias)의 지질단백질 대사작용) 및 순환 단백질 (예를 들어, 혈우병의 혈액 응고 인자)의 분비에서 이의 중심 역할을 고려하여 볼 때 유전자 치료를 위해 가장 중요한 표적 조직 중 하나이다. 또한, 만성 간염 및 간경변과 같은 후천적 장애(acquired disorders)는 일반적이고 또한 폴리뉴클레오티드 기반의 간 치료에 의해 잠재적으로 치료된다. 간에 발생하거나 또는 간에 의해 발생되는 많은 질환 또는 질병은 간에서 유전자 발현의 녹다운 (억제)를 통해 잠재적으로 치료된다. 이러한 간 질환 및 질병은 간암 (간세포암, HCC 포함), 바이러스성 감염 (간염 포함), 신진 대사 장애 (고지혈증 및 당뇨 포함), 섬유증, 및 급성 간 손상을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성 없이, 특정 환자, 조성, 및 투여 방식에 따라 원하는 치료적 반응을 얻기에 효과적인 활성성분의 양을 수득하기 위하여 달라질 수 있다. 선택되는 용량 수준은 본 발명에서 사용된 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료기간, 다른 약물, 사용된 특정 조성물과의 조합으로 사용된 화합물 및/또는 물질, 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강 및 치료 받을 환자의 종전의 병력 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사한 요인을 포함하는 다양한 약동학적 요인에 의존할 것이다.
투여될 전달 고분자, RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 기 컨쥬게이트 또는 전달 고분자-RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트의 양(용량)은 경험에 기인하여 결정될 수 있다. 본 발명자는 0.1-10 ㎎/㎏ 동물 무게의 siRNA 및 1.5-60 ㎎/㎏ 동물 무게의 전달 고분자를 이용하여 유전자 발현의 효과적인 녹다운을 나타내었다. 마우스에서 바람직한 양은 0.25-2.5 ㎎/㎏ siRNA-컨쥬게이트 및 10-40 ㎎/㎏ 전달 고분자이다. 더욱 바람직하게는, 약 1.5-20 ㎎/㎏ 전달 고분자가 투여된다. RNAi-폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트의 양은 일반적으로 더 큰 용량에서 독성이 없기 때문에 쉽게 증가된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, in vivo는 유기체(organism) 내부에서 발생하는, 더 상세하게는 포유동물과 같은, 부분적 또는 죽은 것과 반대되는, 전체 살아있는 다세포 유기체(동물)의 살아있는 조직 안 또는 위에서 수행된 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약학적 조성물"은 본 발명의 컨쥬게이트, 약학적 담체 또는 희석제 및 제형에 필요한 어떠한 기타 매질 또는 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약학적 담체"는 어떠한 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제, 및 생리적으로 호환가능한 유사체를 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하(subcutaneously), 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다.
실시예
실시예 1. 프로테아제 ( 펩티다아제 ) 절단가능한 차폐제의 합성
수성 NaHCO3 중 아미노산의 결합 (coupling) 및 시릴-기 탈보호를 제외한, 모든 반응은 신선한 무수 용매를 이용한 무수 조건에서 수행하였다. 컬럼 정제는 특정한 용출제를 이용한 실리카 겔 상에서 수행하였다. 질량-스펙트럼 (MS)은 전기분무 이온화 (electrospray ionization)을 이용하여 수득하였다.
NAG 및 PEG의 활성 p-니트로페닐-p-아실아미도벤질 카보네이트 유도체 (NAG-L-AA-PABC-PNP 및 PEG-AA-PABC-PNP)의 제조에서, 디펩티도-p-아실아미노벤질 (dipeptido-p-acylaminobenzyl) 알코올 전구체의 아미노 말단을 아실화하기 위하여 각각의 PEG 또는 NAG-함유 유도체의 NHS 에스테르를 사용하였다. 후속 단계에서 벤질릭 히드록실 기를 p-니트로페닐 카보네이트로 전환시키고 아미노산 및 NAG 모이어티로부터 보호 기를 제거하였다. 일부 적용에서, 파라니트로페놀 (paranitrophenol, PNP)-카보네이트가 특정 고분자의 번형에 사용되는 경우, 보호 기는 고분자 변형보다 우선한다.
Figure pct00017
R은 ASGPr 리간드 (보호된 또는 보호되지 않은) 또는 PEG를 포함하고, A1 및 A2 는 아미노산 (보호되거나 또는 보호되지 않은)이다.
H-A1A2-PABA (표 1) 유도체의 제조로부터 합성을 시작한다. 이들 부과물 (adduct)은 일부 변형한 Dubowchik 등 (2002)에 기술된 합성 식을 이용하여 수득하였다. Fmoc-보호된 아미노산, Fmoc-A1-OH는 디시클로헥실카보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 및 N-히드록시숙신이미드 (hydroxycuccinimide NHS)와의 반응에서, N-히드록시숙신이미드 에스테르 (hydroxycuccinimide ester), Fmoc-A1-NHS로 전환시킴으로써 활성화 되었다. 아미노 기 반응성을 유지하기 위하여 첨가된 수성 NaHCO3의 존재 하에 이 반응성 NHS-에스테르를 보호된 아미노산 A2와 결합시켰다. 1e 및 1f (표 1)의 제조를 위하여, NHS 에스테르 대신, 시판되는 펩타플루오로페닐 에스테르 (pentafluorophenyl esters, OPfp)를 결합을 위하여 사용하였다.
Fmoc 디펩티드 1a- h 의 합성.
a) AA의 NHS 에스테르를 NHS 및 DCC와 각각의 아미노산으로부터 제조하였으며, 추가적인 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00018
조건: (i) N-히드록시숙신이미드 (NHS), N-N'-디시클로헥실카보디이미드 (DCC), 0-20 ℃.
Fmoc-Ala-NHS의 경우, DCC (286 mg, 1.38 mmol)를 DCM (13 mL) 중 Fmoc-Ala-OH (412 mg, 1.32 mmol) 및 NHS (160 mg, 1.38 mmol)의 차가운 용액에 첨가하고, 30분 동안 교반한 다음 20 ℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체 디시클로헥실우레아 (dicyclohexylurea, DCU)를 여과하여 버리고 용매를 진공 하에 제거하였다.
Fmoc-Asn(DMCP)-NHS의 경우, DCC (148 mg, 0.72 mmol)를 DCM (13 mL) 중 Fmoc-Asn(DMCP)-OH (298 mg, 0.68 mmol) 및 NHS (83 mg, 0.72 mmol)의 차가운 용액에 첨가하고, 30분 동안 교반한 다음 20 ℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체 디시클로헥실우레아를 여과하여 버리고 용매를 진공 하에 제거하였다.
Fmoc-Gly-NHS의 경우, Fmoc-Gly-OH (891 mg, 3 mmol) 및 NHS (380 mg, 3.3 mmol)를 THF (10 mL) 중에서 0 ℃에서 5분간 교반하고, THF (5 mL) 중 DCC 용액 (650 mg, 3.15　mmol)으로 처리하였다. 30 분에 냉각 수조를 제거하고 반응 혼합물을 20 ℃에서 10시간 동안 교반하였다. 고체 디시클로헥실우레아 (DCU)는 여과하여 버리고, THF로 세척하고 용매는 회전증발기 (rotovap) 상에서 제거하였다. 생성물의 무게를 재고 0.2 mM 용액을 만들기 위하여 DME에 용해시켰다.
Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHS의 경우, DCC (217 mg, 1.05 mmol)를 THF (5　mL) 중 Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-OH (487 mg, 1 mmol) 및 NHS (127 mg, 1.1 mmol)의 차가운 용액에 첨가하고, 15분 동안 교반한 다음 20 ℃에서 10시간 동안 교반하였다. Fmoc-Gly-NHS에 기술된 바와 같이 워크업 (workup)을 수행하였다.
Fmoc-Phe-NHS의 경우, DCC (1.181 g, 5.72 mmol)를 DCM (50 mL) 중 Fmoc-Phe-OH (2.11 g, 5.45 mmol) 및 NHS (664 mg, 5.77 mmol)의 차가운 용액에 첨가하고, 30분 동안 교반한 다음 20 ℃에서 10시간 동안 교반하였다. 고체 DCU를 여과하여 버리고 용매를 진공 하에 제거하였다.
Fmoc-Val-NHS의 경우, DCM (13 mL) 중 Fmoc-Val-OH (339 mg, 1 mmol) 및 NHS (127 mg, 1.1 mmol)의 차가운 용액에 DCC (227 mg, 1.1 mmol)를 첨가하고, 30분 동안 교반한 다음 20 ℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체 DCU를 여과하여 버리고 용매를 진공 하에 제거하였다.
b) 아미노산 H-Asn(DMCP)-OH 및 H-Lys(MMT)-OH를 이용가능한 Fmoc-보호된 유도체로부터 제조하였다.
Figure pct00019
조건: 디메틸포름아미드 (dimethylformamide, DMF) 중 트리에틸아민 (Triethylamine, Et3N).
H-Asn(DMCP)-OH
Fmoc-Asn(DMCP)-OH (576 mg, 1.32 mmol)를 DMF (9 mL) 중에서 Et3N (3.7 mL, 26.4 mmol)와 함께 15시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물질을 40 ℃/오일 펌프 진공에서 회전증발기 상에서 제거하였다. 잔여물은 에테르 (30 mL)로 3 회 배산 (Trituration)하고 진공 하에 건조하였다. 수율 271 mg (96%). MS: 643.6 [3M+1]+; 451.3 [2M+Na]+; 429.5 [2M+1] +; 236.7 [M+Na] +; 215.3 [M+1] +; 132.8 [M-DMCP+1] +.
H-Lys(MMT)-OH. Fmoc-Lys(MMT)-OH (4.902 g, 7.65 mmol)를 DMF (100　mL) 중에서 Et3N (32 mL, 30 eq. 229.4 mmol)와 함께 10시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물질을 40 ℃/오일 펌프 진공에서 회전증발기 상에서 제거하였다. 잔여물은 에테르로 2 회 배산하고 진공 하에 건조하였다. 수율 3.1g (97%). MS (neg. mode): 455, 453.3 [M+Cl]-; 417.8 [M-1]-.
c) Fmoc-A1A2-OH의 합성.
Figure pct00020
A1= Gly, Glu(2PhiPr), Asn(DMCP), Phe, Ala, Val.
A2=Gly, Lys(MMT), Cit, Asn(DMCP), Lys(CH3)2.
조건: (i) H-A2-OH, NaHCO3, 디메톡시에탄 (DME), 테트라히드로퓨란 (tetrahydrofurane, THF) 및 H2O의 혼합물. (ii) H-A2-OH, NaHCO3, DME/THF/H2O. (iii) H-Cit-OH, NaHCO3, H2O 중 THF.
Fmoc-GlyGly-OH 1a의 경우, 글리신 (75 mg, 1 mmol) 및 NaHCO3 (100 mg, 1.2 mmol)를 H2O (10 mL) 및 디메톡시에탄 (dimethoxyethane, DME) (5 mL)에 용해시켰다. DME 중의 Fmoc-Gly-NHS 용액 (5 ml, 1 mmol)을 첨가하였다. THF (2.5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 초음파 처리하여 균질화하고 20 시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 제거하고, 잔여물을 EtOAc 및 H2O 중 5% KHCO3 용액으로 처리하였다. 생성물을 EtOAc로 4 회 추출하고, pH=3 에서 염수로 세척하고, 건조하고 (Na2SO4), 진공 하에 농축하고 건조하였다. 수율 321 mg (90%). MS: 775.0 [2M +2Na]+; 377.4 [M+Na]+; 355.1 [M+1]+.
Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-OH 1b의 경우, 글리신 (75 mg, 1 mmol) 및 NaHCO3 (84 mg, 1　mmol)를 H2O (2 mL), THF (4 mL) 및 DME(5mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. DME (5 mL, 1mmol) 중 Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHS 용액을 첨가하고 10시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 20 mL의 0.1M MES 완충액 (pH=5)을 첨가한 다음 EtOAc (25 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 상에서 교반하고 5% KHSO4 용액을 이용하여 pH=5로 산성화시켰다. EtOAc를 이용하여 생성물을 4 회 추출하고, pH=5에서 염수로 씻어내고, 건조하고 (Na2SO4), 진공 하에 농축 및 건조하였다. 수율 528 mg (96%). MS: 567 [M+Na]+; 562 [M+NH4]+; 545.0 [M+1]+; 427.1 [M-2PhiPr]+.
Fmoc-Asn(DMCP)Gly-OH 1c의 경우 1b에 대해 상기 기술한 바와 같이 Fmoc-Asn(DMCP)-NHS 및 H-Gly-OH로부터 제조하였다. 수율 96%. MS: 987.4 [2M+1] +; 516.3 [M+Na] +; 494.4 [M+1]+; 412.2 [M-DMCP+1] +.
Fmoc-PheLys(MMT)-OH 1d의 경우, 1b에 대해 상기 기술한 바와 같이 Fmoc-Phe-NHS 및 H-Lys(MMT)-OH로부터 제조하였다. 수율 94%. MS: 788.5 [M+1]+, 273.1 [M-MMT+1]+.
Fmoc-PheCit-OH 1e의 경우:
ｉ) H2O (40 mL) 및 THF (20 mL)의 혼합물 중 L-시트룰린 (1.80 g, 10.26 mmol) 및 NaHCO3 (0.86 g, 10.26 mmol)를 함유하는 용액에 DME (40 mL) 중 Fmoc-Phe-NHS (4.96 g, 10.26 mmol) 를 첨가하였다. 반응을 15 시간 동안 교반하였다. 활성화로부터의 잔여 DCC는 여과하고 유기용매는 회전증발기 상에서 제거하였다. 잔여물에 H2O (100 mL) 및 iPrOH (10 mL)를 첨가하였다. 현탁액을 5% KHSO4을 이용하여 pH=3으로 산성화시키고, 생성물을 EtOAc:iPrOH=9:1 용액(3×, 500 mL)으로 추출하고, 염수:iPrOH=9:1 (2×, 50 mL)의 혼합물로 세척하고, 건조하고 (Na2SO4), 여과하고 농축하고, 오일 펌프로 건조하였다. 에테르를 이용한 배산은 순수한 생성물 1e를 제공하였다. 수율 3.84 g (68%). MS: 545.6 [M+Na] +; 528.5 [M-H2O] +; 306.3 [M-Fmoc+H2O] +.
ⅱ) THF (5 mL) 중 Fmoc-Phe-OPfp (553 mg, 1 mmol) 용액을 H2O (2.6 mL) 중 H-Cit-OH (184 mg, 1.05 mmol) 및 NaHCO3 (88.2 mg, 1.05 mmol)용액에 첨가하였다. THF (2 mL) 를 첨가하여 용액을 균질화하고 10시간 동안 교반하였다. THF 를 회전증발기 상에서 제거하고, 잔여물을 H2O (10 mL) 및 iPrOH (1 mL)로 희석하고 3% HCl를 이용하여 pH=1로 산성화시켰다. 생성물은 EtOAc:iPrOH=9:1 용액으로 5 회 추출하고, 염수:iPrOH=9:1의 혼합물로 씻어내고, 건조하고 (Na2SO4) 진공 하에 농축하였다. 에테르를 이용한 배산은 313 mg의 순수한 생성물 1e (57%)를 제공하였다.
Fmoc-AlaCit-OH 1f는 1e-(a)에 대해 상기 기술한 바와 같이 Fmoc-Ala-NHS 및 H-Cit-OH로부터 제조하였다. 수율 77%. MS: 959.8 [2M+Na]+; 938.1 [2M+1]+; 491.4 [M+Na]+; 469.9 [M+1]+.
조 (crude) Fmoc-ValCit-OH 1g는 1b에 대해 상기 기술한 바와 같이 Fmoc-Val-NHS 및 H-Cit-OH로부터 제조하였다. 최종 정제는 에테르를 이용한 배산으로 수행하였다. 총 수율 76%. MS: 1060.3 [2M+3Na]+; 1015.7 [2M+Na]+; 519.7 [M+Na]+; 497.9 [M+1]+.
Fmoc-Ala-Asn(DMCP)-OH 1h는 1b에 대해 상기 기술한 바와 같이 Fmoc-Ala-NHS 및 H-Asn(DMCP)-OH로부터 제조하였다. 수율 95%. MS: 530.2 [M+Na]+; 508.2 [M+1]+; 426.0 [M-DMCP+1]+.
p- 아미노벤질 알코올과의 결합, Fmoc - AA - PABA 및 Fmoc -A- PABA 2a-m 의 제조.
2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디히드로퀴놀린 (2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, EEDQ)의 존재 하에서 생성물 1a-h를 p-아미노벤질 알코올 (p-aminobenzyl alcohol, PABA)과 결합시켜 2a-h를 형성하였다. 또한 PABA 모이어티에 결합된 하나의 아미노산만을 갖는 4개의 대표 3 j-l도 제조하였다.
Figure pct00021
조건: (i) PABA, EEDQ, THF
Fmoc-GlyGly-PABA 2a의 경우, DCM (17 mL) 및 MeOH (6 mL) 중 1a (318 mg, 0.9 mmol) 및 PABA (220 mg, 1.8　mmol)의 용액을 EEDQ (444 mg, 1.8　mmol)와 함께 10시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 잔여물을 Et2O로 배산하고 생성물을 여과해내고 진공 하에 건조하였다.수율 348 mg (84%).
Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-PABA 2b의 경우, DCM (10 mL) 중 1b (524 mg, 0.96 mmol) 및 PABA (142 mg, 1.55 mmol)의 용액을 EEDQ (357 mg, 1.44　mmol)와 함께 10시간 동안 교반하고, 2a에 대해 상기 기술한 바와 같이 워크업을 수행하였다. 수율 462 mg (74%).
Fmoc-Asn(DMCP)Gly-PABA 2c를, 2a에 대해 상기 기술한 바와 같이 제조하였다. 수율 64%. MS: 621.5 [M+22]+; 599.3 [M+1]+.
Fmoc-PheLys(MMT)-PABA 2d는, 2b에 대해 상기 기술한 바와 같이 제조하였다. 수율 70 %.
Fmoc-PheCit-PABA 2e의 경우, DCM (150 mL) 및 MeOH (50 mL) 중 1e (5.98 g, 10.97 mmol) 및 PABA (2.70 g, 21.95　mmol)의 용액을 EEDQ (5.43 g, 21.95　mmol)로 처리하고 15시간 동안 교반하였다. 2a에 대해 상기 기술한 바와 같이 워크업을 수행하였다. 수율 6.14　g (86%). MS: 650.7 [M+1]+; 527.3 [M-PABA+1]+.
Fmoc-AlaCit-PABA 2f의 경우, DCM (45 mL) 및 MeOH (15 mL) 중 1f (2.89 g, 6.17 mmol) 및 PABA (1.52 g, 12.34　mmol)의 용액을 EEDQ (3.05 g, 12.34　mmol)로 처리하고 15시간 동안 교반하였다. 2a에 대해 상기 기술한 바와 같이 워크업을 수행하였다. 수율 4.56　g (74%). MS (ES, neg. mode): 307.4 [M-263.6-1]-; 349.9 [M-Fmoc-1]-; 610, 608.4 [M+HCl-1]-.
Fmoc-ValCit-PABA 2g는 2b에 대해 상기 기술한 바와 같이 제조하였다 (98%).
Fmoc-AlaAsn(DMCP)-PABA 2h는 2a에 대해 상기 기술한 바와 같이 제조하였다. 수율 59%. MS: 613.2 [M+1]+; 531.4 [M-DMCP+1]+; 408.2 [M-205+1]+.
Fmoc-Lys(CH3)2-PABA 2i의 경우, Fmoc-Lys(CH3)2-OH.HCl 염 (433 mg, 1mmol) 및 PABA (246 mg, 2 mmol)를 DCM (10 mL) 및 MeOH (1.5 mL)에 용해시키고, 5 ℃로 냉각하고 EEDQ (495 mg, 2 mmol)를 첨가하였다. 냉각 수조를 제거하고 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 잔여물을 Et2O로 배산하고, 조 생성물을 여과해내었다. 이를 DCM (2 mL) 및 MeOH (1 mL)의 혼합물에 재용해시키고 Et2O (40　mL) 중으로 점적 (dropwise) 첨가하여 다시 침전시켰다. 생성물을 여과하고 진공 하에 건조하였다. 수율 448 mg (83%).
Fmoc-Leu-PABA 2j의 경우, DCM (10 mL) 중 Fmoc-Leu-OH (353 mg, 1 mmol), EEDQ (495 mg, 2　mmol) 및 PABA (222　mg, 1.8 mmol)의 용액을 10시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 잔여물을 Et2O (40 mL)에 용해시키고, 드라이 아이스 상에서 2시간 동안 냉각하고 고체를 원심분리로 분리하였다. 수득한 조 물질을 컬럼 상에서, CHCl3 중 용출제 구배 MeOH (1-2%)로, 정제하였다. 수율 444 mg (97%). MS: 459.4 [M+1]+.
Fmoc-Asn(DMCP)-PABA 2k 를 2j에 대해 기술한 바와 같이 제조하였다. 워크업에서 컬럼 정제 대신 DCM 제거 후 잔여물을 Et2O로 배산하고 0 ℃로 냉각하고 조 생성물을 정재해 내었다. 이 처리를 한번 더 반복하고 뒤이어 진공 하에 건조하였다. 수율 77%. MS: 542.5 [M+1]+.
Fmoc-Cit-PABA 2l의 경우, DCM (10 mL) 및 MeOH (4 mL) 중 Fmoc-Cit-OH (345.7 mg, 0.87 mmol) 및 PABA (214　mg, 1.74 mmol)의 용액을 EEDQ (430　mg, 1.74　mmol)로 처리하고 15시간 동안 교반하였다. 고체 생성물을 에테르로 3 회 배산하고, 생성물을 여과하고 건조하였다. 수율 288 mg (67%). MS: 502.3 [M+1]+; 485.5 [M-H2O+1]+; 263 [M-Fmoc-H2O+1]+; 179.0 [M-306+1]+; 120.2 [M-365.3+1]+.
생성물 2m은 상이한 반응식으로 제조하였다: H-Lys(CH3)2-PABA 유도체 3과 Fmoc-Phe-NHS의 결합.
Figure pct00022
조건: (i) DMF 중 트리에틸아민 (Et3N), 10 시간. (ii) Fmoc-Phe-NHS, 디이소프로필에틸아민 (diisopropylethylamine, DIEA), DMF.
Fmoc-PheLys(CH3)-PABA 2m의 경우, Fmoc-Lys(CH3)2--PABA (2i) (448 mg, 0.83 mmol)를 DMF (11mL) 중 Et3N (3.5 mL)와 함께 10시간 동안 교반하여 Fmoc를 탈보호시켰다. 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하여 조 생성물 3i를 수득하였다. 이 생성물을 DMF (7 mL)에 용해시키고, Fmoc-Phe-NHS (482 mg, 0.996　mmol)를 첨가한 다음 DIEA (0.42 mL, 2.2 mmol)를 첨가하고 혼합물을 10시간 동안 교반하였다. DIEA 와 함께 용매를 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하여 조 2m을 수득였으며 추가적인 정제 없이 사용하였다. MS: 549.4 [M+1]+.
H- AA - PABA 3a-h, m 및 H-A- PABA 3j- l 의 제조.
Figure pct00023
조건: (i) DMF 중 Et3N, 10시간.
3i에 대해 상기 기술된 바와 같이 Fmoc-유도체 2a-h, j-l을 DMF 중 Et3N로 처리하고 뒤이어 진공 하에 농축 및 건조하였다. 조 생성물을 DMF에 용해시켜 0.1　M 용액을 만들었고 추가적인 정제 없이 사용하였다.
H-AA-PABA (1-3)의 중간체
A1 A2
1, 2, 3a Gly Gly
1, 2, 3b Glu(2PhiPr) Gly
1, 2, 3c Asn(DMCP) Gly
1, 2, 3d Phe Lys(MMT)
1, 2, 3e Phe Cit
1, 2, 3f Ala Cit
1, 2, 3g Val Cit
1, 2, 3h Ala Asn(DMCP)
1, 2, 3i Lys(CH3)2
1, 2, 3j Leu -
1, 2, 3k Asn(DMCP) -
1, 2, 3l Cit -
2, 3m Phe Lys(CH3)2
Figure pct00024
프로테아제 절단가능한 NAG -차폐제의 제조.
NAG ( R 1 , R 2 , R 3 )-L- AA - PABC - PNP (표 2, 3)의 제조
Figure pct00025
R1, R2 및 R3 는 보호 기이고 L은 갈락토사민 모이어티 (NAG)와 디펩티드 (AA)간의 결합인 NAG(R1,R2,R3)-L-AA-PABC-PNP의 제조는 NHS 에스테르로의 전환 뒤의, H-AA-PABA 2의 아실화에 사용되는 NAG-L-CO2H 산 6, 10a,b,13 및 17 의 제조로부터 시작한다. 염기 민감성 고분자에 대해 디자인된 카보네이트 21a-f에서 고분자의 변형 전에 보호 기를 제거해야 했다. 이러한 목적을 위하여 10a,b,13 및 17의 제조에서 GAL 모이어티 중 Ac-보호 기를 불안정한 트리에틸실릴 (triethylsilyl, TES) 및 tert-부틸디에틸실릴 (tert-butyldimethylsilyl, TBDMS) 기로 대체하였다. 이러한 기는 0 ℃에서 H2O 중 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid, TFA)의 70 % 용액을 이용하여 염기 민감성 PNP-카보네이트 모이어티의 손상 없이 제거할 수 있다.
a) R1=R2=R3=OAc인 NAG-L1-CO2H 6 의 제조에서, Z-보호된 NAG-테트라아세테이트 4 [3-5]를 Z- 탈보호 (H2, Pd/C(10%), MeOH, CHCl3 (20%)하여 NAG-아민 5를 수득하고, 숙신산 무수물 (succinic anhydride) (숙신산 무수물, Et3N, DCM, 1시간)로 아실화시켰다.
Figure pct00026
조건: (i) H2, Pd/C (10%), MeOH, CHCl3, (20%), (ii), 숙신산 무수물 (Succinic anhydride), Et3N, CDM, 1 시간.
NAG-아민 5: 5의 제조를 위하여 MeOH (144　mL) 및 CHCl3 (36 mL) 중의 NAG 4 (6.74 g, 11.85 mmol) 용액을 10% Pd/C (674 mg) 존재 하에 1 atm으로 10 시간 동안 수소화하였다. 촉매제를 셀라이트 (celite)를 통하여 여과하여 버리고, 생성물을 진공 하에 농축 및 건조하였다. 수율 5.04 g (98%).
NAG-L1-OH 6: 6의 제조를 위하여 DCM (30 mL)중의 숙신산 무수물 (966 mg, 9.65 mmol) 용액을 DCM (50 mL) 중의 NAG-아민 5 (4g, 9.15 mmol)에 첨가한 다음 Et3N (1.964 mL, 14 mmol)를 첨가하였다. 1 시간 후 반응 혼합물을 진공 하에 농축 및 건조하였다. 생성물을 컬럼 상에서, CHCl3 중 용출제 구배 MeOH (5-7%), 정제하였다. 수율 3.1 g (63%). MS: 535.3 [M+1]+; 330.3 [탈글리코실화의 생성물]+.
b) 수성 메탄올에서, 트리에틸아민 혼합물 중의 4의 O-탈아세틸화 (deacetylation)에 이어 트리알킬실릴 염화물로 처리하여, 용이하게 제거가능한 실릴 에테르 보호 기를 갖는 NAG 유도체를 제조하였다.
i) NAG-L1-OH 10a,b. 10a: R1=OTES 및 OTBDMS, R2=OH, R3=OTES; 10b: R1=R3= OTBDMS, R2=OH.
NAG 8a,b의 제조.
Figure pct00027
조건: (i) Et3N, MeOH, H2O (5:7:6) 10 시간. (ii) DMF 중 TBDMSCl (1 eq.), 이미다졸, 1시간 뒤이어 TESCl (3 eq.), 10시간. (iii) DMF 중 TBDMSCl (3 eq.), 이미다졸, 10시간.
NAG 유도체 7.
10a,b의 제조.
Figure pct00028
조건: (i) H2, Pd/C (10%), THF. (ii) 숙신산 무수물, Et3N, DCM, 1시간.
7의 제조를 위하여 NAG 4 (2g, 3.52 mmol)를 MeOH (10 mL), H2O (32 mL), 및 Et3N (25 mL) 용액에서 10시간 동안 교반하여 O-탈아세틸화시켰다. 모든 휘발물질을 40 ℃에서 회전증발기 상에서 제거하고 반응 혼합물로부터 톨루엔을 두번 증발시켜 잔여물을 건조하였다. 생성물 7을 후속 단계에서 바로 사용하였다. MS: 544.3 [M+Et3N+1]+; 443.7 [M+1]+; 204 [탈글리코실화의 생성물]+.
8a 의 제조를 위하여 DMF (15 mL) 중 생성물 7 (1.76 mmol)을 이미다졸 (718 mg, 10.54 mmol) 및 TBDMSCl (265 mg, 1.76 mmol)로 처리하고, 2시간 동안 교반하였으며 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각시켰다. TESCl (531 mg, 3.52 mmol)를 첨하가고, 10 시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축 및 건조하였다. 잔여물을 EtOAc (110 mL) 및 H2O (30 mL)의 혼합물에서 취하였다. 유기층을 분리하고 5 ℃냉각하고, 시트르산 (5%), H2O, NaHCO3 으로 세척하고 건조하였다 (Na2SO4). 조 생성물을 컬럼에 CHCl3 중 용출제 MeOH 2%로 관통시켜 TBDMS 및 TES 디 Si-보호된 NAG 유도체 8a의 혼합물을 제공하였다. 수율 575 mg (49%). MS: 672.0 [M+1]+; 432.5 [탈글리코실화의 생성물]+.
8b의 제조를 위하여 DMF (15 mL) 중 7 (1.76 mmol) 용액을 이미다졸 (718 mg, 10.56 mmol) 및 TBDMSCl (1.061 g, 7 mmol) 과 함께 10시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 8a의 제조를 위하여 상기 기술된 바와 같이 처리하였다. 컬럼 정제 후 수율 767 mg (65%). M: 672.0 [M+1]+; 432.7 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 10a는 하기 10b에 기술된 과정으로 TBDMS 및 TES 디 Si-보호된 NAG 유도체의 혼합물로 제조하였다.
10b 의 제조를 위하여 화합물 8b (920 mg, 1.37 mmol)를 Pc/C 10% (150 mg)의 존재 하에 1 atm에서 10 시간 동안 THF (20　mL) 중에서 수소화하였다. 촉매는 셀라이트를 통하여 여과하여 버리고, 생성물 9b 를 진공 하에 농축 및 건조시켰다.
추가적인 정제 없이 NAG-아민 9b를 DCM (12 mL)에 용해시키고, DCM (7 mL) 중 숙신산 무수물 용액 (140 mg, 1.40 mmol)을 가하고 뒤이어 Et3N (0.236mL, 1.676 mmol)를 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전증발기 상에서 제거하고 생성물을 컬럼 상에서 CHCl3 내 용출제 1% AcOH, 10% MeOH로 정제하였다. 수율 614 mg (72%).
ⅱ) NAG-L2-OH 13. R1=R3=OTBDMS, R2=OH. 더 긴 PEG 스페이서를 갖는 NAG 유도체.
더 긴 PEG 스페이서를 갖는 유사체의 경우, 전구체 5를 첫번째 아세틸-탈보호하여 11을 생성하였다 (Et3N, MeOH, H2O (5:7:6) 10 시간). 그 다음 11을 비스-dPEG5 반 (half) 벤질 반 NHS 에스테르 (Quanta product cat. #10237)로 아실화시켜 벤질 에스테르 12 (NHS-PEG5-CO2Bn, Et3N, DCM)를 생성하였다. 이어서 12를 TBDMSCl로 비스-실릴화시키고 (TBDMSCl (3 eq.), 이미다졸, DMF에서 10 시간), 수소첨가로 탈벤질화 (H2, Pd/C (10%), THF)하여 산 13을 수득하였다.
NAG-유도체 12의 제조.
Figure pct00029
조건: (i) Et3N, MeOH, H2O (5:7:6) 10시간. (ii) NHS-PEG5-CO2Bn, Et3N, DCM.
NAG-L2-OH 13의 제조.
Figure pct00030
조건: TBDMSCl (3 eq.), 이미다졸, DMF 내에서 10시간. (vi) H2, Pd/C (10%), THF.
NAG-PEG8-SA 벤질 에스테르 12. NAG-아민 11의 제조를 위하여, 전구체 7에 대해 기술한 바와 같이 (8a,b를 위한 방법) NAG-아민 5 (0.381　mmol)를 O-탈아세틸화시켰다. 생성물 11을 회전증발기 상에서 2번의 톨루엔 증발을 이용하여 건조시키고 DMF (25 mL)에 용해시켰다. 비스-dPEG5 반 벤질 반 NHS 에스테르 (200 mg, 0.381 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고 뒤이어 DIEA (0.079 mL, 0.457 mmol)를 첨가하고, 8시간 동안 교반한 다음 40 ℃/오일 펌프 진공에서 회전증발기 상에서 농축시켰다. 조 생성물 12는 추가적 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. MS: 719.4 [M+1]+; 516.4 [탈글리코실화의 생성물]+ .
NAG-L2-OBn의 제조를 위하여 건조 생성물 12를 DMF (5 mL)에 용해시키고, TBDMSCl (230 mg, 1.524 mmol)로 처리한 다음 뒤이어 이미다졸 (156 mg, 2.29 mmol)을 처리하였다. 반응 혼합물을 10 시간 동안 교반하고, 모든 휘발물질을 40 ℃/오일 펌프 진동에서 회전증발기 상에서 제거하였고 잔여물은 EtOAc (85 mL)내로 취하고 HCl (1%), H2O로 세척하였다. 수상을 모으고 EtOAc로 역 추출하였다. 모아진 유기 용액을 건조시키고(Na2SO4), 농축하고 컬럼상에서 CHCl3 중 용출제 구배 MeOH (3-6%)로 정제하였다. 벤질 에스테르의 수율 291 mg (80 %). MS: 965.3 [M+NH4]+;948.0 [M+1]+; 516.4 [탈글리코실화의 생성물]+.
NAG-L2-OH 13 의 제조를 위하여, 에스테르 NAG-L2-OBn를 9b에 대해 기술한 바와 같이 (10b를 위한 방법) 수소화하였다. 수율 98%. MS: 858.0 [M+1]+; 426.1 [탈글리코실화의 생성물]+. 생성물은 추가적인 정제 없이 사용하였다.
ⅲ) NAG-L3-OH 17. R1=R3=OTBDMS, R2=OH. 더 긴 PEG 스페이서를 갖는 NAG 유도체.
펜타아세테이트 (pentaacetate) 14 [3-5]를 PEG4 모노-tBu 에스테르와 글리코실화 (TMSOTf, DCE / HO-PEG4-CO2tBu, SnCl4, DCM)시켜 15를 생성하는 것으로 17을 제조하였다. 15를 가수분해 (HCO2H, 10 시간)하여 산 16을 수득한 다음 O-탈아세틸화 (Et3N, MeOH, H2O (5:7:6) 10 시간)시키고 TBDMSCl로 처리 (TBDMSCl (3 eq.), 이미다졸, DMF에서 10 시간)하여 비스-실릴화된 NAG-산 17을 수득하였다.
에스테르 NAG(OAc)3-L3-O-tBu 15의 제조.
Figure pct00031
조건: (i) 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트 (trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate, TMSOTf), 디클로로에탄 (dichloroethane, DCE). (ii)
t-부틸 12-히드록시-4,7,10-트리옥사도데카노에이트 (t-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate, HO-PEG4-CO2tBu), SnCl4, 디클로로메탄 (dichloromethane, DCM).
Figure pct00032
조건:(i) HCO2H, 10시간. (ii) Et3N, MeOH, H2O (5:7:6) 10 시간. (iii) TBDMSCl (3 eq.), 이미다졸, DMF 내에서 10 시간.
에스테르 NAG(OAc)3-L3-O-tBu 15의 경우,
갈락토사민 14 (10 g, 25.64　mmol)의 펜트아세틸 (pentacetyl) 유도체를 톨루엔으로부터 2번의 증발을 통하여 건조하였다. 결과로 생긴 백색 유리를 DCE (223 mL) 중 TMSTf (5.18 mL, 28.6 mmol)로 처리하고 60 ℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각하고, TEA (2.6 mL)로 반응을 종결시키고, CHCl3 (300 mL)로 희석하고 NaHCO3 용액 및 염수로 2회 세척하였다. 분리된 유기 용액에 MgSO4를 처리하고, 농축시키고, 진공 하에 건조하였다. 조 옥사졸린 유도체는 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수율 8.14 g (96%). MS: 368.1 [M+K]+; 352.2 [M+Na]+; 330.2 [M+1]+.
DCM (270 mL) 중의 옥사졸린 유도체 (5.28 g, 16 mmol), t-부틸 12-히드록시-4,7,10-트리옥사도데카노에이트 (t-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) (5.12g, 18.4 mmol) 및 CaSO4 (20g)의 교반 혼합물에 SnCl4 (0.84 mL, 0.84 mmol)을 점적 첨가하였다. 용액을 16 시간 동안 교반하고, 여과하고, CHCl3 (250 mL)로 희석하고, NaHCO3 용액 및 염수로 2회 세척하였다. 생성물을 MgSO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조 생성물을 컬럼 상에서 에틸 아세테이트 중 용출제 구배 MeOH (0-7 %)로 정제하였다. 수율 4.83 g (50%). MS: 630.8 [M+Na]+; 625.5 [M+NH4]+; 608.4 [M+1]+; 552.6 [M-t-Bu+1]+; 330.2 [탈글리코실화의 생성물]+.
NAG(OAc)3-L3-OH 16의 경우, tert-부틸 에스테르 15 (1.99 g, 3.27 mmol)를 깨끗한 포름산 (54 mL)에서 16 시간 동안 교반하고 모든 휘발물질을 진공 하에 제거한 다음 3번의 톨루엔의 증발을 수행하였다. 생성물을 진공 오일 펌프로 2 시간 동안 건조하고 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수율 1.77 g (98%). MS: 330.2 [탈글리코실화의 생성물]+; 590.4 [M+K]+; 574.6 [M+Na]+; 569.6 [M+NH4]+; 552.6 [M+1]+.
NAG(R1,R2,R3)-L3-OH 17 (R1=R3=OTBDMS, R2=OH)의 경우, 생성물 16을 O-탈아세틸화하고, 8b의 제조와 같이 TBDMSCl로 처리하고 컬럼상에서 CHCl3 중 용출제 3% MeOH, 0.5 % AcOH로 정제하였다. 수율 18 %. MS: 1228.7 [M+1]+, 796.7 [탈글리코실화의 생성물]+.
수득된 5개의 산 6, 10a,b, 13, 17 모두를 NHS 및 DCC와 반응 (NHS, DCC, DCM, 10 시간)시켜 NHS 에스테르 18a-e로 전환하였다.
Figure pct00033

조건: (i) NHS, DCC, DXCM, 10 시간.
NAG-L-NHS의 제조를 위하여, 하기 18c에 대해 기술된 방법을 18a-e에 이용하였다. 생성물 18c의 경우, DCM (15　mL) 중의 10b (614 mg, 0.964 mmol) 및 NHS (122　mg, 1.061　mmol)의 차가운 용액을 DCC (219　mg, 1.061　mmol)로 처리하고, 얼음 상에서 30분간 교반하고 20 ℃에서 8 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, DCU 를 여과하여 버리고, 잔여물을 농축하고 진공 하에 건조하였다. 조 생성물을 DMF에 용해시켜 0.05 M 용액을 만들었고, 추가적 정제없이 사용하였다.
생성물 18b-e 을 18a에 기술한 바와 같이 제조하였다.
c) 20a-l의 형성, 3a-h를 하이드록실-보호된 NAG-유도체 18a-e의 NHS 에스테르로 아실화시켜 19a-l를 제공하였다 (DIEA, DMF, 5-10 시간). 그 다음 생성물 19a-l를 5 당량의 비즈(p-니트로페닐) 카보네이트로 처리 ((PNP)2CO) ((PNP)2CO, 디옥산 또는 DCM, 40-50 ℃, 15-24 시간) 하여 O-아세틸 보호된 PNP 카보네이트 유도체 20a-l를 생성하였다. 생성물 20a- e 를 펩티드의 변형에 바로 사용하였다. 아미노산으로부터의 아세틸기 및 보호 기 2PhiPr, DMCP, MMT는 TFA 및 Et3N로 DPC의 연속적인 처리 동안 후속 변형으로 제거하였다.
Figure pct00034
조건: (i) DIEA, DMF, 5-10 시간. (ii) (PNP)2CO, 디옥산 또는 DCM, 25-60℃, 16-48 시간.
NAG(R1R2R3)-L-AA-PABA 19a-l.
생성물 19a (R1=R2=R3=OAc, L=L1, AA=GlyGly)의 경우, DMF (0.05M) 중의 NAG-NHS 에스테르 18a 용액을 DMF 중 3a (0.282　mmol)의 0.1 M의 용액 및 DIEA (59　㎕, 0.338 mmol)로 처리하였다. 3 시간 내로 모든 휘발물질을 40 ℃/오일 펌프 진공에서 회전증발기 상에서 제거하고 Et2O로 배산하고 컬럼상에서 EtOAc:CHCl3:MeOH=8:7:5-8:7:6의 용출제:구배로 정제하였다. 수율 114 mg (53%). MS: 754.4 [M+1]+.
생성물 19b (R1=R2=R3=OAc, L=L1, AA=Glu(2PhiPr)Gly)를 19a에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 컬럼상에서 EtOAc:CHCl3:MeOH=8:7:3 용출제로 정제하였다. 수율 64%. MS: 944.5 [M+1]+.
생성물 19c (R1=R2=R3=OAc, L=L1 AA=Asn(DMCP)Gly)의 경우, DMF (2.15 mL) 중 3c (0.43　mmol) 및 DIEA (83 ㎕, 0.476 mmol)의 용액에 DMF (2.15 mL) 중 18a (0.43 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 교반하고, 여과한 다음 모든 휘발물질을 40 ℃/오일 펌프 진공에서 회전증발기 상에서 제거하였다. 조 생성물을 Et2O로 배산하고 컬럼상에서 용출제 CHCl3:아세톤:MeOH (5:5:1)로 정제하였다. 수율 242 mg (62%). MS: 915.3 [M+Na]+; 910.6 [M+NH4]+; 893.6 [M+1]+.
생성물 19d (R1=R2=R3=OAc, L=L1 AA=PheLys(MMT))를 19a에 대해 기술한 바와 같이 제조하고, 컬럼상에서 CHCl3 중 용출제 구배 MeOH (5-6%)로 정제하였다. 수율 56%. MS: 1187.9 [M+1]+.
생성물 19e (R1=R2=R3=OAc, L=L1, AA=PheCit)의 경우, DMF (3 mL) 중 3e (0.57 mmol) 및 DIEA (119 ㎕, 0.684 mmol)의 용액에 DMF (3 mL) 중 18a (0.57 mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 16 시간 동안 교반하고, 여과한 다음 모든 휘발물질을 40 ℃/오일 펌프 진공에서 회전증발기 상에서 제거하였다. 조 생성물을 CHCl3:MeOH (5 mL)로부터 Et2O (45　mL) 중에서 배산하고 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수율 392　mg (73%). MS: 966.8 [M+Na]+; 944.7 [M+1]+; 926.8 [M-H2O]+; 821.5 [M-PABA+1]+; 615.6 [M-NAcGal+1]+; 492.3 [M-PABA-NAcGal+1]+.
생성물 19f (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L1, AA=AlaCit)은 19e에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수율 50%. MS: 993.2 [M+Na]+; 971.0 [M+1]+; 539.6 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 19g (R1=R3=OTBDMS, R2=OH L=L1, AA=ValCit)은 19f에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 수율 67%: 998.9 [M+1]+.
생성물 19h (R1=R3=OTBDMS, R2=OH L=L1, AA=Glu(2PhiPr)Gly)은 19a에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 컬럼상에서 DCM 중 NH4OH 3% 및 MeOH 7.5%의 용출제 용액으로 정제하였다. 수율 15%. MS: 1047.2 [M+1]+, 615.7, 432.6 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 19i (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L1, AA=PheCit)은 19e의 제조에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수율 50%. MS: 1068.7 [M+Na]+; 1047.3 [M+1]+; 615.4 [탈글리코실화의 생성물]+; 432.5 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 19j (R1=OTBDMS 및 OTES, R2=OH, R3=OTES, L=L1, AA=PheCit)은 3e 및 18b로부터 C-3 및 C-6 O-TBDMS 및 O-TES 보호된 NAG 유도체의 혼합물로서 19e 의 제조에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 수율 76%. MS: 1047.4 [M+1]+, 615.8 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 19k (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L2, AA=PheCit)는 19e에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 수율 67%: 1268.2 [M+1]+; 835.9 [탈글리코실화의 생성물]+ .
생성물 19l (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L3, AA=PheCit)은 19e에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 컬럼 상에서, 용출제 CHCl3 중 5% MeOH 용액으로 정제하였다. 수율 60%. MS: 1064.0 [M+1]+; 632.7 [탈글리코실화의 생성물]+.
NAG-AA-PABC-PNP 20a-l
생성물 20a (R1=R2=R3=OAc, L=L1, AA=GlyGly)의 경우, 디옥산 (5　mL) 중의 19a (100 mg, 0.132　mmol), (PNP)2CO (202 mg, 0.663 mmol) 및 DIEA (0.07 mL, 0.396 mmol)의 현탁액을 40 ℃에서 8시간 동안 어두운 곳에서 교반하였다. (PNP)2CO (121 mg, 0.397　mmol) 및 DIEA (0.04 mL, 0.226 mmol)의 또 다른 부분을 첨가하고 8 시간 동안 40 ℃에서 또 다른 교반을 계속하였다. 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 제거하였고 생성물을 컬럼상에서 용출제: CHCl3:EtOAc:MeOH=7:8:3로 정제하였다. 수율 84 mg (69%).
생성물 20b (R1=R2=R3=OAc, L=L1, AA=Glu(2PhiPr)Gly)의 경우, DCM (10　mL) 중의 19b (160　mg, 0.169 mmol), (PNP)2CO (258 mg, 0.847 mmol) 및 DIEA (0.09 mL, 0.507　mmol)의 용액을 어두운 곳에서 10 시간 동안 교반하고, 회전증발기 상에서 농축하였고 생성물은 컬럼상에서 용출제: CHCl3 중 5-6% MeOH로 정제하였다. 수율 174 mg (92%).
생성물 20c (R1=R2=R3=OAc, L=L1 AA=Asn(DMCP)Gly)의 경우, DCM (5　mL) 중 19c (127　mg, 0.142 mmol), (PNP)2CO (216 mg, 0.710 mmol) 및 DIEA (74 ㎕, 0.426 mmol)의 용액을 어두운 곳에서 16 시간 동안 교반하고, 회전증발기 상에서 농축하였고 생성물을 컬럼 상에서, 용출제: CHCl3:EtOAc:MeOH (7:2.2:0.8)로 정제하였다. 수율 110.6　mg (74%). MS: 1080.9 [M+Na]+; 1058.7 [M+1]+.
생성물 20d (R1=R2=R3=OAc, L=L1 AA=PheLys(MMT))는 20b에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 컬럼 상에서, 용출제: CHCl3:EtOAc:MeOH= 9:7:1 로 정제하였다. 수율 76 mg (47%).
생성물 20e (R1=R2=R3=OAc, L=L1, AA=PheCit)의 경우, 디옥산 (17　mL) 중 19e (164 mg, 0.173　mmol), (PNP)2CO (528　mg, 1.73　mmol) 및 DIEA (182　㎕, 1.04　mmol)의 용액을 어두운 곳에서 16 시간 동안 60 ℃에서 교반하고 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 제거하였다. 잔여 DIEA는 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 DMF의 2회 연이은 증발을 이용하여 제거하였고 생성물을 컬럼상에서, 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH (8:1.5:0.5) 뒤이어 CHCl3:MeOH (7:1)로 정제하였다. 수율 85　mg (44%). MS: 1132.0 [M+Na]+; 1110.1 [M+1]+; 780.8 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 20f (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L1, AA=AlaCit)는 20e에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 컬럼 상에서 용출제: CHCl3:EtOAc:MeOH=9:10:1로 정제하였다. 수율 153　mg (36%).
생성물 20g (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L1, AA=ValCit)는 20e에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 컬럼 상에서 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH=16:3:1로 정제하였다. 수율 44%. MS: 1164.5 [M+1]+.
생성물 20h (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L1, AA=Glu(2PhiPr)Gly)는 20b에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 컬럼 상에서 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH=8:7:1로 정제하였다. 수율 77%.
생성물 20i (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L1, AA=PheCit)의 경우, 디옥산 (7　mL) 중 19i (316　mg, 0.297 mmol), (PNP)2CO (913mg, 2.97 mmol) 및 DIEA (310 ㎕, 1.78 mmol)의 용액을 어두운 곳에서 40 시간 동안 65 ℃에서 교반하였고 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 제거하였다. 잔여 DIEA는 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 DMF의 2회 연이은 증발을 이용하여 제거하였고 생성물은 컬럼 상에서 용출제: CHCl3:EtOAc:MeOH (8:1.5:0.5) 뒤이어 CHCl3:MeOH (92:08)로 정제하였다. 수율 297 mg (81%). MS: 1246.7 [M+NH4]+; 1228.7 [M+1]+; 797.6 [탈글리코실화의 생성물] +; 432.7 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 20j (R1=OTBDMS and OTES, R2=OH, R3=OTES, L=L1, AA=PheCit)의 경우, C-3 및 C-6 O-TBDMS 및 O-TES 보호된 NAG 유도체로서의 생성물 20j는 20e에 대해 기술한바와 같이 제조하고 컬럼 상에서, 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH=16:3:1 뒤이어 CHCl3 중 10% MeOH로 정제하였다. 수율 50%. MS: 1212.0 [M+1]+, 480.0 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 20k (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L2, AA=PheCit)을 20e에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 컬럼상에서, CHCl3 중 MeOH (8-10%)의 용출제 구배로 정제하였다. 수율 85%. 생성물은 바로 다음 단계에서 사용하였다.
생성물 20l (R1=R3=OTBDMS, R2=OH, L=L3, AA=PheCit)의 경우, 디옥산 (8　mL) 중의 19l (316 mg, 297　mmol), (PNP)2CO (912 mg, 3 mmol) 및 DIEA (0.31 mL, 1.78 mmol)의 용액을 Ar 하의 어두운 곳에서 48시간 동안 60 ℃에서 교반하였다. 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 제거하였고 생성물은 컬럼 상에서 용출제: CHCl3:EtOAc:MeOH=16:3:1로 정제하였다. 수율 297 mg (81 %).
NAG-L-AA-PABC-PNP 21a-f (R1=R2=R3=OH), 20f-l의 탈보호
21a-f의 형성. 염기 민감성 폴리아크릴레이트의 변형의 경우, 20f-l를 TFA:H2O=3:1의 혼합물로 처리하여 (TFA/H2O=3:1, 5 ℃, 2-3시간) NAG 상의 보호 기 및 디펩티드 AA를 고분자로의 결합 전에 제거하여 NAG-디펩티드 차폐제 21a-f를 제공하였다.
Figure pct00035
조건: TFA/H2O=3:1, 5 ℃, 2-3 시간
생성물 21a (AA=AlaCit, L=L1)의 경우, 화합물 20f (150 mg, 0.132 mmol)를 차가운 TFA:H2O=3:1 용액 (2 mL)중에서 4 시간 동안 교반하면서 Et2O (20 mL)를 점적 첨가하였다. 침전물을 분리하여 회전증발기/30 ℃ 상에서 톨루엔을 증발시키고 진공 하에서 건조하였다. 수율 112 mg (94%). MS: 907.2 [M+1]+; 704.4 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 21b (AA=ValCit, L=L1)의 경우, 화합물 20g (305 mg, 0.26 mmol)을 차가운 TFA:H2O=3:1 용액 (5　mL)중에서 1시간 동안 교반하고 교반하면서 Et2O (45 mL)에 점적 첨가하였다. 고체 생성물을 분리하고 회전증발기/30 ℃ 상에서 톨루엔을 증발시키고 진공 하에서 건조하였다. 수율 193 mg (79%). MS: 935.8[M+1]+, 732.7 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 21c (AA=GluGly, L=L1)은 21b에 대해 기술된 바와 같이 제조하였다. 수율 55 mg (98 %). MS: 865.5 [M+1]+, 662.3 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 21d (AA=PheCit, L=L1)을 21b에 대해 기술된 바와 같이 제조하였다. MS: 983.7 [M+1]+, 780.9 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 21e (AA=PheCit, L=L2)의 경우, 21b에 대해 기술한 조건 하에서 화합물 20k를 차가운 TFA:H2O=3:1 용액 (5　mL) 중에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 수율 25% 19k로부터 계산. MS: 1203.9 [M+1]+, 1001.0 [탈글리코실화의 생성물]+.
생성물 21f (AA=PheCit L=L3)은 21b에 대해 기술한 조건 하에서 3 시간 탈보호를 이용하여 20l로부터 제조하였다. 수율 75%. MS: 1203.9 [M+1]+, 1001.0 [탈글리코실화의 생성물]+.
중간체 NAG-L-AA-PABA (19) 및 NAG-L-AA_PABC (20)
화합물 A1 A2 L R1 R2 R3
19a Gly Gly L1 OAc OAc OAc
19b Glu(2PhiPr) Gly L1 OAc OAc OAc
19c Asn(DMCP) Gly L1 OAc OAc OAc
19d Phe Lys(MMT) L1 OAc OAc OAc
19e Phe Cit L1 OAc OAc OAc
19, 20f Ala Cit L1 OTBDMS OH OTBDMS
19, 20g Val Cit L1 OTBDMS OH OTBDMS
19, 20h Glu(2PhiPr) Gly L1 OTBDMS OH OTBDMS
19, 20i Phe Cit L1 OTBDMS OH OTBDMS
19, 20j Phe Cit L1 OTBDMS, TES OH OTES
19, 20k Phe Cit L2 OTBDMS OH OTBDMS
19, 20l Phe Cit L3 OTBDMS OH OTBDMS
DPC 제조를 위해 사용되는 최종 NAG-L-A1A2-PABC (20, 21)
화합물 A1 A2 L
20a Gly Gly L1
20b Glu Gly L1
20c Asn Gly L1
20d Phe Lys L1
20e Phe Cit L1
21a Ala Cit L1
21b Val Cit L1
21c Glu Gly L1
21d Phe Cit L1
21e Phe Cit L2
21f Phe Cit L3
프로테아제 절단가능한 PEG -차폐제의 제조.
H-AA-PABA 3b,e,g,h,j,k-m의 어느 아미노기를 PEG-산의 NHS 에스테르로 아실화하여 (DIEA, DMF, 5-10 시간) 22a-k를 생성하였다. 그 다음 생성물 22a-k의 히드록실 기를 p-니트로페닐 카보네이트로 전환하여 ((PNP)2CO, 디옥산 또는 THF, 40-60 ℃, 10 시간) 23a-k를 생성하였다. 23a,d,g의 경우, Asn 및 Glu로부터의 보호 기를 수성 TFA를 처리함으로써 제거하여 (TFA/H2O=3:1, 5 ℃, 2-3h) 원하는 생성물 24a- c 를 수득하였다. (23a, d, g 를 24a, d, g로 전환함으로써 일관성을 유지할 수 있는가?) 또한, NAG와 PEG 형태 사이의 각각의 문자에 대해 아미노산 간의 일관성이 있는가?
PEGn-AA-PABA 22a-k의 제조.
Figure pct00036
조건: (i) DIEA, DMF, 5-10 시간.
생성물 22a (n=11, AA=GluGly). DMF (3.5 mL, 0.35 mmol) 중의 3b 의 0.1M 용액을 PEG11-NHS ester (240 mg, 0.35 mmol) 및 DIEA (0.061 mL, 0.35　mmol)와 함께 10 시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프에서 제거하였고 생성물을 컬럼 상에서 용출제: CHCl3:MeOH:AcOH=38:2:1로 정제하였다. 수율 274 mg (78%) MS: 1015.6 [M+NH4]+, 998.7 [M+1]+.
생성물 22b (n=11, AA=PheCit). DMF (3 mL) 중 3e (0.88 mmol) 및 DIEA (167 ㎕, 0.96　mmol)의 용액에 DMF (3　mL) 중 PEG11-NHS 에스테르 (0.80 mmol)용액을 첨가하였다. 혼합물을 16 시간 동안 교반하고, 여과한 다음 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 40℃/오일 펌프 진공에서 제거하였다. 조 생성물은 CHCl3:MeOH (5　mL)으로부터 Et2O (45 mL)중으로 배산하고, 컬럼상에서, CHCl3 중 MeOH (10-16%)의 용출제 구배로 정제하였다. 수율 420　mg (53%). MS: 1015.9 [M+H2O]+; 998.8 [M+1]+; 981.1 [M-H2O]+.
생성물 22c (n=11, AA=ValCit). 생성물 22f를 22a에 대해 기술한 바와 같이, 조 3g (300　mg, 0.5 mmol의 2g로부터 수득한), PEG11-NHS 에스테르 (298 mg, 0.435 mmol) 및 DIEA (0.09 mL, 0.522　mmol) 로부터 제조하였다. 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프에서 농축 한 후에 생성물을 MeOH:DCM=1:1 혼합물 (6 mL) 에서 현탁시키고, 초음파 처리하고, 여과하고 Et2O (50 mL) 내에서 침전시켰다. 고체를 분리하고 과정을 다시 반복하였다. 잔여 용매를 진공 하에 제거하였다. 수율 283 mg (60%). MS: 951.5 [M+1]+.
생성물 22d (n=11, AA=AlaAsn(DMCP)). DMF (3 mL)중의 3h (0.56 mmol) 및DIEA (116 ㎕, 0.67 mmol)의 용액에 DMF (3 mL) 중 PEG11-NHS 에스테르 (0.56　mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 교반하고, 여과한 다음 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하였다. 잔여물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5 mL)에 용해시키고 냉각된 (0 ℃) Et2O (45 mL) 내에서 침전시켰다. 고체를 컬럼 상에서, DCM 중 MeOH (3-14%)의 용출제 구배로 정제하였다. 수율 261　mg (49%). MS: 983.7 [M+Na]+; 979.1 [M+NH4]+; 961.8 [M+1]+; 943.9 [M-H2O+1]+.
생성물 22e (n=11, AA=PheLys(Me2)). 생성물 22e 는 22a에 대해 기술한 바와 같이 제조하였다. HPLC 컬럼 Nucleodur C-18 (250×4.6, 용출제 ACN-H2O (0.1% TFA), 램프 15-30 %)을 이용하여 정제하였다. MS: 998.1 [M+1]+. 분리된 생성물을 Dowex 1×8 수지 상에서 용출제 H2O로 탈염시켰다. 수율 40%.
생성물 22f (n=11, AA=Leu). 생성물 22f를 22a에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 컬럼상에서 용출제: CHCl3:EtOAc:MeOH:AcOH=9:7:2:0.04로 정제하였다. 수율 48%. MS: 824.9 [M+NH4]+.
생성물 22g (n=11, AA=Asn(DMCP). 조 3k (obtained from 419 mg, 0.77 mmol 의 2k로부터 수득한), Peg11NHS 에스테르 (200 mg, 0.292 mmol) 및 DIEA (0.06 mL, 0.35 mmol)를 DCM (5 mL)에서 10시간 동안 교반하였다. 용매를 회전증발기 상에서 제거하였고 생성물을 컬럼 상에서 용출제 HCl3:EtOAc:MeOH AcOH=4.5:3.5:1:0.02로 정제하였다. 수율 254 mg (37%). MS: 891.1 [M+1]+.
생성물 22h (n=11 AA=Cit). DMF (2.5 mL) 중의 3l (0.50 mmol) 및 DIEA (104 ㎕, 0.60　mmol)의 용액에 DMF (2.5 mL) 중의 PEG11-NHS 에스테르 (0.50 mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 16 시간 동안 교반하고, 여과한 다음 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하였다. 잔여물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5 mL)에 용해시키고 Et2O (45 mL) 내에서 침전시켰다. 침전을 2회 더 반복하였고 생성물은 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수율 340 mg (80%). MS: 869.4 [M+NH4]+; 851.9 [M+1]+.
생성물 22i (n=23, AA=PheCit). DMF (3 mL) 중의 3e (0.72 mmol) 및 DIEA (130 ㎕, 0.74　mmol)의 용액에 DMF (3　mL) 중의 PEG23-NHS 에스테르 (0.60 mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 교반하고, 여과한 다음 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하였다. 잔여물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5 mL)에 용해시키고 Et2O (45 mL) 내에서 침전시켰다. 고체 생성물을 컬럼상에서, CHCl3 중의 MeOH (7-12%)의 용출제 구배로 정제하였다. 수율 487 mg (53%). MS: 1555.2 [M+Na]+; 1544.7 [M+NH4]+;1527.7 [M+1]+.
생성물 22j (평균 MW 1000의 PEG. AA=PheCit). mPEG-1000-알코올 (Fluka) (0.173g, 0.173 mmol), N,N-디숙신이미딜 카보네이트 (N,N-disuccinimidyl carbonate) (62 mg, 0.242　mmol), 및 TEA (0.101 mL, 0.726 mmol)의 혼합물을 MeCN (1 mL)에서 16시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 제거하였고 조 잔여물을 CHCl3 (10 mL)에 용해시켰다. 유기층을 H2O (1 mL, pH=5)로 세척한 다음 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 농축하여 PEG-1000-NHS 카보네이트를 제공하였다. 이 생성물을 DMF (1 mL) 중의 3e (0.121 mmol) 및 DIEA (30 ㎕, 0.173 mmol)과 함께 16 시간 동안 교반하고, 여과한 다음 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하였다. 잔여물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5 mL)에 용해시키고 Et2O (45 mL)내에서 침전시켰다. 침전을 2 회 더 반복하였으며 생성물은 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수율 134 mg (79%).
생성물 22k (n=23, AA=ValCit). DMF (4 mL) 중의 3g (1.0 mmol) and DIEA (183 ㎕, 1.04　mmol)의 용액에 DMF (4 mL) 중의 PEG23-NHS 에스테르 (0.87 mmol)용액을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 교반하고, 여과한 다음 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 40℃/오일 펌프 진공에서 제거하였다. 잔여물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5 mL)에 용해시키고 Et2O (45 mL)내에서 침전시켰다. 침전을 2 회 더 반복하였으며 생성물은 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수율 1.0 g (77%). MS: 1496.1 [M+NH4]+;1479.3 [M+1]+.
PEG-AA-PABC-PNP 23a-k
Figure pct00037
조건: (i) (PNP)2CO, 디옥산 또는 THF, 40-60 ℃, 10 시간.
생성물 23a (n=11, AA=Glu(2PhiPr)Gly)의 경우, DCM (15 mL) 중의 생성물 22a (274 mg, 0.274 mmol)를 어두운 곳에서 (PNP)2CO (418 mg, 1.372 mmol) 및 DIEA (0.143 mL, 0.823 mmol)와 함께 15시간 동안 교반하였다. 용매를 회전증발기 상에서 제거하였고 생성물을 컬럼 상에서, 용출제 CHCl3 중 4% MeOH, 0.2%AcOH로 정제하였다. 수율 260 mg (81%). MS: 1180.7 [M+NH4]+ .
생성물 23b (n=11, AA=PheCit)의 경우, 디옥산 (4 mL) 중의 22b (419 mg, 0.42 mmol), (PNP)2CO (766　mg, 2.52 mmol) 및 DIEA (263 ㎕, 1.52 mmol)의 용액을 어두운 곳에서 50 ℃에서 15 시간 동안 교반하였고, 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 제거하였다. 잔여 DIEA는 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 2회 연이은 DMF의 증발로써 제거하였고 생성물을 컬럼 상에서 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH (4.5:5:0.5) 뒤이어 CHCl3:MeOH (9:1)로 정제하였다. 수율 390 mg (80%). MS: 1181.2 [M+NH4]+,1164.2 [M+1]+.
생성물 23c (n=11, AA=ValCit)의 경우, 1,4-디옥산 (22 mL)중의 22c (273 mg, 0.287 mmol), (PNP)2CO (874 mg, 2.88 mmol) 및 DIEA (0.3 mL, 1.72 mmol)의 용액을 어두운 곳에서 24시간 동안 50 ℃에서 교반하였다. 용매를 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프에서 제거하였고 생성물은 컬럼상에서 용출제 : CHCl3:EtOAc:MeOH=16:3:1 뒤이어 CHCl3 중 12-15 % MeOH로 정제하였다. 수율 163 mg (51%). MS: 1116.0 [M+1]+.
생성물 23d (n=11, AA=AlaAsn(DMCP))를 23b의 제조에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 생성물을 컬럼상에서, 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH (9:2:1)로 정제하였다. 수율 77%. MS: 1144.0 [M+NH4]+; 1127.3 [M+1]+.
생성물 23e (n=11, AA=PheLys(Me)2)는 23a에 대해 기술한 바와 같이 제조하였으며, 컬럼상에서, 용출제: CHCl3 중 10% MeOH, 0.2%AcOH로 정제하였다. 수율 63%. MS: 1163.1 [M+1]+ .
생성물 23f (n=11, AA=Leu)는 단지 5 당량의 (PNP)2CO 및 3 당량의 DIEA를 이용하여 24시간 동안 열을 가하여 23c에 대해 기술한 바와 같이 제조하였다. 생성물은 컬럼 상에서, CHCl3 중의 MeOH (7-12%) 용출제 구배로 정제하였다. 수율 75%. MS: 972 [M+1]+.
생성물 23g (n=11, AA=Asn(DMCP))는 23f에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 조 생성물을 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. MS: 1073.4 [M+18]+.
생성물 23h (n=11, AA=Cit)의 경우, DCM (4 mL) 중의 22h (340 mg, 0.40 mmol), (PNP)2CO (608　mg, 2.00 mmol) 및 DIEA (208 ㎕, 1.20 mmol)의 용액을 어두운 곳에서 30 ℃에서 15 시간 동안 교반하였고, 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 제거하였다. 잔여 DIEA는 회전증발기 상에서 40℃/오일 펌프 진공에서 2회 연이은 DMF의 증발로 제거시키고 생성물은 컬럼상에서 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH (7:2.5:0.5) 뒤이은 CHCl3 중의 MeOH (8-14%) 구배로 정제하였다. 수율 390 mg (80%). MS: 1034.3 [M+NH4]+; 1016.9 [M+1]+.
생성물 23i (n=23, AA=PheCit)는 23b에 대해 기술한 바와 같이 제조하였고, 컬럼 상에서, 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH (4.5:5:0.5) 및 뒤이은 CHCl3 중 MeOH (6-12%)의 구배로 정제하였다. 수율 86%. MS: 1711.4 [M+NH4]+; 1694.4 [M+1]+.
생성물 23j (PEG 1000K AA=PheCit)는 23b에 대해 기술한 바와 같이 제조하였고 컬럼상에서, 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH (4.5:5:0.5) 및 뒤이은 CHCl3 중 MeOH (6-12%)의 구배로 정제하였다. 수율 72%.
생성물 23k (n=23, AA=ValCit)은 23b의 제조에서 기술한 바와 같이 제조하였으며, 생성물은 HPLC로 정제하였다. 컬럼: Luna (Phenomenex) 5u, C-8, 100 A. 이동상:ACN-H2O (F3CO2H 0.01%), ACN 구배 30-37%, 31분. 수율: 530 mg (48%). MS: 1666.4 [M+Na]+;1644.2 [M+1]+.
PEG-AA-PABC-PNP 24a-c, AA 탈보호.
Figure pct00038
조건: (i) TFA/H2O=3:1, 5 ℃, 2-3 시간.
생성물 24a (n=11, AA=GluGly). 생성물 23a (250 mg, 0.215 mmol)를 CHCl3 (16 mL) 의 3% TFA 용액에서 35분간 교반하고, 회전증발기 상에서 농축하고 진공 하에 건조시켰다. 수율 224 mg (100%) (MS: 1062.6 [M+NH4]+ .; 1045.9 [M+1]+.
생성물 24b (n=11, AA=AlaAsn-PABC-PNP). 화합물 23d를 TFA:DCM (3:1)의 혼합물에서 1.5 시간동안 교반하였고, 모든 휘발물질은 회전증발기 상에서 20℃에서 제거하였다. 생성물을 컬럼상에서, CHCl3 중의 MeOH (6-12%)의 용출제 구배로 정제하였다. 수율 30%. MS: 1066.7 [M+Na]+, 1062.0 [M+NH4]+; 1045.2 [M+1]+.
생성물 24c (n=11, AA=Asn). 23g (160 mg, 0.143 mmol)를 포함하는 반응 플라스크를 0 ℃로 냉각시키고 TFA:H2O (9:1)의 차가운 혼합물을 (12.5 mL) 첨가하였다. 혼합물을 1.5 시간동안 교반하고 차가운 H2O (50 mL)로 희석시켰다. 교반을 20 ℃에서 20분간 지속하였다. 침전물을 여과하여 버리고 H2O로 씻어내었다. 모든 휘발물질을 회전증발기 상에서 40 ℃에서 제거하였고 생성물은 컬럼상에서, 용출제 CHCl3:EtOAc:MeOH:AcOH= 4.5:3.5:1.2:0.02로 정제하였다. 수율 43 mg (30%). MS: 974.0 [M+1]+.
DPC 제조에 사용되는 최종 PEG-L-A1A2-PABC.
화합물 AA 크기
PEGn-AA-PABA PEGn-AA-(PNP) A1 A2
22 23a Glu(2PhiPr) Gly n = 11
22 23b Phe Cit n = 11
22 23c Val Cit n = 11
22 23d Ala Asn(DMCP) n = 11
22 23e Phe Lys(CH3)2 n = 11
22 23f Leu - n = 11
22 23g Asn(DMCP) - n = 11
22 23h Cit - n = 11
22 23i Phe Cit n = 23
22 23j Phe Cit 1 kDa
22 23k Val Cit n = 23
24a Glu Gly n = 11
24b Ala Asn n = 11
24c Asn - n = 11
실시예 2. 프로테아제 절단가능한 차폐제의 아민-함유 고분자로의 결합 - p-아실아미도벤질 카바메이트 (p- acylamidobenzyl carbamate ) 결합의 형성.
A. 프로테아제 절단가능한 차폐제를 이용한 멜리틴의 변형.
2-6×mg의 아민-반응성 p-니트로테밀 카보네이트 또는 NAG-함유 프로테아제 절단가능한 물질의 N-히드록시숙신이미드 카보네이트 유도체의 첨가로 1×mg의 멜라틴 펩티드 및 1-10 mg/mL 펩티드에서의 10×mg의 HEPES 염기를 차폐하였다. 그 다음 용액을 동물에 주사하기 전에 1 시간 이상 실온 (room temperature, RT)에서 배양하였다.
B. 프로테아제 절단가능한 차폐제를 이용한 폴리아민의 변형.
p-아실아미도벤질 알코올 유도체의 활성화된 (아민 반응성) 카보네이트를 양극성 막 활성 폴리아민의 아미노기와 H2O 중에서 pH>8 에서 반응시켜 p-아실아미도벤질 카바메이트를 생성하였다.
Figure pct00039
R1은 ASGPr 리간드 (보호되거나 또는 보호되지 않은) 또는 PEG를 포함하고,
R2는 양극성 막 활성 폴리아민이며,
AA는 디펩티드 (보호되거나 또는 보호되지 않은)이고,
Z는 아민-반응성 카보네이트이다.
×mg 고분자에 12×mg의 등장성 글루코오스 중 HEPES 유리 염기룰 첨가하였다. 완충된 고분자 용액에 DMF 중 2× 내지 16×mg 200 mg/ml 디펩티드 차폐제를 첨가하였다. 일부 적용에서, 고분자를 2×디펩티드 차폐제를 이용하여 변형시킨 다음 siRNA를 결합시켰다. 그 다음 고분자-siRNA 컨쥬게이트를 6× 내지 8× 디펩티드 차폐제로 더 변형시켰다.
실시예 3. siRNAs .
siRNA는 하기의 서열을 가졌다:
인자 VII siRNA
센스: (Chol)-5' GfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT) 3' (서열번호 1)
안티센스: 5' pdTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT 3' (서열번호 2)
또는
센스: 5' GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT 3' (서열번호 3)
안티센스: 5' GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT 3' (서열번호 4)
또는
센스: (NH2C6)GfuUfgGfuGfaAfuGfgAfgCfuCfaGf(invdT) 3' (서열번호 5)
안티센스: pCfsUfgAfgCfuCfcAfuUfcAfcCfaAfcdTsdT 3' (서열번호 6)
또는
센스: 5'(NH2C6)uGuGfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT) 3' (서열번호 23)
안티센스: 5' pdTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT 3' (서열번호 24)
인자 VII siRNA (영장류)
센스: (chol)-5' uuAGGfuUfgGfuGfaAfuGfgAfgCfuCfaGf(invdT) 3' (서열번호 7)
안티센스: 5' pCfsUfgAfgCfuCfcAfuUfcAfcCfaAfcdTsdT 3' (서열번호 8)
ApoB siRNA:
센스: (cholC6SSC6)-5' GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA 3' (서열번호 9)
안티센스: 5' uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU 3' (서열번호 10)
AhaI siRNA:
센스: (NH2C6)GfgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT) 3' (서열번호 11)
안티센스: pdAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT 3' (서열번호 12)
Luc siRNA
센스: (chol) 5'-uAuCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAf(invdT)-3' (서열번호 13)
안티센스: 5'-UfcGfaAfgUfaCfuCfaGfcGfuAfaGfdTsdT-3' (서열번호 14)
또는
센스: (NH2C6)cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT 3' (서열번호 15)
안티센스: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT 3' (서열번호 16)
Eg5-KSP
센스: (NH2C6)UfcGfaGfaAfuCfuAfaAfcUfaAfcUf(invdT) 3' (서열번호 17)
안티센스: pAfGfuUfaGfuUfuAfgAfuUfcUfcGfadTsdT 3' (서열번호 18)
또는
센스: AGUuAGUUuAGAUUCUCGAdTsdT 3' (서열번호 19)
안티센스: (NH2C6)ucGAGAAucuAAAcuAAcudTsdT 3' (서열번호 20)
EGFP
센스: 5' (NH2C6)AuAucAuGGccGAcAAGcAdTsdT 3' (서열번호 21)
안티센스: 5' UGCUUGUCGGCcAUGAuAUdTsdT 3' (서열번호 22)
소문자 = 2'-O-CH3 치환
s = 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 결합
뉴클레오티드 후 f = 2'-F 치환
뉴클레오티드 전 d = 2'-데옥시
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 고체지지체로서 조절된 공극 유리 (controlled pore glass, CPG) 상에서 종래의 포스포라미디트 화학으로 고체상 위에서 RNA 합성을 수행하였다.
실시예 4. RNAi 폴리뉴클레오티드의 in vivo 투여, 및 간세포로의 전달.
DPC는 상기 기술한 바와 같이 제조하였다. 6 내지 8주령 마우스 (종 C57BL/6 또는 ICR, 각 ~18-20　g)을 Harlan Sprague Dawley (Indianapolis IN)로부터 구입하였다. 마우스를 주사 전 2일 이상 수용하였다. Harlan Teklad Rodent Diet (Harlan, Madison WI)를 자유식으로 급여하였다. DPC는 본 명세서에서 기술한 바와 같이 합성하였다. 컨쥬게이트 용액 (0.4 mL)을 꼬리 정맥으로의 투입으로써 주사하였다. 조성물은 생리적 조건에서 가용성 및 비응집 (nonaggregating)이었다. 다른 관, 예를 들어 후안와 (retro-orbital)로의 주사는 동일하게 효과적일 것으로 예측된다. Wistar Han 랫트, 175-200g 을 Charles River (Wilmington, MA)로부터 구입하였다. 랫트를 주사 전 1 주 이상 수용하였다. 랫트를 위한 주사량은 일반적으로 1 ml였다. 특별한 사항이 없으면, 주사 후 48시간에 혈청 샘플을 취하고 및/또는 간 샘플을 회수하였다.
혈청 ApoB 수준 측정.
마우스를 악하 출혈(submandibular bleeding)로 혈청을 수집하기 전에 4 시간(랫트에 대해서는 16 시간)동안 금식시켰다. 랫트의 경우 혈액을 목정맥으로부터 수집하였다. 혈청 ApoB 단백질 수준은 표준 샌드위치 ELISA 방법으로 측정하였다. 간단하게, 다클론 염소 항-마우스 ApoB 항체 및 토끼 항-마우스 ApoB 항체 (Biodesign International)를 각각 포획물 및 검출 항체로 사용하였다. HRP-결합된 염소 항-토끼 IgG 항체(Sigma)는 ApoB/항체 복합체를 결합하기 위해 차후에 적용되었다. 그 다음 테트라메틸-벤지딘 (TMB, Sigma) 비색 개발의 흡광도를 450 nm에서 Tecan Safire2 (Austria, Europe) 마이크로플레이트 리더로 측정하였다.
혈장 인자 Ⅶ (F7) 활성 측정.
혈액 (9 부피)을 0.109 mol/L 소듐 시트레이트 항응고제(1 부피)를 함유하는 미세원심분리 튜브 내로 수집 (마우스의 경우 악하출혈로 또는 랫트의 경우 목정맥으로부터)함으로써 동물로부터 혈장 샘플을 표준 과정에 따라서 제조하였다. 혈장 중 F7 활성은 제조사의 권고에 따라서 BIOPHEN VII kit (Hyphen BioMed/Aniara, Mason, OH)를 이용한 발색분석(chromogenic method)으로 측정한다. 비색 개발의 흡광도는 450 nm에서 Tecan Safire2 마이크로플레이트 리더를 이용하여 측정되었다.
실시예 5: 디펩티드 절단가능한 차폐제로 가역적으로 변형된 양극성 막 활성 폴리아크릴레이트 폴리아민을 이용한 in vivo siRNA 의 간 세포로의 전달.
100　mM pH 7.5 HEPES 완충액 중 폴리아크릴레이트 Ant-41658-111를 활성화된 디설파이드 시약 숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파(2-피리딜-디티오)톨루엔 (succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-alpha(2-pyridyl-dithio)toluene, SMPT) (Pierce)으로 0.5 wt% 변형시켜 siRNA의 차후 결합을 위한 티올 반응성 기를 제공하였다. 그 다음 티올-반응성 고분자를 60 mg/mL HEPES 염기 중에서 5　mg/mL로 희석시켰다. 이 용액에 10 mg/mL 다양한 기술된 효소 절단가능한 차폐제를 첨가하였다. 이 양은 1 고분자 아민과 2 차폐제의 몰비를 나타내었다. 고분자 변형 반응에 대해, 고분자 아민과 차폐제의 바람직한 몰비는 1:1 내지 1:5 이다. 더 바람직한 비는 1:2 내지 1:4이다. 더 바람직한 비는 1:2이다. 1시간 후, 아세테이트-보호된 티올 내인성 설치류 인자 VII siRNA (고분자와 비례하여 0.1 내지 0.2　wt 당량)을 고분자 용액에 첨가하였다. 밤새 배양 후, 말레익 무수물의 N-아세틸갈락토사민 유도체 (NAG-CDM; 표 5)의 첨가로 컨쥬게이트를 더 변형하였다. NAG-CDM을 25 mg/mL까지 첨가하고 30분부터 4시간까지 배양하였다.
NAG-CDM 고분자 변형의 경우, NAG-CDM를 빙초산의 0.1 % 수용액으로부터 동결건조하였다. 건조한 NAG-CDM를 고분자 용액에 첨가하였다. 무수물의 완전한 용해 후에, 동물 투여 전 용액을 30분 이상동안 RT에서 배양하였다. d NAG-CDM과 고분자의 반응은 생성하였다:
Figure pct00040
여기서 R은 고분자이고 R1은 ASGPr 리간드 (예를 들어, N-아세틸갈락토사민)을 포함한다.
표 5에 나타난 바와 같이, 인자 VII 발현은 디펩티드제 차폐된 DPC로 처리된 동물에서 49-85% 감소하였다.
PEG-AA-p-니트로페닐-카바메이트 + NAG-CDM-DPC로 처리된 마우스에서의 in vivo 인자 VII의 녹다운.
디펩티드 차폐제 고분자 용량 (mg/kg) a siRNA 용량 (mg/kg) a % fVII 활성b
PEG12-AlaAsn 15 2 32
PEG12-PheCit 15 2 15
PEG12-AsnGly 15 2 51
PEG24-PheCit 1.5 0.25 23
PEG12-Asn 1.5 0.25 34
PEG24-ValCit 1.5 0.25 23
a mg 동물무게 kg 당 polymer 또는 siRNA
b 음성대조군에 대하여
실시예 6. NAG / PEG - AA -p- 니트로페닐 - 카바메이트 폴리 ( 아크릴레이트 ) DPCs 를 이용한 siRNA in vivo 전달.
A) PEG + NAG 변형.
100 mM pH 7.5 HEPES 완충액 중 폴리아크릴레이트 Ant-41658-111를 Pierce사의 활성화된 디설파이드 시약 숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파(2-피리딜디티오)톨루엔 (SMPT)으로 0.5 wt % 변형시켰다. 티올-반응성 고분자를 60 mg/mL HEPES 염기 중 5 mg/mL 로 희석하였다. 이 용액에 10 mg/mL의 다양한 PEG-AA-p-니트로페닐-카보네이트 차폐제를 첨가하였다. 1 시간 후, 5-10 대 1의 고분자 대 siRNA의 비율 범위로 아세테이트-보호된 티올 인자 VII siRNA를 고분자 용액에 첨가하였다. 밤새 배양 후, NAG-AA-p-니트로페닐-카보네이트 차폐제를 40 mg/mL에 첨가하였다. 30 분 이상, 4 시간 이하의 배양 후, DPC를 20 g ICR 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 주사 후 48시간에, 혈청 샘플을 회수하고 fVII의 수준을 측정하였다.
B) NAG 단독 변형.
100 mM pH 7.5 HEPES 완충액 중 폴리아크릴레이트 ANT-41658 111를 Pierce사의 활성화된 디설파이드 시약 숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파(2-피리딜디티오)톨루엔 (SMPT)으로 0.5 wt % 변형시켰다. 티올-반응성 고분자를 60 mg/mL HEPES 염기 중 5 mg/mL으로 희석시켰다. 5-10 대 1의 비율 범위의 고분자 대 siRNA로 아세테이트-보호된 티올 siRNA 인자 VII를 고분자 용액에 첨가하였다. 밤새 배양 후, NAG-AA-p-니트로페닐-카보네이트 차폐제를 50 mg/mL로 첨가하였다. 30 분 이상, 4 시간 이하의 배양 후, 고분자-결합된 siRNA를 20 gm ICR 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 주사 후 48 시간에, 혈청 샘플을 회수하고 fVII의 수준을 측정하였다.
PEG/NAG-AA-p-니트로페닐-카바메이트 DPC로 처리된 마우스에서의 in vivo 인자 VII의 녹다운.
차폐제 양c 고분자 양 (mg/kg) a siRNA 양 (mg/kg) a % fVII활성b
12 단위 PEG12-PheCit
뒤이은 NAG-PEG4-PheCit		 2×
8×		 15 2 27
24 unit PEG24-PheCit
뒤이은 NAG-PEG4-PheCit		 2×
8×		 15 2 27
PEG24-PheCit
뒤이은 NAG-PEG4-PheCit		 2×
8×		 1.5 2.5 23
NAG-PEG4-PheCit 10× 15 2 44
NAG-PEG2-GluGly 10× 1.5 2.5 27
NAG-PEG2-PheCit 10× 1.5 2.5 72
a kg 동물 무게 당 mg 고분자 또는 siRNA
b 음성 대조군에 대하여
c 등가 무게
실시예 7. NAG / PEG - AA -p- 니트로페닐 - 카바메이트 폴리 (비닐 에테르) DPC 를 이용한 siRNA 의 in vivo 전달.
고분자 변형 중에 차폐제가 보호 기를 유지하는 것을 제외하고 폴리아크릴레이트 Ant-41658-111에 대해 상기 기술한 바와 같이, 양극성 막 활성 폴리(비닐 에테르) 폴리아민 DW1360을 10×등가 무게의 디펩티드 절단가능한 차폐제로 변형시켰다. 고분자 변형 후, 아미노산 보호 기를 TFA로 제거하고 30 부피 % 트리에틸아민, 50% 메탄올 및 20% 물의 용액의 존재 하에 배양하여 NAG 아세테이트 보호 기를 제거하였다. 아세테이트 탈보호 용액을 회전증발로 제거하였다. 차폐된 고분자를 콜레스테롤-ApoB siRNA 컨쥬게이트와 함께 마우스에 병용주사 하였다.
NAG-AA-p-니트로페닐-카바메이트 폴리(비닐 에테르) 및 콜레스테롤-ApoB siRNA 컨쥬게이트가 병용주입된 마우스에서의 ApoB in vivo 녹다운.
고분자 차폐제 고분자 용량 (mg/kg) a siRNA 용량 (mg/kg) a % ApoBb
NAG-AsnGly 25 5 67
NAG-PheLys 25 5 70
NAG-GluGly 25 5 48
a kg 동물 무게 당 mg 고분자 또는 siRNA
b 음성 대조군에 대하여
실시예 8. 마우스에서의 멜리틴 전달 펩티드, 효소적으로 절단가능한 차폐제로 ApoB siRNA 전달에 따른 내인성 ApoB 수준의 In vivo 녹다운.
상기 기술한 바와 같이 표시된 량의 효소적 절단가능한 차폐제로 멜리틴을 가역적으로 변형시켰다. 그 다음 200-300 ㎍ 멜리틴을 50-100 ㎍ ApoB siRNA-콜레스테롤 컨쥬게이트와 함께 병용주사 하였다. ApoB 수준의 영향을 상기 기술한 바와 같이 결정하였다. 펩티다아제 절단가능한 디펩티드-아미도벤질 카바메이트 변형된 멜리틴은 효과적인 siRNA 전달 펩티드였다. 효소적으로 절단가능한 차폐제와의 조합에서 D-형 멜리틴 펩티드가 바람직하다. 동일한 수준의 표적 유전자 녹다운을 위하여 더 많은 펩티드가 요구되는 반면, 펩티드 차폐가 더 안정적이기 때문에, 치료 지수 (therapeutic index)는 변하거나 개선되지 않았다 (동일한 펩티드를 CDM-NAG로 차폐한 것에 비교하여).
인자 VII-siRNA 콜레스테롤 컨쥬게이트 및 바람직한 효소적 절단가능한 차폐제로 가역적으로 억제된 G1L-멜리틴 (D 형) (서열번호 25)으로 처리된 마우스의 정상 간세포 내의 인자 VII 활성의 억제.
NAG-결합 ㎍ ㎍ 퍼센트
펩티드 양a 종류 펩티드 siRNA 녹다운
G1L d-Mel
(서열번호 25)		 5× CDM-NAG 200 100 97
5× NAG-AlaCit 200 50 96
5× NAG-GluGly 200 50 96
5× NAG-PEG4-PheCit 200 50 94
5× NAG-PEG7-PheCit 200 50 86
5× CDM-NAG 300 50 98
2× NAG-GluGly 300 50 95
4× NAG-GluGly 300 50 95
6× NAG-GluGly 300 50 82
a 차폐반응에서 사용된 멜리틴 아민 당 차폐제의 양.
실시예 9. 펩티다아제 절단가능한 DPC 로의 종양 표적.
A) 표적 유전자 녹다운 측정.
하기의 모든 연구에서 표적 유전자인, Aha1 유전자 전사체에 특이적인 siRNA를 나타내었다. 향상된 녹색형광단백질 (enhanced green fluorescent protein, EGFP)의 siRNA를 탈-표적 (off-target) 대조군으로 사용하였다. Aha1 siRNA는 인간 및 마우스 유전자 모두에서 100 % 상동성인 Aha1 내의 서열 모티프에 상보적이었다. 따라서, 인간 이종이식 (human xenograft)에서 숙주세포 또는 종양 세포 내로의 Aha1 siRNA의 전달은 mRNA의 절단 및 분해를 야기한다. 마우스와 인간 Aha1 유전자의 다른 서열 모티브를 이용하여, 세포 종류의 혼합된 집단을 함유하는 조직 샘플 중 인간 Aha1 및 마우스 Aha1 mRNA 수준 모두를 양적으로 측정할 수 있는 PCR 프라이머를 디자인하였다. siRNA 전달 후 24, 48 또는 72 시간에서, 결합된 일부 건강한 마우스 간 조직과 함께 종양을 회수하고 총 RNA 분리를 위하여 Tri-Reagent (Invitrogen)내에 처리하였다. 그 다음 인간 Cyc-A 및 마우스 β-액틴을 체내 표준 유전자로 사용하여, qPCR 어세이로 인간 및 마우스 Aha1 mRNA 수준 모두를 측정하였다. 위-주사된 (mock-injected) 동물, 또는 탈-표적 대조군 GFP siRNA를 수여받은 마우스로부터의 동물 내 Aha1 mRNA 수준을 100 %로 간주하였다. 결과는 대조군에 대한 Aha1 mRNA 수준의 퍼센트로 표현하였으며 하기의 표에 나타내었다.
B) 정위 ( Orthotopic ) 간세포암종 ( hepatocellular carcinoma , HCC ) 종양 모델 마우스.
HegG2, Hep3B, 또는 HuH7 세포 간세포암종을 pMIR85 인간 태반 분비 알칼리성 인산가수분해효소 (human placental secreted alkaline phosphatase, SEAP) 백터 및 pMIR3 네오마이신/카나마이신 (neomycine/kanamycin)-저항성 유전자 벡터인, 2개의 발현 벡터로 공-형질감염 (co-transfect)시켜 SEAP 발현이 안정적인 세포주를 개발하였다. 세포는 10% FBS 및 300 ug/ml G418으로 보충된 DMEM로 성장시키고, 수집하고, 개수하고, 마트리젤 (BD Biosciences) (부피로 50 %)과 혼합하였다. 무흉성 (Athymic nude) 또는 Scid beige 마우스를 ~3% 이소플루레인 (isoflourane)으로 마취시키고 흉골 횡와위 (sternal recumbent position)에 배치하였다. 명치 (xyphoid) 바로 아래에 작은, 1-2 cm의, 정중선 복부 절개 (midline abdominal incision)를 수행하였다. 촉촉한 면봉을 이용하여, 간의 좌엽을 부드럽게 몸 밖으로 꺼냈다 (exteriorize). 간의 좌엽을 부드럽게 오므리고 주사기 바늘을 좌엽의 중간으로 삽입하였다. 주사기 바늘을 간 피막 (capsule) 바로 아래 약 0.5 cm 아래 경사로 삽입하였다. 100,000 개 세포를 함유하는, 10 ㎕의 세포/마트리젤 혼합물을 주사기 펌프를 이용하여 간 내로 주사하였다. 주사가 완료됨을 확인하기 위하여 바늘을 간에 잠시 (15-20 초) 놔두었다. SEAP-HepG2 세포를 무흉선 마우스에 주사하였다. SEAP-Hep3B 및 SEAP-HuH7 세포를 Scid beige 마우스에 주사하였다. 그 다음 주사기를 간으로부터의 바늘로부터 제거하고 세포의 누출 또는 출혈을 방지하기 위하여 면봉을 주사 위치에 배치하였다. 마트리젤/세포 혼합물은 가시적이고 바늘의 제거 뒤에 사라지지 않는 덩어리를 형성하였다. 간엽을 복부내로 제자리에 부드럽게 배치시킨 다음 복벽을 닫았다. 종양 이식 후 주 당 1회 혈청을 수집하고 세포 성장을 관찰하기 위하여 SEAP 어세이를 수행하였다. 대부분의 연구에서, 종양 마우스는 SEAP 값에 기초하여 종양 측정이 약 4-8 mm으로 예상되는 때인, 이식 후 4-5 주 동안 사용하였다.
C) 결장 전이 종양 모델.
10% FBS가 보충된 McCoy의 5a 배지에서 HT29 세포를 성장시키고, 수집하고, 개수하고, 마트리젤 (BD Biosciences) (부피로 50%)과 혼합하였다. 무흉선 마우스를 ~3% 이소플루레인으로 마취시키고, 흉골 횡와위 (sternal recumbent position)에 배치하였다. 명치 (xyphoid) 바로 아래에 작은, 1-2 cm의, 정중선 복부 절개 (midline abdominal incision)를 수행하였다. 촉촉한 면봉을 이용하여, 간의 좌엽을 부드럽게 몸 밖으로 꺼냈다 (exteriorize). 간의 좌엽을 부드럽게 오므리고 주사기 바늘을 좌엽의 중간으로 삽입하였다. 주사기 바늘을 간 피막 (capsule) 바로 아래 약 0.5 cm 아래 경사로 삽입하였다. ~40,000개 세포를 함유하는, 5 ㎕의 세포/마트리젤 혼합물을 주사기 펌프를 이용하여 간 내로 주사하였다. 주사가 완료됨을 확인하기 위하여 바늘을 간에 잠시 (15-20 초) 놔두었다. 그 다음 주사기를 간으로부터 제거하고 세포의 누출 또는 출혈을 방지하기 위하여 면봉을 주사 위치에 배치하였다. 마트리젤/세포 혼합물은 가시적이고 바늘의 제거 뒤에 사라지지 않는 덩어리를 형성하였다. 간엽을 복부내로 제자리에 부드럽게 배치시킨 다음 복벽을 닫았다. 종양 마우스는 이식 후 4-5 주 동안 사용하였다.
실시예 10. PEG 24 - Val - Cit DPC 투여에 따른 HepG2 - SEAP 정위 간세포암종 모델에서의 표적 유전자 발현의 in vivo 녹다운 (2011062805).
상기 기술한 대로 18× 중량 과량의 PEG24-Phe-Cit 차폐제 (또는 PEG24-Val-Cit 차폐제) 또는 7×PEG550-CDM으로 Ant-129-1 고분자 DPC를 변형(차폐)시켰다. Aha1-siRNA (RD-09070) 또는 GFP-siRNA (RD-05814; 탈-표적 대조군)을 상기 기술한 고분자에 결합시켰다 (4:1 중량비). 전달 전 DPC를 겔 여과로 정제하지 않고, 표적 리간드를 첨가하지 않았다. 동물 당 200 ㎕ 등장성 글루코오스 중 320 ㎍ (고분자 중량) DPC 컨쥬게이트를 꼬리 정맥 주사로 투여하였다 (그룹 당 n=3). 24시간 후, 동물에게 200 ㎕ 등장성 글루코오스 중 320 ㎍ (고분자 중량) DPC 컨쥬게이트의 두번째 주사를 하였다. 두번째 주사 후 48시간에, 혈청 샘플을 수집하여 간 효소 (ALT 및 AST) 및 혈액요소질소 (blood urea nitrogen, BUN) 수준을 측정하여 독성을 평가하고, 뒤이어 조직 회수, 및 qPCR 분석을 수행하였다.
Aha1 siRNA의 전달에의 PEG24-Val-Cit-Ant-129-1-siRNA DPC를 이용하여, 인간 종양 세포에서 Aha1 유전자의 46% 녹다운을 야기하였다 (표 9). 인간 Aha1 녹다운 수준과 대조적으로, 마우스 Aha1는 PEG24-Val-Cit-Ant-129-1-siRNA DPC 투여에 대응하여 70 % 녹다운되었다 (표 1). 이 치환된 말레익 무수물 차폐제 (PEG550-CDM)로 만든 유사한 DPC과 비교하여, 내인성 간세포 Aha1 녹다운은 감소하였다. ALT, AST 및 BUN 수준으로 나타나는 바와 같이, PEG24-Val-Cit DPC는 잘 용인되며 독성을 나타내지 않았다 (표 10).
말레익 무수물 변형된 대 (vs.) 펩티드 절단가능한 변형된 Aha1 siRNA DPCs에 의한 HepG2 간 종양 모델에서의 Aha1 녹다운.
PEG550-CDM DPC PEG24-Val-Cit DPC
대조군 siRNA Aha1 siRNA Aha1 siRNA
인간 Aha1 수준
(종양)		 100 ± 8.0 54.4 ± 7.3 54.9 ± 7.6
마우스 Aha1 수준
(간세포)		 100 ± 9.2 7.5 ± 0.9 30.4 ± 3.1
말레익 무수물 변형된 또는 펩티드 절단가능한 변형된 Aha1 siRNA DPCs의 투여에 따른 혈액 화학 독성 마커.
PEG550-CDM DPC PEG24-Val-Cit DPC
대조군 siRNA Aha1 siRNA Aha1 siRNA
ALT 44.3 ± 5.1 58.0 ± 37.5 35.0 ±11.3
AST 81.7 ± 4.0 102.3 ±57.5 67.7 ± 14.4
BUN 25.3 ± 4.2 23.0 ± 3.5 21.3 ± 1.2
실시예 11. 이중특이적 항체 ( bispecific antibody , bsAb )- 표적된 DPC 에 의한 표적 유전자 발현의 녹다운 (2011090701).
상기에서 기술한 바와 같이 5× Dig-PheCit (Dig-FCit) 차폐제로 Ant-129-1 고분자를 변형하였다. 그 다음 siRNA를 컨쥬게이트에 결합시켰다. 최종적으로, Dig-FCit-Ant-129-1-siRNA 컨쥬게이트를 8× (wt) PEG12-FCit로 더 변형시켰다. Aha1-siRNA (RD-09070) 또는 GFP siRNA (RD-05814)를 4:1 고분자:siRNA 중량 비로 결합시켰다. 결합되지 않은 시약을 제거하기 위하여 PEG12-FCit DPCs를 Sephadex G50 스핀 컬럼상에서 정제하였다.
헤파린 설페이트 프로테오글리칸 글리피칸-3 (Glypican-3, GPC3), HepG2-SEAP 세포에서 높게 발현되는 것으로 알려진 세포 표면 헤파린 설페이트 프로테오 글리칸, 및 디곡시제닌 (digoxigenin, Dig)에 특이적인 세포 표적 이중특이적 항체 (bispecific antibodies, bsAb)를 만들었다. 대조군으로서, 단백질 CD33 (골수-유도된 조혈줄기세포의 마커) 및 Dig에 특이적인 이중특이적 항체를 만들었다. CD33는 HepG2-SEAP 세포에 의해 발현되지 않는다. BsAbs를 변형된 DPC와 1.25:1 중량비로 복합 (Complex)하여 예상되는 1:1 몰비를 제공하였다. 복합체는 전달 전 30 분 이상 PBS 중에서 형성되었다.
bsAb 표적 제제와 함께 또는 없이, HepG2-SEAP 종양을 갖는 마우스에 DPCs를 투여하였다. 각 동물 (그룹당 n=3)에게 250 ㎍ (고분자 질량) DPCs의 단일 용량을 제공하였다. 200 ㎕ 살균 PBS 중의 DPC를 마우스의 꼬리 정맥으로 주사하였다. 혈청 및 조직 샘플을 48 시간 후 회수하고 상기 기술한 바와 같이 분석하였다. 표 11에 나타난 바와 같이, bsAb 표적 DPCs (250 ㎍ 고분자, 62.5 ㎍ siRNA)의 단일 용량은 21-32 %의 표적 유전자 녹다운을 야기하였다.
이중특이적 항체를 이용하여 표적된 펩티드 절단가능한 차폐제 변형된 Aha1 siRNA DPC에 의한 HepG2 간 종양 모델에서의 Aha1 녹다운.
Dig-FCit + PEG12-FCit 차폐제
GPC-Dig bsAb CD33-Dig bsAb
대조군 siRNA Aha1 siRNA
인간 Aha1 수준
(종양)		 100 ± 10.1 78.6 ±11.5 72.7 ±2.4 68.1 ±6.4
마우스 Aha1 수준
(간세포)		 100 ±9.5 65.1 ±8.1 73.7 ±10.5 91.3 ±8.3
실시예 12. 이중특이적 항체( bsAb )- 표적된 DPCs 로의 표적 유전자 발현의 녹다운.
a) PEG24-FCit를 PEG12-FCit 대신 사용하고 b) Dig를 고분자에 결합시키기 위하여 Dig-PEG12-NHS를 사용하는 것을 제외하고 상기와 같이 DPCs를 제조하였다. PEG24-FCit DPCs는 PEG12-FCit DPCs보다 덜 응집하고 더 작으며 더 균일하다. 비-불안정성 결합이 되는 것과 더불어, Dig-PEG12-NHS는 또한 더 긴 PEG를 함유한다. DPCs를 bsAb 와 복합하여 상기에 기술한 바와 같이 동물에 주사하였다. 혈청 및 조직 회수를 주사 후 24 또는 48 시간에 수행하였다. 표 12에 나타난 바와 같이, DPCs의 단일 용량 (250 ㎍ 고분자 질량)은 주사 후 24시간 46-56%의 인간 Aha1 의 녹다운을 야기하였다.
증가된 PEG 길이와 함께 펩티드 절단가능한 차폐제를 이용하여 변형된 Aha1 siRNA DPCs에 의한 HepG2 간 종양 모델에서의 Aha1 녹다운.
Dig-PEG12-NHS + PEG24-FCit 차폐제
GPC-Dig bsAb CD33-Dig bsAb
대조군 siRNA Aha1 siRNA
인간 Aha1 수준
(종양)		 100 ±3.1 54.1 ± 15.1 43.5 ± 6.6
실시예 13. bsAb 표적된 DPCs 에 의한 인간 결장 선암종 전이성 간 종양 조직에의 표적 DPCs .
5×몰 과량의 Dig-PEG12-NHS 및 8×중량 과량의 PEG24-FCit으로 Ant-129-1 고분자를 변형시켰다. Aha1 siRNA 또는 GFP siRNA 를 변형된 고분자에 4:1 고분자:siRNA 중량비로 결합시켰다. 결합하지 않은 시약을 제거하기 위하여 DPCs를 Sephadex G50 스핀 컬럼상에서 정제하였다. 주사 전에 30분 이상 Dig-DPCs를 동몰 (equimolar)량의 살균된 PBS 중 IGF1R-Dig bsAb 또는 CD33-Dig bsAb와 또는 bsAb 없이 복합하였다. HT29 종양 세포 (인간 결장 선암종; ATCC Number HTB-38)을 함유하는 동물에 DPC를 주사하였다. HT29 세포는 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 단백질 (insulin-like growth factor-1 receptor, IGF1R)을 과발현시키고, IGF1R-Dig 이중특이적 항체를 결합 및 내재화 (internalize) 할 수 있다. 동물 (n=3)에게 DPCs (320㎍ 고분자)를 수여하였다. 주사는 24시간 후 반복하였다. 혈청 및 조직 샘플을 두번째 용량 후 48시간에 수집하였다. 종양 세포내 인간 Aha1 의 녹다운은 26-38% 였다 (표 13). CDM-DPC와 비교하여, FCit-DPC는 더 적은 탈 표적 간 Aha1 녹다운을 나타내었다 (24-36 %와 비교하여 78-83 %). 또한 FCit-DPC는 CDM-DPC와 비교하여 감소된 간 축적을 나타내었다.
디펩티드 절단가능한 Aha1 siRNA DPC에 의한 HT29 결장 선암종 전이성 간 종양 내의 Aha1 녹다운.
Ant-129-1 고분자
Dig-PEG12-NHS + PEG24-FCit 차폐제
IGF1R-Dig bsAb CD33-Dig bsAb
대조군 siRNA Aha1 siRNA
인간 Aha1 수준
(종양)		 100 ± 4.9 72.3 ±6.1 73.7 ±3.2 62.0 ±9.0
마우스 Aha1 수준
(간)		 100.0 ±11 64.0 ±5.0 75.7 ±11 66.6 ±5.8
실시예 14. 간 종양에서의 내인성 Aha1 의 In vivo 녹다운.
400 ㎍ Lau41648-106를 8×(중량) PEG12-ValCit 또는 16× PEG24-PheCit로 변형시켰다. 100 ㎍ Aha1 siRNA 또는 100 ㎍ Eg5 대조군 siRNA를 변형된 고분자에 상기 기술한 바와 같이 결합시켰다. Hep3B-SEAP 종양 세포를 함유하는 동물에 DPCs를 주사하였다. 혈청 및 조직 샘플을 주사 후 48 시간에 수집하였다. 종양 세포에서의 인간 Aha1 녹다운은 26-38 %였다.
디펩티드 절단가능한 Aha1 siRNA DPC에 의한 Hep3B-SEAP 간 종양에서의 Aha1 녹다운.
고분자
(400 ㎍)		 변형 siRNA
(100 ㎍)		 Aha1 KD
Lau41648-106 8×PEG12-ValCit Aha1 38 ± 0.02 %
16×PEG24-Phecit Aha1 41 ± 0.07 %
EG5 13 ± 0.11 %
실시예 15. 차폐된 고분자의 in vivo 순환 및 조직 표적.
Lau24AB 폴리아크릴레이트 (100 ㎍)에 125I-Bolton-Hunter (BH) 시약 (50 μCi)를 50　mM HEPES pH 8.0 완충액에서 1시간 동안 RT에서 처리하였다. 표지된 고분자를 물 중 2 ml Sephadex QEA 스핀 컬럼에서 정제하였다. 표지된 고분자의 용액을 4 ℃에서 보관하였다. 200 g 랫트 당 0.2 μCi를 갖는 약 1 mg 고분자를 주입하기 위하여 표지되지 않은 고분자를 125I-표지된 고분자로 보충하였다. PEG24-FCit 또는PEG-CDM (2 mg/ml 폴리아크릴레이트, 14 mg/ml PEG-CDM 시약, 14 mg/ml NAG-PEG-CDM 시약, 16 mg/ml PEG24-FCit 시약)으로 상기 기술한 바와 같이 표지된 및 표지되지 않은 고분자의 혼합물 (~3.5 동물에 대하여 계산)을 변형하였다. 배양시간은 1시간이었다. 그 다음 반응 혼합물을 등장성 클루코오스에 희석하여 1 ml 부피의 동물당 주사 용량을 생성하였다. 3 동물/그룹에 주사하였다. 동물을 주어진 시간에 출혈시켰다 (0.1 - 0.2 ml). 샘플내에 존재하는 고분자의 양은 감마 계수기의 계수로 결정하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 프로테아제 절단가능한 차폐제로 변형된 고분자는 pH 불안정한 말레익 무수물 차폐제로 차폐된 고분자에 비하여 혈청으로부터 덜 빠르게 제거되었다. 증가된 순환 시간은 간이 아닌 조직의 표적에 유익하다.
실시예 16. 양극성 막 활성 고분자 합성.
A) 폴리( 비닐아크릴레이트 )
i) N- Boc - 에틸에톡시 아크릴레이트 및 프로필 메타아크릴레이트의 RAFT 공중합:
Figure pct00041
여기서, A는 boc 보호된 에틸-에톡시 아미노 아크릴레이트이고
B는 프로필 메타크릴레이트이며
C는 RAFT 제제 CPCPA (4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오) 펜타노익 산, 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio) pentanoic acid)이고
n 및 m은 정수이다.
합성 후 boc 보호 기의 제거는 아민 모노머를 생성한다.
기타 막 활성 고분자의 경우, A는 또한 탈보호된 에틸, 프로필, 또는 부틱 아미노 아크릴레이트일 수 있다. B는 더 높은 소수성 (10-24 탄소 원자, C18을 나타냄) 아크릴레이트, 더 낮은 소수성 (1-6 탄소 원자, C4 나타냄) 아크릴레이트, 또는 더 낮은 더 높은 아크릴레이트의 조합일 수 있다.
아민 아크릴레이트/C3 메타크릴레이트로 이루어진 공중합체를 하기와 같이 합성하였다. 모노머 및 RAFT 제제의 무게를 재고 표시된 비로 부틸 아세테이트로 끌어올렸다. AIBN (아조비스-이소부티로니트릴, azobis-isobutyronitrile)를 첨가하고 질소를 RT에서 1시간 동안 반응에 흘렸다. 그 다음 반응 혼합물을 80℃에서 15 시간 동안 오일 욕조 내에 배치시켰다. 그 다음 헥산으로 고분자를 침전시키고, DCM/헥산 용매 시스템을 이용하여 더욱 분별 침전시켰다 (하기 참조). 그 다음 고분자를 감압 하에서 건조시켰다. 고분자를 아세트 산 중 7ml 2M HCl으로 RT에서 30 분간 탈보호하였다. 30분 후 15 ml의 물을 반응 혼합물에 첨가하였고, 혼합물을 3.5 kDa MWCO 투석 배관으로 이동시켰다. 고분자를 NaCl 에 대하여 밤새 투석한 다음 다른 날에는 dH2O에 대하여 투석하였다. 동결건조를 통하여 물을 제거 한 다음, 고분자를 dH2O 에 용해시켰다.
( Ant 41658-111)을 위한 모노머 합성.
2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴) (2,2'-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN, radical initiator), 4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오) 펜타노익 산, (4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio) pentanoic acid) (CPCPA, RAFT Agent) 및 부틸 아세테이트를 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 프로필 메타크릴레이트 모노머 (Propyl Methacrylate monomer) (Alfa Aesar)를 여과하여 억제제를 제거하였다.
교반 바를 갖춘 2L의 둥근-바닥 플라스크에서, 2-(2-아미노에톡시) 에탄올 (2-(2-aminoethoxy) ethanol) (21.1 g, 202.9　mmol, Sigma Aldrich)을 350 mL 디클로로메탄 (dichloromethan)에 용해시켰다. 별도의 1L 플라스크에서, BOC 무수물 (36.6 g, 169.1 mmol)을 660 mL 디클로로메탄에 용해시켰다. 2L 둥근-바닥 플라스크를 추가 깔때기로 맞추고, BOC 무수물 용액을 6시간에 걸쳐 플라스크에 첨가하였다. 반응을 밤새도록 교반하면서 방치하였다. 2L 분별 깔때기에서, 생성물을 각 300 ml의 10% 시트르산, 10% K2CO3, 포화 NaHCO3, 및 포화 NaCl로 세척하였다. 생성물, BOC 보호된 2-(2-아미노에톡시) 에탄올을 Na2SO4로 건조시키고, 중력 여과하고, 회전 증발과 고 진공을 이용하여 DCM을 증발시켰다.
교반 바를 갖추고 아르곤이 분출되는 500 ml 둥근-바닥 플라스크에서, BOC 보호된 2-(2-아미노에톡시) 에탄올 (27.836g, 135.8 mmol)을 첨가한 다음 240 mL 무수 디클로로메탄을 첨가하였다. 디이소프로필에틸 아민(35.5 ml, 203.7 mmol)을 첨가하고, 시스템을 드라이 아이스/아세톤 욕조에 배치하였다. 아크릴로일 클로라이드(12.1 ml, 149.4 mmol)를 10 ml의 디클로로메탄을 이용하여 희석시키고, 아르곤이 분출된 시스템에 점적 첨가하였다. 시스템을 아르곤 하에 유지시키고, 실온이 되도록 방치하고 밤새 교반하였다. 생성물을 각 100 mL의 dH2O, 10% 시트르산, 10% K2CO3, 포화 NaHCO3, 및 포화 NaCl로 세척하였다. 생성물, BOC-아미노 에틸 에톡시 아크릴레이트 (BAEEA)를 Na2SO4로 건조시켰고, 중력 여과하고, 회전 증발을 이용하여 DCM을 증발시켰다. 생성물을 7.5㎝ 직경 컬럼을 이용하여 29㎝ 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 사용된 용매 시스템은 헥산 중 30% 에틸 아세테이트였다. Rf: 0.30. 분획을 수집하고, 회전 증발과 고진공을 이용하여 용매를 제거하였다. BAEEA를, 74% 수율로 수득하였다. BAEEA를 냉동고에 저장하였다.
Figure pct00042

고분자 Ant -41658-111:
부틸 아세테이트 중 AIBN (1.00 mg/mL) 및 RAFT 제제 (4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오)펜타노익 산, 4-Cyano-4(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid (CPCPA), 10.0 mg/mL)의 용액을 제조하였다. 모노머 몰 공급 비는 75 BAEEA : 0.108 CPCPA RAFT 제제 및 0.016 AIBN 촉매와 함께 25 프로필 메타크릴레이트 (CAS:2210-28-8) (0.00562 총 mol) 이었다.
BAEEA (1.09 g, 4.21 mmol) (A), 프로필 메타크릴레이트 (0.180 g, 1.41 mmol) (B), CPCPA 용액 (0.170 ml, .00609 mmol) (C), AIBN 용액 (0.150 ml, 0.000915 mmol), 및 부틸 아세테이트 (5.68 ml)를 교반 바를 포함하는 20 ml 유리 바이알에 첨가하였다. 바이알을 고무캡으로 봉하고 배출구로서의 두번째 짧은 주사기 바늘과 함께 긴 주사기 바늘을 이용하여 1 시간 동안 용액에 질소를 흘렸다. 주사기 바늘을 제거하고 오일 욕조를 이용하여 80 ℃로 15시간 동안 시스템을 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고 헥산 (35 ml)을 용액에 첨가하기 전 50 ml 원심분리 튜브에 이동시켰다. 용액을 2분간 4,400 rpm에서 원심분리하였다. 상청액 층을 조심스럽게 붓고 바닥 (고체 또는 겔-유사) 층을 헥산으로 헹구었다. 그 다음 바닥층을 DCM (7 mL)에 재용해시키고, 헥산 (35 mL)에 침전시키고 한번 더 원심분리하였다. 상청액을 붓고 몇 시간 동안 고분자를 감압 하에서 건조하기 전 바닥 층을 헥산으로 헹구었다. MALS을 통하여 수득한 분자량: 73,000 (PDI 1.7); H1NMR을 이용하여 수득한 고분자 조성: 69:31 아민:알킬.
분별 침전 ( Fractional Precipitation ).
건조되고, 침전된 생성물을 DCM (100　mg/mL)에 용해시켰다. 구름점에 도달한 직후까지 헥산을 첨가하였다 (~20 ml). 결과로 생긴 우윳빛 용액을 원심분리하였다. 바닥 층 ( ~ 60%의 고분자를 나타내는 두꺼운 액체)을 추출하고 헥산으로 완전히 침전시켰다. 남은 상위 용액 또한 헥산의 추가적 첨가로 완전히 침전시켰다. 양 분획 모두 원심분리하고, 후에 고분자를 분리하고 진공 하에서 건조하였다. 분획 1: Mw 87,000 (PDI 1.5); 분획 2: Mw 52,000 (PDI 1.5-1.6).
MALS 분석.
약 10 mg의 고분자를 0.5 mL 89.8% 디클로로메탄, 10%　테트라히드로퓨란, 0.2% 트리에틸아민에 용해시켰다. 분자량 및 다분산성 (polydispersity, PDI)을 Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVB 컬럼을 이용한 Shimadzu Prominence HPLC에 결합된 Wyatt Helos II 다각 광 산란 검출기를 이용하여 측정하였다. 조 고분자: MW: 73,000 (PDI 1.7), 분획 1: MW 87,000 (PDI:1.5), 분획 2: MW 52,000 (PDI 1.5-1.6)
정제된 BOC-보호된 고분자를 아세트산 (7 ml) 중 2M HCl과 0.5 시간 동안 반응시켜 BOC 보호 기를 제거하고 아민을 생성하였다. 15 mL dH2O를 반응에 첨가하고, 용액을 3500 분획 분자량 (MW cutoff) 셀룰로오스 배관으로 이동시키고, 고염에 대하여 24 시간 동안 투석한 다음 dH2O 에 대하여 18 시간 동안 투석하였다. 내용물을 동결 건조한 다음, DI H2O에 20 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 고분자 용액을 2-8 ℃에서 보관하였다.
ii ) 모노머 공급비가 72.5 BAEEA : 27.5 프로필 메타크릴레이트인 것을 제외하고 상기와 같이 고분자 Lau24B 를 제조하였다.
iii ) 하기의 모노머가 사용된 것을 제외하고 상기에 기술한 바와 같이 Ant -129-1를 본질적으로 만들었다:
Figure pct00043
,
Figure pct00044
,
Figure pct00045
, 및
Figure pct00046
.
Ant-129-1 고분자 합성 반응물.
MW (g/mol) mol % 몰 질량
(g)		 부피 (ml) 반응 몰
모노머
N-Boc-아미노-프로필 아크릴레이트 229.27 70 3.94×10-3 0.9031 0.005627
부틸 메타크릴레이트 142.2 25 1.41×10-3 0.2000 0.224 0.005627
C18 메타크릴레이트 338.54 5 2.81×10-4 0.0952 0.005627
에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 170.16 5 2.81×10-4 0.0479 0.44 0.005627
기타 반응물
CPCPA (RAFT 제제) 279.38 0.213 1.2×10-5 0.0033 0.335 0.005627
AIBN (억제제) 164.21 0.032 1.8×10-6 0.0003 0.295 0.005627
부틸 아세테이트 5.272
표적 분자량 100000
CTA 당 총 단위 469.56
% CTA 0.213
N-Boc-아미노-프로필-아세테이트(N-Boc-Amino-Propyl-Acrylate, BAPA)의 경우, 교반 바를 갖추고 아르곤이 분출되는 500 ml 둥근 바닥 플라스크에서, 3-(BOC-아미노)-1-프로판올 (TCI) (135.8 mmol)을 가한 다음 240mL 무수 디클로로메탄을 첨가하였다. 디이소프로필에틸 아민 (203.7 mmol) 을 첨가하고, 시스템을 드라이 아이스/아세톤 수조에 배치하였다. 아크릴로일 클로라이드 (149.4 mmol) 를 10 ml의 디클로로메탕을 이용하여 희석하고, 아르곤이 분출되는 시스템에 점적 첨가하였다. 시스템을 아르곤 하에 유지시키고 실온이 되도록 방치하고 밤새 교반하였다. 생성물을 각 100 mL의 dH2O, 10% 시트르산, 10% K2CO3, 포화 NaHCO3, 및 포화 NaCl로 세척하였다. 생성물, BOC-아미노 프로필 아크릴레이트 (BAPA)를 Na2SO4로 건조시켰고, 중력 여과하고, 회전 증발을 이용하여 DCM을 증발시켰다. 생성물을 7.5㎝ 직경 컬럼을 이용하여 29 ㎝ 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 사용된 용매 시스템은 헥산 중 30% 에틸 아세테이트였다. Rf: 0.30. 분획을 수집하고, 회전 증발과 고진공을 이용하여 용매를 제거하였다. BAPA를, 74% 수율로 수득하였다. BAPA를 냉동고에 저장하였다.
ⅳ) N- Boc - 에틸에톡시 아크릴레이트 및 프로필 메타아크릴레이트의 무작위 (random) 공중합.
아민 아크릴레이트/Cn 메타아크릴레이트로 이루어진 공중합체를 하기와 같이 합성하였다. 모노머의 무게를 재고 표시된 비로 디옥산으로 끌어올렸다. AIBN (아조비스-이소부티로니트릴, azobis-isobutyronitrile)을 첨가하고 질소를 RT에서 1시간 동안 반응에 흘렸다. 그 다음 반응 혼합물을 60℃에서 3 시간 동안 오일 욕조 내에 배치하였다. 그 다음 고분자를 감압 하에서 건조하였다. 고분자는 GPC로 정제하였다. 그 후 고분자 분획을 아세트 산 중 7ml 2M HCl으로 RT에서 30 분간 탈보호하였다. 30 분 후, 15 ml의 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 3.5 kDa MWCO 투석 배관으로 이동시켰다. 고분자를 NaCl 에 대하여 밤새 투석한 그 다음 다른 날에는 dH2O에 대하여 투석하였다. 동결건조를 통하여 물을 제거한 다음, 고분자를 dH2O에 용해시켰다.
고분자 Lau41648 -106.
모노머 몰 공급 비는 총 모노머 몰을 기준으로 80 BAEEA : 20 프로필 메타크릴레이트 (CAS:2210-28-8) 및 3% AIBN 촉매였다. BAEEA (6.53 g, 25.2 mmol) (A), 프로필 메타크릴레이트 (0.808 g, 6.3 mmol) (B), AIBN (0.155 g, 0.945 mmol), 및 디옥산 (34.5 ml) 을 교반 바를 포함하는 50 ml 유리 튜브에 첨가하였다. 화합물 A 및 B는 상기 실시예 16Ai에 기술한 바와 같이 제조하였다. 반응은 3회 실시하였다. 각 용액에 긴 피펫을 이용하여 1시간 동안 질소를 흘렸다. 피펫을 제거하고 각 튜브를 주의 깊게 덮었다. 그 다음 각 용액을 60 ℃에서 3시간동안 오일 욕조를 이용하여 가열하였다. 각 용액을 실온까지 냉각시키고 둥근 바닥에 모았다. 조 고분자를 감압하에서 건조하였다. MALS 통해 수득한 분자량: 55,000 (PDI 2.1); H1NMR를 이용하여 수득한 고분자 조성: 74:26 아민:알킬.
Figure pct00047
Lau41648-106
GPC 분획.
건조된 조 고분자를 75% 디클로로메탄, 25% 테트라히드라퓨란, 및 0.2% 트리에틸아민 중에서 50 mg/ml로 끌어올렸다. 그 다음 고분자를 Jordi Gel DVB 104 Å- 500mm/22mm 컬럼으로 5　ml/분의 유속 및 10 ml의 주입을 이용하여 분획하였다. 초기 분획을 15-17분으로부터 수집하고, 후기 분획은 17-19 분으로부터 수집하였다. 분획 15-17: Mw 138,000 (PDI 1.1); 분획 17-19: Mw 64,000 (PDI 1.2).
MALS 분석.
약 10 mg의 고분자를 0.5 mL 89.8% 디클로로메탄, 10%　테트라히드로퓨란, 0.2% 트리에틸아민에 용해시켰다. 분자량 및 다분산성 (PDI)을 Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVB 컬럼을 이용한 Shimadzu Prominence HPLC에 결합된 Wyatt Helos II 다각 광 산란 검출기를 이용하여 측정하였다. 조 고분자: MW: 55,000 (PDI 2.1), 분획 15-17: MW 138,000 (PDI:1.1), 분획 17-19: MW 64,000 (PDI 1.2)
정제된 BOC-보호된 고분자를 아세트산 (7 ml) 중 2M HCl와 0.5 시간 동안 반응시켜 BOC 보호 기를 제거하고 아민을 생성하였다. 15 mL dH2O를 반응에 첨가하고, 용액을 3500 분획 분자량 셀룰로오스 배관으로 이동시키고, 고염에 대하여 24 시간 동안 투석한 그 다음 dH2O 에 대하여 18 시간 동안 투석하였다. 내용물을 동결 건조한 다음, DI H2O에 20 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 고분자 용액을 2-8 ℃에서 보관하였다.
ⅴ) 수- 용성 , 양극성, 막 활성 폴리 (비닐 에테르) 폴리아민 삼량체의 합성.
X mol% 아민-보호된 비닐에테르(예를 들어, 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드)를 무수 디클로로메탄에 질소로 덮여진 오븐 건조된 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 이 용액에, Y mol % 더 낮은 소수성 기(예를 들어, 프로필, 부틸) 비닐에테르 및 임의로 Z mol % 더 높은 소수성 기(예를 들어, 도데실, 옥타데실) 비닐에테르를 첨가하였다(도 1). 용액을 -50 내지 -78℃ 욕조에 놓고, 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드를 침전시켰다. 이 용액에 10 mol % BF3·(OCH2CH3)2 를 첨가하고, -50 내지 -78℃에서 2-3시간 동안 반응을 수행하였다. 메탄올 용액 내 암모늄 히드록사이드를 첨가하여 중합을 종결시켰다. 고분자를 감압 하에 건조시킨 다음, 1,4-디옥산/메탄올 (2/1)에 넣었다. 프탈이미드 당 20 mol 당량의 히드라진을 가하여 아민으로부터 보호 기를 제거하였다. 용액을 3시간 동안 환류시킨 다음 감압 하에서 건조시켰다. 결과로 생긴 고체를 0.5 mol/L HCl에 녹이고 15-분 동안 환류시켜 고분자의 염산 염을 형성하고, 증류수로 희석하고, 추가 시간 동안 환류시켰다. 용액을 NaOH로 중화시킨 다음, 실온 (RT)으로 냉각시키고, 분자 셀룰로오스 배관으로 이동시키고, 증류수로 투석하고 동결건조하였다. 고분자를 크기 배제 또는 다른 크로마토그래피를 이용하여 더 정제할 수 있다. 고분자의 분자량은 분석용 크기-배제 크로마토그래피 및 SEC-MALS(size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering)를 포함하는 표준 과정에 따라 컬럼을 이용하여 평가하였다.
고분자 DW1360 .
아민/부틸/옥타데실 폴리(비닐 에테르) 삼중합체를 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드(5 g, 23.02 mmol), 부틸 비닐에테르(0.665　g, 6.58 mmol), 및 옥타데실 비닐에테르(0.488 g, 1.64 mmol) 모노머로부터 합성하였다. 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드를 36 mL 무수 디클로로메탄이 있는 아르곤으로 덮여진 마그네틱 바를 함유하는 200 mL 오븐 건조된 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 이 용액에 부틸 비닐 에테르 및 n-옥타데실 비닐 에테르를 첨가하였다. 실온(RT)에서 모노머를 완전히 용해시켜 투명하고 균일한 용액을 얻었다. 투명한 용액을 함유한 반응 용기를 ACS 등급 변성된 알콜 및 에틸렌 글리콜의 1:1 용액에 드라이 아이스를 첨가하여 발생된 -50℃ 욕조에 놓은 다음, 프탈이미드 모노머의 눈에 보이는 침전을 형성하였다. 약 1.5분 동안 냉각시킨 후, BF3·(OCH2CH3)2 (0.058 g, 0.411 mmol) 를 가하여 중합 반응을 개시하였다. 중합 개시하면서 프탈이미드 모노머를 용해시켰다. 반응을 -50℃에서 3시간 동안 수행하였다. 메탄올 중 1% 암모늄 히드록사이드 5 mL를 가하여 중합을 종결하였다. 그 다음 용매를 회전 증발로 제거하였다.
그 다음, 고분자를 30 mL의 1,4-디옥산/메탄올 (2/1)에 용해시켰다. 이 용액에 히드라진 (0.147 g, 46 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 가열하여 3시간 동안 환류하였다. 그 다음, 용매를 회전 증발로 제거하였고, 결과로 생긴 고체를 20 mL의 0.5 mol/L HCl에 넣은 다음 15분 동안 환류시키고, 20 mL의 증류수로 희석하고, 추가 시간 동안 환류하였다. 이 용액을 NaOH로 중화시킨 다음, RT로 냉각시키고, 3,500 분자량 셀룰로오스 튜브로 옮기고, 증류수로 24시간 (2×20L) 동안 투석하고, 동결건조하였다.
B) 멜리틴 .
모든 멜리틴 펩티드를 기술분야의 펩티드 합성 기술 표준을 이용하여 만들었다. 적합한 멜리틴 펩티드는 모든 L-형 아미노산, 모든 D-형 아미노산 (역 (inverso))일 수 있다. L 또는 D 형 독립적으로, 멜리틴 펩티드 서열은 반대일 수 있다 (레트로 (retro)).
<110> Arrowhead Madison Inc Rozema, David Lewis, David Kitas, Eric Blokhin, Andrei Carlson, Jeffrey Benson, Jonathan Hadwiger, Philipp Roehl, Ingo Hoffman, Torsten Jahn-Hofmann, Kerstin Martin Mueller, Hans Mohr, Peter Ott, Guenther Wakefield, Darren Wolff, Jon <120> In Vivo Polynucleotide Delivery Conjugates Having Enzyme Sensitive Linkages <130> 27189 US1 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gcaaaggcgu gccaacucat 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 tgaguuggca cgccuuugct t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 ggaucaucuc aagucuuact t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 guaagacuug agaugaucct t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 guuggugaau ggagcucagt 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 cugagcucca uucaccaact t 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 7 uuagguuggu gaauggagcu cagt 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 8 cugagcucca uucaccaact t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 ggaaucuuau auuugaucca a 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 uuggaucaaa uauaagauuc ccu 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 ggaugaagug gagauuagut 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 acuaaucucc acuucaucct t 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Photinus pyralis <400> 13 uaucuuacgc ugaguacuuc gat 23 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Photinus pyralis <400> 14 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Photinus pyralis <400> 15 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Photinus pyralis <400> 16 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 ucgagaaucu aaacuaacut 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 aguuaguuua gauucucgat t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 19 aguuaguuua gauucucgat t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 ucgagaaucu aaacuaacut t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 21 ccacaugaag cagcacgacu u 21 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 22 aagucgugcu gcuucaugug guc 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 ugugcaaagg cgugccaacu cat 23 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 tgaguuggca cgccuuugct t 21 <210> 25 <211> 26 <212> PRT <213> Apis florea <400> 25 Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln 20 25

Claims (20)

  1. 디펩티드-아미도벤질-카보네이트 (dipeptide-amidobenzyl-carbonate)에 공유결합된 입체적 안정화제 또는 표적 리간드를 포함하는, 양극성 막 활성 폴리아민의 가역적 변형을 위한 화합물.
  2. 청구항 1에 있어서, 화합물은 하기에 나타난 구조를 갖는 것인 화합물:
    Figure pct00048

    여기서
    X는 ―NH―, ―O―, 또는 ―CH2―이고
    Y는 ―NH― 또는 ―O―이며
    R1은 ―CH2―페닐―, ―CH―(CH3)2―, ―CH2―CH―(CH3)2, ―CH(CH3)―CH2―CH3, ―CH3,
    또는
    Figure pct00049
    이고;
    R2은 수소, ―(CH2)3―NH―C(O)―NH2, ―(CH2)4―N―(CH3)2, 또는 ―CH2―C(O)―NH2이며,
    R4은 비하전 (uncharged)이고 폴리에틸렌 글리콜 또는 표적 리간드를 포함하고,
    R5은 2, 4, 또는 6 위치에서 ―CH2―O―C(O)―O―Z이며, 여기서 Z는 ―할로겐화물,
    Figure pct00050
    ,
    Figure pct00051
    ,
    Figure pct00052
    , 또는
    Figure pct00053
    ; 이고
    R6은 R5에 의해 점유된 위치를 제외한 2, 3, 4, 5, 또는 6 각각의 위치에서 독립적으로 수소, 알킬, ―(CH2)n―CH3(여기서 n=0-4),―(CH2)―(CH3)2, 또는 할로겐화물이다.
  3. 청구항 2에 있어서, R4는 입체적 안정화제를 포함하는 것인 화합물.
  4. 청구항 3에 있어서, 입체적 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)인 것인 화합물.
  5. 청구항 2에 있어서, 표적 리간드는 아시알로당단백질 수용체 (asialoglycoprotein receptor, ASGPr) 리간드를 포함하는 것인 화합물.
  6. 청구항 5에 있어서, ASGPr 리간드는 락토오스, 갈락토오스, N-아세틸갈락토사민, 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민, 및 N-이소-부타노일-갈락토사민으로 이루어진 목록으로부터 선택된 것인 화합물.
  7. 청구항 1에 있어서, X 및 Y는 ―NH―이고, Z는
    Figure pct00054
    인 것인 화합물.
  8. 청구항 7에 있어서, R1은 ―CH2―페닐인 것인 화합물.
  9. 청구항 7에 있어서, R2은 ―(CH2)3―NH―C(O)―NH2인 것인 화합물.
  10. 하기 구조를 포함하는 RNA 간섭 (RNAi) 폴리뉴클레오티드의 세포로의 in vivo 전달을 위한 전달 고분자:
    M 1 x ―P― M 2 y
    여기서:
    P는 양극성 막 활성 폴리아민이고,
    M 1 은 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 (dipeptide-amidobenzyl-carbamate) 결합을 통하여 P에 결합되는 표적 리간드이며,
    M 2 는 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합을 통하여 P에 결합되는 입체적 안정화제이고,
    y 및 z는 0 이상의 정수이며,
    y + z는 어떠한 차폐제의 부재에서 P 상의 아민의 양으로 결정되는 바와 같은 폴리아민 P 상의 일차 아민의 50 % 보다 높은 값을 갖는다.
  11. 청구항 10에 있어서, 입체적 안정화제는 PEG인 것인 전달 고분자.
  12. 청구항 10에 있어서, 표적 리간드는 ASGPr 리간드를 포함하는 것인 전달 고분자.
  13. 청구항 12에 있어서, ASGPr 리간드는 락토오스, 갈락토오스, N-아세틸갈락토사민, 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민, 및 N-이소-부타노일-갈락토사민으로 이루어진 목록으로부터 선택된 것인 전달 고분자.
  14. 청구항 10에 있어서, 양극성 막 활성 폴리아민은 랜덤, 블록 또는 교호 (alternating) 합성 고분자로 이루어진 목록으로부터 선택된 것인 전달 고분자.
  15. 청구항 10에 있어서, 양극성 막 활성 폴리아민은 멜리틴 펩티드인 것인 전달 고분자.
  16. 청구항 10에 있어서, 디펩티드-아미도벤질-카바메이트 결합은 하기에 표시되는 구조를 갖는 것인 전달 고분자:
    Figure pct00055

    여기서
    X은 ―NH―, ―O―, 또는 ―CH2―이고
    Y은 ―NH― 또는 ―O―이며
    R1은 ―CH2―페닐, ―CH―(CH3)2, ―CH2―CH―(CH3)2,―CH(CH3)―CH2―CH3,―CH3,
    또는
    Figure pct00056
    이고;
    R2은 수소, ―(CH2)3―NH―C(O)―NH2,―(CH2)4―N―(CH3)2, 또는 ―CH2―C(O)―NH2이며,
    R4은 M 1 의 표적 리간드 또는 M 2 의 입체적 안정화제를 포함하고,
    폴리아민은 양극성 막활성 폴리아민이다.
  17. 청구항 16에 있어서, 양극성 막 활성 폴리아민은 RNAi 폴리뉴클레오티드에 더 공유결합된 것인 전달 고분자.
  18. RNAi 폴리뉴클레오티드와 청구항 10의 전달 고분자를 포유동물에 병용투여하는 단계를 포함하는, RNAi 폴리뉴클레오티드를 포유동물 in vivo 내의 세포에 전달하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 전달 고분자에 공유결합되는 것인 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 세포는 간세포 또는 간암 세포인 것인 방법.
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