JP2002537318A - 全身性遺伝子送達のための抗体標的化フラグメントイムノリポソーム - Google Patents

全身性遺伝子送達のための抗体標的化フラグメントイムノリポソーム

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Abstract

(57)【要約】 治療薬としての核酸−イムノリポソーム組成物の有用性を開示する。該組成物は、(ｉ)カチオンリポソーム、（ｉｉ）トランスフェリン受容体に結合する単鎖抗体フラグメント、（ｉｉｉ）野生型ｐ５３をコードする核酸、からなるのが好ましい。該組成物は、トランスフェリン受容体を発現する細胞、例えば腫瘍細胞を標的としている。該組成物は、腫瘍、頭頚部癌、肺癌または前立腺癌に疾病しているヒトもしくは動物を処置するために治療上使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明の名称：全身性遺伝子送達のための抗体標的化フラグメントイムノリポ
ソーム
【０００２】 （技術分野） 本発明は、リピドタグ抗体フラグメント標的化リポソームを含む抗体標的化フ
ラグメント（「イムノリポソーム」）を調製するための方法、イムノリポソーム
を使用するインビトロトランスフェクションのための方法、およびインビボにお
ける全身性遺伝子送達のための方法を提供するものである。本発明のリポソーム
は、標的化遺伝子送達を行うのに有用であり、全身投与後の効率的な遺伝子発現
のために効果的である。送達系の特異性は、標的化抗体フラグメントから誘導さ
れる。
【０００３】 癌に対する理想的な治療は、腫瘍表現型の原因となる細胞経路を選択的に標的
とし、健常細胞に関して非毒性のものである。遺伝子治療を含む癌治療は、かな
り有望ではあるが、一方でこの有望性を実現し得る前に指向すべき多くの問題を
抱えている。おそらく、高分子治療に関連する問題の中の最も主要なものは、体
内で必要とされる部位への治療学的分子の有効な送達である。ウイルスおよびリ
ポソームを含む多様な送達系(別名「ベクター」)が試験されてきた。理想的な送
達系ビヒクルは、全身的に投与されうるもの（局所とは反対に）であり、体内に
存在する場所はどこでも腫瘍細胞を選択的に標的化し得るものである。
【０００４】 また、送達ベクターとしてウイルスを魅力的にする伝染性は、同時に最も大き
な欠点をもたらす。従って、分子治療上の送達のための非ウイルスベクターに対
して多大な注意が払われる。該リポソームの研究は、遺伝子送達のためのウイル
スの諸方式に対して多くの利点を提供する。最も重要なことは、リポソームは、
自己複製し得る伝染性薬物ではないため、別の個体に移入する危険性を持たない
。リポソームにより腫瘍細胞を標的化することは、その成分が腫瘍細胞に選択的
に送達するようにリポソームを修飾することによって達成し得る。癌細胞の外側
表面に存在する特異的分子に関する重要な知識基盤がここに存在する。かかる細
胞表面分子は、腫瘍細胞の外表面に存在する該分子は通常細胞上にあるものとは
異なるので、リポソームを腫瘍細胞に標的化するために使用することができる。
【０００５】 発明の背景を説明するために明細書中で用いた、もしくは実施に関して追加の
説明を提供する文献および他の物質は、出典明示により本明細書の一部とする。
【０００６】 現行の身体遺伝子治療のアプローチは、ウイルスまたは非ウイルスベクター系
のいずれかを用いる。多くのウイルスベクターは、遺伝子移入の効率は高いが、
ある領域においては不十分である（Ledley FD. et al. Hum. Gene Ther(1995) 6
:1129-1144）。非ウイルス遺伝子移入ベクターは、ウイルスベクター使用時に付
随するいくつかの問題を回避する。この問題は、インビボにおけるヒトの治療用
遺伝子に関する、非ウイルス性、医薬配合物の開発、特にカチオンリポソーム介
在遺伝子導入系（Massing U. et al., Int.J.Clin. Pharmacol. Ther.(1997)35:
87-90）に進歩があった。ＤＮＡ送達に関して、それらを融通性のおよび魅力的
なカチオンリポソームの形態は以下を包含する：調製の簡易性；大量のＤＮＡを
複合体化する能力；いかなるタイプおよびサイズのＤＮＡまたはＲＮＡの使用の
際にも融通性があること；非分割細胞を含む多くの異なるタイプ細胞をトランス
フェクションする能力；免疫原性もしくは生物学的危険物質活性の欠如（Felgne
r PL, et al., Ann NY Sci.(1995)772:126-139;Lewis JG, et al.,Proc.Natl. A
cad. Sci USA(1996)93:3176-3181）。ヒト腫瘍治療に関する知見から、より重要
性があるものは、カチオンリポソームは、インビボ遺伝子送達に関して安全かつ
効率的であることが証明されてきた（Aoki K et al., Cancer Res.(1997)55:381
0-3816; Thierry AR, Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1997)92:9742-9746）。３０
以上の臨床試験が、現在遺伝子治療に関してカチオンリポソームを用いて行われ
ており（Zhang W et al.,Adv. Pharmacology (1997)32:289-333;RAC Committee
Report : Human Gene Therapy Protocols-December 1998）、小分子治療物質（
例えば、抗菌および従来の化学療法）を送達するためのリポソームはすでに市販
されている（Allen TM, et al., Drugs(1997)54 Suppl 4:8-14）。
【０００７】 カチオンリポソームのトランスフェクション効率は、細胞表面の受容体によっ
て認識されるリガンドを持つ場合に、劇的に増加し得る。受容体介在エンドサイ
トーシスは、真核生物表面に存在する高効率の内在化経路を示す（Cristiano RJ
J, et al., Cancer Gene Ther.(1996) 3:49-57, Cheng PW, Hum Gene Ther .(19
96)7:275-282）。リポソーム上のリガンドの存在は、細胞表面上へのその受容体
によるリガンドとの初期結合に続く結合複合体の内在化によって細胞へのＤＮＡ
導入を助ける。トランスフェリンおよび葉酸を含む多様なリガンドが、そのリポ
ソーム標的化能力に関して試験されてきた（Lee RJ, et al., J. Biol Chem.(19
96)271:8481-8487）。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）レベルは、前立腺癌を
含む種々の腫瘍タイプの腫瘍細胞において上昇するが、ヒトリンパ節および骨の
転移から派生した前立腺癌細胞系でもそうである（Ke HN et al.,J. Urol(1990)
143:381-385）; Chackal-Roy M et al., J.Clin. Invest.(1989)84:43-50;Rossi
MC, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA(1992)89:6197-6201;Grayhack JT, et
al., J. Urol.(1979)121:295-299)。また、上昇したＴｆＲレベルは、腫瘍細胞
の促進または増殖能と相関する。そのため、ＴｆＲレベルは、予後の腫瘍マーカ
ーとして有用であると考えられ、ＴｆＲは悪性腫瘍細胞の治療の際に薬物送達に
関する有力な標的である(Miyamoto T et al., Int J. Oral Maxillofac. Surg.(
1994)23:430-433;Thorstensen K. et al., Scand J. Clin. Lab. Invest.Suppl(
1993)215:113-120)。我々の研究室では、リガンドを持たないカチオンリポソー
ムではわずか５〜２０％であるのと比較して、ＳＣＣＨＮで腫瘍細胞トランスフ
ェクション効率が６０〜７０％であるトランスフェリン複合体カチオンリポソー
ムを調製した（Xu L, et al., Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475）。
【０００８】 腫瘍細胞上の受容体によって認識されるリガンドの使用に加えて、特異的抗体
も、それらを特異的な腫瘍細胞表面抗原（これは受容体に制限するものではない
）（Allen TM, Biochim. Biohpys. Acta (1995)1237:99-108）を指向しうるリポ
ソーム表面へ結合することができる（Allen TM et al.,(1995) Stealth Liposom es ,pp.233-244）。これらの「イムノリポソーム」、特に立体的に安定化したイ
ムノリポソームは、特定の標的細胞群に治療薬物を送達することができる（Alle
n TM et al.,(1995) Stealth Liposomes,pp.233-244）。Parkら（Park JW, et a
l., Proc. Natl. Acad.Sci.USA(1995)92:1327-1331）は、リポソームに接合した
抗ＨＥＲ-２モノクローナル抗体(Ｍａｂ)Ｆａｂフラグメントが、肺癌細胞系Ｓ
Ｋ-ＢＲ-３を重複発現するＨＥＲ-２特異的に結合し得ることを明かにした。イ
ムノリポソームは、被覆ピット経路を介する受容体介在エンドサイトーシスによ
って、また膜融合によっても効率的に内在化することが見出された。さらに、抗
ＨＥＲ−２Ｆａｂフラグメントのアンカリングによって、その阻害効果は増強し
た。ドキソルブチンを有する抗ＨＥＲ−２イムノリポソームは、インビボおよび
インビトロにおける標的細胞に対して重要な特異的細胞毒性を示した（Park et
al.,Proc. Natl Acad.Sci.USA(1995)92:1327-1331）。さらに、Suzuki et al.,(
Suzuki S, et al.,J.Cancer (1997)76:83-89)は、インビトロにおいてヒト白血
球細胞においてさらに効率よいドキソルブチンを送達するために抗トランスフェ
リン受容体モノクローナル抗体接合イムノリポソームを用いた。Huwyler J, ら(
Huwyler J, et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:14164-14169)は、
インビボにおいてラットグリオーマ細胞（ＲＴ２）に、ダウノマイシンを送達す
るために抗ＴｆＲモノクローナル抗体イムノリポソームを用いた。このペグ化(P
EGlated)イムノリポソームは、通常の組織および臓器において薬物の濃度低下を
生じる。これらの研究は、腫瘍標的化薬物送達のためのイムノリポソームの有用
性を示すものである。SuzukiらおよびHuwylerらによって使用されたイムノリポ
ソーム複合体は、彼らが、アニオンリポソームを使用したこと、および彼らの方
法では核酸を送達することができない点で、本発明に記載のものとは異なってい
ることに注意すべきである。
【０００９】単鎖核酸抗体 生物工学における発展は、Ｍａｂからの特異的な認識ドメインの誘導体を可能
にした(Poon RY, (1997) Biotechnology International: International Develo
pments in the Biotechnology Industry.pp.113-128)。重鎖および軽鎖の多様な
領域の組替えと、そのシングルポリペプチド内への組込みは、標的化の目的のた
めに単鎖抗体誘導体（ｓｃＦｖを設計）を使用することの可能性を提供する。癌
胎児性抗原に対して指向したｓｃＦｖ、ＨＥＲ-２、ＣＤ３４、黒色腫関連抗原
およびトランスフェリン受容体を提示するように作製したレトロウイルスベクタ
ーが開発された（Jiang A, et al.,J. Virol(1998)72:10148-10156, Konishi H.
et al., Hum Gene Ther.(1994)9:235-248:Martin F, et al., Hum. Gene Ther.
(1998)9:737-746）。ウイルスを指向したこれらのｓｃＦｖは、特別な抗原を発
現する細胞のタイプに特異的に結合および感染する標的を示している。さらに、
少なくとも癌胎児性抗原の場合、ｓｃＦｖは、親の抗体として同じ細胞特異性を
持つことが示されている（Nicholson IC, Mol. Immunol.(1997)34:1157-1165）
。
【００１０】 カチオンリポソーム遺伝子転移およびイムノリポソーム技術の組み合わせは、
標的化遺伝子送達のための有望なシステムであると考えられる。
【００１１】 発明の要旨 我々は、ヒト遺伝子治療の際に使用するために核酸の全身送達および腫瘍を標
的化し得る多様なイムノリポソームを構築した。下記の実施態様に示したデータ
に基に、これらのＴｆＲｓｃＦｖを組込んだイムノリポソームＤＮＡ複合体は、
完全なＴｆ分子を持つ同じリポソームＤＮＡ複合体以上にトランスフェクション
効率のより高いレベルのものを作ることができる。そのため、本発明の一態様に
おいて、本発明のイムノリポソームは、トランスフェリン受容体を発現する多様
な哺乳動物細胞型の高いトランスフェクション効率のためのキットを作成するた
めに使用することが可能である。本発明の一態様において、我々は、リピドタグ
を有するｓｃＦｖタンパク質を構築したが、これはリピドが細菌細胞によって自
然に加えられ、ｓｃＦｖを不活性化させ得る化学反応を回避しながらリポソーム
へのｓｃＦｖの組込みを容易にするようにした。
【００１２】 リピドタグｓｃＦｖイムノリポソームは、基本的に２つの方法で調製される：
脂質膜可溶化法およびダイレクト・アンカー法である。この脂質膜可溶化法は、
界面活性剤の透析法を修飾したもので、Laukkanen ML, et al., (Laukkanen ML,
et al., Biochemistry (1994)33:11664-11670)およびKruf et al.,(de Krurif
et al.,FEBS Lett.(1996)399:232-236)によって、中性またはアニオンリポソー
ムに関して記載されており、この両方法は出典明示により本明細書の一部とする
。この方法は、リピドタグｓｃＦｖとカチオンリポソームとを結合するために適
当である。脂質膜可溶化法において、クロロホルム中の脂質は、減圧下蒸発し、
丸底ガラスフラスコ内に乾燥脂質膜を得る。次いで、脂質膜０.５〜４％、好ま
しくは１％のリピド修飾ｓｃＦｖを含むβ-Ｄ-グルコシド（ＯＧ）を用いて可溶
化し、撹拌にかける。滅菌水で希釈後、該溶液を簡単に音波処理し、透明にする
。
【００１３】 リピド標的化抗体または抗体フラグメントを結合するための第２の方法は、ダ
ダイレクト・アンカー法であり、これはＥ. Coliリポタンパク質Ｎ末端の９個の
アミノ酸とｓｃＦｖ（ｌｐｐ-ｓｃＦｖ）または他のリピド修飾抗体またはフラ
グメントを結合するため、これを予め形成したリポソームに結合するために特異
的に有用である。ｓｃＦｖと予め形成したリポソームを結合するために、1：３
〜1：１０の体積比で、１％のＯＧ中リピド修飾ｓｃＦｖは撹拌にかけながら予
め形成したリポソームに添加される。該混合物は、さらに５〜１０分間撹拌にか
けられ、ｓｃＦｖイムノリポソームの透明溶液を得る。残存ＯＧおよび非複合体
化ｓｃＦｖは、クロマトグラフィーで除去することができるが、後の過程で干渉
しない。分離実験、即ちCentricon-１００(Amicon)を用いる限外濾過、Ficoll−
４００濾過（Shen DF, et al., Biochem. Biophys. Acta(1982)689:31-37）また
はSepharose CL-4B（Pharmacia）クロマトグラフィーにより、カチオンリポソー
ムに、添加された全リピドタグｓｃＦｖ分子を結合または接続されていることを
示す。これは、中性またはアニオンリポソームに対するｌｐｐ-ｓｃＦｖの非常
に低い結合率を改善する。そのためこの改善は、結合ｓｃＦｖを除去するための
さらなる精製工程を不必要とした。
【００１４】 表面上に１以上のリピドタグを持つように修飾し得る全ての抗体、抗体フラグ
メントまたは別のペプチド/タンパク質リガンドは、本発明において有用である
。他のリピド修飾方法は、Liposome Technology, 2nd Ed.Gregorisdis, G., Ed
., CRC Press, Boca Raton, FL, 1992に記載の、リピド鎖と抗体もしくはフラグ
メントとの直接的接合を包含する。
【００１５】 本発明の別の態様において、システインはｓｃＦｖ配列のＣ末端で添加され、
該タンパク質は、Ｅ. Coliの封入体で発現し、活性ｓｃＦｖを生成して再折りた
たみが生じる。Ｃ末端システインは、ｓｃＦｖとリポソームの接合を助ける遊離
メルカプト基を提供する。２つの方法が、接合過程において使用し得る。１）前
結合法：第一段階は、マレイミドイル（maleimidyl）基または別のメルカプト反
応基を含むカチオンリポソームとのｓｃＦｖ-ＳＨを接合し、ｓｃＦｖリポソー
ムを生成する。次いで、核酸はｓｃＦｖリポソームに添加し、ｓｃＦｖ-リポソ
ーム-ＤＮＡ複合体を形成する。２）後結合法：この方法は、はじめに、核酸と
カチオンリポソームを複合体化し、縮合構造（condensed structure）を形成す
る。次いで、ｓｃＦｖ-ＳＨは、ＤＮＡリポソーム複合体の表面上で結合し、ｓ
ｃＦｖ-リポソーム-ＤＮＡを生成する。後結合法は、ｓｃＦｖがＤＮＡ複合体化
後に結合するように設計される。そのため、この方法は、標的化リガンドｓｃＦ
ｖの使用および制御された複合体の内部構造を良好にしうる。
【００１６】 抗体または抗体フラグメントがリピドタグであるかもしくはリポソームへの接合
しているかに拘らず、核酸イムノリポソーム複合体は治療上使用することができ
る。好ましい複合体は、注目とする部位、好ましくは癌細胞を示す細胞、より好
ましくはトランスフェリン受容体に結合する細胞を標的にする。標的化剤は、ト
ランスフェリン受容体に好ましく結合する該抗体または該抗体フラグメントであ
る。核酸は、治療薬であり、好ましくはＤＮＡ分子であり、より好ましくは野生
型ｐ５３分子をコードする核酸である。核酸イムノリポソーム複合体は、好まし
くは治療用組成物は、全身投与、好ましくは静脈注射することが可能である。
【００１７】 （図面の簡単な説明） 図１は、ｓｃＦｖＴｆＲリピド−タグの構築を示す。 図２は、全身投与による腫瘍異種移植片におけるインビボのｓｃＦｖ−リポソ
ーム−標識化ｐ５３発現に関するウェスタン・ブロット分析を示す。 図３は、ｐＣＭＶｐ５３およびｐＣＭＶｐＲＯ構築物を示す。 図４は、ｐ５３−３’Ａｄの構築を示す。 図５は、Ｈｉｓ−タグとｓｃＦｖＴＦＲ−システインの構築を示す。 図６は、Ｈｉｓ−タグとｓｃＦｖＴｆＲ−システインの構築を示す。 図７は、セルロース結合ドメイン(ＣＢＤ)タグとＳタグとのｓｃＦｖＴｆＲ−
システインの構築を示す。 図８は、接合法によって生成した精製ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質に関するコマ
ジー・ブルー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。 図９は、全身投与による腫瘍異種移植片におけるインビボでのＴｆＲｓｃＦｖ
−リポソーム標的化ｐ５３の発現を生じる接合法ウェスタン・ブロット分析を示
す。
【００１８】 （本発明の詳細な説明） 本発明は、イムノリポソームを目的とし、該イムノリポソームの作成および使
用する方法を目指すものである。様々なタグをつけたイムノリポソームおよびｓ
ｃＦｖをリポソームに結合する多様な方法を包む多様な態様を開示する。イムノ
リポソームは、リピドタグを含むか、または還元基、好ましい態様においては遊
離メルカプト基と結合してもよい。
【００１９】 腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の変異体は、１５〜５０％の肺癌と２５〜７０％の転移
性の前立腺癌を含めて、ヒト腫瘍の５０％以上と関連がある。また、ｐ５３にお
ける異常は、多様なタイプの悪性腫瘍における貧困な予後に関連する。そのため
、全身投与し、ｗｔｐ５３の機能を効果的に修復させるように腫瘍に対して効果
的に遺伝子治療の標的とする能力は、癌治療における重要な治療態様であろう。
即ち、本発明の方法によって生成されたイムノリポソームは、ｗｔｐ５３機能の
修復のみならず他の治療薬剤遺伝子に関して腫瘍標的化全身性送達ビヒクルとし
ても効率的な新規治療態様として有用であろう。 本発明は次の実施例で説明する。
【００２０】 実施例 生合成的なリピド標的化ｓｃＦｖの構築および発現 ＴｆＲｓｃＦｖに関する表現ベクターの構築 Ｉ．発現ベクターを構築するために、Ｅ.coliリポプロテインシグナルペプチド
（ssＬＰＰ）と該ｓｃＦｖクローニング部位（de Kruif et al. FEBS Lett. (19
96)399:232-236）との間のアミノ酸リンカー配列を含むベクターｐＬＰ１を使用
した。このベクターは、発現したｓｃＦｖの精製および検出のために使用し得る
ｃ−ｍｙｃとＨｉｓ６タグ配列の両方を含む（図１）。
【００２１】 我々は、プラスミド発現ベクターであるｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫを得た。この
発現ベクターは、ＤＮＡ結合タンパク質と結合する５Ｅ９抗体に関する単鎖フラ
グメントを含み（Haynes, et al. J. Immunol(1981) 127:347-351）、ヒトトラ
ンスフェリン受容体（ＴfＲ）を認識する。このベクターは、ＤＮＡ結合タンパ
ク質に関する配列を含み、ｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫ中のｓｃＦｖ配列をフランキ
ングする独特な制限酵素部位は存在しない。さらに、我々は、ＮotIを含む３’
プライマー
【表１】 ＮcoI部位を含む５’プライマー
【表２】 を用いて所望のフラグメントをＰＣＲ増幅して、ＶＨ−リンカーＶκｓｃＦｖを
クローニングした。プライマーＲＢ５５１およびＲＢ５５２を用いるＰＣＲ増幅
によって、８１塩基のＭｅｔから８２１塩基のＬｙｓのｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫ
由来ＴfＲに関するｓｃＦｖを増幅した。ｐＬＰ１ベクターは、Laukkenen ML, e
t al (Laukkanen ML, et al., Biochemistry (1994)) およびde Kruif et al(Kr
uif et al., FEBS Lett.(1996)399:232-236) によって述べられているように、
Ｅ.coliリポプロテインシグナルペプチド（ssＬＰＰ）とＥ.coliリポプリテイン
Ｎ末端の９個のアミノ酸（ＬＰＰ）に関する配列をも含む。これらの配列の挿入
は、Ｅ.coli宿主において発現シグナルの脂肪酸アシル化を引き起こし、細菌膜
内にその導入がおこる。該ベクターは、不安定でない１０個のアミノ酸リンカー
配列を有し、リピドタグ部位とｓｃＦｖとの間の空間を広げる。細菌膜由来のリ
ピド修飾ｓｃＦＣｖ配列の精製によって、リポソーム中に結合するか挿入され得
る活性分子となる。
【００２２】 ２．ＴｆＲｓｃＦｖの発現および精製 我々は、Ｅ.coli発現宿主ＳＦ１１０Ｆ’を上記構築した発現ベクターを用い
て形質転換した。宿主細胞は不安定ではないが、発現したｌａｃ受容体を含むの
が好ましい。多くのクローンを選別し、最良の収率でｓｃＦｖを生成する一つの
クローンが選択された。リピド修飾ｓｃＦｖ（ｌｐｐ-ｓｃＦｖ）を、Kruif ら(
de Kruif et al., FEBS Lett.(1996)399:232-236)によって記載されたようにＴr
iton Ｘ-１００を使用する細菌膜から単離した。精製するために、単一コロニー
を５％グルコースと適当な抗菌剤を含むＬＢ(２００μｌ)中で再懸濁した。該混
合物を、５％グルコースと適当な抗菌剤を含む２枚のＬＢ寒天プレート(９９mm)
上で塗布し、一晩増殖した。翌日、該細胞を、プレートから洗浄し、０.１％グ
ルコースと適当な抗菌剤を含むＬＢ(全量５リットル)の播種に使用した。該培養
物を、ＯＤ６００で０.５〜０.７に達するまで、６時間、２５℃、２００rpmで
増殖した。ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度まで添加し、該培養物をさらに一晩イン
キュベートした。翌日、該細菌培養物を、遠心分離で回収し、２００ｍｌの分解
用緩衝液で、室温で３０分間分解した。該試料を、氷上で冷やしながら２８ワッ
トで５分間音波処理を行った。該分解緩衝液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.
４〜７.９）、０.５ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０.１ｍＭ ＰＭＳＦ
を含む。引用したプロトコールから唯一逸脱したことは、各々２０および２００
ｍＭ イミダゾールを含む、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４〜７.９）、０.５
Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０.１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％ｎ−オクチルβ
−Ｄ−グルコシド(ＯＧ)、そして１０％グリセロールを含む緩衝液でメタル・ア
フィニティーカラムの洗浄および溶出を包含する。ｌｐｐ−ｓｃＦｖの溶出試料
は、抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブ
ロットで分析し、精製ｓｃＦｖが約３０ｋＤａのバンドを示すことを確認した。
【００２３】 実施例２ 脂質膜可溶化法によるリピドタグｓｃＦｖイムノリポソームの調製 この態様は、リピドタグｓｃＦｖイムノリポソームを調製するために脂質膜可
溶化法に関する詳細な方法を開示する。クロロホルム中のリピド(５μｌ、ＤＯ
ＴＡＰ／ＤＯＰＥ、１:１モル比)を、減圧下で蒸発させ、丸底ガラスフラスコ中
で乾燥リピド膜を得た。リピド膜に、０.５ｍｌの、リピド修飾ｓｃＦｖを含む
１％ＯＧ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７.４)を添加した
。これを、室温で、１０〜２０分間インキュベーションし、次いでリピド膜を撹
拌で混合し、溶解した。次いで、滅菌水（２ｍｌ）を添加し、ｓｃＦｖリピド混
合物を希釈した。該溶液を、２０℃で、バス型ソニケーターにより簡単に音波処
理し、透明にした。該ｓｃＦｖ−リポソームは限定した量の界面活性剤ＯＧ残り
を有する透明な溶液である。該ＯＧおよび非複合体ｓｃＦｖを、SepharoseCL-4B
もしくはSepharoseＳ500を使用するクロマトグラフィーによって除去し得るが、
それらは後の使用において干渉しない。
【００２４】 実施例２ ダイレクト・アンカー法によるリピド標的化ｓｃＦｖイムノリポソームの調製 この態様は、リピド標的化ｓｃＦｖイムノリポソームを調製するためにダイレ
クト・アンカー法を提示する。丸底ガラスフラスコ内の乾燥リピド膜として調製
したリピド（２０μmol、リピドＡ−Ｈ、組成および比は以下を参照）を、純水
（１０ｍｌ）に添加し、バス型ソニケーターで、室温（リピドＡ、Ｂ、Ｃ）もし
くは６５℃（リピドＤ、Ｅ、Ｇ、Ｈもしくは全てのコレステロール(Ｃhol)との
組成物）で、１０〜３０分間音波処理した。調製した該カチオンリポソームは、
透明な溶液であり、その組成および比は以下である。
【表３】 予め形成したリポソームをｓｃＦｖに結合するために、撹拌を行いながら、１
:３〜１:１０の体積比で、１％ＯＧを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ(０.５ｍｌ、ｐＨ７.４)中の該リピド修飾ｓｃＦｖ(IPP−scFv)を添加し
、リポソームを予め形成する。該混合物を、さらに１〜５分間撹拌にかけ、ｓｃ
Ｆｖイムノリポソームの透明溶液を得た。残存ＯＧと非複合体ｓｃＦｖは、クロ
マトグラフィーによって除去し得るが、それらは後の使用において干渉しない。
分離実験、すなわちCentricon−１００(Amicon)を用いる限外濾過、Ficoll−４
００フローテション(Shen DF, et al.,Biochem Biophys Acta (1982)689：31-37
)またはSepharose CL-4B(Pharmacia)クロマログラフィーは、実際に、添加した
全てのリピド標的化scFvが、カチオンリポソームに結合またはアンカリングして
いることを示した。これは、対照的に、アニオンもしくは中性リポソームとlpp-
ｓｃＦｖと結合速度は非常に低い。そのため、ｓｃＦｖを除去するために、さら
なる精製工程は必要でない。
【００２５】 実施例４： ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよび免疫蛍光法によって示したリピド標的化ｓｃＦｖ イムノリポソームの免疫活性 この態様は、ＴｆＲ(＋)細胞への結合能に関する抗ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポ
ソームの特徴を提供するものである。該ヒト前立腺癌細胞系ＤＵ１４５および頭
部および頚部のヒト扁平上皮細胞癌細胞系ＪＳＱ−３は、これらの研究に対する
ＴｆＲ＋標的細胞として機能する。
【００２６】 間接的細胞系酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、リポソー
ムに結合する前後のｌｐｐ−ｓｃＦｖの免疫活性を測定した。９６ウェルプレー
トにおける融合性ＪＳＱ−３細胞を、ＰＢＳ中の０.５％のグルタルアルデヒド
を用いて、１０分間、室温で固定した。該プレートを、ＰＢＳ中の５％メス子牛
血清(ＦＢＳ）を用いて、３０℃で３０分間ブロッキングした。ｌｐｐ−ｓｃＦ
ｖ、ｓｃＦｖ−イムノリポソームおよびリポソームを、２つのウェルに添加し、
４℃で一晩インキュベーションした。３回のＰＢＳ洗浄の後、抗−ｃ−ｍｙｃモ
ノクローナル抗体を、ＰＢＳ中３％のＦＢＳの各ウェルに添加し、３７℃、６０
分間インキュベーションした。３回のＰＢＳ洗浄の後、３％のＦＢＳで希釈した
ＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ(Sigma)を各プレートに添加し、３０分間３
７℃でインキュベーションした。該プレートを、３回ＰＢＳで洗浄し、クエン酸
緩衝液(Sigma)中の基質(１００μｌ)と０．４ｍｇ／ｍｌＯＰＤを各ウェルに添
加した。発色を２Ｍ スルホン酸(１００μｌ)の添加により停止した。該プレー
トを、４９０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Molecular Devices Corp)で
読取った。間接的細胞ＥＬＩＳＡにより、抗ＴfＲ-scFvがリポソーム複合体中に
組込まれた後にその免疫活性を保持することを示した(表１)。 表１：ＪＳＱ−３への抗ＴｆＲｓｃＦｖリポソームの結合
【表４】
【００２７】 ＦＡＣＳ分析に関して、抗ＴfＲ-ｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ分析は、４℃でＪＳＱ−
３とＤＵ１４５細胞をインキュベーションし、次いでＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウ
スＩｇＧとも、４℃でインキュベーションした。ＪＳＱ−３細胞とｓｃＦｖ−Ｌ
ｉｐＡのインキュベーションは、結合しない遊離の抗ＴfＲ lpp-ｓｃＦｖ抗体に
よって観察されたものと同一の蛍光変化を示し、標的細胞に結合する量が非常に
多いことを示した。対照的に、非標的リポソームは、細胞への結合が非常に少な
いことを示した。類似の結果が、前立腺癌細胞系ＤＵ１４５で観察された。また
、明細書中、該ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）複合体は、非標的化Ｌｉｐ（Ａ）と比較
すると、腫瘍細胞への充分な結合を明確に示した。ＦＡＣＳデータは表２にまと
めた。表２では、蛍光変化を、蛍光を示す細胞の百分率として表示した。これら
の研究において、陽性細胞の百分率によって示した細胞への結合レベルは、非結
合の遊離ｓｃＦｖのものと類似し、さらにリポソーム複合体中への結合が、抗Ｔ
ｆＲ ｌｐｐ−ｓｃＦｖの免疫学的活性を不活性にしないことを示唆した。ＤＵ
１４５を用いるこれらの初期実験に対して使用したリポソーム調製物が、ＪＳＱ
細胞に至適化されることを示すべきである。そのため、前立腺腫瘍細胞へのｓｃ
Ｆｖ標的化リポソーム複合体の結合は、さらにこの細胞型に対して至適化された
リポソーム複合体の使用によって増幅される。 表２：ＪＳＱ−３およびＤＵ１４５へのＴｆＲｓｃＦｖリポソームのＦＡＣＳ
分析
【表５】
【００２８】 ｓｃＦｖリポソーム（Ｌｉｐ（Ａ）が、ローダミンＤＯＰＥで標識されている
）とＦＩＴＣ標識化抗マウスＩｇＧの後に抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いる間接的免疫
蛍光染色によって、ＪＳＱ細胞へのｓｃＦｖ標識化リポソーム複合体の結合を確
認した。形質移入細胞において赤色および緑色の蛍光濃度は、抗ＴfＲｓｃＦｖ
（緑色蛍光としてＦＩＴＣ標識化抗ｃ−ｍｙｃ抗体によって示される）が、細胞
への直接的なローダミン標識Ｌｉｐ（Ａ）を示す。さらに、ｓｃＦｖ Ｌｉｐ（
Ａ）システムに関する細胞性結合の高いレベルは、高い％の赤／緑二重陽性蛍光
細胞によって示される。
【００２９】 実施例５ インビボでの標的細胞のｓｃＦｖイムノリポソーム介在遺伝子トランスフェクシ
ョンの至適化 我々は、レポーター遺伝子としてβガラクトシダーゼを用いるＪＳＱ細胞にに
おける抗ＴｆＲｓｃＦｖＬｉｐ（Ａ）複合体のトランスフェクション効率を測定
した。これらの研究において、使用したレポーター遺伝子構築物は、ＣＭＶプロ
モータ（ｐＣＭＶｂ）制御下でβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、その同じプロ
モーターをｐＣＭＶｐ５３に使用した（図３）。トランスフェクションした細胞
におけるβＧｌａ発現レベル(トランスフェクション効率と相関する)は、βＧａ
ｌ酵素アッセイで評価した（XuL, et al.,Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475）。
表３に示したように、抗ＴfＲｓｃＦｖのＬｉｐＡへの結合は、非標的化リポソ
ーム複合体と比較すると、ｓｃＦｖ-Ｌｉｐ（Ａ）-ｐＣＭＶｂトランスフェクシ
ョンした細胞における酵素活性が２倍であった。この発現レベルは、トランスフ
ェリン自身を標的化リガンド(Ｔｆ-Ｌｉｐ（Ａ）-ｐＣＭＶｂ)として使用した場
合に観察される発現レベルと視覚的に実際に同一であった。さらに、遺伝子発現
における増加は、レポーター遺伝子用量依存性であることが示された。表４は、
ＪＳＱ-３細胞におけるｓｃＦｖリポソーム介在トランスフェクションの至適化
を示す。 表３：抗ＴｆＲ−リポソームによるＪＳＱ細胞のトランスフェクション
【表６】 表４：ＪＳＱ−３へのｓｃＦｖ−リポソームトランスフェクションの至適化
【表７】
【００３０】 実施例６ 化学療法薬への感受性を生じる腫瘍細胞を標的とするｓｃＦｖイムノリポソー ム介在ｐ５３遺伝子トランスフェクション １．インビボにおけるリポソーム介在ｗｔｐ５３遺伝子トランスフェクション
を促進した抗−ＴfＲｓｃＦｖ 抗ＴfＲ−ｓｃＦｖ標的化Ｌｉｐ(Ａ)−ｐ５３−３’Ａｄによって遺伝子移入
したＪＳＱ−３腫瘍細胞における外来性ｗｔｐ５３の発現を、ｐ５３応答性プロ
モーターの制御の下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む（Chen L.et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1998)95:195-200）発現プラスミド（ｐＢＰ１０
０）のトランスフェクションによって評価した。結果として、外来性ｗｔｐ５３
の発現レベルが高くなると、ルシフェラーゼ活性のレベルも高かった。このルシ
フェラーゼ酵素活性は、相対的光単位(ＲＵＬ)として表現した。上記に示したよ
うに、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と、Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’
Ａｄ複合体への標的化剤としての抗ＴｆＲｓｃＦｖの添加は、非標的化Ｌｉｐ（
Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ複合体を超えるトランスフェクション効率とｗｔｐ５３
タンパク質の発現において大きく増加した（ルシフェラーゼ活性のＲＬＵによっ
て表現される）。再び、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄトランスフ
ェクション細胞におけるｐ５３発現レベルは、トランスフェリンそれ自身を、標
的化リガンド（Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ）として使用した場合に観察さ
れたレベルと非常に類似する。そのため、これらの知見は、抗ＴｆＲ単鎖抗体方
法が、腫瘍細胞への標的化カチオンリポソーム複合体を標的化し、生物学的に活
性なｗｔｐ５３遺伝子を送達する有用な方法であることを示す。
【表８】 表５：ＪＳＱ−３細胞での異なるリポソームによって介在したインビトロでのｐ
５３発現
【００３１】 ２．抗ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム介在ｐ５３遺伝子修復は、シスプラチ
ン（ＣＤＤＰ）の細胞毒性への腫瘍細胞を感受性にした ｐ５３誘導アポトーシスの研究に対して、マウス黒色腫細胞系Ｂ１６を、２セ
ットの６ウェルプレートに、５μｇのＤＮＡ／２×１０５細胞の用量で、ｐ５３
−３’Ａｄ（図４）と、またはｐＣＭＶｐＲｏプラスミド（図３）との抗ＴｆＲ
ｓｃＦｖイムノリポソーム複合体でトランスフェクションを行った。比較のため
に、トランスフェリン−リポソーム−ＤＮＡ（ＬｉｐＴ−ｐ５３もしくはＬＩｐ
Ｔ−ｐＲｏ）も、５μｇＤＮＡ／２×１０５細胞の用量で遺伝子移入した。２４
時間後、ＣＤＤＰを、一組のプレートに、終濃度１０μｌまで添加した。薬物添
加後の２４および４８時間、結合および浮遊細胞の両方を、アポトーシスの染色
のために回収した。細胞を、使用プロトコールに従って、アネキシン（Annexin
）Ｖ−ＦＩＴＣキットで染色した（Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD）。アネ
キシンＶは、リポコルチンであり、天然に存在する血液タンパク質と抗凝固薬あ
る。染色細胞は、ＦＡＣＳサイトメーター上で測定した（Becton and Dickinson
）。表６は、アポトーシス分析の結果の要約である。 表６：リポソームｐ５３遺伝子修復によって誘導されたＢ１６細胞およびＣＤ
ＤＰ細胞のアポトーシス
【表９】
【００３２】 ＣＤＤＰを含まない場合、リポソーム複合体単独によって誘導される量と比較
すると、ｓｃＦｖリガンドの添加によって２４時間でアポトーシス細胞％におい
て増加しなかった。しかし、４８時間までには、リポプレックスへの標的化ｓｃ
Ｆｖの添加により、アポトーシス細胞％では、２倍以上に増加した。ＣＤＤＰを
有する場合、非標的化リポソーム複合体と比較して、２４時間であってもアポト
ーシス細胞において顕著に増加した（約１.５倍）。さらに重要なことは、ＣＤ
ＤＰと組合せたアポトーシス細胞における増加は、Ｔｆ分子それ自身を用いる以
上に標的リガンドとしてＴｆ受容体にｓｃＦｖを使用すると、さらに顕著であっ
た。この増加は、トランスフェクション効率と相関する。
【００３３】 実施例７ 全身投与による、インビボにおけるｓｃＦｖイムノリポソーム標的化ｗｔｐ５ ３遺伝子の送達および発現 リポソームを含有する抗ＴｆＲｓｃＦｖ能を試験するために、ｗｔｐ５３をイ
ンビボにおいて腫瘍細胞へ特異的に送達するために、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）ｐ
５３−３’Ａｄ（図４）を、ＪＳＱ−３皮下異種移植片の腫瘍細胞を有するヌー
ド・マウスに静脈注射をおこなった。注射２日後、腫瘍細胞を摘出し、ウェスタ
ン・ブロッティングのために肝臓および皮膚に加えて該腫瘍細胞からタンパク質
を単離した（Xu L, et al., Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475）。当量のタンパ
ク質（１００μｇ、濃度によって決定する場合）を、各々のレーンに流した。図
２に示したように、マウス由来の腫瘍を、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）ｐ５３−３’
Ａｄ複合体で全身的に処置し、図２でｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３を標識し
、非常に強いｐ５３シグナルを示し、外来性のｗｔｐ５３の高い発現レベルに関
するさらに追加の低いバンド表示を示、一方で、外来性マウスｗｔｐ５３の非常
に低い発現が、皮膚おび肝臓の双方において明らかとなった。対照的に、我々の
初期段階の結果を基に期待していたように、非常低いレベルの外来性ｐ５３発現
が非標的化Ｌいｐ（Ａ）ｐ５３−３’Ａｄ注入マウス、図２中の標識化Ｌｉｐ（
Ａ）−ｐ５３から単離した腫瘍細胞において明らかである。すなわち、我々の新
規でかつ独創的な抗ＴｆＲｌｐｐ−ｓｃＦｖリガンドによって標的化したリポソ
ーム複合体は、外来性遺伝子を、インビボで腫瘍細胞に選択的に送達することが
できることは明らかである。これらの結果は、効率よく標的化する新規の方法の
潜在性は、全身に、カチオンリポソーム複合体を特異的に送達したことを示すも
のである。
【００３４】 実施例８ 接合（コンジュゲーション）法で使用するための３’システインを用いるＴｆ ＲｓｃＦｖの構築および精製 リピドタグの非存在下、別の方法を考案し、リポプレックスに精製ＴｆＲｓｃ
Ｆｖタンパク質を結合した。このアプローチは、還元基、例えばメルカプト基に
よるカチオンリポソームへの単鎖タンパク質の接合を目的とする。好ましい態様
において、システイン残基を、ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質の３’末端で添加する
。このシステインの還元は、カチオンリポソームに接合し得る遊離のメルカプト
基において生じ、すなわちトランスフェリン受容体を発現する細胞にリポプレッ
クスを標的化するものである。一方、以下の実施例は、還元基としてシステイン
を用い、他の類似の還元基はこの方法で機能することもまた明らかである。
【００３５】 １．構築 Ａ．ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームを製造する接合法において使用するために
ヒスチジンタグを有する３’システインを含む発現ベクターの構築 実施例１のように、ＴｆＲのためのＶＨ−リンカー−ＶκｓｃＦｖを、プラス
ミド発現ベクター、ｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫから得た（実施例１に記載）。ＰＣ
Ｒ増幅のための５’プライマー
【表１０】 を用いてＮｃｏＩ部位を、ｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫｂに導入した。 システイン残基に対するヌクレオチド配列に加えてＮｏｔｌ制限部位を、３’
プライマー
【表１１】 を使用して導入した。ＰＣＲ産物を、市販のベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）（Nova
gen）のＮｃｏＩおよびＮｏｔｌ部位にクローンした。このベクターは、Ｎｃｏ
Ｉ部位の５’、ｐｅｌＢリーダーシグナル配列も含む。発現ベクター中のこの配
列の存在は、ペリプラスミック（peliplasmic）スペースにこのタンパク質を輸
送する。該タンパク質の精製を助けるために、ｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクターもＮ
ｏｔｌ部位のヒスチジンタグ配列の３’を含む（図５）。
【００３６】 Ｂ．ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームを製造する接合法で使用するためのヒスチ
ジンタグを持たない３’システインを含む発現ベクターの構築 ヒトが治療用送達ビヒクルとして使用するためには、ヒスチジンタグなしにＴ
ｆＲｓｃＦｖが製造されることが好ましい。さらに、該構築は、実施例８、セク
ション１において記載した。 Ａを、最終タンパク質生成物においてこのタグを排除するために修飾した。こ
れを達成するために、上記に記載した（実施例８、セクション１.Ａ）同じ５’
プライマーを使用した。しかし、異なる３’プライマーを用いた。システイン残
基およびＮｏｔｌ制限部位に対するヌクレオチド配列に加えて、このプライマー
【表１２】 は、システイン配列の隣と、Ｎｏｔｌ部位の前にＤＮＡストップコドンを導入し
た（図６）。即ち、この構築物のタンパク質生成物は、ヒスチジンタグを含まな
い。
【００３７】 Ｃ．ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームを製造する接合法における使用のために
５’ＣＢＤＴＭタグを有する３’システインを含む発現ベクターの構築 接合法を用いるカチオンリポプレックスと結合するためにシステイン残基を含
む３つの選択的な構築物もおこなった。この構築物のために、実施例８、セクシ
ョン１.Ｂにおいて上記記載の２つの同じプライマーを使用した（図７）。即ち
、ヒスチジンタグは、タンパク質生成物中には存在しなかった。しかし、これら
の反応のＰＣＲ産物を、異なるベクター、ｐＥＴ３７ｂ（＋）でクローンした。
このベクターは、セルロース結合ドメインタグ（ＣＢＤＴＭタグ）とＳタグ、ベ
クター中のＮｃｏｌ部位の５’両方を含む。該ＣＢＤＴＭタグ配列は、ミクロバ
イアルセルロースから誘導されたセルロース結合ドメインをコードする。そのた
め、このタグは、高い特異性、タンパク質生成物の低いコストアフィニティー精
製のためのセルロースを基本とする支持体の使用を可能にした。この構築物中に
存在するＳタグの存在は、ウスタン・ブロットでのタンパク質生成物を簡単に検
出すること、タンパク質量の簡単に酵素的な定量を可能にする。
【００３８】 ２．システイン残基を含有するＴｆＲｓｃＦｖの精製 発現したｌａｃリプレッサーを含む市販入手し得るＥ.coli発現宿主ＢＬ２１
（ＤＥ３）を、実施例８に記載したような発現ベクター（３つ全てを個々に用い
た)で形質転換した。多くのクローンを選択し、最も収率のよくＴｆＲｓｃＦｖ
産生するものを選抜した。ヒスチジンタグを有する実施例８、セクション１.Ａ
において、上記の構築物由来のタンパク質の精製は、実施例に詳細に記載するが
、同じ方法を、実施例８、セクション１.Ａで記載した３つ全ての構築物由来の
ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を含有するシステインの精製に使用した。主要なＴｆ
Ｒｓタンパク質（約９０％）は、可溶性で存在するのではなく、封入体内に存在
することが明らかとなった。そのため、システインリンカーを含有するＴｆＲｓ
ｃＦｖを、以下のように封入体から精製した。単一クローンを、５０μｇ／ｍｌ
のカナマイシン含有ＬＢ培地（５〜１０ｍｌ）で培種し、３７℃、２５０ｒｐｍ
、０.５〜０.７のＯＤ６００のなるまで（４〜５時間）増殖させた。この少量の
培養物を沈殿させ、ＬＢ培地（ブロス）で懸濁し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ン含有ＬＢ培地（１Ｌ）に添加し、３７℃、２５０ｒｐｍ、ＯＤ６００が０.５
〜０.７になるまで（４〜５時間）増殖させた。ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質の発
現を誘導するために、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧをこの時点で添加し、さらに４時
間インキュベーションを継続した。この時点がタンパク質発現の最高レベルをも
たらすことを測定した。次いで、バクテリア培養物を遠心分離で回収し、１５分
間、３０℃で、リゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）を含有するコールドの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５、１００ｍｌ）で分解した。試料を、氷上、１０
ワットで５分間（３０秒で破裂）音波処理した。この封入体を、遠心分離（１３
０００ｇ、１５分間）で単離した。得られた沈殿物を、３回、コールドの２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.５）で３回洗浄した。封入体の精製度と量
を、可溶化する前にＳＤＳポリアミドゲル電気泳動によって決定した。
【００３９】 単離した封入体を、６Ｍ グアニジン−ＨＣｌと２００ｍＭ ＮａＣｌ(６Ｍ Ｇ
ｕＨＣｌ緩衝溶液)を含有する１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）
に溶解し、遠心分離（１２,３００ｇ、１５分間）を行い、不溶性堆積物を除去
した。２−メルカプトエタノールを、タンパク質濃度の約５０モル倍に等しい終
濃度まで上清に添加し、１時間、室温で回転させながらインキュベーションした
。このような高濃度のグアニジン−ＨＣｌと還元剤の存在により、全く折りたた
まれていないタンパク質を生じる。ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質の再折りたたみは
、４℃で、透析を行って、２−メルカプトエタノールの非存在下、グアニジン−
ＨＣｌ濃度を低下させて行った。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pＨ８.０)およ
び２００ｍＭ ＮａＣｌ中:次の６Ｍ、３Ｍ、２Ｍ、１Ｍおよび０．５Ｍのグアニ
ジン−ＨＣｌ濃度に対して各々、２４時間、透析を行った。最初の透析は、１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pＨ８.０)および２００ｍＭ ＮａＣｌを３回取り替え
た。４回目の透析溶液（１Ｍ グアニジン−ＨＣｌ）は、２ｍＭ グルタチオン（
酸化型）と５００ｍＭ Ｌ-アルギニンも含有する。これらの試薬は、部分的に再
折りたたみされたタンパク質を適切なジスルフィド結合を形成させ、正しいタン
パク質構造を形成させる。該溶液を、凝集物を除去するために遠心分離（１３０
００ｇ）によって分離した。該試料を、遠心分離用フィルター（Centrplus cent
rifugal filter）（Amicon）を用いて、約１.５倍に濃縮した（３０００g、９０
分間）。ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、ほんの微々たる混在物を含む、約２８ｋＤａの分
子量を有するＴｆＲｓｃＦｖを含む可溶化システインのシングルバンドを示した
（図８）。
【００４０】 実施例９ 接合法によるｓｃＦｖリポソームの調製 １．ｓｃＦｖの還元 精製したｓｃＦｖを、ＤＴＴにより還元し、モノマーｓｃＦｖ-ＳＨを以下の
ように得た：ＨＢＳ(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４)
中のｓｃＦｖに、１Ｍ ＤＴＴを、１〜５０ｍＭ の終濃度になるまで添加した。
室温、５〜１０分間の回転後、該タンパク質を、１０−ＤＧカラム（Bio-Read）
で脱塩した。遊離ＳＨ基を５,５’ジチオビス−（２−ニトロベンゼン酸）（Ｄ
ＴＮＢ、Ｅllman's 試薬）によって測定し（G.L. Ellman (1959)Arch. Biochem.
Biophys. 82:70-77. P.W.Riddles, R.L.Blakely, B.Zeruer(1993)Methods Enzy
mol. 91:49-60）、ＳＨ／タンパク質モル比もしくは遊離ＳＨ／ｓｃＦｖ分子の
数として計算した（表７）。この結果は、１〜１０ｍＭＤＴＴが、ｓｃＦｖ還元
に供されたことを示す。 表７：ＴｆＲｓｃＦｖの還元
【表１３】
【００４１】 ２．リポソーム調製 ４−（p−マレイミドフェニル）ブチレート−ＤＯＰＥ（ＭＰＢ−ＤＯＰＥ）
（Avanti Polar Lipids）は、リピド総量の５〜８％モルまで、実施例３に記載
した７つのリポソーム化合物を包含する。ＭＰＢリポソームを、実施例３に記載
したと同じ方法で調製した。他のリポソーム調製方法を、カチオンリポソームを
調製するために使用することができる。例えば、Campbell MJ (Biotechniques 1
995 Jun; 18(6):1027-32)によって記述した方法から修飾したエタノール注射法
は、本発明において上手く使用した。簡単に言うと、全てのリピドを、エタノー
ル中で可溶化させ、混合し、ハミルトン（Hamilton）シリンジを用いて、５０〜
６０℃の純水を撹拌しながら注入した。該溶液を、さらに１０〜１５分間、撹拌
した。この溶液の終濃度は、１〜２ｍＭの全リピドであった。エタノール注入方
法は、敏速かつ容易で確実である。終濃度１０〜２０ｍＭになるまで、１Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７.５（ｐＨ７.０〜８.０）を添加した。我々は、マレイミド基
が水溶液中（ｐＨ７.０以上）で不安定であるとわかったので、該リポソームを
、水（ｐＨ５〜６.５）中で調製した。ｐＨは、後の被覆反応を利用するために
、ｓｃＦｖ−ＳＨに結合する前に、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.０〜７.０
〜８.０）を用いて７.０〜８.０に調整することができる。
【００４２】 ３．前結合法 ｓｃＦｖ−ＳＨを、１／５〜１／４０のタンパク質／リピド（ｗ／ｗ）比、好
ましくは１／１０〜１／２０の比で、ＭＰＢ−リポソームに添加した。該溶液を
ゆっくりと、３０分間、室温で回転して混合し、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐを生成した。
ｓｃＦｖ−Ｌｉｐを精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bクロマトグラフィ
ーで精製することが可能である。プラスミドＤＮＡを水で希釈し、１／６〜１／
２０、好ましくは１／１０〜１／１４のＤＮＡ／リピド（μｇ／ｎｍｏｌ）比で
ｓｃＦｖ−Ｌｉｐに添加した。該溶液を、数回反転させて、５−１５分間充分に
混合し、ｓｃＦｖ−ＤＮＡ複合体を生成した。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡは精製
せずに使用したが、Sepharose CL-4Bクロマトグラフィーで精製することが可能
である。８０〜１００％のｓｃＦｖがリポソームに接合していたことが分かった
。
【００４３】 Ｂ．後接合法 プラスミドＤＮＡを水で希釈し、１／６〜１／２０、好ましくは１／１０〜１
／１４のＤＮＡ／リピド（μｇ／ｎｍｏｌ）比で、ＭＰＢリポソームに添加した
。該溶液を、数回反転させて、５〜１５分間充分に混合し、ＭＰＢ−Ｌｉｐ−Ｄ
ＮＡ複合体を生成した。次いで、ｓｃＦｖ−ＳＨを該複合体に、１／５〜１／４
０、好ましくは１／１０〜１／２０のタンパク質／リピド（ｗ／ｗ）比で、複合
体に添加した。該溶液を、ゆっくりと、３０分間、室温で回転させて混合し、最
終的なｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を生成した。該ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮ
Ａは精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bクロマトグラフィーで精製するこ
とが可能である。８０〜１００％のｓｃＦｖがリポソームに接合していたことが
分かった。 ４．静脈注射のために、５０％のデキストリン溶液を、終濃度５％までｓｃＦｖ
−Ｌｉｐ−ＤＮＡに添加した。
【００４４】 実施例１０ ＥＬＩＳＡアッセイによるシステイン含有ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームの 免疫反応活性 この態様は、インビトロでのＴｆＲ（＋）細胞への結合能に関して、本発明の
接合法によって生成した抗ＴｆＲｓｃＦｖ−イムノリポソームに関する特性付与
を示す。ヒト扁平上皮細胞の頭頚部癌細胞系ＪＳＱ−３は、これらの研究に関し
てＴｆＲ（＋）標的細胞として機能する。
【００４５】 実施例４に記載したように、間接的細胞系酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）を用いて、リポソームに結合する前後のＴｆＲｓｃＦｖ免疫反応活性を測
定した。９６ウェルプレートで融合性ＪＳＱ−３細胞を、ＰＢＳ中の０.５％の
グルタルアルデヒドを用いて、１０分間、室温で固定した。該プレートを、ＰＢ
Ｓ中の５％メス子牛血清(ＦＢＳ）を用いて、３０℃で３０分間ブロッキングし
た。システイン含有ＴｆＲｓｃＦｖ単独、カチオンリポソームに接合したＴｆＲ
ｓｃＦｖ（ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームおよび非標的化リポソームを、３つ
のウェルに添加した。抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体（Ｈｂ２１
、David Fitzgerald, NIHから入手）を陽性対照として、一連のウェルに使用し
た。該プレートを、４℃で一晩インキュベーションした。該ウェルを、３回ＰＢ
Ｓで洗浄し、ＰＢＳ中３％のＦＢＳの抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Qiagen）を
各ウェルに添加し、６０分間３７℃でインキュベーションした。３回ＰＢＳ洗浄
の後、３％のＦＢＳで希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma）を、各
ウェルに添加し、３０分間３７℃でインキュベーションした。該プレートを、Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、クエン酸リン酸緩衝液(Sigma)中の基質(１００μｌ)と０．
４ｍｇ／ｍｌＯＰＤを各ウェルに添加した。発色は、各ウェルに２Ｍ スルホン
酸(１００μｌ)を添加して停止した。該プレートを、４９０ｎｍで、ＥＬＩＳＡ
プレートリーダー(Molecular Devices Corp)によって測定した。
【００４６】 間接的細胞系ＥＬＩＳＡは、Ｃ末端システインを含有する抗ＴfＲ-ｓｃＦｖが
、該免疫活性を保持することを明確に示した。ＯＤ４９０値は、タンパク質（０
.６μｇ）で０.０６０±０.６から、ＴｆＲｓｃＦｖ（１.５μｇ）で０.１００
±０.００３８およびＴｆＲｓｃＦｖ（３μｇ）で０.１３２±０.００３１まで
ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質量の増加と共に増加した。さらに、このＴfＲ-ｓｃＦ
ｖタンパク質は、陽性対照として使用した親のＨｂ２１抗トランスフェリン受容
体以上にさらに高い結合活性を示すことが分かった。Ｈｂ２１（１００μｌ）の
最高濃度に関するＯＤ４９０は、約２〜４倍低い（０.０３３±０.００８６）。
【００４７】 間接的細胞系ＥＬＩＳＡアッセイは、異なる２つのリポソーム複合体（Ｌｉｐ
（Ａ）およびＬｉｐ（Ｂ））中に本発明（実施例９）の接合方法によって同じＴ
ｆＲｓｃＦｖを組み込んだ後に実施し、カチオンリポソームを用いるこの方法の
万能性を示す。実施例９において詳細に記載されたリポソーム調製物の前および
後接合法の両方法を用いた。表８に示したように、接合法によって調製したＴｆ
ＲｓｃＦｖの免疫反応活性は、２つのリポソーム組成物の両方と複合体化するこ
とによって失わない。これは、イムノリポソーム複合体を生成するために使用し
た前および後の結合法の両方に対して真実である。該ＴｆＲｓｃＦｖ標的化リポ
プレックスを、細胞に結合することを示した。この結合は、ＴｆＲｓｃＦｖを含
まないリポソームの結合以上に非常に高く、この結合は、実際、細胞へのトラン
スフェリン受容体へのＴｆＲｓｃＦｖの結合によって介在すると考えられる。 表８：インビトロでの接合法によるＪＳＱ−３へのＴｆＲｓｃＦｖイムノリポ
ソームの結合
【表１４】
【００４８】 実施例１１ インビボにおける標的細胞の接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム介在遺伝子 トランスフェクション 我々は、プラスミドｐＬuc（これは、レポーター遺伝子として、ＣＭＶプロモ
ータの制御の下、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む）を用いる細胞における接
合法によって調製したＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム複合体のインビトロでの
トランスフェクション効率を決定した。標的リガンドとしてＴｆＲｓｃＦｖの万
能性を示すために、ここでもまた実施例１０のように、２つの異なるリポソーム
複合体（ＬＩｐ（Ａ）とＬｉｐ（Ｂ））を、ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質に接合し
た。ヒト肺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５および頭および頚部のヒト扁平上皮瘍
細胞を、これらの研究で使用した。インビボでのトランスフェクションを、２４
ウェルプレートで行った（Xu L, et al., Hum. Gene Yher.(1999)10:291-2952）
。トランスフェクション溶液を、１０％の血清存在下、細胞に添加した。２４時
間後、細胞を洗浄し、ルシフェラーゼ活性およびタンパク質濃度を測定した。該
結果は、表９Ａおよび９Ｂに示したように、分解物中のμｇタンパク質あたりの
相対的光単位（ＲＬＵ）として表現した。
【表１５】
【表１６】
【００４９】 上記結果は、接合法によって調製したシステイン含有ＴｆＲｓｃＦｖイムノリ
ポソームは、非標的化リポソームよりも３〜６倍高く、トランスフェリン標的化
リポソームよりも２〜３倍高い、インビトロで非常に高いトランスフェクション
活性を有することを示す。これは、両方のヒト腫瘍細胞系および両方のリポソー
ム組成物に関して真実である。即ち、それらは、その免疫反応活性を保持し、標
的受容体に結合することができる。表９Ａを基にすると、ｓｃＦｖリポソームを
、インビトロにおける有効な遺伝子トランスフェクション薬物として使用するこ
とができ、市販入手し得るカチオンリポソーム（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＤ
ＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびトランスフェリンよりも有効であった。本発明で開示
した該ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームは、トランスフェリン受容体と哺乳類細
胞のトランスフェクションに有用なインビトロ遺伝子トランスフェクションキッ
トのために使用することができる。
【００５０】 ＴｆＲｓｃＦｖは、トランスフェリンそれ自身よりも小さな分子である。その
ため、得られた複合体はよりコンパクトで、高いトランスフェクション効率を示
す細胞によって簡単に執り込まれる。これらの結果は、ヒトに使用するための全
身送達のためにＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームに対する利点を示す。類似サイ
ズは、微小管からの腫瘍細胞へのアクセスを増加させた。最も重要なことは、Ｔ
ｆＲ分子の場合、ＴｆＲｓｃＦｖはヒト血液産物ではない。そのため、ヒトの治
療用のトランスフェリンそれ自身の使用に関連する懸念および技術的問題は回避
される。
【００５１】 実施例１２ ヌード・マウス異種移植片モデルにおける野生型ｐ５３の接合ＴｆＲｓｃＦｖ イムノリポソーム介在発現後の全身送達 この実施例において、本発明の接合法によって生じた全身性送達の後のインビ
ボで腫瘍細胞に優先的に野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）遺伝子を持つリポプレック
スを指向するＴｆＲｓｃＦｖの能力を示す。標的リガンドとしてＴｆＲｓｃＦｖ
の万能性を示すために、明細書中の実施例１０に示したように、２つの別のリポ
ソーム組成物（Ｌｉｐ（Ａ）およびＬｉｐ（Ｂ））を、接合法によってシステイ
ン含有ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質と複合体化した。実施例９において詳細に説明
したような前接合法だけを、この研究で用いた。２.５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−
４３５ヒト肺癌細胞を、４−６週令のメス無胸腺ヌード・マウスに皮下注射した
。Martrigelコラーゲン基部膜[Collaborative Biomedical Produsts(登録商標)]
中で懸濁した１.１×１０７ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞を、４−６週令のメス
無胸腺ヌード・マウスに皮下注射して腫瘍を発病させた。５０−２００ｍｍ３の
腫瘍を持つ動物を本実験で使用した(１個体／１試験試料)。ｗｔｐ５３遺伝子を
持つ接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム、さらに非標的化Ｌｉｐ（Ｂ）および
ｗｔｐ５３本来のＤＮＡを動物の尾血管中に静脈注射した。追加対照として、ｐ
５３含有ベクタの位置にある空ベクターを保持する接合ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ
（Ａ）を、マウスに注入した。実施例７に示したように、注射後の約６０時間後
、該動物を屠殺し、腫瘍、肝臓を採取した。タンパク質を組織から単離し、各々
の試料(１００μｇ)を、抗５３モノクローナル抗体を用いるウエスタン・ブロッ
ト分析のために１０％ポリアクリルアミドゲルに流した。これら両方の腫瘍細胞
のタイプでは、外来性マウスと外来性ヒトｐ５３は、同じ位置で移動する。明細
書においてこの結果は、実施例７における記載を反映するものであった。図９に
示したように、接合法によって調製したＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐＣＭ
Ｖｐ５３リポプレクッスまたはＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ｂ）−ｐＣＭＶｐ５３
リポプレックスによって静脈注射した動物由来のＤＵ１４５およびＭＤＡ−ＭＢ
−４３５腫瘍細胞の両方は、強いｐ５３シグナルとさらに低いバンドによって示
されるような、ＤＵ１４５腫瘍細胞において最良の発現と共に、外来性ｗｔｐ５
３の高い発現レベルを示した。一方、両方の腫瘍細胞型において、Ｌｉｐ（Ａ)
組成物はいくらかＬｉｐ（Ｂ）よりも良好であり、両方のリポソーム組成物はこ
の方法の万能性を示す。外来性マウスｐ５３タンパク質のみ、これらの動物の肝
臓に顕性であった。対照的に、外因性マウスｐ５３タンパク質のみは、空のベク
ターを有する接合ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ｂ）または本来ｗｔｐ５３ＤＮＡを
用いて注入したマウスから発生した腫瘍に顕性であった。また、ｐ５３の発現に
おける若干の増加を、非標的化Ｌｉｐ（Ｂ）−ｐ５３と共にＤＵ１４５腫瘍にお
いて観察した。即ち、優先的に腫瘍細胞へｗｔｐ５３遺伝子を送達した接合Ｔｆ
ＲｓｃＦｖイムノリポソームは、２つの異なる腫瘍細胞において顕性であり、こ
の発明の方法の広い有用性を示すものである。そのため、実施例において記載し
た本発明の方法は、カチオンリポソームへの結合能を保持するだけでなく、イン
ビボおよびインビトロにおいてもトランスフェリン受容体への結合能を保持する
ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を発生させる、即ち、遺伝子治療用に、腫瘍特異性の
、標的化イムノリポソームを生成する我々の目的を満たすものであった。
【００５２】 本発明は、本明細書中で、本発明の好ましい態様の詳細を引用して記載してい
るが、この記載は、本発明の精神および特許請求の範囲の範囲内で、修飾が当業
者には容易になされるということが考えられるため、限定的意図よりむしろ説明
的であることを意図することは理解されるべきである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｓｃＦｖＴｆＲリピド−タグの構築を示す。
【図２】 図２は、全身投与に伴なう腫瘍異種移植片でのインビボにおける
ｓｃＦｖ−リポソーム−標識化ｐ５３発現のウェスタン・ブロット分析を示す。
【図３】 図３は、ｐＣＭＶｐ５３およびｐＣＭＶｐＲＯ構築物を示す。
【図４】 図４は、ｐ５３−３’Ａｄの構築を示す。
【図５】 図５は、Ｈｉｓ−タグを伴なうｓｃＦｖ−システインの構築を示
す。
【図６】 図６は、Ｈｉｓ−タグを伴なわないｓｃＦｖ−システインの構築
を示す。
【図７】 図７は、セルロース結合ドメイン(ＣＢＤ)タグとＳタグを伴なう
ｓｃＦｖ−システインの構築を示す。
【図８】 図８は、接合法によって生成した精製ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質
に関するコマジー・ブルー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。
【図９】 図９は、全身投与による腫瘍異種移植片におけるインビボでのＴ
ｆＲｓｃＦｖ−リポソーム標的化ｐ５３の発現を生じる接合法ウェスタン・ブロ
ット分析を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 シナージーン・セラピューティックス・イ ンコーポレイテッド ＳｙｎｅｒＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ ｉｃｓ， Ｉｎｃ． アメリカ合衆国20015−2601ワシントン・ ディストリクト・オブ・コロンビア、スウ ィート288、ノース・ウエスト、コネチカ ット・アベニュー5505番 (72)発明者 シュ・リアン アメリカ合衆国22209バージニア州アーリ ントン、ノース・クイーン・ストリート・ ナンバー608、1200番 (72)発明者 フアン・チェン−チェン アメリカ合衆国22209バージニア州アーリ ントン、ノース・クイーン・ストリート・ ナンバー102、1200番 (72)発明者 ウィリアム・アレキサンダー アメリカ合衆国20851メリーランド州ロッ クビル、アリソン・ドライブ1211番 (72)発明者 タン・ウェンフア アメリカ合衆国22209バージニア州アーリ ントン、ノース・クイーン・ストリート・ ナンバー608、1200番 (72)発明者 エスター・エイチ・チャン アメリカ合衆国20815メリーランド州チェ ビー・チェイス、ベール・ストリート7508 番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 DA06 EA04 GA11 HA17 4C076 AA19 BB13 CC07 CC27 EE59 EE60 FF65 FF68 GG41 4C084 AA02 AA03 AA14 BA35 BA36 BA42 BA44 CA17 MA05 MA24 MA66 NA05 NA10 NA13 NA14 ZB262 4C085 AA13 CC03 CC04 DD86 EE01 EE06 FF14 GG02 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA05 MA24 MA66 NA05 NA10 NA13 NA14 ZB26

Claims (57)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 i)カチオンリポソーム、ii）抗体もしくは抗体フラグメント
    、およびiii)核酸からなるイムノリポソーム。
  2. 【請求項２】 該抗体もしくは抗体フラグメントがトランスフェリン受容体
    に結合し得る、請求項１記載のイムノリポソーム。
  3. 【請求項３】 該核酸がＤＮＡである、請求項１記載のイムノリポソーム。
  4. 【請求項４】 該核酸が野生型ｐ５３をコードする、請求項１記載のイムノ
    リポソーム。
  5. 【請求項５】 該抗体もしくは抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求
    項１記載のイムノリポソーム。
  6. 【請求項６】 該抗体もしくは抗体フラグメントが、該抗体もしくは抗体フ
    ラグメント上のカルボキシ末端でメルカプト基の一部である硫黄原子を介して該
    カチオンリポソームに共有結合する請求項１記載のイムノリポソーム。
  7. 【請求項７】 硫黄原子がシステイン残基の一部である、請求項６記載のイ
    ムノリポソーム。
  8. 【請求項８】 該抗体もしくは抗体フラグメントが、ＭＰＢに結合したＤＯ
    ＰＥまたは別のメルカプト反応基と共有、請求項６記載のイムノリポソーム。
  9. 【請求項９】 該抗体フラグメントが単鎖である、請求項１記載のイムノリ
    ポソーム。
  10. 【請求項１０】 該抗体もしくは抗体フラグメントおよびカチオンリポソー
    ムが、1：５〜１：４０の範囲内のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で存在する
    、請求項１記載のイムノリポソーム。
  11. 【請求項１１】 該核酸および該カチオンリポソームが、1：６〜１：２０
    の範囲内の核酸：リピド（μｇ：ｎｍｏｌ）で存在する、請求項１記載のイムノ
    リポソーム。
  12. 【請求項１２】 請求項１記載のイムノリポソームを含む、医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 以下の工程： ａ）野生型ｐ５３をコードする核酸とカチオンリポソームを混合し、核酸リポソ
    ーム複合体を生成する； ｂ）トランスフェリン受容体に結合し得る抗体もしくは抗体フラグメントを調製
    し；そして ｃ）該核酸リポソーム複合体と該抗体もしくは抗体フラグメントを混合し、該核
    酸カチオンイムノリポソーム複合体を形成する；、 からなる核酸カチオンイムノリポソーム複合体を調製するための方法。
  14. 【請求項１４】 該抗体もしくは該抗体フラグメントがリピドタグを含む、
    請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該抗体もしくは該抗体フラグメントが、該核酸リポソーム
    複合体と混合する前にカルボキシ末端で還元基を含む、請求項１３記載の方法。
  16. 【請求項１６】 該還元基がメルカプト基である、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該メルカプト基がシステイン残基の一部である、請求項１
    ６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該カチオンリポソームがＭＰＢに結合したＤＯＰＥもしく
    は別のメルカプト反応基を含む、請求項１５記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該核酸がＤＮＡである、請求項１３記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該抗体もしくは抗体フラグメントおよび該カチオンリポソ
    ームが、1：５〜１：４０の範囲内のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で、該核
    酸カチオンイムノリポソームに存在する、請求項１３記載の方法。
  21. 【請求項２１】 該核酸および該カチオンリポソームが、1：６〜１：２０
    の範囲内の核酸：リピド比（μｇ：ｎｍｏｌ）で、該核酸カチオンイムノリポソ
    ームに存在する、請求項１３記載の方法。
  22. 【請求項２２】 該抗体フラグメントが単鎖である、請求項１３記載の方法
    。
  23. 【請求項２３】 以下の工程： ａ）トランスフェリン受容体に結合し得る抗体もしくは抗体フラグメントを調製
    する； ｂ）抗体もしくは抗体フラグメントとカチオンリポソームを混合し、カチオンイ
    ムノリポソームを形成する；そして ｃ）該カチオンイムノリポソームと野生型ｐ５３をコードする核酸を混合し、該
    核酸カチオンイムノリポソーム複合体を形成する； からなる核酸カチオンイムノリポソーム複合体を調製するための方法。
  24. 【請求項２４】 該抗体もしくは該抗体フラグメントがリピドタグを含む、
    請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該抗体もしくは該抗体フラグメントが該核酸リポソーム複
    合体と混合する前にカルボキシ末端で還元基を含む、請求項２３記載の方法。
  26. 【請求項２６】 該還元基がメルカプト基である、請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該メルカプト基がシステイン残基の一部である、請求項２
    ６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 該カチオンリポソームがＭＰＢ-ＤＯＰＥを含む、請求項
    ２５記載の方法。
  29. 【請求項２９】 該核酸がＤＮＡである、請求項２３記載の方法。
  30. 【請求項３０】 該抗体もしくは抗体フラグメントおよびカチオンリポソー
    ムが、1：５〜１：４０の範囲内のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で、該核酸
    カチオンイムノリポソームに存在する、請求項１３記載の方法。
  31. 【請求項３１】 該核酸および該カチオンリポソームが、1：６〜１：２０
    の範囲の核酸：リピド（μｇ：ｎｍｏｌ）で、該核酸カチオンイムノリポソーム
    に存在する、請求項２３記載の方法。
  32. 【請求項３２】 該抗体フラグメントが単鎖である、請求項２３記載の方法
    。
  33. 【請求項３３】 治療分子を必要とする動物に提供するための方法であって
    、i)カチオンリポソーム、ii）抗体もしくは抗体フラグメント、およびiii)核酸
    からなる該核酸カチオンイムノリポソームの治療上有効量を、該動物に投与する
    方法。
  34. 【請求項３４】 該複合体が全身投与される、請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 該複合体が静脈投与される、請求項３３記載の方法。
  36. 【請求項３６】 該抗体もしくは該抗体フラグメントがトランスフェリン受
    容体に結合し得る、請求項３３記載の方法。
  37. 【請求項３７】 該抗体フラグメントが単鎖である、請求項３３記載の方法
    。
  38. 【請求項３８】 該核酸がＤＮＡである、請求項３３記載の方法。
  39. 【請求項３９】 該核酸が野生型ｐ５３をコードする、請求項３３記載の方
    法。
  40. 【請求項４０】 該抗体もしくは該抗体フラグメントがリピドタグを含む、
    請求項３３記載の方法。
  41. 【請求項４１】 該抗体もしくは該抗体フラグメントが、該抗体もしくは該
    抗体フラグメント上のカルボキシ末端で還元基の一部である硫黄原子を介して該
    カチオンリポソームに共有結合する、請求項３３記載の方法。
  42. 【請求項４２】 該還元基がメルカプト基である、請求項４１記載の方法。
  43. 【請求項４３】 該メルカプト基がシステイン残基の一部である、請求項４
    ２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 該抗体もしくは該抗体フラグメントが、ＭＰＢに結合した
    ＤＯＰＥもしくは別のメルカプト反応基と共有結合する、請求項４１記載の方法
    。
  45. 【請求項４５】 該抗体もしくは該抗体フラグメントおよび該カチオンリポ
    ソームが、1：５〜１：４０の範囲のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で、該核
    酸イムノリポソーム複合体中に存在する、請求項３３記載の方法。
  46. 【請求項４６】 該核酸および該カチオンリポソームが、1：６〜１：２０
    の範囲内の核酸：リピド（μｇ：ｎｍｏｌ）で該核酸イムノリポソーム複合体中
    に存在する、請求項３３記載の方法。
  47. 【請求項４７】 該動物がヒトである、請求項３３記載の方法。
  48. 【請求項４８】 該動物が癌にかかっている、請求項３３記載の方法。
  49. 【請求項４９】 該癌が、ｉ）頭頚部癌、ii）肺癌、iii）前立腺癌からな
    る群から選択される、請求項４８記載の方法。
  50. 【請求項５０】 該カチオンイムノリポソームが、トランスフェリン受容体
    結合抗体フラグメントを含む該カチオンイムノリポソームを含むキット。
  51. 【請求項５１】 該抗体フラグメントが単鎖である、請求項５０記載のキッ
    ト。
  52. 【請求項５２】 該抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項５０記載
    のキット。
  53. 【請求項５３】 該抗体フラグメントがカチオンリポソームに接合する、請
    求項５０記載のキット。
  54. 【請求項５４】 該抗体フラグメントおよびカチオンリピドが、1：５〜１
    ：４０の範囲のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で存在する、請求項５０記載の
    キット。
  55. 【請求項５５】 該カチオンイムノリポソームが水溶液中に存在する、請求
    項５０記載のキット。
  56. 【請求項５６】 該カチオンイムノリポソームから分けた容器において陽性
    対照として使用するための核酸をさらに含む、請求項５０記載のキット。
  57. 【請求項５７】 ルシフェラーゼ群、β-ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光
    タンパク質から選択されたレポーター遺伝子をコードする該核酸をさらに含む、
    請求項５０記載のキット。
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