CN112996543A - 表面修饰的细胞外囊泡 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及表面修饰的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡包含与细胞外囊泡的膜蛋白共价连接的外源性多肽标签。在特定的实施方式中，所述标签通过分选酶介导的连接共价连接于微囊泡的膜蛋白。本文还公开了制备所述细胞外囊泡的方法和使用所述负载有治疗性分子的细胞外囊泡用于治疗疾病的方法。

Description

表面修饰的细胞外囊泡
发明领域
本发明涉及细胞外囊泡，特别是但不仅限于涉及表面修饰的细胞外囊泡。
背景
包括小干扰RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，反义寡核苷酸(ASO)， 信使RNA(mRNA)，长非编码RNA和CRISPR–Cas9基因组编辑向导RNA(gRNA) 的RNA疗法是可编程疗法的新兴形式，其以高度的特异性和灵活性靶向患病的 人类基因组。用于RNA药物递送的常见载体，包括病毒(例如，腺病毒、腺相 关病毒、慢病毒、逆转录病毒)，脂质转染试剂和脂质纳米颗粒，通常是免疫 原性和/或细胞毒性的。因此，将RNA药物递送至多数主要组织和癌细胞(包括白血病细胞和实体瘤细胞)的安全有效策略还不明确。
细胞外囊泡(EV)已被用于将RNA递送给患者。EV由体内所有类型的细胞 分泌，以用于细胞间通讯。EV包括来自多囊泡体的小囊泡(10-100nm)，来 自活细胞质膜的微囊泡(100-1000nm)和来自凋亡细胞质膜的凋亡小体 (500-5000nm)。基于EV的药物递送方法是理想的，但是EV的生产有局限性。 为了生产高纯度和均质的EV，需要严格的纯化方法，例如蔗糖密度梯度超速离 心或尺寸排阻色谱法，但它们耗时且不可扩展。此外，由于产量很低，以至于 需要数十亿个细胞才能获得足够的EV，而且通常无法获得如此数量的细胞。原 代细胞的永生化将面临着将癌基因DNA和反转录转座子元件与RNA药物一起转 移的风险。实际上，所有有核细胞都存在一定程度的水平基因转移风险，因为 无法预先预测哪些细胞已经带有危险的DNA，哪些没有。因此，仍然需要一种 有效的方法来将核酸材料递送给患者，以减少副作用。
此外，为了使基于EV的治疗更具特异性，通过用逆转录病毒或慢病毒转染 或转导的质粒在供体细胞中表达肽或抗体，然后进行基于抗生素或荧光的选择， EV可以被改造以含有特异性结合特定靶细胞的肽或抗体。这些方法构成了水平 基因转移的高风险，因为高表达的质粒很可能被整合到EV中，并最终转移到靶 细胞中。质粒中的遗传元件可能会导致肿瘤发生。如果制造出稳定细胞系来生 产EV，则包括突变DNA、RNA和蛋白质在内的大量致癌因子会被封装在EV中，并 将肿瘤发生的风险传递至靶细胞。另一方面，基因工程方法不适用于红细胞， 由于其缺乏核糖体，质粒无法在红细胞中转录。基因工程方法也不适用于难以 转染或转导的干细胞和原代细胞。
近来，有一种抗体包被EV的新方法，所述抗体融合有乳黏附素的C1C2结构 域，其与EV表面上的磷脂酰丝氨酸(PS)结合。该方法使得EV与抗体结合，而 无需任何基因修饰。但是，C1C2是疏水蛋白，因此需要在哺乳动物细胞中进行 繁琐的纯化方法，并需要存储在含有牛血清白蛋白的缓冲液中。此外，EV与C1C2 融合抗体的结合基于C1C2与PS之间的瞬时亲和结合。
因此，对用于治疗或诊断目的的稳定EV仍然有强烈需求。鉴于以上考虑而 设计了本发明。
先前已经提出了分选酶介导的M13噬菌体衣壳蛋白功能化的方法(US 2014/0030697 A1)。这种功能化使病毒表面具有多种结构，对于产生新的病 毒表面修饰(可用于产生表面相互作用)很有用。
先前已经通过使用基因工程细胞开发了用于红细胞表面修饰的分选方法 (WO2014/183071 A2)。在该方法中，人CD34+祖细胞被基因工程化以表达 包含红细胞膜蛋白和目的肽的融合蛋白。在一些实施方式中，融合蛋白包含与 肽融合的II型红细胞跨膜蛋白，所述肽包含被分选酶识别的用于表面修饰的序 列。
先前已经看到试剂与哺乳动物细胞的缀合(WO 2014/183066 A2)。该文 献提出了将试剂缀合至哺乳动物细胞的方法，其通过在分选酶存在下，将活细 胞与分选酶和包括分选酶识别基序和试剂的分选酶底物接触。
发明内容
发明人设计了一种用于细胞外囊泡表面的酶修饰的方法。因此，本公开涉 及在其表面上包含标签的修饰的细胞外囊泡，以及制备和使用这种修饰的细胞 外囊泡的方法。
细胞外囊泡(EV)由于其天然生物相容性，高递送效率，低毒性和低免疫 原性特性而成为新兴的药物递送载体。EV通常是通过对其供体细胞进行遗传修 饰来工程改造的，但是，基因工程方法在原代细胞中效率低下，并且最终存在 水平基因转移的风险，这对于临床应用是不安全的。在此，我们描述了一种使 用蛋白质连接酶以共价偶联包括肽、小分子、蛋白质和抗体在内的分子修饰EV 表面的方法。对于EV工程化而言，此方法简单，安全且有效。它可以应用于多 种类型的EV，包括那些来自原代细胞的EV。细胞外囊泡是膜来源的囊泡，因此 包含膜，通常是脂质双层。
EV介导的药物(包括小分子，蛋白质和核酸)的递送是一个有吸引力的平 台，因为EV的天然生物相容性能克服大多数体内递送的障碍。EV通常是无毒且 无免疫原性的。它们很容易被多种细胞类型吸收，但是它们可能具有一些抗吞 噬标记(例如CD47)，帮助它们逃避网状内皮系统巨噬细胞和单核细胞的吞噬 作用。而且，EV能够很好地通过内皮间连接渗透，甚至穿过血脑屏障，因此， 它们是多功能的药物载体。3具有临床价值的是，肿瘤细胞经常使用P-糖蛋白来 清除许多化合物，而P-糖蛋白过表达引起的多药耐受机制不会阻碍EV的递送。
最普遍的情况是，本公开提供了一种在其表面上具有标签的细胞外囊泡。 所述标签可以是肽，多肽或蛋白质。所述标签优选是外源的，意指在细胞外囊 泡的表面上通常不存在该标签。所述标签可以与细胞外囊泡共价连接。例如， 所述标签可以共价连接至细胞外囊泡的膜。它可以与细胞外囊泡膜内的蛋白质 相连，例如具有N末端甘氨酸或带有侧链氨基基团(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、 精氨酸、赖氨酸和组氨酸)残基的蛋白质。所述肽，多肽或蛋白质可以与小分 子例如生物素、FLAG表位(FLAG标签)、HA标签或多组氨酸(例如6xHis标签) 缀合。在一些情况下，所述标签可以包含生物素、FLAG标签、HA标签或多组氨酸中的一种或多种。这些可以促进标签的检测，分离或纯化。所述肽或小分子 任选地是与靶细胞表面上的受体结合的配体。所述肽、多肽或蛋白质可以是靶 向部分或结合部分。在某些情况下，所述靶向部分或结合部分是抗体或抗原结 合片段。在一些方面，所述抗原结合片段是单结构域抗体(sdAb)或单链抗体 (scAb)。所述sdAb/scAb对靶细胞可以具有结合亲和力。所述标签可以包含 治疗性分子或实体。所述标签可以包含标记分子或实体。
所述细胞外囊泡可以是微囊泡或外泌体。尽管细胞外囊泡可以源自任何合 适的细胞，但是本文特别考虑了源自红细胞(RBC)的细胞外囊泡。
在某些方面，本文所述的细胞外囊泡载有一种或多种负荷分子。换句话说， 所述细胞外囊泡包裹负荷，例如蛋白质、肽、小分子或核酸。所述负荷可以是 内源的或外源的。所述负荷可以是治疗性的。所述负荷可以是紫杉醇。所述负 荷可以是标记分子或实体，例如可检测的小分子。在某些情况下，所述负荷是 选自下组的核酸：反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、mRNA、gRNA或质粒。所述负 荷可能是外源的，意指在产生细胞外囊泡的细胞中通常找不到该负荷。
本文还公开了包含一种或多种本文公开的细胞外囊泡的组合物。优选地， 组合物中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或 基本上所有的细胞外囊泡都与标签连接。在一些情况下，组合物中至少75％、 至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或基本上所有的细胞外 囊泡包裹一种或多种负荷分子。
本文还公开了在药物中使用的细胞外囊泡和包含细胞外囊泡的组合物。这 样的组合物和细胞外囊泡可以以有效量施用于需要治疗的受试者。所述受试者 可以需要治疗或可以患有遗传性疾病、炎性疾病、癌症、自身免疫性疾病、心 血管疾病或胃肠道疾病。所述癌症任选地选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺 癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、鼻咽癌、肾癌或神经胶质瘤。
在本文公开的某些方面，提供了一种通过以下方法获得的带标签的细胞外 囊泡，所述方法包括：获得细胞外囊泡并将所述细胞外囊泡与标签连接。所述 标签优选通过共价键连接。它可以与细胞外囊泡膜中的分子连接，例如在膜表 面的分子。可以使用蛋白质连接酶将细胞外囊泡与标签连接。
在另一方面，提供了一种抑制癌细胞生长或增殖的方法，包括使癌细胞与 本发明的细胞外囊泡或组合物接触。本文还公开了体外方法，其包括使细胞与 细胞外囊泡接触。
本文还公开了产生修饰的细胞外囊泡的方法，以及通过这种方法获得的细 胞外囊泡。最普遍的情况是，这样的方法包括在允许标签和细胞外囊泡的表面 蛋白共价结合的条件下，使细胞外囊泡与标签和蛋白连接酶接触。这样的方法 还可以包括步骤：使细胞外囊泡与负荷接触，并电穿孔以将负荷包裹在细胞外 囊泡中。细胞外囊泡可以在与标签接触之前或之后与负荷接触。优选地，细胞 外囊泡在与标签接触之前与负荷接触。在这种情况下，与标签和蛋白质连接酶 接触的细胞外囊泡是包裹负荷分子的细胞外囊泡或“负载的细胞外囊泡”。产 生修饰的细胞外囊泡的方法可以进一步包括纯化、分离或洗涤细胞外囊泡的步 骤。在用标签标记了细胞外囊泡之后，进行该步骤。纯化、分离或洗涤细胞外 囊泡可以涉及细胞外囊泡的差速离心。差速离心可以涉及蔗糖梯度或冷冻蔗糖 垫离心。在优选的方面，用于将标签共价连接至细胞外囊泡的蛋白质连接酶是 分选酶或天冬酰胺基内肽酶(AEP)及其衍生物。优选地，所述连接酶是分选 酶A或其衍生物。所述连接酶可以是天冬酰胺基内肽酶1或其衍生物。在将标签 与细胞外囊泡连接后，优选将连接酶从细胞外囊泡洗涤或以其他方式除去。
本文所述的方法利用标签。所述标签将包含蛋白质连接酶识别序列。将选 择蛋白质连接酶识别序列以对应于用于标记细胞外囊泡的连接酶。例如，在连 接酶是分选酶的情况下，所述标签将包含分选酶识别序列。所述标签可以任选 地包含间隔子或接头。所述间隔子或接头优选地分布在结合分子和标签的肽识 别位点之间。所述间隔子可以是柔性接头，例如包含约10个或更多个氨基酸的 肽接头。
接头肽可在C端具有连接酶结合位点，从而使其通过肽连接酶与EV偶联， 并在N端具有反应性氨基酸残基(例如GL)使其与肽连接酶反应，从而与sdAb 缀合。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不允许或明确避免 这种组合。
附图概述
现在将参照附图进行讨论，以说明本发明原理的实施例和实验，其中：
图1.使用分选酶将EV与单结构域抗体(sdAb)缀合。A.用于纯化分选酶A， sdAb和EV缀合的实验流程图。B.His标签的分选酶A(18kDa)在FPLC纯化之前 (输入)和之后(洗脱)的蛋白质凝胶电泳分析。C.具有His标签、Myc标签、 HA标签、FLAG标签和分选酶结合位点LPETG的抗mCherry(mC)sdAb可变重链(VHH) (总计20kDa)在进行FPLC纯化之前(输入)和之后(洗脱)的蛋白质凝胶电 泳分析。D.来自3个供体的RBCEV的平均浓度和大小分布，SEM为灰色(100000x 稀释度)。E.RBCEV的代表性透射电子显微镜图像，放大倍数为86000X(右)。比例尺，200nm。F.在分选标记反应之前和之后，分选酶A、sdAb和RBCEV中的 His标签的蛋白质免疫印迹(WB)分析。
图2.使用分选酶将EV与肽缀合。A.缀合了含有用于自我识别或“不要吃我” 信号的部分CD47的肽，分选酶结合序列和生物素标签的RBCEV的蛋白质免疫印 迹(WB)分析。B.RBCEV上的生物素的蛋白质免疫印迹分析，RBCEV来自3个不 同供体，分别纯化，与包含EGFR结合序列、分选酶结合序列和生物素标签 (bi-YG20)的YG20肽缀合，使用分选酶A反应。使用HRP缀合的链霉亲和素来 检测生物素。C.使用分选酶A反应，用AF647偶联的链霉亲和素珠(Strep-AF647) 结合未包被的RBCEV或结合用bi-YG20包被的RBCEV，以Alexa-Fluor-647(AF647， APC通道)对前向散射(FSC-A)的形式进行FACS分析。D.使用质谱法鉴定RBCEV 中最丰富的蛋白质(得分>1,000)。基于红细胞中已知的相互作用预测蛋白质 相互作用。E.使用生物素-链霉亲和素拉下法和质谱法鉴定与生物素化肽分选 标记的膜蛋白。根据丰度和检测置信度计算质谱(MS)分数。
图3.EGFR阳性SKBR3乳腺癌细胞对YG20肽包被的EV的摄取。A.用未包被的 RBC-EV或YG20肽包被的RBCEV处理的具有低或高EGFR表达的SKBR3细胞中，以 PKH26(PE通道)对FSC-A的形式进行FACS分析，门控如B所示。所有RBCEV均用 PKH26标记。来自RBCEV标记实验最后一次洗涤的上清液用作阴性对照。B.门控 低EGFR和高EGFR的SKBR3细胞群。使用与FITC偶联的抗EGFR抗体检测EGFR表达。 C.在A中确定的PKH26阳性细胞的平均百分比,±SEM(n＝3次重复)。Student’ s t检验结果显示为**P<0.01。
图4.使用分选酶将EV与肽缀合。A.用OaAEP1表达载体转化大肠杆菌，经过 亲和纯化和SEC纯化后，对OaAPE1(49.7kDa)和His-Ub-OaAPE1连接酶(59.5 kDa带有His-Ub标签)进行的凝胶电泳。B.对RBCEV上的生物素进行蛋白质免疫 印迹分析，所述RBCEV使用OaAEP1连接酶辍合生物素化的TRNGL肽，通过HRP结 合的链霉亲和素检测。C.使用OaAEP1连接酶，将AF647偶联的链霉亲和素珠 (Strep-AF647)结合至未包被的RBCEV或用bi-TRNGL包被的RBCEV，以 Alexa-Fluor-647(AF647，APC通道)对前向散射区域(FSC-A)的形式进行FACS 分析。D.对RBCEV中的生物素进行蛋白质印迹分析，所述RBCEV使用连接酶辍合 生物素化的EGFR靶向(ET)肽。E.比较来自3种不同供体(D1-D3)的bi-TR肽 连接的RBCEV中的生物素检测结果，并用生物素化的辣根过氧化物酶(HRP)进 行连续稀释。基于蛋白质印迹带的强度，其相对于系列稀释液中生物素化HRP 的拷贝，计算每个EV的肽数。
图5.具体递送方式。使用蛋白连接酶(例如分选酶A或OaAEP1)将RBCEV与 sdAb或肽辍合，然后负载治疗药物，例如细胞毒性小分子、RNA、用于基因治 疗的DNA、用于治疗或诊断的蛋白质。肽和sdAb与靶细胞表面的特定受体的结 合，导致药物通过RBCEV递送并在靶细胞中产生后续治疗作用。
图6.在细胞外囊泡上添加标签。该示意图说明了具有代表性的例子，该例 子说明了如何通过蛋白质连接酶(在该代表性例子中为分选酶A)的作用将具 有蛋白质连接酶识别序列的标签(在该代表性例子中为LPETG)添加到细胞外 囊泡中。
图7.白血病EV与肽的连接。A.用尺寸排阻色谱法纯化THP1细胞中的EV，洗 脱30个流份。使用Nanosight颗粒分析仪检测EV，并使用BCA测定法测量蛋白质 浓度。B.对THP1 EV中的生物素进行的蛋白质印迹分析，使用OaAEP连接酶将THP1 EV与生物素化的TRNGL肽辍合。
图8.EGFR靶向肽的特异性结合促进了EGFR阳性细胞对分选标记的RBCEV的 摄取。(A)EGFR在人白血病(MOLM13)，乳腺癌(SKBR3和CA1a)和肺癌(H358 和HCC827)细胞中的表达，使用具有FITC抗EGFR抗体的FACS分析。(B)生物 素化的对照(Cont)或EGFR靶向(ET)肽与3种所示细胞系的结合，通过结合 生物素的AF647-链霉亲和素的FACS分析显示。(C)使用RBCEV处理过的H358细 胞中钙黄绿素(Calcein)AM荧光的FACS分析，所述RBCEV已用钙黄绿素-AM标记 并使用分选酶A与Cont或ET肽缀合。直方图中的颜色以与图中相同的模式显示。Student’s t-检验***P<0.001。
图9.连接酶介导的RBCEV与EGFR靶向肽的缀合也可增强RBCEV的特异性摄 取。(A)钙黄绿素-AM标记的RBCEV处理后的H358细胞中钙黄绿素AM荧光的FACS 分析，所述RBCEV使用OaEAP1连接酶与Cont或ET肽缀合。(B)竞争性结合EGFR 的阻断肽对连接的RBCEV摄取的影响。(C)化学抑制剂，EIPA(阻断大胞饮)， 菲律宾菌素(Filipin)(阻断网格蛋白介导的内吞作用)，渥曼青霉素 (Wortmannin)(阻断甘露糖受体介导的内吞作用)对RBCEV摄取的影响，所 述RBCEV被钙黄绿素-AM标记并与ET肽缀合。Student’s t-检验*P<0.05，*** P<0.001。
图10.靶向EGFR的RBCEV在携带EGFR阳性肺癌的小鼠的肺中富集。(A)(A) 在尾静脉注射DiR标记的RBCEV前1小时，通过眶后注射残影细胞或RBC，用红细 胞残影细胞膜或完整红细胞对小鼠进行处理。24小时后，在器官中观察到荧光。 (B)在NSG小鼠的尾静脉中注射了1百万个H358荧光素酶细胞。3周后，使用体 内成像系统(IVIS)在肺部检测到生物发光。肺癌小鼠通过眶后注射用红细胞 进行预处理。1小时后，给小鼠注射0.1mg DiR标记的RBCEV。8小时后，使用 IVIS在器官中观察到DiR荧光。静脉注射H358荧光素酶细胞3周后，肺中的生物 发光信号显示了肺癌小鼠的代表性图像。对注射了未包被的RBCEV，对照/ET肽连接的RBCEV或RBCEV洗脱液的小鼠的器官进行了代表性的DiR荧光成像。每个 器官的平均DiR荧光强度是相对于平均强度，减去流通对照中检测到的信号。 Student’s t-检验*P<0.05，**P<0.001。
图11.与自身肽的缀合可防止RBCEV吞噬并增强RBCEV在循环中的可用性。 (A)用对照或自身肽(SP)连接的RBCEV处理的MOLM13和THP1单核细胞中钙黄 绿素AM的FACS分析。直方图中的颜色与图中的颜色相同。(B)被生物素化抗 GPA抗体结合的链霉亲和素珠的FACS分析，该抗体在尾静脉注射0.2mg CFSE标 记的RBCEV后5分钟捕获了NSG小鼠血浆中的RBCEV。(C)DiR标记的RBCEV的生 物分布，所述RBCEV使用分选酶A与对照肽或SP辍合。Student’s t-检验***P <0.001。
图12.RBCEV与sdAb的缀合可通过接头肽增强。(A)在His-标签亲和纯化 之前(输入)和之后(洗脱液)的EGFR VHH sdAb的凝胶电泳分析。(B)两步 连接反应的示意图。在第一步中，将具有连接酶结合位点的接头肽缀合到RBCEV 上带有GL的蛋白质上。在第二步中，将接头肽连接至带有NGL的VHH。(C)RBCEV 上的VHH(使用抗VHH抗体)的蛋白质印迹分析，所述RBCEV使用OaAEP1连接酶 与EGFR靶向的VHH缀合。连接的RBCEV用SEC洗涤。(D)在4℃孵育1小时后，结 合到HCC827细胞上的未包被的RBCEV或ET-VHH连接的RBCEV上的GPA(RBCEV标志 物)FACS分析。
图13.单域抗体促进靶细胞对RBCEV的特异性摄取。(A)使用RBCEV处理的 EGFR阳性H358细胞中钙黄绿素AM的FACS分析,所述RBCEV用钙黄绿素AM标记并 使用OaAEP1连接酶与EGFR靶向性VHH sdAb通过或不通过接头肽缀合。(B)使 用RBCEV处理的表达表面mCherry的CA1a细胞中钙黄绿素AM的FACS分析，所述 RBCEV用钙黄绿素AM标记，并使用OaAEP1连接酶与mCherry靶向性VHH sdAb通过 或不通过接头肽缀合。颜色在直方图和条形图中显示的方式相同。Student’s t-检验*P<0.05，**P<0.05，***P<0.001。
图14.使用EGFR靶向性RBCEV递送RNA和药物。(A)使用连接了ET-VHH的 RBCEV将荧光素酶mRNA递送至H358细胞。处理24小时后，在H358细胞的裂解物 中测量荧光素酶活性。阴性对照包括未包被的和mCherry-VHH连接的RBCEV。(B) 使用RBCEV将紫杉醇(PTX)递送至H358肿瘤的示意图。使用超声将PTX负载到 RBCEV中。洗涤负载的RBCEV，并与ET肽连接。向NSG小鼠的尾静脉注射H358细 胞。在肺部检测到肿瘤3周后，仅用RBCEV或PTX治疗小鼠，每3天1次，共5次。 并且每3天测量一次生物发光。(C)使用HPLC测定在RBCEV中PTX的负载效率。(D)小鼠上半身的生物发光信号，小鼠仅用20mg/kg PTX或等量PTX负载的 RBCEV(带有或不带有EGRF靶向肽)治疗，每3天1次。从治疗的第一天开始， 每3天1次，使用IVIS测量肺部的生物发光。显示了每种情况下小鼠的代表图像。
发明详述
现在将参考附图讨论本发明的各方面和实施例。对于本领域技术人员而言， 其他方面和实施例将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本 文。
本文描述了在酶(如蛋白质或蛋白质连接酶或变体)存在下用标签修饰细 胞外囊泡表面的方法。所述标签可以是允许细胞外囊泡结合至靶细胞以进行靶 标特异性递送的结合分子。
细胞外囊泡
如本文所用，术语“细胞外囊泡”是指从细胞释放到细胞外环境中的小囊 泡状结构。
细胞外囊泡(EV)是直径在50到1000nm之间，质膜或内体膜的基本为球形 的碎片。在病理和生理条件下，细胞外囊泡从各种细胞类型中释放出来。细胞 外囊泡有膜。该膜可以是双层膜(即脂质双层)。该膜可以源自质膜。因此， 细胞外囊泡的膜可具有与其来源的细胞相似的组成。在本文公开的一些方面， 细胞外囊泡是基本上透明的。
术语细胞外囊泡包括外泌体、微囊泡、膜微粒、外体、泡和凋亡小体。细 胞外囊泡可通过向外出芽和裂变产生。产生可以是自然过程，也可以是化学诱 导或增强的过程。在本文公开的一些方面，细胞外囊泡是通过化学诱导产生的 微囊泡。
基于它们的大小和形成的起源，细胞外囊泡可以分类为外泌体、微囊泡或 凋亡小体。根据本文公开的发明，微囊泡是一类特别优选的细胞外囊泡。优选 地，本发明的细胞外囊泡已经从质膜脱落，并且不起源于内体系统。
本文公开的细胞外囊泡可衍生自各种细胞，例如红细胞、白细胞、癌细胞、 干细胞、树突状细胞、巨噬细胞等。在优选的实施例中，细胞外囊泡衍生自红 细胞，尽管可以使用任何来源的细胞外囊泡，例如白血病细胞和细胞系。
微囊泡或微粒通过质膜的直接向外出芽和裂变而产生。微囊泡通常比外泌 体大，直径范围为100-500nm。在一些情况下，微囊泡的组合物包含直径范围 为50-1000nm、50-750nm、50-500nm、50-300nm、101-1000nm、101-750nm、 101-500nm、或100-300nm或101-300nm的微囊泡。优选地，直径为100-300nm。 例如在组合物、药物组合物、药物或制剂中存在的微泡群体中将包含具有不同 直径范围的微囊泡，微囊泡样品内微囊泡的中位直径可以在50-1000nm、 50-750nm、50-500、50-300nm、101-1000nm、101-750nm、101-500nm或100-300nm 或101-300nm的范围内。优选地，中位直径在100-300nm之间。
外泌体的直径范围从大约30到大约100nm。在一些情况下，外泌体的组合 物包含直径范围为10-200nm、10-150nm、10-120nm、10-100nm、20-150nm、 20-120nm、25-110nm、25-100nm或30-100nm的外泌体。优选地，直径为30-100nm。 例如在组合物、药物组合物、药物或制剂中存在的外泌体群体将包含具有不同 直径范围的外泌体，样品内外泌体的中位直径范围可以为10-200nm、10-150nm、 10-120nm、10-100nm、20-150nm、20-120nm、25-110nm、25-100nm或30-100nm。 优选地，中位直径在30-100nm之间。
在各种培养的细胞中观察到外泌体，包括淋巴细胞、树突状细胞、细胞毒 性T细胞、肥大细胞、神经元、少突胶质细胞、施旺细胞和肠上皮细胞。外泌 体来源于位于多泡体(胞浆中的大囊)内的内体网络。这些囊融合到质膜上， 然后释放到细胞外环境中。
凋亡小体或小泡是最大的细胞外囊泡，范围为1-5μm。经历凋亡的有核细 胞经历了几个阶段，从核染色质的凝结开始，膜起泡到最终释放包括凋亡小体 的EV。
优选地，细胞外囊泡衍生自人类细胞或人类起源的细胞。本发明的细胞外 囊泡可以从已经与囊泡诱导剂接触的细胞中诱导。囊泡诱导剂可以是钙离子载 体、溶血磷脂酸(LPA)或佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)。
红细胞细胞外囊泡(RBC-EV)
在本文公开的某些方面，细胞外囊泡衍生自红细胞。出于多种原因，红细 胞是EV的良好来源。因为红细胞是无核的，所以RBC-EV包含的核酸少于其他来 源的EV。RBC-EV不包含内源性DNA。RBC-EV可能包含miRNA或其他RNA。RBC-EV 不含致癌物质，例如致癌DNA或DNA突变。
RBC-EV可包含血红蛋白和/或红细胞膜整合蛋白(stomatin)和/或脂筏标 记蛋白(flotilin-2)。它们可以是红色的。通常，RBC-EV在透射电子显微镜 下呈现弧形(凹形)表面或“杯形”。RBC-EV的特征可以在于具有细胞表面CD235a。 根据本发明的RBC-EV的直径可以为约100至约300nm。在某些情况下，RBC-EV的 组成包括直径范围从50-1000nm、从50-750nm、从50-500nm、从50-300nm、从 101-1000nm、从101-750nm、从101-500nm、或从100-300nm，或从101-300nm的 RBC-EV。优选地，直径为从100-300nm。一系列RBC-EV将包括具有不同直径范 围的RBC-EV，RBC-EV样本中RBC-EV的中位直径范围可以从50-1000nm、从 50-750nm、从50-500nm、从50-300nm、从101-1000nm、从101-750nm、从101-500nm、 或从100-300nm、或从101-300nm。优选地，中位直径在100-300nm之间。
优选地，RBC-EV衍生自人或动物血液样品或衍生自原代细胞或固定化红细 胞系的红细胞。血细胞可以与待治疗的患者进行类型匹配，因此血细胞可以是A型、B型、AB型、O型或Oh血型。优选地，血液是O型型。血液可以是恒河猴阳 性或恒河猴阴性的。在某些情况下，血液是O型和/或恒河猴阴性，例如O-型。 血液可以已被确定为没有疾病或病症，例如没有HIV、镰状细胞贫血、疟疾。 但是，可以使用任意的血型。在某些情况下，RBC-EV是自体的，并且从待治疗 的患者的血液样本中提取。在某些情况下，RBC-EV是同种异体的，并不是来自 待治疗的患者的血液样本。
RBC-EV可以从红细胞样本中分离。从红细胞获得EV的方案在本领域中是已 知的，例如在Danesh等人，(2014)血液，2014年1月30日；123(5)：687-696 中所述。用于获得EV的有效方法可包括以下步骤：提供或获得包含红细胞的样 品；诱导红细胞产生细胞外囊泡；以及分离细胞外囊泡。样品可以是全血样品。 优选地，已经从样品中除去了红细胞以外的细胞，从而样品的细胞成分是红细 胞。
样品中的红细胞可以浓缩或与全血样品的其他成分(例如白细胞)分开。 红细胞可通过离心浓缩。样品可以进行白细胞去除。
包含红细胞的样品可以基本上仅包含红细胞。通过使红细胞与囊泡诱导剂 接触，可以从红细胞诱导细胞外囊泡。囊泡诱导剂可以是钙离子载体、溶血磷 脂酸(LPA)或佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)。
可以通过离心(有或没有超速离心)，沉淀，过滤工艺(例如切向流过滤) 或尺寸排阻色谱法分离RBC-EV。以这种方式，RBC-EV可以与RBC和混合物的其 他组分分离。
可以通过以下方法从红细胞获得细胞外囊泡：获得一红细胞样品；使红细 胞与囊泡诱导剂接触；并分离诱导的细胞外囊泡。
可通过低速离心和使用去白细胞滤器将红细胞与含有白细胞和血浆的全 血样品分离。在某些情况下，红细胞样本不包含其他类型的细胞，例如白细胞。 换句话说，红细胞样品基本上由红细胞组成。红细胞在与囊泡诱导剂接触之前， 可以在诸如PBS的缓冲液中稀释。囊泡诱导剂可以是钙离子载体、溶血磷脂酸 (LPA)或佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)。囊泡诱导剂可以是约10nM 的钙离子载体。红细胞可以与囊泡诱导剂过夜接触，或接触至少1、至少2、至 少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少8 9、至少10、至少11、至少12或超过12小时。可以对混合物进行低速离心以除去RBC，细胞碎片或其他 非RBC-EV物质和/或使上清液通过约0.45um的注射器式过滤器。RBC-EV可以通 过超速离心来浓缩，例如以100000x g的速度离心。可以通过超速离心至少10 分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少1小时来浓 缩RBC-EV。浓缩的RBC-EV可以在冷PBS中悬浮。它们可以在60％的蔗糖垫上分 层。蔗糖垫可包含冷冻的60％蔗糖。通过在100000x g下进行超速离心至少1 小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少1小时7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、 至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时，至少18小 时或更长时间，来使RBC-EV在蔗糖垫上分层。优选地，可以通过在100,000x g 下进行超速离心约16小时，使RBC-EV在蔗糖垫上分层。然后收集蔗糖垫上方的 红色层，从而获得RBC-EV。所获得的RBC-EV可以进行进一步处理，例如洗涤， 标记和任选地负载。
标签
本发明的细胞外囊泡在其表面具有标签。标签优选是蛋白质或肽序列。标 签可以是肽或蛋白质。它可以是修饰的肽或蛋白质，例如糖基化或生物素化的 蛋白质或肽。标签可以共价连接至细胞外囊泡，例如共价连接至细胞外囊泡中 的膜蛋白。在细胞外囊泡形成之后，标签可能已被添加至细胞外囊泡。标签可 以通过序列连接至细胞外囊泡，所述序列包含蛋白质连接酶识别序列或衍生自 蛋白质连接酶识别序列的序列，或由蛋白质连接酶识别序列或衍生自蛋白质连 接酶识别序列的序列组成。例如，标签可以通过序列与细胞外囊泡连接，所述 序列与蛋白质连接酶识别序列具有100％序列同一性，或与蛋白质连接酶识别 序列具有大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％或大约40％的 序列同一性。氨基酸序列可以包含LPXT。
标签存在于囊泡的外表面上，并因此暴露于囊泡外环境。发明人发现，细 胞外囊泡的表面修饰减少了巨噬细胞对细胞外囊泡的摄取，并改善了循环中细 胞外囊泡的利用率，以及增强了非内源性物质或负荷向靶细胞的特异性递送。
标签可以是外源分子。换句话说，标签是一种非天然存在于囊泡的外表面 的分子。在某些情况下，标签是外源分子，其不存在于细胞外囊泡衍生自的细 胞或红细胞中。
标签可以增加细胞外囊泡循环中的稳定性、摄取效率和可用性。这样的标 签可以增强已经具有某些内在治疗特性的细胞外囊泡的作用，例如用于心脏再 生或疫苗接种的分别来自间充质干细胞或来自树突状细胞的细胞外囊泡。
在某些情况下，标签的作用是在体内的循环系统和器官中，呈递细胞外囊 泡和含有负荷的细胞外囊泡。肽和蛋白质可以充当治疗分子，例如阻断/激活 靶细胞功能或呈递抗原以进行疫苗接种。它们还可以用作生物标志物检测(例 如毒素诊断)的探针。
标签优选地包含功能结构域和蛋白质连接酶识别序列。所述功能性结构域 可以能够结合至靶标部分，能够检测或能够诱导治疗效果。功能性结构域可以 结合靶分子。包含这种功能性结构域的标签在本文中可以称为结合分子。结合 分子是能够与靶分子特异性相互作用的分子。包含结合部分的细胞外囊泡对于 将负荷或治疗剂递送至具有靶分子的细胞可能特别有用。合适的结合分子包括 抗体和抗原结合片段(有时称为抗体片段)，配体分子和受体分子。结合分子 将结合感兴趣的靶标。靶标可以是与感兴趣的细胞(例如癌细胞)相关联的分 子，例如在其表面上表达的分子。配体可以与靶细胞上的生物分子(例如受体 分子)形成复合物。
合适的结合分子包括抗体和抗原结合片段。片段，例如Fab和Fab2片段，可 以用作基因工程抗体和抗体片段。抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)结 构域参与抗原识别，这一事实最早通过蛋白酶消化实验发现。通过啮齿动物抗 体的“人源化”进行了进一步的证实。啮齿动物来源的可变结构域可以与人源 的恒定结构域融合，使得所得抗体保留啮齿动物亲本抗体的抗原特异性 (Morrison等人(1984)美国科学院院报81，6851-6855)。在本文公开的细 胞外囊泡中有用的抗体或抗原结合片段将识别和/或结合至靶分子。靶分子可以是存在于癌细胞表面上的蛋白质。
从涉及细菌表达抗体片段的实验中已知抗原特异性是由可变结构域赋予 的并且不依赖于恒定结构域，这些抗体片段均包含一个或多个可变结构域。这 些分子包括类Fab分子(Better等人(1988)科学240，1041)；Fv分子(Skerra 等人(1988)科学240，1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL伴侣结构 域通过柔性寡肽连接(Bird等(1988)科学242，423；Huston等人(1988) 美国科学院院报85，5879)和单结构域抗体(dAb)，其包含分离的V结构域 的(Ward等人(1989)自然341，544)。在Winter和Milstein(1991)自然349， 293-299中找到了涉及合成保留其特异性结合位点的抗体片段的技术概述。可 用于本文的抗体和片段可以是人的或人源化的、鼠类、骆驼科动物、嵌合的或 来自任何其他合适的来源。
所谓“ScFv分子”，我们意指其中VH和VL伴侣结构域共价连接的分子，例 如通过肽或通过柔性寡肽直接地连接。Fab、Fv、ScFv和sdAb抗体片段均可在 大肠杆菌中表达并从大肠杆菌中分泌出来，因此可轻松生产大量所述片段。
完整抗体和F(ab')2片段是“二价”的。“二价”是指所述抗体和F(ab') 2片段具有两个抗原结合位点。相反，Fab、Fv、ScFv和sdAb片段是单价的，仅 具有一个抗原结合位点。由于其尺寸小，单价抗体片段尤其可用作标签。
用于本文的优选的结合分子是sdAb。所谓“sdAb”是指由一个，两个或多 个单体可变抗体结构域组成的单结构域抗体。sdAb分子有时称为dAb。
在某些情况下，结合分子是单链抗体或scAb。scAb由共价连接的VH和VL伴 侣结构域(例如通过肽或通过柔性寡肽直接地连接)和任选的轻链恒定结构域 组成。
其他合适的结合分子包括对靶分子具有亲和力的配体和受体。标签可以是 细胞表面受体例如EGFR结合肽的配体。实例包括链霉亲和素和生物素，抗生物 素蛋白和生物素，或其他受体(例如纤连蛋白和整联蛋白)的配体。小尺寸的 生物素对结合分子的生物学活性几乎没有影响。由于生物素和链霉亲和素，生 物素和抗生物素蛋白，以及纤连蛋白和整联蛋白以高亲和力和特异性结合它们 的配对，因此它们作为结合分子非常有用。抗生物素蛋白-生物素复合物有蛋 白质与配体之间已知最强的非共价相互作用(Kd＝10-15M)。键的形成迅速， 并且一旦形成，就不受极端的pH值、温度、有机溶剂和其他变性剂的影响。生物素与链霉亲和素的结合也很强，形成迅速，在生物技术应用中很有用。
功能性结构域可以包含治疗剂或由治疗剂组成。治疗剂可以是酶。它可以 是凋亡诱导剂或抑制剂。
功能性结构域可以包含抗原，抗体识别序列或T细胞识别序列。标签可以 包含一种或多种衍生自一种或多种抗原肽的短肽。所述肽可以是抗原肽的片段。 合适的抗原肽是本领域技术人员已知的。
功能性结构域可包含可检测部分或由可检测部分组成。可检测部分包括荧 光标记、比色标记、光致变色化合物、磁性颗粒或其他化学标记。可检测部分 可以是生物素或His标签。
标签可以包含间隔子或接头部分。间隔子或接头可以布置在标签和蛋白质 连接酶识别序列之间。间隔子或接头可以连接至标签的N或C末端。优选地，间 隔子或接头被布置从而不干扰或阻碍标签的功能，例如标签的靶结合活性。间 隔子或接头优选是肽序列。在特定的方面，间隔子或接头是一系列至少1、至 少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10个氨基酸， 至少11个氨基酸，至少12个氨基酸，至少13个氨基酸，至少14个氨基酸或至少15个氨基酸。优选地，间隔子或接头是柔性的。间隔子可以包含多个甘氨酸和 /或丝氨酸氨基酸。
间隔子和接头序列是技术人员已知的，并且描述于例如Chen等人，Adv DrugDeliv Rev(2013)65(10)：1357-1369，其通过引用整体并入本文。在一些 实施方式中，接头序列可以是柔性接头序列。柔性接头序列允许由接头序列连 接的氨基酸序列的相对运动。柔性接头是技术人员已知的，并且在Chen等人， Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10)：1357-1369中鉴定了几种。柔性接头 序列通常包含高比例的甘氨酸和/或丝氨酸残基。
在一些实施方式中，间隔子或接头序列包含至少一个甘氨酸残基和/或至 少一个丝氨酸残基。在一些实施方式中，所述接头序列由甘氨酸和丝氨酸残基 组成。在一些实施方案中，间隔子或接头序列具有1-2、1-3、1-4、1-5或1-10 个氨基酸的长度。
我们观察到包含间隔子或接头可以提高细胞外囊泡与标签部分之间的蛋 白质连接酶反应的效率。如本文所用，术语“标签”可涵盖包含标签、间隔子 和蛋白质连接酶识别序列的肽。
合适的蛋白质连接酶识别序列是本领域已知的。蛋白质连接酶识别序列被 在标记细胞外囊泡的方法中使用的蛋白质连接酶识别。例如，如果所述方法中 使用的蛋白质连接酶是分选酶，则蛋白质连接酶识别序列是分选酶结合位点。 在那些情况下，序列可以是LPXTG(其中X是任何天然存在的氨基酸)，优选LPETG。 或者，在酶为AEP1的情况下，蛋白质连接酶识别序列可以为NGL。蛋白质连接 酶结合位点可以布置在肽或蛋白质的C末端。
标签可以另外包含一个或多个其他序列，以在标签本身的生产过程中，在 标记方法期间或在随后的纯化中帮助标签的纯化或加工。可以使用本领域已知 的任何合适的序列。例如，序列可以是HA标签、FLAG标签、Myc标签、His标签 (例如多聚His标签或6xHis标签)。
本文提供了产生适于标记细胞外囊泡的标签的方法。所述方法可以涉及工 程化肽。所述方法可以包括化学合成肽。所述方法可以包括工程化核酸序列以 表达标签。例如，所述方法可以包括制备编码标签的核酸构建体。核酸构建体 可以编码包含标签和一个或多个间隔子序列、蛋白质连接酶识别序列，一个或 多个其他序列的多肽。例如，核酸构建体可以编码包含标签、间隔子和蛋白质 连接酶序列或由标签、间隔子和蛋白质连接酶序列组成的多肽。
还提供了编码如本文公开的标签的核酸。所述核酸可以包含在载体内。所 述载体可以包含编码标签、间隔子和蛋白质连接酶识别序列的核酸。载体可以 是大肠杆菌表达载体。
标记方法
本文公开了标记细胞外囊泡的方法。所述方法包括将标签连接至细胞外囊 泡的表面。所述方法可包括例如通过共价键将标签结合至细胞外囊泡。所述方 法可以包括将标签连接至细胞外囊泡的膜。优选地，本文公开的标记方法不涉 及已知与磷脂酰丝氨酸(PS)结合的乳粘附素的C1C2结构域。优选地，标签在 形成囊泡之后被添加到细胞外囊泡，而不是被添加到衍生出囊泡的细胞，从而 使得标签在囊泡形成过程中被包裹在囊泡中。所述方法可以包括以下步骤：使 细胞外囊泡和标签与蛋白质连接酶或其变体接触，并且在允许标签和细胞外囊 泡的表面蛋白之间共价结合的条件下孵育混合物。该条件允许标签裂解并结合 至细胞外囊泡的表面。所使用的条件取决于所使用的连接酶。
在本文公开的一些方法中，在单独的步骤过程中用标签标记细胞外囊泡。 换句话说，制备标签并将其连接至细胞外囊泡。
在其他方法中，在多步骤过程中用标签标记细胞外囊泡。在这样的方法中， 首先将细胞外囊泡连接至肽以产生肽标记的细胞外囊泡，然后将肽标记的细胞 外囊泡连接至功能性结构域，例如结合部分或靶向部分。在一些方法中，在与 功能性结构域连接之前，细胞外囊泡被标记至一种或多种肽。所述方法可以包 括在允许肽与细胞外囊泡的表面蛋白之间共价结合的条件下，使细胞外囊泡与 肽和第一蛋白质连接酶接触，从而产生肽标记的细胞外囊泡。所述方法然后可 以包括在允许共价结合至细胞外囊泡的肽和功能性结构域肽之间的共价结合 的条件下，使肽标记的细胞外囊泡与功能性结构域肽和第二蛋白质连接酶接触。
在这些情况下，肽可以在肽的任一末端包含连接酶结合位点。连接酶结合 位点可以包含连接酶识别位点和连接酶受体位点。肽可以在一端包含连接酶识 别位点，并且在另一端包含连接酶受体位点。或者，连接酶结合位点均可包含 连接酶识别位点。连接酶识别位点可以是被连接酶识别的特定位点。连接酶可 以催化在连接酶识别位点和连接酶受体位点的一个或多个氨基酸残基之间形 成键。例如，连接酶识别位点可以包含NGL，而连接酶受体位点可以包含GL。
连接酶结合位点可以对应于相同或不同的连接酶。例如，连接酶结合位点 可以都是分选酶结合位点，或者可以都是AEP1结合位点。或者，连接酶结合位 点可以对应于不同的连接酶，例如分选酶结合位点和AEP1结合位点。第一蛋白 质连接酶可以是与第二蛋白质连接酶相同的连接酶，或者第一和第二蛋白质连 接酶可以不同。在某些情况下，第一和第二蛋白质连接酶是分选酶。在某些情 况下，第一蛋白质连接酶和第二蛋白质连接酶均为分选酶A。
功能性结构域肽可包含一个或多个功能性结构域和连接酶结合位点。连接 酶结合位点可以包含连接酶识别位点或连接酶受体位点。优选地，连接酶结合 位点包括连接酶识别位点。连接酶结合位点对应于肽上的连接酶结合位点，使 得连接酶可以催化肽的连接酶结合位点与功能性结构域肽的连接酶结合位点 之间的连接。
所述肽和功能性结构域肽可以包含再一个的功能分子序列，例如生物素、 FLAG标签、HA标签、His标签或其他序列。此类方法可以涉及在细胞外囊泡上 构建标签，并连续添加不同的组分，例如接头、一个或多个功能性结构域，例 如可检测的标签、结合部分或靶向部分。
在某些情况下，所述方法涉及分别制备每个组分。所述方法可以涉及制备 或提供细胞外囊泡、标签、接头、肽和/或连接酶。所述方法可以包括组合选 自标签、细胞外囊泡和连接酶的一种、两种或三种组分以形成混合物。所述混 合物可以包含其他试剂，例如缓冲剂。所述混合物可以通过以任意顺序组合组 分来制备。例如，可以将三种组分基本上同时地组合，或者可以在添加第三试 剂之前，制备两种组分的混合物并储存一段时间。
可以将混合物在约0℃至约30℃，约4℃至约25℃，约4℃或约25℃下孵育 至少15分钟、30分钟、1小时、或2小时、或3小时。优选地，将混合物轻轻地 搅拌。以这种方式，蛋白质连接酶通过在结合分子和细胞外囊泡的表面蛋白之 间形成共价键，而将结合分子贴附在细胞外囊泡的表面上。
优选地，混合物的pH是酸性的。pH可以为8.0或更低。pH值可以低于8、7、 6、5、4、3、2或1。
所述方法可以包括从混合物中分离修饰的细胞外囊泡的步骤。分离可包括 超速离心，或尺寸排阻色谱法或过滤。差速离心可以包括将所得混合物添加至 冷冻的蔗糖垫中并进行离心。术语“蔗糖垫”是指在离心过程中建立的蔗糖梯 度。可以通过使用约40％至约70％，约50％至约60％或约60％，优选约60％蔗 糖的溶液来制备蔗糖梯度。
在某些情况下，标记的细胞外囊泡可借助标签分离，例如通过亲和层析分 离。分离可以利用标签肽(例如HA标签，FLAG标签，His标签或其他序列)的 一个或多个功能域进行，。
离心后，收集纯化的修饰的细胞外囊泡，并任选地用如磷酸盐缓冲盐水 (PBS)的缓冲溶液洗涤。然后进行离心以收集纯化的修饰的细胞外囊泡。所 述方法可以包括一个或多个洗涤步骤。优选地，所述方法包括两个或三个洗涤 步骤。
所述细胞外囊泡可以被负载或未负载。换句话说，细胞外囊泡可以包裹负 荷或不包含外源材料。在某些情况下，在标签连接之后，细胞外囊泡负载有负 荷。优选地，所述负荷在标签连接之后被负载。换句话说，制备了标记的细胞 外囊泡。然后将负荷负载到标记的细胞外囊泡中。
优选的方法包括使细胞外囊泡与标签接触。所述方法可以包括使细胞外囊 泡和标签与蛋白质连接酶进一步接触。细胞外囊泡和标签可以在适合于诱导标 签连接到细胞外囊泡的条件下接触。例如，标签和囊泡可以在缓冲液(例如蛋 白质连接酶缓冲液)中接触。囊泡和标签可以接触足够的时间以发生标记。
所述方法可以包括洗涤标记的细胞外囊泡以除去连接酶的步骤。
本文还公开了在其表面具有标签的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡通过本文 公开的方法获得。以这种方式标记的细胞外囊泡不同于从标记的细胞获得的细 胞外囊泡，因此是从头开始(ab initio)的标记。例如，细胞外囊泡和标签 之间的连接在组成上可以是不同的。
在一个实施方式中，所述方法将标签连接至细胞外囊泡的表面。所述方法 可以将标签连接至细胞外囊泡的膜。在一个实施方式中，所述方法通过共价键 将标签连接至细胞外囊泡的表面。在另一个实施方式中，所述方法通过共价键 将标签连至细胞外囊泡的膜。在另一个实施方式中，所述标记细胞外囊泡的方 法将细胞外囊泡与含有间隔子或接头的标签连接。在另一个实施方式中，所述 标记细胞外囊泡的方法将细胞外囊泡与包含功能分子的标签连接，所述功能分 子能被检测或能够诱导治疗作用。
在一个实施方式中，标记细胞外囊泡的方法在酸性条件下进行。在一些实 施方式中，标记细胞外囊泡的方法包括使细胞外囊泡和标签与蛋白质连接酶接 触的步骤。在一些实施方式中，标记细胞外囊泡的方法包括使细胞外囊泡和标 签与分选酶接触的步骤。在一些实施方式中，标记细胞外囊泡的方法包括使细 胞外囊泡和标签与分选酶A接触的步骤。在一些实施方式中，标记细胞外囊泡 的方法标记未负载的细胞外囊泡。在一些实施方式中，标记细胞外囊泡的方法 标记负载的细胞外囊泡。
本文公开的某些方法包括将标记的细胞外囊泡配制成药物产品的步骤。这 可能涉及添加一种或多种药物赋形剂或载体，例如缓冲液或防腐剂。在某些情 况下，所述方法可涉及冷冻、冻干或以其他方式保存细胞外囊泡或包含细胞外 囊泡的组合物。
制备标签
本文公开的方法可以涉及制备标签。所述标签可以是重组蛋白。标签的制 备可能涉及分子生物学技术，例如在Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》， 纽约：冷泉港出版社，1989中述及，或本领域中其他已知的方法。所述标签可 以被提前制备并存储。例如，冷冻、冷藏、冻干或其他提前制备的方式。
所述标签必须包含一个能够与EV结合的结合位点。因此，根据所使用的蛋 白质连接酶的类型来制备或合成标签，即包括用于蛋白质连接酶识别的相应结 合位点。例如，当所用的蛋白质连接酶是分选酶或其衍生物时，结合分子带有 分选酶结合位点；或当蛋白质连接酶是AEP时(例如OaAEP1)，结合分子带有 OaAEP1结合位点。具体而言，所述分选酶A识别序列可以是LPXTG(其中X是任 何天然存在的氨基酸)，优选LPETG。分选酶B识别序列可以是NXZTN(其中X是 任何天然存在的氨基酸)或NP(Q/K)(T/S)(N/G/S)(D/A)，分选酶C酶 在它们识别各种分类信号和氨基基团的能力中表现出独特的差异性。
所述标签可以被工程化以包含间隔子或接头。所述间隔子或接头可以布置 在结合分子和标签的肽识别位点之间。所述间隔子可以是柔性接头，例如包含 约10个或更多个氨基酸的肽接头。
所述接头肽可以是一个独立的肽，在一个末端具有连接酶结合位点(例如 NGL)，从而允许其使用肽连接酶与EV偶联，并在另一个末端具有反应性氨基 酸残基(例如GL)使其与肽连接酶反应从而与sdAb缀合。所述接头肽应至少为 10个氨基酸。它还可以包含Myc标签、His标签或HA标签以进行检测。它可以包 含聚乙二醇(PEG)以防止吞噬作用。
为避免寡聚，可使用2个接头肽而不是1个。一种接头肽具有C端NGL以允许 其与EV连接和N端与二苯并环辛炔(DBCO)基团缀合的半胱氨酸。另一个接头 具有一个可将其连接到带有NGL的sdAb的N末端GL，和一个带有叠氮基团(N3) 的C末端赖氨酸。将2种肽分别连接到RBCEV和sdAb之后，可以使用DBCO和叠氮 化物基团之间的点击化学反应将它们连接起来。
标签还可任选地包含能够被检测或能够诱导治疗作用的功能性分子。功能 性分子可以能够结合靶分子。包含用于结合的功能分子的细胞外囊泡对于将负 荷或治疗剂递送至具有靶分子的细胞可能特别有用。合适的功能性结合分子包 括抗体和抗原结合片段(有时称为抗体片段)，配体分子和受体分子。结合分 子将结合感兴趣的靶标。靶标可以是与感兴趣的细胞(例如癌细胞)相关联的 分子，例如在其表面上表达的分子。
功能性结构域可以包含治疗剂或由治疗剂组成。治疗剂可以是小分子，酶 或凋亡诱导剂或抑制剂。
功能性结构域可以包含抗原，抗体识别序列或T细胞识别序列。标签可以 包含一种或多种衍生自一种或多种抗原肽的短肽。所述肽可以是抗原肽的片段。 合适的抗原肽是本领域技术人员已知的。
功能性结构域可包含可检测部分或由可检测部分组成。可检测部分包括荧 光标记、比色标记、光致变色化合物、磁性颗粒或其他化学标记。可检测部分 可以是生物素或His标签。
标签的制备可以包括工程化编码标签的核酸。核酸可以包含编码功能性结 构域的序列和蛋白质连接酶识别序列。核酸也可以包括编码间隔子或接头的核 酸。编码间隔子或接头的核酸可以布置在功能性结构域和蛋白质连接酶识别序 列之间。
还提供了包含编码标签的核酸的载体。所述载体可以是表达载体，用于在 细胞(例如大肠杆菌)的培养物中表达标签。
蛋白表达
适用于在细胞中产生本发明的肽或多肽(例如标签或负荷分子)的分子生 物学技术是本领域众所周知的，例如在Sambrook等人，《分子克隆：实验室手 册》纽约：冷泉港出版社，1989年中提出的那些技术。
肽可以从核苷酸序列表达。核苷酸序列可以包含在细胞中存在的载体中， 或者可以整合到细胞的基因组中。
如本文所用，“载体”是用作运载体将外来遗传物质转移到细胞中的寡核 苷酸分子(DNA或RNA)。载体可以是用于在细胞中表达外源遗传物质的表达载 体。这样的载体可以包括启动子序列，其与编码要表达的基因序列的核苷酸序 列可操作地连接。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任 何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于从本发明的载体表达植物 天冬氨酸蛋白酶。合适的载体包括质粒、二元载体、病毒载体和人工染色体(例 如酵母人工染色体)。
在本说明书中，术语“可操作地连接”可以包括这样的情况，其中所选核 苷酸序列和调节性核苷酸序列(例如启动子和/或增强子)以使得核苷酸序列 的表达受到调节序列的影响或控制(从而形成表达盒)的方式共价连接。因此， 如果调节序列能够影响核苷酸序列的转录，则该调节序列可操作地连接至所选 核苷酸序列。然后在适当情况下，可以将所得的转录物翻译成所需的蛋白质或 多肽。
适合于多肽表达的任何细胞都可以用于产生本发明的肽。所述细胞可以是 原核生物或真核生物。优选地，所述细胞是真核细胞，例如酵母细胞、植物细 胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在某些情况下，所述细胞不是原核细胞，因为 某些原核细胞不适用与真核生物相同的翻译后修饰。另外，在真核生物中可能 有非常高的表达水平，并且使用适当的标签可以更容易地从真核生物中纯化蛋 白质。也可以利用特异性质粒以增强蛋白质向培养基中分泌。
产生目的肽(例如标签)的方法可以包括培养或发酵经修饰以表达所述肽 的真核细胞。所述培养或发酵可在提供有适当养分、空气/氧气和/或生长因子 的生物反应器中进行。分泌的蛋白质可通过将培养基/发酵液与细胞分离，提 取蛋白质内容物，并分离单个蛋白以分离分泌的天冬氨酸蛋白酶来收集。培养、 发酵和分离技术是本领域技术人员众所周知的。
生物反应器包括一个或多个可以在其中培养细胞的容器。生物反应器中的 培养可以连续进行，反应物连续流入反应器，培养的细胞连续流出反应器。或 者，培养可以分批进行。生物反应器监测和控制环境条件，例如pH、氧气、流 入和流出容器的流速以及容器内的搅动，从而为培养的细胞提供最佳条件。
培养表达目的肽的细胞后，优选分离所述肽。可以使用本领域已知的从细 胞培养物中分离蛋白质的任何合适方法。为了从培养物中分离出目的蛋白质， 可能有必要首先从含有目的蛋白质的培养基中分离培养的细胞。如果目的蛋白 质是从细胞分泌的，则可通过离心将细胞与含有分泌蛋白质的培养基分离。如 果目的蛋白质聚集在细胞内，例如在细胞的液泡中，则有必要在离心之前破坏 细胞，例如使用超声、快速冻融或渗透裂解法。离心将产生含有培养细胞或培 养细胞的细胞碎片的沉淀，以及含有培养基和目的蛋白质的上清液。
然后可能需要从上清液或培养基中分离目的蛋白质，所述上清液或培养基 可以包含其他蛋白质和非蛋白质成分。从上清液或培养基中分离蛋白质成分的 常用方法是沉淀。不同溶解度的蛋白质会在不同浓度的沉淀剂(例如硫酸铵) 下沉淀。例如，在低浓度的沉淀剂下提取水溶性蛋白质。因此，通过添加不同 的浓度增加的沉淀剂，可以区分具有不同溶解度的蛋白质。随后可使用透析法 从分离的蛋白质中去除硫酸铵。
区分不同蛋白质的其他方法是本领域已知的，例如离子交换层析和尺寸色 谱法。这些可以用作沉淀的替代方案，或者可以在沉淀之后进行。
在本文公开的方法中有用的肽和蛋白质可以被纯化，或者可以已经经过纯 化步骤。本文公开的方法可以涉及纯化蛋白质或肽的一个或多个步骤。例如， 可以使用亲和层析法纯化蛋白质或肽。
一旦从培养物中分离出目标蛋白质后，可能有必要浓缩蛋白质。浓缩目的 蛋白的许多方法是本领域已知的，例如超滤或冻干。
蛋白连接酶
本文公开的标记方法可涉及使用蛋白质连接酶将细胞外囊泡与标签连接。 蛋白质连接酶可以是转肽酶。术语蛋白质连接酶和肽连接酶在本文可互换使用。 适用于本文公开的方法的蛋白质连接酶可以以低成本在细菌(如大肠杆菌)中 以高纯度大规模生产。连接酶介导的反应是可再现的，具有可预测的速率和靶 标。连接酶不改变细胞外囊泡的物理性质，并且连接酶可以通过洗涤容易地去 除。
合适的蛋白质连接酶促进标签在细胞外囊泡表面上的结合。换句话说，标 签充当连接酶的底物。
本文公开的方法中使用的蛋白质连接酶可以是能够通过形成化学键，优选 共价键来促进物质与蛋白质结合的任何酶。特别地，蛋白质连接酶能够促进标 签与细胞外囊泡表面或表面上的分子的连接。蛋白质连接酶的任何变体也包括 在本发明中，例如但不限于同工酶和同种酶(alloenzymes)。还包括具有在 不影响蛋白质连接效果的情况下对蛋白质连接酶的结构进行的修饰的变体。
在一些方面，用于将标签共价连接至细胞外囊泡的蛋白质连接酶是分选酶、 生物素蛋白质连接酶(BPL)、泛素连接酶或天冬酰胺基内肽酶(AEP)及它们 的衍生物，例如AEP嵌合蛋白、AEP片段或AEP突变体。优选地，所述连接酶是 分选酶A或其衍生物，例如分选酶A嵌合蛋白、分选酶A片段或分选酶A突变体。 所述连接酶可以是天冬酰胺基内肽酶1或其衍生物，例如天冬酰胺基内肽酶1嵌 合蛋白、天冬酰胺基内肽酶1片段或天冬酰胺基内肽酶1突变体。在将标签与细 胞外囊泡连接后，优选将连接酶从细胞外囊泡洗涤或以其他方式除去。
在某些情况下，转肽酶是分选酶。分选酶是源自原核生物的酶，其通过识 别和裂解羧基末端分选信号来修饰表面蛋白。分选酶可以将许多肽连接到在 RBC表面具有N端甘氨酸残基的未修饰的蛋白质，这些肽在其C末端均通过分选 酶识别序列延伸。
在某些情况下，连接酶是分选酶A，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分选酶A(NCBI登录号：BBA25062.1 GI：1236588748)。肺炎链球菌 (Streptococcuspneumoniae)分选酶A(NCBI登录号：CTN13080.1 GI： 906766293)，单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)分选酶A (NCBI登录号：KSZ47989.1 GI：961372910)，粪肠球菌(Enterococcus faecium) 分选酶A(NCBI登录号：OZN21179.1 GI：1234782246)。或者，连接酶可以是 与已知分选酶A序列具有100％序列同一性的酶，或与已知分选酶A序列具有约90％、约80％、约70％、约60％、约50％或约40％序列同一性的酶。此外，蛋 白质连接酶可以是具有与分选酶A相同的酶功能的酶。
在某些情况下，连接酶是分选酶B，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分选酶B(NCBI登录号：KPE24466.1 GI：929343259)，单核细胞增 生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)分选酶B(NCBI登录号：KSZ47109.1 GI：961372026)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)分选酶B(NCBI 登录号：EJH14940.1 GI：395904018)，艰难梭菌(Clostridioides difficile) 分选酶B(NCBI登录号：AKP43679.1 GI：873321415)。或者，连接酶可以是 与已知分选酶B序列具有100％序列同一性的酶，或与已知分选酶B序列具有约 90％、约80％、约70％、约60％、约50％或约40％序列同一性的酶。一个序列。 此外，蛋白质连接酶可以是具有与分选酶B相同的酶功能的酶。
在某些情况下，连接酶是分选酶C，例如粪肠球菌(Enterococcus faecium) 分选酶C(NCBI登录号：KWW64427.1 GI：984823861)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)分选酶C(NCBI登录号：EIA07041.1 GI：379642509)，蜡状芽 孢杆菌(Bacillus cereus)Sortase C(NCBI登录号：AJG96560.1 GI：753363636)， 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)分选酶B(NCBI登录号： WP_075491524.1GI：1129540689)。或者，连接酶可以是与已知分选酶C序列 具有100％序列同一性的酶，或与已知分选酶C序列具有约90％、约80％、约70 ％、约60％、约50％或约40％序列同一性的酶。一个序列。此外，蛋白质连接 酶可以是具有与分选酶C相同的酶功能的酶。
在所述酶是分选酶的情况下，标记细胞外囊泡的方法是分选标记方法(Sortagging method)。分选酶A识别序列可以是LPXTG(其中X是任何天然存 在的氨基酸)，优选LPETG。分选酶B识别序列可以是NXZTN(其中X是任何天然 存在的氨基酸)，也可以是NP(Q/K)(T/S)(N/G/S)(D/A)，分选酶C酶 在它们识别各种分类信号和氨基基团的能力中表现出独特的差异性。
在某些情况下，蛋白质连接酶是AEP1(天冬酰胺基内肽酶1)。它可以是 兰花耳草(Oldenlandia affinis)OaAEP1(NCBI登录号：ALG36105.1 GI： 931255808)。它可以是OaAEP1-Cys247丙氨酸肽酶或其变体。也可以是拟南芥 (Arabidopsis thaliana)天冬酰胺基内肽酶(例如NCBI登录号：Q39119.2 GI： 148877260)，水稻(Oryza sativa)天冬酰胺基内肽酶(例如NCBI登录号： BAC41387.1 GI：26006022)，蝶豆(Clitoria ternatea)天冬酰胺基内肽酶 (例如NCBI登录号：ALL55653.1 GI：944204395)。或者，连接酶可以是与已 知的天冬酰胺基内肽酶序列具有100％序列同一性的酶，或与已知的天冬酰胺 基内肽酶序列具有约90％、约80％、约70％、约60％、约50％或约40％的序列 同一性的酶。一个序列。此外，蛋白质连接酶可以是具有与天冬酰胺基内肽酶 相同的酶功能的酶。
当所述酶是天冬酰胺基内肽酶时，蛋白质连接酶识别序列可以是NGL。
在某些情况下，蛋白质连接酶是蝶豆粘酶(butelase)。它可以是蝶豆 (Clitoriaternatea)粘酶1(例如NCBI登录号：6DHI_A GI：1474889693)。 或者，连接酶可以是蝶豆(Clitoria ternatea)粘酶2
在本文公开的方法中有用的蛋白连接酶可以从商业来源获得，或者可以由 大肠杆菌或其他细菌或酵母细胞培养物中产生。
负荷(Cargo)
本文公开的细胞外囊泡可以负载或含有负荷。负荷，也称为负载，可以是 核酸、肽、蛋白质、小分子、糖或脂质。负荷可以是非天然存在的或合成的分 子。负荷可以是治疗性分子，例如治疗性寡核苷酸、肽、小分子、糖或脂质。 在某些情况下，负荷不是治疗分子，例如可检测的部分或可视化试剂。负荷在 递送至靶细胞后可在靶细胞中发挥治疗作用。例如，负荷可以是在靶细胞中表 达的核酸。它可以起到抑制或增强特定目的基因或蛋白质表达的作用。例如， 蛋白质或核酸可以用于编辑靶基因以进行基因沉默或修饰。
优选地，负荷是外源性分子，有时称为“非内源性物质”。换句话说，负 荷是在细胞外囊泡或其来源的细胞中非天然存在的分子。优选将这种负荷在形 成囊泡之后装载到细胞外囊泡中，而不是由细胞装载或产生，从而也将其包含 在细胞外囊泡中。
在某些情况下，负荷可以是核酸。负荷可以是RNA或DNA。核酸可以是单链 或双链的。负荷可以是RNA。RNA可以是治疗性RNA。RNA可以是小干扰RNA(siRNA)、 信使RNA(mRNA)、向导RNA(gRNA)、环状RNA、微小RNA(miRNA)、piwiRNA (piRNA)、转运RNA(tRNA)或通过化学合成或体外转录产生的长非编码RNA (lncRNA)。在一些情况下，负荷是反义寡核苷酸，例如，其具有与内源核酸 序列互补的序列，例如转录因子、miRNA或其他内源mRNA。
负荷可以编码感兴趣的分子。例如，负荷可以是编码Cas9或另一种核酸酶 的mRNA。
在细胞中，反义核酸与相应的mRNA杂交，形成双链分子。反义核酸干扰mRNA 的翻译，因为细胞不会翻译双链的mRNA。使用反义方法抑制基因的体外翻译是 本领域公知的(参见例如Marcus-Sakura，Anal.Biochem.1988,172:289)。 此外，可以使用与DNA直接结合的反义分子。反义核酸可以是单链或双链核酸。 反义核酸的非限制性实例包括siRNA(包括其衍生物或前体，例如核苷酸类似 物)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、saRNA(小活化RNA)和小核 仁RNA(snoRNA)或它们的某些衍生物或前体。反义核酸分子可以刺激RNA干扰(RNAi)。
因此，反义核酸负荷可以干扰靶基因的转录，干扰靶mRNA的翻译和/或促 进靶mRNA的降解。在某些情况下，反义核酸能够诱导靶基因表达的减少。
如本文所用的“siRNA”、“小干扰RNA”、“小RNA”或“RNAi”是指形 成双链RNA的核酸，当与所述基因或靶基因在同一个细胞中表达时，该双链RNA 具有减少或抑制该基因或靶基因表达的能力。杂交形成双链分子的核酸的互补 部分通常具有基本或完全的同一性。在一个实施方式中，siRNA或RNAi是与靶 基因具有基本或完全的同一性并形成双链siRNA的核酸。在实施方式中，siRNA 通过与互补细胞mRNA相互作用从而干扰互补mRNA的表达来抑制基因表达。通常， 核酸的长度为至少约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度 为15-50个核苷酸，而双链siRNA的长度为约15-50个碱基对)。在一些实施方 式中，长度为20-30个碱基核苷酸，优选地，长度为约20-25或约24-29个核苷 酸，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
RNAi和siRNA描述于例如Dana等人，Int J Biomed Sci.2017；13(2):48-57， 其通过引用整体并入本文。反义核酸分子可以包含与靶核酸序列(例如FHR-4) 互补的双链RNA(dsRNA)或部分双链RNA。通过在分子内的第一RNA部分和第二 RNA部分之间的互补配对形成双链RNA分子。RNA序列(即一部分)的长度通常 小于30个核苷酸的长度(例如29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、 18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸)。在一些实施方式 中，RNA序列的长度是18至24个核苷酸的长度。在某些siRNA分子中，RNA分子 的互补的第一部分和第二部分形成发夹结构的“茎”。这两个部分可以通过连 接序列连接，这可以在发夹结构中形成“环”。连接序列的长度可以变化，并 且可以是例如5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸的长度。合适的连接 序列是本领域已知的。
可以通过本领域已知的方案设计用于本发明的方法的合适的siRNA分子， 参见例如Elbashire等人，自然，2001 411：494-8；Amarzguioui等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2004 316(4):1050-8；和Reynolds等人，Nat.Biotech. 2004,22(3):326-30。siRNA分子的制备细节可在一些商业供应商的网站上找 到，例如Ambion、Dharmacon、GenScript、英杰(Invitrogen)和OligoEngine。 通常，可以使用BLAST比对程序检查任何潜在的siRNA候选序列与其他核酸序列 的任何可能匹配或核酸序列的多态性(请参阅美国国家医学图书馆互联网网 站)。通常，大量siRNA被产生和筛选以获得有效的候选药物，参见美国专利 No.7,078,196。siRNA可以从载体表达和/或化学或合成产生。合成的RNAi可获 自商业来源，例如英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。RNAi载体也可以从 商业来源获得，例如英杰公司。
核酸分子可以是miRNA。术语“miRNA”根据其清楚的普通含义使用，并且 是指能够转录后调节基因表达的小的非编码RNA分子。在一个实施方式中， miRNA是与靶基因具有基本或完全同一性的核酸。在一些实施方式中，miRNA通 过与互补细胞mRNA相互作用从而干扰互补mRNA的表达来抑制基因表达。通常， miRNA的长度至少为约15-50个核苷酸的长度(例如，miRNA的每个互补序列的 长度为15-50个核苷酸的长度，而miRNA的长度为约15-50个碱基对)在某些情 况下,核苷酸是合成的或重组的。
本文公开的核酸可以包含一种或多种修饰，或非天然存在的元件或核酸。 在优选的方面，所述核酸包含2’-O-甲基类似物。在某些情况下，所述核酸包 含3'硫代磷酸酯核苷酸间键或其他锁核酸(LNA)。在某些情况下，所述核酸 包含ARCA帽。可以使用其他化学修饰的核酸或核苷酸，例如2'-位糖修饰、2'-O- 甲基化、2'-氟修饰、2'NH2修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺的修 饰、4-硫尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、非常 规的碱基配对组合(如异胞苷和异胍)等。修饰还可以包括3'和5'修饰，例如 加帽。例如，所述核酸可以被聚乙二醇化。
可用于本发明方法的核酸包括靶向致癌miRNA(也称为oncomiR)或转录因 子的反义寡核苷酸、mRNA、siRNA或gRNA。所述负荷可以是核酶或适体。在某 些情况下，所述核酸是质粒。
所述核酸分子可以是适体。如本文所用的术语“适体”是指与蛋白质、肽 和小分子结合(例如以高亲和力和特异性)的寡核苷酸(例如短寡核苷酸或脱 氧核糖核苷酸)。适体由于其倾向于形成互补碱基对而通常具有限定的二级或 三级结构，因此通常能够折叠成各种复杂的分子结构。三维结构对于适体结合 亲和力和特异性至关重要，特定的三维相互作用驱动适体-靶标复合物的形成。 可以通过指数富集(SELEX如Ellington AD，SzostakJW，自然1990，346： 818-822；Tuerk C，Gold L.科学1990，249：505-510中述及)或通过开发SOMAmers(慢解离速率修饰的适体)(Gold L等人(2010)用于生物标志物发 现的基于适体的多重蛋白质组学技术，PLoS ONE 5(12)：e15004)，进行配 体的系统进化过程，在体外从非常大的随机序列库中选择适体。
在本文所述的某些方面，所述负荷是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷 酸可以与miRNA或mRNA互补。反义寡核苷酸至少包含与靶mRNA序列在序列上互 补的一部分。反义寡核苷酸可以结合并从而抑制靶序列。例如，反义寡核苷酸 可以抑制靶序列的翻译过程。所述miRNA可以是与癌症相关的miRNA(Oncomir)。 所述miRNA可以是miR-125b。ASO可以包含序列5’ -UCACAAGUUAUAGGGUCUCAGGGA-3’或由其组成。
在某些方面，负荷是基因编辑系统的一个或多个组分。例如，CRISPR/Cas9 基因编辑系统。例如，负荷可以包括识别特定靶序列的核酸。所述负荷可以是 gRNA。此类gRNA可以用在CRISPR/Cas9基因编辑中。所述负荷可以是Cas9 mRNA 或编码Cas9的质粒。其他基因编辑分子可以用作负荷，例如锌指核酸酶(ZFN) 或转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)。负荷可以包含经工程改造以靶向 靶细胞中特定核酸序列的序列。所述基因编辑分子可以特异性地靶向miRNA。 例如，基因编辑分子可以是靶向miR-125b的gRNA。所述gRNA可以包含序列5’ -CCUCACAAGUUAUAGGGUCUCA-3’或由其组成。
在一些实施方式中，所述方法使用位点特异性核酸酶(SSN)进行靶基因 编辑。使用SSN的基因编辑在Eid和Mahfouz，Exp Mol Med.2016年10月；48(10)： e265中进行了综述，其通过引用整体并入本文。可以使用能够产生位点特异性 双链断裂(DSB)的酶，以将DSB引入目标靶核酸序列。DSB可以通过易错配的 非同源末端连接(NHEJ)进行修复，其中末端断裂的两端通常通过插入或删除 核苷酸来重新连接。可选地，可以通过高度同源定向修复(HDR)来修复DSB， 其中提供末端与断裂位点同源的DNA模板，并将其引入DSB的位点。
能够被工程化以生成靶核酸序列特异性DSB的SSN包括ZFN、TALEN和簇状规 则间隔回文重复序列/CRISPR相关9(CRISPR/Cas9)系统。
ZFN系统在例如Umov等人，Nat Rev Genet.(2010)11(9):636-46中进行了 综述，其通过引用整体并入本文。ZFN包含可编程的锌指DNA结合结构域和DNA 切割结构域(例如FokI核酸内切酶结构域)。可以通过筛选能够结合靶核酸序 列的锌指阵列来鉴定DNA结合结构域。
TALEN系统在例如Mahfouz等人，Plant Biotechnol J.(2014)12(8)： 1006-14中进行了综述，其通过引用整体并入本文。TALEN包含可编程的DNA结 合TALE结构域和DNA切割结构域(例如FokI核酸内切酶结构域)。TALE包含由 33-39个氨基酸的重复序列组成的重复结构域，除了每个重复的第12和13位上 的两个残基为重复可变二残基(RVD)外，它们是相同的。每个RVD根据以下关 系确定重复序列与靶DNA序列中核苷酸的结合：“HD”与C结合，“NI”与A结 合，“NG”与T结合，“NN”或“NK”与G结合(Moscou和Bogdanove，科学(2009) 326(5959)：1501.)。
CRISPR是簇状规则间隔短回文重复序列的缩写。该术语是在这些序列的起 源和功能未知时首次使用的，并且假定它们是起源于原核的。CRISPR是回文重 复序列(两个方向上的核苷酸序列均相同)中包含短而重复的碱基序列的DNA 片段。每次重复之后是先前整合的来自病毒或质粒的外源DNA间隔区DNA的短片 段。小簇CAS(CRISPR相关)基因位于CRISPR序列旁边。带有间隔区序列的RNA 有助于Cas(CRISPR相关)蛋白质识别和切割外源病原体DNA。其他RNA引导的 Cas蛋白可切割外源RNA。CRISPR/Cas系统的一个简单版本CRISPR/Cas9已被改 良以编辑基因组。通过将Cas9核酸酶和合成的向导RNA(gRNA)递送到细胞中， 可以在所需位置切割细胞的基因组，从而去除现有的基因和/或添加新的基因。CRISPR-Cas系统分为两类。1类系统使用多种Cas蛋白复合物降解外来核酸。2 类系统使用一个单独的大Cas蛋白来达到同样的目的。1类分为I，III和IV型； 2类分为II，V和VI型。CRISPR基因组编辑使用II型CRISPR系统。
在某些方面，EV装载有CRISPR相关负荷。换句话说，EV可用于涉及基因编 辑(例如治疗性基因编辑)的方法中。在某些情况下，EV可用于体外基因编辑。
所述负荷可以是向导RNA。向导RNA可以包含CRIPSR RNA(crRNA)和反式 激活CRISPR RNA(tracrRNA)。所述crRNA包含一个向导RNA，该RNA定位宿主 DNA的正确部分以及与tracrRNA结合形成活性复合物的区域。tracrRNA与crRNA 结合并形成活性复合物。gRNA组合了tracrRNA和crRNA，从而编码了活性复合 物。gRNA可以包含多个crRNA和tracrRNA。可以将gRNA设计为结合感兴趣的序 列或基因。gRNA可以靶向用于切割的基因。可选地，包括DNA修复模板的可选 部分。修复模板可用于非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。
所述负荷可以是核酸酶，例如Cas9核酸酶。核酸酶是一种蛋白质，其活性 形式能够修饰DNA。核酸酶变体能产生单链切口、双链断裂，DNA结合或其他不 同功能。核酸酶识别DNA位点，允许位点特异性的DNA编辑。
gRNA和核酸酶可以在质粒上编码。换句话说，EV负荷可以包含同时编码 gRNA和核酸酶的质粒。在某些情况下，一个EV包含gRNA，另一个EV包含或编码 核酸酶。在某些情况下，EV包含编码gRNA的质粒和编码核酸酶的质粒。因此， 在一些方面，提供了包含EV的组合物，其中一部分EV包含或编码例如Cas9的核 酸酶，并且一部分EV包含或编码gRNA。在一些情况下，将含有包含或编码gRNA 的EV的组合物和含有编码或包含核酸酶的EV的组合物共同施用。在某些情况下， 所述组合物包含EV，其中所述EV包含同时编码gRNA和核酸酶的寡核苷酸。
CRISPR/Cas9和相关系统，例如CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1、CRISPR/C2c2 和CRISPR/C2c3在例如Nakade等人，生物工程(2017)8(3)：265-273中综述， 其通过引用整体并入本文。这些系统包含核酸内切酶(例如，Cas9，Cpf1等) 和单个向导RNA(sgRNA)分子。sgRNA可以被改造以将核酸内切酶活性靶向目 的核酸序列。
在某些情况下，核酸编码或靶向一种或多种去分化因子，例如一种或多种 编码“Yamanaka因子”、Oct4、Sox2、Klf4和Myc的核酸。
在某些情况下，所述负荷是肽或蛋白质。它可以是重组肽或蛋白质。合适 的肽或蛋白质包括酶，例如基因编辑酶，例如Cas9、ZFN或TALEN。
合适的小分子包括细胞毒性试剂和激酶抑制剂。小分子可以包含荧光探针 和/或金属。例如，所述负荷可包括超顺磁性颗粒，例如氧化铁颗粒。所述负 荷可以是超小型超顺磁性氧化铁颗粒，例如氧化铁纳米颗粒。
在某些情况下，所述负荷是可检测的部分，例如荧光右旋糖酐。可以对负 荷进行放射性标记。
可以通过电穿孔将负荷装载到细胞外囊泡中。电穿孔或电通透作用是一种 微生物技术，其向细胞施加电场以增加细胞膜的渗透性，从而能够将化学药品， 药物或DNA引入细胞中。换句话说，可以通过电穿孔诱导或迫使细胞外囊泡包 裹负荷。像这样，本文公开的方法可以包括在负荷分子存在下电穿孔细胞外囊 泡或电穿孔细胞外囊泡和负荷分子的混合物的步骤。
在本文公开的其他方法中，通过超声、超音波、脂转染或低渗透析将负荷 装载到细胞外囊泡中。
可以在标记细胞外囊泡之前或之后将负荷装载到细胞外囊泡中。
组合物
本文公开了包含细胞外囊泡的组合物。
所述组合物每毫升可包含106至1014的颗粒。所述组合物可包含每毫升至少 105颗粒，每毫升至少106颗粒，每毫升至少107颗粒，每毫升至少108颗粒，每毫 升至少109颗粒，每毫升至少1010颗粒，每毫升至少1011颗粒，每毫升至少1012颗 粒，每毫升至少1013颗粒或每毫升至少1014颗粒。
所述组合物可以包含基本上具有同源尺寸的细胞外囊泡。例如，细胞外囊 泡的直径可以在100-500nm的范围内。在某些情况下，微囊泡的组合物包含直 径范围从50-1000nm、从101-1000nm、从101-750nm、从101-500nm或从100-300nm 或从101-300nm的微囊泡。优选地，直径为从100-300nm。在一些组合物中，微 囊泡平均直径为100-300nm，优选为150-250nm，优选为约200nm。
尽管期望标签基本上与组合物中所有细胞外囊泡相连，但是本文公开的组 合物包含的细胞外囊泡中的至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少 50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至 少85％、至少90％、至少95％、至少96％或至少97％的细胞外囊泡包含标签。 优选地，至少85％、至少90％、至少95％，至少96％或至少97％的细胞外囊泡 包含标签。在某些情况下，组合物中不同的细胞外囊泡包含不同的标签。在某 些情况下，细胞外囊泡包含相同或基本相同的标签。
在一些组合物中，除了包含标签之外，细胞外囊泡还包含负荷。尽管在这 样的组合物中期望将负荷基本上包裹到组合物中所有细胞外囊泡中，但是本文 公开的组合物包含的细胞外囊泡中的至少30％、至少35％、至少40％、至少45 ％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％的细胞外囊泡含有该负荷。。 优选地，至少85％、至少90％、至少95％或至少97％的细胞外囊泡含有负荷。 在某些情况下，组合物中不同的细胞外囊泡含有不同的负荷。在某些情况下， 细胞外囊泡包含相同或基本相同的负荷分子。
所述组合物可以是药物组合物。所述组合物可以包含一种或多种细胞外囊 泡，以及任选地药学上可接受的载体。可以配制药物组合物以通过特定的给药 途径进行给药。例如，可以配制药物组合物以用于静脉内、肿瘤内、腹膜内、 皮内、皮下、鼻内或其他给药途径。
组合物可以包含缓冲溶液。组合物可以包含防腐的化合物。组合物可以包 含药学上可接受的载体。
细胞外囊泡的治疗和使用方法
本文公开的细胞外囊泡可用于治疗方法。特别地，所述方法可用于治疗患 有与靶基因相关的疾病的受试者，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用 有效量的修饰的细胞外囊泡，其中所述修饰的细胞外囊泡在其表面包含结合分 子，并包裹了一种非内源性物质，可与靶细胞中的靶基因相互作用。所述非内 源性物质可以是用于所述治疗的核酸。
本文公开的细胞外囊泡特别可用于治疗遗传性疾病、炎性疾病、癌症、自 身免疫性疾病、心血管疾病或胃肠道疾病。在某些情况下，所述疾病是选自地 中海贫血、镰状细胞性贫血或遗传代谢疾病的遗传性疾病。在某些情况下，细 胞外囊泡可用于治疗肝、骨髓、肺、脾、脑、胰腺、胃或肠的疾病。
在某些方面，所述细胞外囊泡可用于治疗癌症。本文公开的细胞外囊泡可 用于抑制癌细胞的生长或增殖。所述癌症可以是液体或血液癌，例如白血病、 淋巴瘤或骨髓瘤。在其他情况下，所述癌症是实体癌，例如乳腺癌、肺癌、肝 癌、结直肠癌、鼻咽癌、肾癌或神经胶质瘤。在某些情况下，癌症位于肝、骨 髓、肺、脾、脑、胰腺、胃或肠中。
所述靶细胞取决于待治疗的疾病。例如，靶细胞可以是乳腺癌细胞、结肠 直肠癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞等。所述负荷可以是用于抑制或增强靶基因 表达或进行基因编辑以使特定基因沉默的核酸。
本文所述的细胞外囊泡和组合物可以通过多种途径施用或配制以用于施 用，包括但不限于全身、肿瘤内、腹膜内、肠胃外、静脉内、动脉内、皮内、 皮下、肌内、口服和经鼻。优选地，通过选自肿瘤内、腹膜内或静脉内的途径 施用细胞外囊泡。药物和组合物可以配制成液体或固体形式。可以配制流体制 剂通过注射到人体或动物体的选定区域来给药。
细胞外囊泡可以包含与待治疗的细胞或组织表面上的分子结合的标签。所 述标签可以特异性结合至待治疗的细胞或组织。细胞外囊泡可以包含治疗性负 荷。所述治疗负荷可以是用于与靶细胞中的靶基因相互作用的非内源性物质。
施用优选以“治疗有效量”，这足以显示出对个体的益处。实际给药的量 以及给药的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方， 例如决定剂量等，是在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常要考虑待 治疗的疾病、个别患者的病情、递送部位、给药方法和从业者已知的其他因素。 上述技术和方案的示例可以在2000年由利平科特，威廉和威尔金斯出版社出版 的《雷明顿药学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)(第20版)中 找到。
取决于待治疗的病症，细胞外囊泡可单独施用或与其他治疗组合，同时或 依次施用。
如本文所述负载有负荷的细胞外囊泡可用于将该负荷递送至靶细胞。在某 些情况下，所述方法是体外方法。在特别优选的体外方法中，所述负荷是标记 分子或质粒。
所述待治疗的受试者可以是任何动物或人类。所述受试者优选是哺乳动物， 更优选是人类。所述受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选是人类。所述受 试者可以是男性或女性。所述受试者可以是患者。治疗用途可用于人类或动物 (兽医用途)。
试剂盒
本文还公开了包含细胞外囊泡或用于标记细胞外囊泡的试剂盒。所述试剂 盒可以包含选自以下的一种或多种组分：一种或多种细胞外囊泡，标签或编码 标签的核酸(例如用于在细胞培养物中表达标签的表达载体)，封装在细胞外 囊泡中的负荷或非内源性分子，蛋白质连接酶和任选的蛋白质连接酶缓冲液。
在上述描述、或以下权利要求或附图中公开的特征，以其特定形式或者以 执行所公开功能的手段、或者用于获得所公开结果的方法或过程表示的特征， 可以合适地单独地或者以这些特征的任何组合表示，用于以各种形式实现本发 明。
尽管已经结合上述示例性实施例描述了本发明，但是当给出本公开时，许 多等同的修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，以上阐述的 本发明的示例性实施例被认为是说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的 精神和范围的情况下，可以对所描述的实施例进行各种改变。
为了避免任何疑问，本文提供的任何理论解释是为了提高读者的理解。发 明人不希望受到任何这些理论解释的束缚。
本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不应解释为限制所描述的 主题。
在整个说明书中，包括所附的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词 语“包含”和“包括”以及诸如“含有”、“具有”和“其中包括”的变体将 被理解为暗示包括陈述的整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其他整 数或步骤或一组整数或步骤。
必须注意的是，除非上下文另外明确指出，在说明书和所附权利要求书中 使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象。范围可以在本文 中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达这样的范围 时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用 先行词“约”将值表示为近似值时，将理解的是，特定值形成另一实施例。相 对于数值的术语“约”是可选的，并且是指例如+/-10％。
实施例
实施例1
为了进行治疗性递送，许多研究小组已尝试从癌细胞系和干细胞生产EV， 由于大规模的细胞培养，这些EV非常昂贵。此外，来自癌症和干细胞的EV可能 含有致癌蛋白或促进癌症生长的生长因子。来自血浆和血细胞的EV对于癌症治 疗来说更安全。我们最近开发了一种从红细胞(RBC)大规模纯化EV强效方法， 并将结合了RNA的EV用于针对癌症的基因治疗，包括急性髓细胞性白血病(AML) 和三阴性乳腺癌(TNBC)。我们已经展示了RBCEV均能被AML和TNBC细胞很好地 吸收，并且与商业转染试剂相比，RBBCV具有更好的转染效率且毒性更低。我 们还观察到在RBCEV递送反义寡核苷酸(ASO)处，体内RBCEV的摄取能抑制致 癌的miR-125b，并抑制AML和TNBC的进展。RBCEV也可用于递送Cas9 mRNA和gRNA， 以在白血病细胞中进行基因组编辑。该平台对于抗癌基因疗法非常有前景。
为了使基于EV的疗法更具特异性，通常会对EV进行改造，使其具有与特定 靶细胞特异性结合的肽或抗体5。通常，这些肽或抗体在供体细胞中通过使用逆 转录病毒或慢病毒转染或转导的质粒表达，然后通过基于抗生素或基于荧光的 筛选3。这些方法水平基因转移的风险高，因为高表达的质粒可能已整合到EV 中，并最终转移至靶细胞。质粒中的遗传元件可能会导致肿瘤发生。如果制造 出稳定细胞系来生产EV，则包括突变DNA、RNA和蛋白质在内的大量致癌因子会 被封装在EV中，并向靶细胞传递肿瘤发生的风险。另一方面，基因工程方法不 适用于RBC，因为其缺乏核糖体而无法在RBC中转录质粒。它也不适用于难以转 染或转导的干细胞和原代细胞。
最近，有一种抗体包被EV的新方法，所述抗体融合有乳黏附素的C1C2结构 域，其与EV表面的磷脂酰丝氨酸(PS)结合6。该方法使得EV与抗体结合，而无 需进行任何基因修饰6。然而，C1C2是一种疏水蛋白，因此需要在哺乳动物细胞 中进行繁琐的纯化方法并将其存储在含牛血清白蛋白的缓冲液中。此外，EV与 C1C2融合抗体的结合基于C1C2与PS之间的瞬时亲和力结合。为了使EV与靶蛋白 或治疗性蛋白稳定持久地结合，我们需要使用化学或酶促反应以产生共价键的 结合方法。
我们以前使用转肽酶分选酶将肽和单结构域抗体(sdAb)，具有人、骆驼 或软骨鱼类来源的具有单个免疫球蛋白结构域的蛋白共价连接到RBC的表面， 所述RBC通过改造以在RBC表面蛋白中具有分选酶识别基序7。最近的一项研究表 明，分选酶可以将许多肽段，连接到RBC表面具有N端甘氨酸残基的未修饰蛋白 上，这些肽段均在C末端通过分选酶识别序列延伸。8因此，分选酶可以使细胞 表面带有N末端甘氨酸的天然蛋白共价连接于带有C末端分选酶标签的蛋白或 肽8。我们假设，在RBCEV表面具有N末端甘氨酸和/或侧链氨基的天然蛋白质可 以充当分选酶的底物。因此，我们可以使用分选酶和类似的蛋白质连接酶将肽、 小分子、蛋白质和sdAb包被RBCEV。
在这里，我们描述了一种使用分选酶A对EV表面进行酶促修饰的方法。与 小分子(例如生物素)缀合的肽和包含分选酶结合位点的sdAb通过稳定的共价 键与EV表面的蛋白质连接。这使得能够将EV靶向递送到特定的细胞类型以达到 治疗目的。
结果
使用分选酶A将EV与sdAb缀合
发明人开发了一种简单的工作流程，用于将EV与肽和sdAb缀合，包括纯化 每种组分，分选标记反应和检测在EV上分选标记的蛋白质(图1A)。分选酶A 在大肠杆菌中用His标签表达，并使用亲和力和尺寸排阻色谱法纯化，从1L细 菌培养物中获得～27mg蛋白质，纯度约为100％(图1B)。类似地，mCherry 特异性的sdAb(mC-sdAb)在大肠杆菌中与His标签、FLAG标签、HA标签和分选 酶结合位点(LPETG)一起表达，并使用与分选酶A相同的方法纯化，来自1L 培养物的产量为8mg纯蛋白质。在VHH和分选酶结合位点之间插入15个或更多的氨基酸，以提高分选酶结合位点对分选酶的易接触性和柔韧性。纯化后，sdAb 显示为清晰的20kDa单条带(图1C)。
根据我们已建立的方案纯化RBCEV，包括使用钙离子载体刺激EV释放，差 速离心以去除细胞和碎片以及进行3次超速离心(包括一次使用蔗糖垫)。4 Nanosight分析表明，从多个供体纯化的RBCEV具有一致性，直径范围从100到 300nm(图1D)。EV显示为清晰的双层膜囊泡，具有典型的杯形形状，并且在 透射电子显微镜下显示没有蛋白质聚集(图1E)。
使用抗His标签抗体(也与VHH结合)进行蛋白质印迹分析，我们发现分选 酶A和mC-sdAb分别为18kDa和20kDa条带(图1F)。值得注意的是，在将RBCEV 与分选酶A和mC-sdAb一起孵育后，我们观察到RBCEV在仅与分选酶A或仅与 mC-sdAb一起孵育后，在～40和70kDa处不存在其他条带。在分选标记反应后 出现了新的条带表明mC-sdAb与分选酶A和RBCEV中的蛋白质相结合。这种结合 在变性条件下是稳定的，表明mC-sdAb通过分选标记反应产生的共价键与RBCEV 上的蛋白质结合。
使用分选酶A将EV与肽结合
我们进一步测试了RBCEV是否可以用肽进行分选标记。我们在肽的C末端添 加了一个分选酶A结合位点，该肽被称为“自身肽”，因为它源自CD47，这是 “不要吃我”的信号，以避免巨噬细胞的吞噬作用。10该肽还具有N末端的生物 素标签。在蛋白质印迹分析中使用HRP偶联的链霉亲和素进行，由于肽体积小 (2.4kDa)，当它被单独装载时我们无法单独检测到该肽，但当我们将RBCEV 与肽和分选酶A一起孵育时，在～20kDa处观察到一条较宽的条带，与分选酶 加肽的大小相对应，因此它应该是分选标记反应的中间产物(图2A)。此外，我们在与肽和分选酶A孵育的RBCEV中观察到了从25kDa到75kDa的多个条带 (图2A)。这些条带应该是RBCEV表面上的蛋白质，并已用生物素化的肽进行 了分选标记。同样，我们将分选酶结合位点添加到另一种肽上，已知该肽与表 皮生长因子受体(EGFR)(一种在许多类型的实体癌中都高度表达的表面蛋白) 结合。11生物素标签也通过化学合成被添加到了该肽的N末端(以下称为bi-YG20 肽)。我们将YG20肽分选标记到3个不同批次的RBCEV，这些RBCEV从3个供体中 独立纯化，并在3个样品中发现了类似的分选标记蛋白条带，除了第三个样品 中的一条额外的带。该观察结果表明每个供体的RBCEV表面上一些丰富的蛋白 质都包含N末端甘氨酸残基，这些残基均与分选酶A反应。
为了评估分选的效率，我们将bi-YG20包被的EV与乳胶微球孵育，并用 AlexaFluor 647(AF647)缀合的链霉亲和素对微球进行染色。FACS分析表明 96％的微球呈AF647阳性，表明大多数EV已成功与生物素化肽偶联(图2C)。
使用质谱法，我们鉴定了在RBCEVs中高丰富的近20种蛋白质，其中包括12 种膜蛋白，这些蛋白也已知在RBC中表达(图2D)。为了鉴定与分选酶A反应的 膜蛋白，我们使用了链霉亲和素珠子将RBCEV膜裂解物中与生物素化肽偶联的 蛋白拉下(pull down)。我们鉴定了3种蛋白质，包括STOM、GLUT1和MPP1，它 们在生物素-链霉亲和素复合物中富集(图2E)。这些蛋白质的分子量(31.9、 54.4和52.5kDa)与使用蛋白质印迹法观察到的某些蛋白质相似，并且它们是 在RBCEV中检测到的丰富的蛋白质，因此它们很可能与分选酶A反应。
用EGFR结合肽对EV进行分选标记会促进EGFR阳性乳腺癌细胞对EV的摄取
为了测试乳腺癌细胞对EV的摄取，我们如上所述用荧光膜染料PKH26标记 了RBCEV，并使用bi-YG20肽对标记的RBCEV进行了分选标记。标记和分选的 RBCEV经过2轮超速离心(包括一次用蔗糖垫)以充分洗涤。我们用次优剂量的 标记的RBCEV(我们使用MOLM13细胞显示99％摄取时的一半剂量)4孵育SKBR3 细胞，并在孵育24小时后分析了细胞中的PHK26荧光(图3A)。基于标记的RBCEV 的最后一次洗涤的上清液确定荧光背景。为了测试EGFR的表达对于摄取是否重 要，我们还用与FITC偶联的抗EGFR抗体对细胞进行了染色，并对两个SKBR3细 胞群进行了门控：一个低EGFR表达，一个高EGFR表达(图3B)。结果，在EGFR 低和EGFR高群中，用bi-YG20包被的RBCEV处理的SKBR3细胞中PKH26阳性细胞的百 分比显著高于用未包被的RBCEV处理的(图3A，3C)。EGFR的高表达在bi-YG20 包被的RBCEV的摄取方面也产生了显著差异(图3A，3C)。因此，RBECV与YG20 肽的缀合促进了EGFR阳性乳腺癌细胞对EV的特异性摄取。
使用OaAEP1连接酶将RBCEV与肽缀合
我们进一步测试了蛋白质连接酶OaAEP1用于RBCEV与带有TRNGL序列的肽 的缀合。在这里，我们使用具有Cys247Ala修饰的OaAEP1变体，该变体具有快 速的催化动力学。12我们使用亲和色谱和SEC纯化了OaAEP1，并获得了带有和不 带有His-Ub标签的纯酶(图4A)。将该酶与RBCEV和/或含有OaAEP1结合序列“NGL” 的肽孵育。即使在连接的RBCEV进行了3次彻底洗涤后，用HRP偶联的链霉亲和 素仍能检测到RBCEV与该肽的反应产生了从35kDa到～55kDa到200kDa的多个 蛋白带(图4B)。这些条带不同于分选标记反应中出现的条带，可能是因为 OaAEP1连接酶仅作用于在C末端同时具有甘氨酸和亮氨酸(GL)的蛋白质。使 用FACS分析，我们发现RBCEV偶联的效率为99.3％，因为与bi-TRNGL肽发生连 接反应后，有一定比例的RBCEV含有生物素(图4C)。我们进一步测试了RBCEV 与含有连接酶结合位点(NGL)的生物素化EGFR靶向肽的连接。我们的蛋白质 印迹分析显示了在连接和3次洗涤后的30-45kDa的显著条带(图4D)。
为了量化在RBCEV上连接的肽的数量，我们比较了从连接的RBCEV蛋白到连 续稀释的生物素化HRP的生物素信号强度。该比较表明，连接至每个RBCEV的TR 肽约有380个拷贝，是来自3个不同血液供体的RBCEV的平均值(图4E)。
这些数据证明了将sdAb和肽作为标签与EV缀合的新方法，该标签介导靶细 胞类型(例如用于癌症治疗的肿瘤细胞)对EV的特异性摄取。这种方法可以促 进治疗分子的特异性递送，例如用于基因治疗的RNA和DNA，用于酶替代治疗或 疫苗接种的蛋白质，用于癌症治疗的细胞毒性小分子等的特异性递送，并具有 降低的副作用(图5-6)。另外，包被在EV表面上的肽和抗体也可以直接用于 诊断和治疗。
使用OaAEP1连接酶将白血病EV与肽连接
为了验证OaAEP1连接酶在修饰其他类型EV上的应用，我们从白血病THP1细 胞中分离了EV。用含有10％不含EV的FBS的培养基培养THP1细胞，并用钙离子 载体处理过夜，然后将培养上清液以增加的速度多次离心，以去除细胞和碎片。 使用蔗糖垫超速离心分离THP1 EV，然后进一步通过SEC柱完全去除血清蛋白(图 7A)。使用针对RBCEV优化的相同连接方案，我们将THP1 EV连接至生物素化的 TRNGL肽，从而产生25至75kDa的多个连接蛋白带(图7B)。这种模式不同于 RBCEV上的连接蛋白带，因为THP1 EV可能在其膜上显示带有N端GL的不同蛋白。
用EGFR结合肽对EV进行分选标记可促进EGFR阳性肺癌细胞对EV的摄取
我们进一步检查了EGFR在5种不同的人类细胞系中的表达，发现EGFR在 MOLM13中呈阴性，在包括乳腺癌SKBR3和CA1a细胞，肺癌H358和HCC827细胞的 实体癌细胞中丰富存在(图8A)。使用生物素-链霉亲和素的FACS分析，我们 发现相对于仅有链霉亲和素的对照，生物素化的EGFR-靶向肽与肺癌H358和 HCC827细胞的表面结合而不与MOLM13细胞结合(图8B)。具有干扰序列的生物 素化对照肽不结合任何测试的细胞系。
为了测试细胞对RBCEV的摄取，我们用荧光染料钙黄绿素AM标记了RBCEV， 并如上所述用生物素化的EGFR靶向肽对标记的RBCEV进行了分选标记。标记和 分选标记的RBCEV用SEC和2轮离心充分洗涤。我们用次优剂量的标记的RBCEV孵 育了H358细胞，并在孵育2小时后分析了细胞中的钙黄绿素AM荧光(图8C)。 根据标记的RBCEV的最后一次洗涤(流穿)的上清液确定荧光背景。结果，与 用对照肽包被的RBCEV处理相比，在用EGFR靶向肽包被的RBCEV处理的H358细胞 中钙黄绿素AM阳性细胞的百分比显著更高(图8C)。因此，RBCEV与EGFR靶向 肽的缀合促进了EGFR阳性肺癌细胞对EV的特异性摄取。
连接酶介导的RBCEV与EGFR靶向肽的缀合通过网格蛋白介导的内吞作用增 强RBCEV的特异性摄取
我们使用OaEAP1连接酶代替分选酶A重复了上述实验。正如预期的，与对 照肽相比，EGFR靶向肽的连接显著提高了H358细胞对RBCEV的摄取(图9A)。 为了检查摄取的特异性，我们将高浓度的游离EGFR靶向肽添加到了H358细胞与 EGFR靶向肽连接的RBCEV的孵育中。游离肽竞争与EGFR的结合，因此阻断了连 接的EGFR靶向肽对RBCEV的作用(图9B)，表明结合EGFR靶向肽连接的RBCEV的 增加需要EGFR结合。
为了确定RBCEV的摄取途径，我们在H358细胞与EGFR靶向肽连接的RBCEV的 孵育中添加了3种不同的内吞抑制剂。结果，只有阻断网格蛋白介导的内吞作 用的菲律宾菌素才能减少与ET连接的RBCEV的摄取(图9C)。因此，EGFR靶向 肽连接的RBCEV的摄取是由网格蛋白介导的内吞作用介导的。
RBCEV与EGFR靶向肽的缀合导致RBCEV在EGFR阳性肺肿瘤中的富集
由于RBCEV通常由于被库普弗(Kupffer)细胞摄取而在肝脏中积累，因此 我们试图通过在注射RBCEV之前用一定剂量的人RBC或RBC残影(RBC的膜)对小 鼠进行预处理来防止RBCEV的快速清除(图10A)。我们观察到，在减少肝脏中 RBCEV的摄取并增加在肺和脾脏中RBCEV的摄取上，RBC比RBC残影更好。为了生 成肺癌的体内模型，我们将荧光素酶标记的H358细胞注射到NSG小鼠的尾静脉 中(图10B)。3周后，当在肺中检测到肿瘤细胞时，我们用DiR标记的RBCEV处 理了小鼠，并使用荧光成像观察了EV的生物分布。注射H358荧光素酶细胞3周 后，在NSG小鼠的肺部一致地检测到肿瘤细胞的生物发光，但在其他器官中未 检测到信号，除了尾巴中偶尔存在，这是由于尾静脉注射的残留细胞所致。将RBCEV与对照肽或EGFR靶向肽缀合，然后用DiR荧光染料标记，并使用SEC和离 心充分洗涤。使用血红蛋白测定法对未包被或包被的RBCEV进行定量，并将其 等量地注射到预处理小鼠的尾静脉中。使用EV冲洗液的流穿确定荧光背景。注 射RBCEV后八小时，我们观察到未包被的RBCEV在脾、肝、肺和骨骼中的分布(图 10B)。肽包被的RBCEV显示在相同器官中的摄取。然而，与对照连接的RBCEV 相比，EGFR靶向肽连接的RBCEV在肺中的积累显著增加，而在肝中则减少(图10B)。这些数据表明，EGFR靶向肽将RBCEV运送到表达EGFR的肺肿瘤中。
与自身肽的缀合可防止RBCEV的吞噬作用，并增强RBCEV在血液循环中的可 用性。
与图2A相似，我们将RBCEV与自身肽缀合，但使用OaAEP1连接酶代替分选 酶A。有趣的是，与自身肽的连接显著降低了单核细胞MOLM13和THP1细胞对 RBCEV的摄取(图11A-B)。
我们进一步用CFSE标记了自身肽包被的RBCEV，并将其注射到NSG小鼠的尾 静脉中。5分钟后，我们使用包被有抗GPA抗体的磁珠捕获了血液中的RBCEV(图 8B)。由于GPA是人RBCEV的标志物，而不是小鼠RBCEV的标志物，我们预期纯 化注入的人RBCEV，将其与小鼠EV分离。基于对来自磁珠的CFSE荧光信号的FACS 分析，对RBCEV进行了定量。分析显示，在注射的小鼠的血液循环中，自身肽 连接的RBCEV比对照肽连接的RBCEV丰富得多(图8B)。此外，我们还在尾静脉 中注射了DiR标记的自身肽连接的RBCEV，并观察到RBCEV在包括肝脏、脾脏、 肺、骨骼和肾脏在内的多个器官中的生物分布增强(图8C)。这些数据表明， 与自身肽的缀合可用于增加RBCEV的循环和生物分布。
RBCEV与生物营养性单域抗体的缀合需要接头肽
我们寻求使用sdAb来指导RBCEV的靶向递送，因为已知sdAb具有高度特异 性并易于修饰，因为它们只有一种多肽。除了图1所示的mCherry sdAb，我们 还生产了另一种具有His标签、FLAG标签、HA标签和连接酶结合位点的对EGFR 特异的驼源sdAb(也称为VHH)。纯化的EGFR VHH约为37kDa。这是一种生物 营养性抗体，因此比典型的sdAb大。它具有2个针对EGFR的高亲和力结合位点。
在多次尝试将EGFR VHH直接连接至RBCEV失败后(可能是由于VHH的大尺寸)， 我们设计了一个连接肽，以在VHH和RBCEV之间建立桥梁(图12B)。该接头肽 由中间的Myc标签，在N末端的“GL”和在C末端的“NGL”组成。“NGL”序列 促进了肽与RBCEV的连接。随后，“GL”序列使接头肽与带有“NGL”的VHH连 接。我们用多个对照进行了连接反应。使用抗VHH蛋白质印迹，我们观察到游 离VHH为37kDa条带(图12C)。在VHH中添加OaAEP1连接酶会导致另外两个条 带，这可能是由于VHH的裂解和寡聚所致。在添加或不添加连接肽的情况下，将RBCEV连接至VHH，并使用SEC和4轮离心充分洗涤。包含接头肽时，抗VHH抗 体在两步VHH连接RBCEV中检测到了45至60kDa的几个蛋白带(图12C)。这些 条带不同于那些仅将VHH与连接酶一起孵育而出现的条带。在没有接头肽时， VHH与RBCEV的连接中未观察到条带。数据表明，EGFR VHH与RBCEV的连接需要 添加接头肽。
作为EGFR VHH缀合的结果，基于细胞表面GPA的FACS分析，与未包被的RBCEV 相比，我们观察到RBCEV与EGFR阳性HCC827细胞的结合增加(图12D)。
RBCEV与单域抗体的缀合可促进靶细胞对RBCEV的特异性摄取
为了测试VHH缀合对RBCEV摄取的影响，我们用钙黄绿素AM标记了VHH包被 的RBCEV，并使用SEC对其进行了洗涤。钙黄绿素AM的FACS分析表明，仅当RBCEV 与接头肽和EGFR靶向的VHH分两步连接时，H358细胞对RBCEV的摄取才会增加 (图13A)。同样，我们测试了mCherry靶向的VHH与RBCEV的连接以及CA1a细胞 对表面表达的mCherry蛋白的摄取。CA1a-SmCherry细胞对RBCEV的摄取仅随着 连接到接头肽和mCherry VHH的RBCEV的增加而增加(图10B)。VHH连接中缺乏 接头肽不会导致摄取增加。因此，VHH与RBCEV的连接需要接头肽。
使用连接sdAb的RBCEV递送RNA和药物
之前我们已经证明RBCEV可用于将ASO，gRNA或mRNA递送至癌细胞。在这里， 我们将连接反应和RNA负载实验偶联。我们发现，首先需要缀合RBCEV，使用离 心洗涤两次，然后使用EV转染试剂(例如ExoFect(系统生物科学))装载RNA。 因此，我们将EGFR VHH或mCherry VHH连接到RBCEV并为其装载了萤光素酶mRNA (图14A)。用这些RBCEV和萤光素酶活性处理表达EGFR但不表达mCherry的H358 细胞，并在24小时后进行比较。连接EGFR VHH的RBCEV在H358细胞中产生的荧 光素酶活性比未包被的RBCEV或连接mCherry VHH的RBCEV处理后的荧光素酶活 性高2倍，尽管所有经RBCEV处理的细胞均显示出比未处理的对照更高的荧光素 酶信号(图14A)。因此，RBCEV与EGFR VHH结合后能够以更高的效率将荧光素酶mRNA递送至H358细胞。
我们还优化了使用超声处理将紫杉醇(PTX)(一种常用于肺癌治疗的化 学疗法药物)装载到RBCEV中的方案(图14B)。彻底洗涤载有药物的RBCEV， 并如上所述与EGFR靶向肽连接。每三天将修饰的RBCEV注射入患有H358肺癌的 NSG小鼠中，仅使用相同剂量的PTX作为对照。使用HPLC确定PTX的浓度。平均 约6％的PTX被装载到RBCEV中，未结合的PTX被洗去(图14C)。肿瘤的生物发 光成像显示，与仅使用PTX或未包被PTX负载的RBCEV相比，EGFR靶向的RBCEV增 强了PTX对肿瘤抑制的作用(图14D)。这些数据表明靶向递送抗癌药物可以通过增加药物在靶标肿瘤细胞中的累积来提高治疗效果。
实施例2：方法
EV的纯化
在知情同意的情况下，血液样本从香港红十字会的健康捐献者获得。所有 使用人体血液样本的实验均根据香港城市大学人类伦理委员会的指导方针和 批准进行。通过离心(在4℃下1000xg离心8分钟)从血浆中分离RBC，并用 PBS洗涤3次(在4℃下1000xg离心8分钟)，并通过离心和去白细胞滤器去除 白细胞(日本泰尔茂或中国南格尔)。在Nigale缓冲液(0.2g/l柠檬酸，1.5 g/l柠檬酸钠，7.93g/l葡萄糖，0.94g/l磷酸二氢钠，0.14g/l腺嘌呤，4.97 g/l氯化钠，14.57g/l甘露醇)中收集分离的RBC，在含有0.1mg/ml氯化钙的 PBS中稀释3倍，并用10mM钙离子载体(西格玛奥德里奇)处理过夜(钙离子 载体的终浓度为10μM)。为了纯化EV，通过在4℃下以600xg离心20分钟， 1600xg离心15分钟，3260xg离心15分钟和10000xg离心30分钟来去除RBC和 细胞碎片。使上清液通过0.45μm注射过滤器。通过在4℃下,用TY70Ti转子(贝 克曼库尔特，美国)以100000xg或50000xg的转速进行超速离心来浓缩EV。 将EV重悬于冰冷的PBS中。为了标记，将一半的EV与20μM PKH26(美国西格玛 奥德里奇)混合。将标记或未标记的EV置于在2ml冷冻的60％蔗糖垫上方，并 使用SW41Ti转子(贝克曼库尔特)以降低的制动速度，以100000xg或50000xg 的转速于4℃离心16小时。收集红色层的EV(蔗糖上方)，并在TY70Ti转子(贝 克曼库尔特)中用冰冷的PBS以100000xg或50000xg的转速于4℃超速离心70 分钟来洗涤一次(未标记的EV)或两次(标记的EV)。值得注意的是，以100000xg 的转速超速离心获得了更高的RBCEV产量。当我们试图轻柔地处理EV时，使用 了50000xg转速。所有超速离心实验均使用贝克曼XE-90超速离心机(贝克曼库尔特)进行。纯化的RBCEVs在-80℃下保存在含有4％海藻糖的PBS中。EV的浓 度和尺寸分布使用NanoSight追踪分析NS300系统(英国马尔文)定量。EV的 蛋白质含量使用二喹啉甲酸测定法(BCA测定法)进行定量。为了对EV进行透 射电子显微镜分析，通过添加等量的4％多聚甲醛将EV固定在铜网(200目，用 聚乙烯醇缩甲醛碳膜包被)上。用PBS洗涤后，添加4％乙酸铀酰用于EV的化学 染色，并使用Tecnai 12 BioTWIN透射电子显微镜(FEI/飞利浦，美国)捕获 图像。使用血红蛋白定量试剂盒(艾博抗)对RBCEV的血红蛋白含量进行定量。
从THP1细胞中纯化白血病EV
THP1细胞获自美国典型培养物保藏中心(美国ATCC)，并保存在含10％胎 牛血清(美国Biosera)和1％青霉素/链霉素(美国赛默飞世尔科技)的RPMI (赛默飞世尔科技)中。为了制造不含EV的FBS，在4℃下以110000xg的转速 超速离心18小时将FBS从EV中去除。将THP1细胞以106细胞/ml的浓度在上述含有 无EV的EBS和0.2μM钙离子载体的培养基中培养48小时。从5瓶处理过的THP1细 胞中收集培养上清液。通过在4℃下以300xg离心10分钟，400xg离心15分钟， 900xg离心15分钟来去除细胞和碎片。使上清液进一步通过0.45μm过滤器，置 于2ml冷冻的60％蔗糖上方，在4℃下通过使用SW32转子以100000xg的转速离 心90分钟来浓缩。从交界处收集EV并在冰冷的PBS中1:1稀释，然后置于SW41转 子中的2ml冷冻的60％蔗糖垫上方，在4℃使用降低的制动速度以100000xg的 转速离心12个小时(贝克曼库尔特)。收集红色层的EV(蔗糖上方)，通过在 TY70Ti转子(贝克曼库尔特)中以100,000xg的转速在4℃下超速离心70分钟， 用冰冷的PBS洗涤一次(未标记的EV)或两次(标记的EV)。从交界处收集了 500μl EV，并将其添加到qEV SEC柱(Izon)中。在每个流份中收集500μl洗脱液。使用Nanosight分析仪和BCA分析，在30个流份中测量EV和蛋白质的浓 度。为了连接，将流份7至11中的EV合并，并在Amicon-15过滤器中，以100kDa 的截断值(cut-off)，在15000xg下离心20分钟来浓缩。
肽和sdAb设计
使用96/102孔自动肽合成仪合成生物素化自身肽(生物素 -GNYTCEVTELTREGETIIELK-GGGGS-LPETGGG)，Bi-YG20肽(生物素 -YHWYGYTPQNVIGLPETGGG，下划线为分选酶结合位点)和生物素-TRNGL以及其 他在表1中列出的肽，并通过高效液相色谱法纯化(GL生物化学有限公司，中 国上海)。抗mCherry sdAb(387bp)的可变重链(VHH)序列是从Fridy等人 9获得的，其在C末端带有额外的分选酶结合位点(LPETG)或连接酶结合位点 (NGL)、HA标签和FLAG标签。Myc标签、凝血酶切割位点和6His标签也被添加 到VHH的N末端。通过广州IGE生物技术有限公司(中国)，合成了6*His-SSG- 凝血酶切割位点-Myc-VHH-GSG-HA-GSG-LPETGGG-Flag的整个序列(555bp，20 kDa，斜体表示接头)，并插入到pET32(a+)质粒的T7启动子之后。具有生物 营养性的EGFR-VHH序列获自Roovers等人(国际癌症杂志，2011，129(8)， 2013-2024)，并按以下顺序克隆了8His标签、FLAG标签和连接酶结合位点： 8*His-GSG-VHH-GSG-FLAG-NGL，插入上述pET32(a+)质粒。
表1.肽序列
Figure BDA0002987506620000451
Figure BDA0002987506620000461
蛋白的表达和纯化
用pET30b-7M-SrtA质粒(Addgene 51140)转化感受态BL21(DE3)大肠杆 菌，并在含卡那霉素(西格玛)的琼脂平板上涂布，OaAEP1-Cys247Ala质粒(由 南洋理工大学的Dr.Bin Wu提供)或用pET32(a+)-VHH质粒(用特定的VHH序 列克隆)转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌，在含氨苄青霉素的琼脂平板上涂 布，并在37℃下孵育过夜。从每个平板中选择单个菌落，并在37℃下在溶原 性肉汤培养基(LB)中振荡培养过夜。在LB中用0.5mM异丙基β-D-1-硫代吡 喃半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，于25℃振荡培养16h。收集培养 物并在4℃下以6000×g离心15分钟。除去上清液，并将沉淀重悬于50mL结合缓 冲液(500mMNaCl，25mM Tris-HCl，1mM苯基甲烷磺酰氟(PMSF)，5％甘油) 中，并转移至50mL离心管中并再次离心。
使用高压匀浆器(1000psi)将细菌裂解4-6轮。将细胞裂解液在4℃下 以8000rpm离心60分钟。收集上清液并通过0.45μm膜(密理博)过滤。使用 NGC-QUEST-10快速蛋白质液相色谱(FPLC)系统(伯乐)纯化蛋白质。简而言 之，将样品加载到用结合缓冲液平衡过的5mLNi填充的柱子(伯乐)中。该柱 用3％洗脱缓冲液(500mM NaCl，25mM Tris-HCl，1mM咪唑，1mM PMSF和5％甘 油)洗涤，然后在8％至50％洗脱缓冲液中洗脱。流速保持恒定在3ml/分钟。 当蛋白质以UV280峰出现时，收集2ml流份。使用离心过滤器(密理博)浓缩 蛋白质，并在摆桶式转子中以4000×g离心，并通过0.22μm膜过滤。使用具有 FPLC系统的HiLoad16/600Superdex 200pg尺寸排阻色谱柱(GE保健公司) 在低离子强度缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl)中以0.5ml/min流速 进一步纯化蛋白质。在适当的UV280峰处收集目标蛋白，并使用考马斯蓝染色 的凝胶电泳进行确认。对于OaAEP1连接酶，激活时，将含有1mMEDTA和0.5mM Tris 1mM EDTA和0.5mM Tris(2-羧乙基)膦盐酸盐的缓冲液添加到未成熟的蛋白质中，并用冰醋酸将溶液的pH调节至4。将蛋白质库在37℃下孵育5小 时。在此pH下的蛋白质沉淀可通过离心去除大部分的污染蛋白质。通过使用10 kDa截留浓缩器超速离心，来浓缩活化的蛋白质，并储存在-80℃。
使用带有LPETG序列的抗体和肽对EV进行分选标记
将600pmol分选酶A与2.75μmol sdAb或21μmol肽在1x分选酶缓冲液(50 mMTrisHCl pH 7.5，150mM NaCl)中混合，并在冰上放置30分钟。随后，将 8x1011EV(～50μgEV蛋白)添加到分选酶混合物中，在125μl的总体积中， 分选酶A最终浓度为4μM(～10ug)和VHH-LPETG最终浓度为20μM(～50μg)。 将反应物在4℃下孵育60分钟，在端对端(end-over-end)摇床上温和搅拌(20 rpm)。将缀合的EV添加到2ml冷冻的60％蔗糖垫中，并使用降低的制动速度 的SW41Ti转子(贝克曼库尔特)以100000xg的转速于4℃离心16小时。收集 EV的红色层(蔗糖上方)，并用16ml冰冷的PBS洗涤一次，在70Ti转子(贝克 曼库尔特)中以100000xg的转速在4℃下超速离心70分钟。
使用OaAEP1 Cys247Ala蛋白连接酶用带有TRNGL序列的肽包被EV
每20μl反应混合物中，含有3μl RBCEV(0.72x1011颗粒/ul，相当于RBCEV 中100μg血红蛋白)，2.5-10μl 1mM肽和5μl 10μM连接酶，在pH 7至7.4 (pH 7最佳)的PBS缓冲液中，至连接酶(1μM)和肽(50至500μM)的最终 浓度。将反应物在室温下孵育30分钟，在端对端(end-over-end)摇床上温和 搅拌(30rpm)。当反应规模扩大时，需要更长的孵育时间，例如连接1-2mg RBCEV需要3小时(基于血红蛋白定量)。
用荧光染料标记包被的RBCEV
包被有肽或sdAb的RBCEV用PBS洗涤一次，通过在4℃下以21000xg转速离 心15分钟。洗涤后的RBCEV在室温下与10μM钙黄绿素AM孵育20分钟，或在37℃ 与20μM CFSE孵育1小时，或在室温下与2μM DiR孵育15分钟。立即将标记的 RBCEV装入SEC柱(Izon)中，并用PBS洗脱。收集流份7至10(呈粉红色)，并 在4℃下，通过21000xg离心15分钟来洗涤3次。
将RNA和药物负载到RBCEV中
在负载RNA之前，在4℃下，将连接的RBCEV用PBS在21000xg的转速下洗涤 3次，每次15分钟。使用转染试剂将9μg荧光素酶mRNA(Trilink)负载到50μ gRBCEV中，反应30分钟。然后以21,000xg的转速离心3次，在PBS中洗涤EV。
为了载药，在37℃下，将未包被的RBCEV与200μg PTX在1ml PBS中孵育 15分钟。在4℃下，使用超声破碎仪(Biogenode)将混合物超声处理12分钟， 然后在37℃下恢复1小时。负载的RBBCV在21000xg下离心15分钟，用PBS洗涤， 使用血红蛋白测定法定量，并如上所述用肽包被。如所描述的，使用SEC重新 纯化包被的RBCEV。为了测量装载入RBCEV的PTX，将负载的RBCEV的一份试样在 21000xg下离心15分钟。在75℃下干燥沉淀，于乙腈中重悬，并在21000xg下 离心10分钟。使上清液通过0.22μm的滤器，并使用HPLC进行分析。
蛋白质印迹分析
将缀合的EV与添加了蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(Biotool)在冰上孵育5 分钟。在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离30μg蛋白质裂解液，并转移到硝酸纤维 素膜(GE保健公司)上。将PM5100 ExcelBandTM3色高范围蛋白梯(中国台湾， SmoBio)加到样品的两侧。在室温下，用含0.1％Tween-20(TBST)的Tris缓 冲盐水中的5％脱脂牛奶将膜封闭1小时，并在4℃下与一抗孵育过夜：小鼠抗 His/VHH(金斯瑞，稀释度1：1000)，小鼠抗FLAG(西格玛，稀释度1：500)。 印迹用TBST洗涤3次，然后与HRP偶联的抗小鼠二抗(Jackson免疫研究，稀释 度1：10000)在室温下孵育1小时。对于生物素化的肽检测，印迹不与任何抗 体一起孵育，而直接与HRP偶联的链霉亲和素(赛默飞世尔，稀释度1：4000) 孵育。使用Azure Biosystems凝胶文档系统对印迹进行成像。
用肽或sdAb包被的EV处理癌细胞
人乳腺癌SKBR3细胞，人肺癌H358和HCC827细胞获自美国典型培养物保藏 中心(ATCC，美国)。人乳腺癌MCF10CA1a(CA1a)从Karmanos癌症研究所(美 国韦恩州立大学)获得。急性髓样白血病MOLM13和THP1细胞是从DSMZ微生物和 细胞培养物保藏中心(德国不伦瑞克)获得的。将所有实体癌细胞和白血病细 胞分别保存在含有10％的胎牛血清(美国Biosera)和1％青霉素/链霉素(赛 默飞世尔科技，美国)DMEM或RPMI(赛默飞世尔科技)中。为了测试EV的摄取， 将100000个SKBR3细胞与6x1011PKH26标记的未包被或YG20包被的EV，在24孔 板中的每孔500μl生长培养基中孵育24小时。在较短的吸收测定中，将H358、HCC827、MOLM13和THP1细胞与钙黄绿素AM标记的RBCEV在37℃下孵育1至2小时。 为了确定EV的摄取途径，我们添加了25-100μMEIPA，5-20μg/ml菲律宾菌素， 0.25-1μM渥曼青霉素。在EV结合测定中，将HCC827细胞与未标记的RBCEV在4℃ 下孵育1小时。
流式细胞仪分析
将经RBCEV处理的SKBR3或其他细胞用PBS洗涤两次，然后重悬于100μl FACS缓冲液(含0.5％胎牛血清的PBS)中。将细胞与3μl FITC缀合的EGFR抗 体(生物传奇公司)在冰上避光孵育15分钟，然后用1ml FACS缓冲液洗涤两 次。为了量化肽的包被效率，将100μgbi-YG20包被或bi-TRNGL包被的RBCEV或 未包被的RBCEV(作为阴性对照)与2.5μg乳胶微球(赛默飞世尔科技)在摇 床上于4℃孵育过夜，用PBS洗涤3次，然后重悬于100μl的包含1μl与Alexa Fluor 647(AF647)偶联的链霉亲和素的FACS缓冲液中，在冰上孵育15分钟并 用FACS缓冲液洗涤两次。使用CytoFLEX-S细胞计数器(贝克曼库尔特)对FACS 缓冲液中的乳胶微球或细胞进行流式细胞术，并使用Flowjo V10(Flowjo，美 国)进行分析。最初基于FSC-A和SSC-A对微球或细胞进行门控，以排除碎片和 死细胞(低FSC-A)。根据FSC宽度相对FSC高度的关系对细胞进一步门控，以 排除双峰和聚集体。随后，在适当的荧光通道中对荧光阳性的微球或细胞进行 门控：PE用于PKH26，APC用于AF647，因为在未染色/未处理的阴性对照中的细 胞群显示的信号可忽略。
体内癌症模型的产生和RBCEV的治疗
用慢病毒载体(pLV-Fluc-mCherry-Puro)转导H358细胞，并用嘌呤霉素 选择以产生稳定的细胞系。将1百万个H358-luc细胞注射到NSG小鼠(6-7周龄) 的尾静脉中。3周后，在注射D-荧光素后，使用IVIS Lumina II(珀金埃尔默) 检测到肺中的生物发光。具有相当的生物发光信号的小鼠通过眶后注射0.5至5 x109个人类RBC(从供体收集后1-7天)或具有相同RBC数量的残影进行预处理。
1小时后，为进行生物分布实验，给小鼠注射100μg DiR标记的RBCEV，其 与尾静脉中的对照或EGFR靶向肽连接。8小时后，处死小鼠并立即在器官中测 量DiR荧光。为进行药物治疗，在红细胞预处理后1小时，每3天对小鼠静脉注 射20mg/kg单独的紫杉醇(PTX)或同等剂量的带有或不带有EGFR肽连接的PTX。 将相同量的未负载的RBCEV用作阴性对照。
血液循环中RBCEV的定量
将500μgCFSE标记的肽连接的RBCEV注射到NSG小鼠的尾静脉中。5分钟后， 从眼睛中收集100μl血液。去除血细胞，并将20μl血浆与5μl生物素化的GPA 抗体在室温下孵育2小时，并轻轻旋转。然后将混合物与20μl链霉亲和素珠子 在室温下孵育1小时。将珠子洗涤3次，并于500μlFACS缓冲液中重悬以用于 CFSE分析。
参考文献
以上引用了许多出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属 的技术水平。以下提供了这些参考文献的完整引文。这些参考文献中的每一个 都整体并入本文。
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有关标准分子生物学技术的信息，请参见Sambrook，J.，Russel，D.W.《分 子克隆，实验室手册》第3版，2001，纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社。

Claims (23)

1.一种包含外源多肽标签的细胞外囊泡，其中所述标签与细胞外囊泡的膜蛋白共价连接。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡，其中所述标签包含一个或多个功能性结构域，其中所述功能域能够结合至靶标部分，能够被检测和/或能够诱导治疗作用。
3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述功能性结构域包含抗体或抗原结合片段，优选sdAb。
4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡是微囊泡或外泌体，优选微囊泡。
5.根据权利要求4所述的细胞外囊泡，其中，所述细胞外囊泡是源自红细胞的微囊泡。
6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡负载有负荷。
7.根据权利要求6所述的细胞外囊泡，其中，所述负荷是核酸、肽、蛋白质或小分子。
8.根据权利要求7所述的细胞外囊泡，其中，所述负荷是选自下组的核酸：反义寡核苷酸、信使RNA、长RNA、siRNA、miRNA、gRNA或质粒。
9.一种组合物，其包含一个或多个根据权利要求1至8中任一项所述的细胞外囊泡。
10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞外囊泡或组合物，用于治疗方法。
11.一种治疗方法，所述方法包括将权利要求1所述的细胞外囊泡施用于需要治疗的患者。
12.根据权利要求1-11中任一项的细胞外囊泡或组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的细胞外囊泡或组合物的用途，治疗方法或用途，其中所述治疗方法包括对患有遗传性疾病、炎性疾病、癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病或胃肠道疾病的受试者施用根据权利要求1-9中任一项所述的细胞外囊泡或组合物。
14.根据权利要求13所述的细胞外囊泡或组合物的用途，治疗方法或用途，其中所述受试者患有癌症，所述癌症任选地选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、鼻咽癌、肾癌或神经胶质瘤。
15.一种方法，其包括在允许标签和细胞外囊泡的表面蛋白之间共价结合的条件下，使细胞外囊泡与标签和蛋白质连接酶接触，从而产生标记的细胞外囊泡。
16.一种方法，其包括：
(a)在允许肽与细胞外囊泡的表面蛋白之间共价结合的条件下，使细胞外囊泡与肽和第一蛋白连接酶接触，从而产生肽标记的细胞外囊泡；和
(b)在允许共价结合至细胞外囊泡的肽与功能性结构域肽之间共价结合的条件下，使肽标记的细胞外囊泡与功能性结构域肽和第二蛋白连接酶接触。
17.根据权利要求16所述的方法，其中第一和第二肽连接酶是相同的。
18.根据权利要求16所述的方法，其中第一和第二肽连接酶是不同的。
19.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中，所述方法还包括使所述细胞外囊泡与负荷接触并且电穿孔以将所述负荷包裹在所述细胞外囊泡中。
20.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述蛋白质连接酶选自下组：分选酶或AEP1，优选分选酶A。
21.一种通过根据权利要求15-20中任一项所述的方法获得的细胞外囊泡。
22.一种标签，所述标签包含结合分子和蛋白质连接酶识别位点，所述标签任选地进一步包含间隔子，所述间隔子位于所述结合分子和所述蛋白质连接酶识别位点之间。
23.一种编码根据权利要求22所述的标签的核酸。
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