CN114522252B - 一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法及修饰试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法及修饰试剂，在Lewis碱催化剂的催化条件下，叠氮化物将细胞外囊泡表面醇羟基取代为叠氮基，一步制备得到叠氮化修饰细胞外囊泡；修饰过程在不影响细胞外囊泡的形态学、膜结构及生物学功能。制备得到的叠氮化修饰的细胞外囊泡能够用于细胞外囊泡活体示踪，与炔化修饰的荧光探针在铜离子催化条件下进行点击化学偶联，完成对细胞外囊泡的荧光标记，荧光标记后的细胞外囊泡取得了良好的示踪效果，荧光标记率较高，稳定性高。

Description

一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法及修饰试剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法及修饰试剂。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular Vesicle, EV)是一类由细胞分泌，具备磷脂双分子层膜结构及其包裹的蛋白质、脂质以及核酸等多种生物分子的生物纳米囊泡。细胞外囊泡由母细胞分泌并释放至胞外后，一般通过膜融合的形式将所携带的生物大分子递送至受体细胞，是细胞之间物质交换及信息传递的新型内源性载体。细胞外囊泡基于自身颗粒尺寸小(直径在30~1000 nm范围)，比表面积大，天然的分子传输属性以及良好的生物相容性，作为新型内源性药物载体在药物递送领域具有巨大的应用前景。
细胞外囊泡作为药物载体应用于疾病治疗的前提与关键是细胞外囊泡的活体示踪。迄今为止，细胞外囊泡示踪常用的技术手段是将脂溶性荧光探针分子通过疏水作用插入细胞外囊泡膜结构中，对细胞外囊泡进行荧光标记。然而，大多数荧光探针对细胞外囊泡脂膜标记的方法存在光漂白现象、标记效率低以及可重复性差等缺陷。此外，常规细胞外囊泡示踪方法均在一定程度上会改变细胞外囊泡的膜结构组成，进而影响其理化性质、形态学特征及生物学功能。这些问题严重影响了细胞外囊泡的示踪应用。因此，亟需一种在不影响细胞外囊泡脂膜结构及生物学功能的条件下通过对细胞外囊泡的定向修饰实现细胞外囊泡在体内外示踪的方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法及修饰试剂。
本发明采用的技术方案是：一种叠氮化修饰试剂，包括叠氮化物和Lewis碱催化剂，叠氮化物和Lewis碱催化剂的摩尔比为1:1-3。
优选地，叠氮化物为叠氮酸、叠氮化钠或叠氮磷酸二苯酯(DPPA)。
优选地，Lewis碱催化剂为1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)和偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)中的一种或多种。
一种叠氮化修饰的细胞外囊泡，细胞外囊泡表面的一个或多个醇羟基被叠氮基取代。
一步法制备叠氮化修饰细胞外囊泡的方法，叠氮化物、Lewis碱催化剂和细胞外囊泡混合孵育，将细胞外囊泡表面醇羟基取代为叠氮基。
优选地，采用修饰细胞外囊泡的试剂与细胞外囊泡混合孵育，25-37℃反应20-24h。
优选地，细胞外囊泡来源于奶源、血液、尿液或干细胞。
优选地，叠氮化修饰的细胞外囊泡与炔化修饰的荧光探针混合孵育，铜离子催化条件下进行偶联，得到荧光标记的细胞外囊泡。
优选地，炔化修饰的荧光探针为罗丹明末端炔烃。
优选地，25-37 ℃孵育3-4 h。
本发明具有的优点和积极效果是：提供一种基于Mitsunobu反应的一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法，利用Mitsunobu反应高效且反应条件温和的特点，使用叠氮化物在Lewis碱催化条件下将细胞外囊泡脂膜上的醇羟基一步取代为叠氮基；该修饰过程在不影响细胞外囊泡的形态学、膜结构及生物学功能的前提下完成，有助于对细胞外囊泡的荧光标记及示踪研究。
附图说明
图1为细胞外囊泡进行荧光标记的制备流程图；
图2为叠氮化修饰细胞外囊泡结构示意图；
图3为细胞外囊泡的荧光标记率及粒径分布，其中图3中A图为实施例3中得到的荧光标记细胞外囊泡的荧光标记率，图3中B图为对比例的荧光标记率，图3中C图为实施例2制得的叠氮化修饰细胞外囊泡的粒径分布，图3中D图为未标记的细胞外囊泡的粒径分布；
图4为细胞外囊泡的透射电镜图片(形态学)，其中图4中A图为实施例2制得的叠氮化修饰细胞外囊泡的透射电镜图片，图4中B图为未标记的细胞外囊泡的透射电镜图片；
图5为未标记的细胞外囊泡、实施例2制得的叠氮化修饰细胞外囊泡标志蛋白CD9、CD81与TSG101的Western blot鉴定结果，其中EVs表示未标记的细胞外囊泡，Azide-EVs表示实施例2制得的叠氮化修饰细胞外囊泡；
图6为细胞外囊泡的纯度分析图，其中图6中A图为实施例2制得的叠氮化修饰细胞外囊泡纯度分析结果，图6中B图为未标记的细胞外囊泡纯度分析结果；
图7为细胞外囊泡被U251细胞摄取的效果，其中图7中A图为未标记的细胞外囊泡的FSC-SSC散点图，图7中B图为未标记的细胞外囊泡的流式直方图，图7中C图为实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡的FSC-SSC散点图，图7中D图为实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡的流式直方图；其中EVs表示未标记的细胞外囊泡，YF488-EVs表示实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡；
图8为细胞外囊泡被293T细胞摄取的效果，其中图8中A图为未标记的细胞外囊泡的FSC-SSC散点图，图8中B图为未标记的细胞外囊泡的流式直方图，图8中C图为实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡的FSC-SSC散点图，图8中D图为实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡的流式直方图；其中EVs表示未标记的细胞外囊泡，YF488-EVs表示实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡；
图9为细胞外囊泡在U251细胞内成像效果，其中图9中A图为实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡在U251细胞内成像图片，图9中B图为对比例获得的荧光标记的细胞外囊泡在U251细胞内成像图片；
图10为细胞外囊泡在293T细胞内成像效果，其中图10中A图为实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡在293T细胞内成像图片，图10中B图为对比例获得的荧光标记的细胞外囊泡在293T细胞内成像图片。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做出说明。
本发明公开一种一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法，将叠氮化物、Lewis碱催化剂与细胞外囊泡混合孵育，基于Mitsunobu反应将细胞外囊泡表面的醇羟基一步取代为叠氮基，获得叠氮化修饰的细胞外囊泡。叠氮化修饰的细胞外囊泡可以进一步应用于其他应用，例如将制得的叠氮化修饰的细胞外囊泡与炔化修饰的荧光探针混合孵育，在铜离子催化条件下进行点击化学偶联，实现对细胞外囊泡的荧光标记。将获得的荧光标记的细胞外囊泡加入细胞培养体系中，取得了良好的细胞内细胞外囊泡示踪效果。
叠氮化物和Lewis碱催化剂作为叠氮化修饰试剂的主要成分，叠氮化物和Lewis碱催化剂的摩尔比为1:1-3，优选为1:1；叠氮化物为叠氮酸、叠氮化钠或叠氮磷酸二苯酯(DPPA)，优选为叠氮磷酸二苯酯(DPPA)；Lewis碱催化剂为1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)或偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)，优选为1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。本发明某些实施例中，叠氮化修饰试剂可以作为试剂盒的组成成分，应用于叠氮化修饰细胞外囊泡的试剂盒。
一步法制备叠氮化修饰细胞外囊泡的方法，如图1所示，具体为将叠氮化修饰试剂和细胞外囊泡混合孵育，将细胞外囊泡表面一个或多个醇羟基取代为叠氮基。叠氮化修饰试剂和细胞外囊泡可以以任意比例混合，均能够实现对细胞外囊泡的修饰，基于修饰效果、修饰稳定性和成本控制，按照一定混合比例将二者进行混合，以200 μg蛋白质/150 μL PBS的细胞外囊泡为基准，DPPA用量为140-160 nmol，优选为150 nmol；DBU用量为145-155nmol，优选为150 nmol；其他类型叠氮化物用量可参考DPPA；孵育条件为以超纯水、生理盐水或PBS缓冲液为溶剂，25-37 ℃反应20-24 h。获得叠氮化修饰的细胞外囊泡，结构如图2所示。反应过程中，温度优选为25 ℃，溶剂优选为PBS缓冲液，反应时长优选为24 h。制备得到叠氮化修饰的细胞外囊泡后通过离心柱层析法进行纯化，柱层析条件为采用CORE400填料，PBS缓冲液(pH 7.4)作流动相；离心条件为20-25 ℃，1000-2000 g离心2-5 min；离心温度优选为25℃，离心速度优选为1000 g，离心时长优选为2 min。
本发明利用Mitsunobu反应产率高且反应条件温和的特点，使用安全高效的叠氮磷酸二苯酯(DPPA)在DBU催化条件下将细胞外囊泡脂膜上的醇羟基一步取代为叠氮基。反应副产物磷酸二苯酯及DBU盐易溶于水，可通过分离除去，修饰过程在不影响细胞外囊泡的形态学、膜结构及生物学功能的前提下完成，最大程度保证了细胞外囊泡功能完整。
制备得到的叠氮化修饰的细胞外囊泡，能够进一步应用于连接其他物质，例如将其与炔化修饰的荧光探针混合孵育，如图1制备流程所示，在铜离子催化条件下进行点击化学偶联，获得荧光标记的细胞外囊泡；炔化修饰的荧光探针和铜离子的摩尔比为25-30:1；优选为27:1；炔化修饰的荧光探针为罗丹明末端炔烃；优选为罗丹明110-PEG4-炔烃，结构如式1所示；
式1。
式1化合物标记细胞外囊泡时，与通过离心柱层析法纯化后的细胞外囊泡混合孵育，式1化合物用量为7-10 nmol，优选为8.5 nmol；铜离子Cu(I)用量为0.1-0.5 nmol，优选为0.32 nmol；孵育条件为以超纯水、生理盐水或PBS缓冲液为溶剂，25-37 ℃反应3-4 h。获得荧光标记的细胞外囊泡。反应过程中，温度优选为25 ℃，溶剂优选为超纯水，反应时长优选为3 h。制备得到荧光标记的细胞外囊泡后通过离心柱层析法进行纯化，柱层析条件为CORE400填料，PBS缓冲液(pH 7.4)作流动相；离心条件为20-25 ℃，1000-2000 g离心2-5min；离心温度优选为25℃，离心速度优选为1000 g，离心时长优选为2 min。
使用炔化修饰的荧光探针对叠氮化修饰的细胞外囊泡进行荧光标记时，通过纳米流式、细胞流式及激光共聚焦显微镜体外检测实验表明，炔化修饰的荧光探针在铜离子催化条件下能够与通过本发明所述的一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法修饰的细胞外囊泡发生点击化学偶联(copper(I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition, CuAAC)，细胞外囊泡的荧光标记效率超过60%。本发明通过化学修饰方法实现对细胞外囊泡的一步法叠氮化修饰，并通过点击化学方法对叠氮化修饰的细胞外囊泡进行荧光标记，取得了良好的细胞外囊泡示踪效果，为开发细胞外囊泡活体示踪方法提供了新策略。
本发明中细胞外囊泡为来源于奶源、血液、尿液或干细胞的细胞外囊泡，其中干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种或多种。通过实验比对，细胞外囊泡为牛奶来源的细胞外囊泡时叠氮化及荧光标记效果明显；另外，与其他来源的细胞外囊泡相比，牛奶来源的细胞外囊泡制备工艺简单，成本低廉，产量较大且纯度较高，尤其适合用于细胞外囊泡的研究，下面实施例以牛奶来源的细胞外囊泡为例，对本发明进行进一步说明。
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。实施例中细胞培养基、FBS、双抗及胰酶等试剂均购于Gibco公司，培养板、爬片等细胞培养耗材均购于Corning公司。本发明的实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中的定量实验结果，均为自设置的三次平行重复实验结果所取的平均值。
实施例1：
通过将新鲜牛奶依次通过酸沉(pH 4.0)、超速离心及柱层析等工艺分离纯化得到牛奶来源的细胞外囊泡，通过纳米流式检测技术表征牛奶来源的细胞外囊泡的粒径分布、透射电镜观察细胞外囊泡的形态学、Western blot检测细胞外囊泡的表面标志物蛋白和超高液相-分子排阻色谱法检测细胞外囊泡的纯度，其结果将分别如图3中D图、图4中B图、图5和图6中B图所示。
实施例2：一步法制备叠氮化修饰的细胞外囊泡
将150 μL实施例1制备得到的牛奶来源的细胞外囊泡(含200 μg蛋白质)与DPPA(33.3 μL, 150nmol)混合，加入DBU(22.4μL, 150nmol)，在25℃下反应24 h。实施例中细胞外囊泡的终浓度为1000 μg/mL蛋白质。
重力离心管经PBS缓冲液润洗2次，装填CORE400填料，加入上述混合液，将重力离心管置于15 mL离心管中，25 ℃下以1000 g速度离心2min，分离除去反应体系中的小分子副产物，收集样品，获得纯化后的叠氮化修饰的牛奶来源的细胞外囊泡。
实施例3：荧光标记的细胞外囊泡的制备
将荧光探针罗丹明110-PEG4-炔烃(1 mg, 1.70 μmol)溶于DMSO(200 μL)，制备成8.5 mM的罗丹明110-PEG4-炔烃荧光染料。用于荧光标记的荧光探针罗丹明110-PEG4-炔烃的分子结构如式1所示；
式1。
向实施例2中获得的200 μL叠氮化修饰的牛奶来源的细胞外囊泡中加入1 μL罗丹明110-PEG4-炔烃荧光染料(8.5nmol)，同时加入CuSO4(1μL, 0.32 nmol)与维生素A(5 μL，7.2 nmol)，在25℃下反应3 h。
将上述混合液转移至经PBS缓冲液润洗2次后的装填有CORE400填料的重力离心管中，并将重力离心管置于15 mL离心管中，25 ℃下以1000 g速度离心2min后，分离除去反应体系中的金属离子及未偶联的荧光探针分子，收集样品，获得纯化后的荧光标记的牛奶来源的细胞外囊泡。
对比例：
将150 μL实施例1制备得到的牛奶来源的细胞外囊泡(含200 μg蛋白质)与罗丹明110-PEG4-炔烃(1 μL, 8.5nmol)混合，加入56 μL的PBS缓冲液，在25℃下孵育3 h。
将上述对比例的混合液转移至经PBS缓冲液润洗2次后的装填有CORE400填料的重力离心管中，并将重力离心管置于15 mL离心管中，25 ℃下以1000 g速度离心2min后，分离除去反应体系中的游离的荧光探针分子，收集样品，获得纯化后的荧光标记的牛奶来源的细胞外囊泡。
实施例4：应用纳米流式检测技术表征细胞外囊泡的荧光标记率及粒径分布
将实施例3与对比例中获得的荧光标记的细胞外囊泡用PBS分别稀释1000倍，选择250 ± 5 nm的单分散纳米荧光硅球用于纳米流式检测仪的光学校准和计数标准，选择一组粒径分别为68 ± 2 nm，91 ± 3 nm，113 ± 3 nm及155 ± 3 nm的纳米硅球用于纳米流式检测仪的粒径标准，通过纳米流式检测技术(Nano flow cytometry, NanoFCM)分别检测实施例3与对比例中至少5000个细胞外囊泡的荧光标记率。
检测条件：488 nm的激光器，检测通道分别为散射通道和FITC荧光通道，衰减系数10%，进样压力1.0kPa，进样速度25.10 nL/min。
将实施例2中获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡与150 μL牛奶来源的细胞外囊泡(含200 μg蛋白质)原液用PBS稀释1000倍，选择250 ± 5 nm的单分散纳米荧光硅球用于纳米流式检测仪的光学校准和计数标准，选择一组粒径分别为68 ± 2 nm，91 ± 3 nm，113± 3 nm及155 ± 3 nm的纳米硅球用于纳米流式检测仪的粒径标准，通过纳米流式检测技术(Nano flow cytometry, NanoFCM)分别检测实施例2中获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡与未标记的细胞外囊泡的粒径。检测条件：检测通道为散射通道，衰减系数10%，进样压力1.0kPa，进样速度25.10 nL/min。
如图3中A图所示，由实施例3获得的细胞外囊泡的荧光标记率为61.1%；如图3中B图所示，由对比例获得的细胞外囊泡的标记率为2.5%。说明实施例3获得的细胞外囊泡的荧光标记率远高于对比例。如图3中C图所示，实施例2获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡的平均粒径为87.63 nm；如图3中D图所示，未标记的细胞外囊泡的平均粒径为80.14 nm。说明实施例2获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡的平均粒径相比未标记的细胞外囊泡略有增加，但未有显著变化。
实施例5：应用透射电镜观察细胞外囊泡的形态学
将实施例2获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡与未标记的细胞外囊泡(200 μg蛋白质/150 μL PBS)分别用PBS稀释10倍，各取10 μL与同体积的4%的多聚甲醛(PFA)混合固定后，静置15 min。取15 μL样品滴于200目的铜网上，室温静置3 min，用吸水纸吸干铜网上多余液体；在样品的铜网上滴加2%醋酸双氧铀溶液(15 μL)，室温静置1 min，对样品进行负染，用吸水纸吸干铜网上多余液体，将制备好的样品置于透射电镜(TEM)下观察，并采集图片。
如图4中A图所示，实施例2获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡与未标记的细胞外囊泡(图4中B图)相比，形态学未发生显著变化，形态为较为完整的杯托状囊泡结构。
实施例6：通过Western blot检测细胞外囊泡的表面标志物蛋白CD9、CD81和TSG101
蛋白样品制备：在未标记的细胞外囊泡与实施例2获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡中分别加入RIPA裂解液裂解细胞外囊泡，反复吹打后转移至洁净1.5 mL EP管内，冰上裂解30 min，每10 min涡旋振荡一次，再于4 ℃下以12000 rpm速度离心15 min，转移上清至新的EP管中；使用BCA法测定细胞外囊泡蛋白浓度，向其余蛋白液中加入5倍上样缓冲液，在沸水中煮10 min，于-80 ℃冰箱中贮备。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：将洁净的玻板装于制胶架上，底边吻合严密，用蒸馏水验漏。按分离胶配方制备10％的分离胶溶液，充分混匀后用移液器将4.5ml分离胶溶液加入玻板缝隙中，立即缓慢加入蒸馏水将分离胶液面压平，约20 min后分离胶凝固。再按配方制备5％的浓缩胶溶液，将1.5ml浓缩胶溶液灌注于分离胶的上方，立即插入梳子，待浓缩胶凝固。将配好的胶板置于电泳槽内，使短玻板向内侧，在两块玻板间加入电泳液，拔出梳子后按测定蛋白浓度统一上样量，将蛋白样品加入上样孔中，添加电泳液至电泳槽标记处，90 V开始电泳，待溴酚蓝移至分离胶处，将电压调至120 V，直至溴酚蓝接近玻板底部时则停止电泳。
转膜与封闭：将聚丙烯酰胺凝胶置于黑色夹板一侧，剪取适宜大小的PVDF膜，置于甲醇中活化60 s，置于胶上，除尽气泡后夹好转膜夹，放置于转膜槽中，添加转膜液，冰浴恒压120 V转膜2 h。将转膜完成的PVDF膜取出，用TBST溶液清洗后置于5％的脱脂牛奶(封闭液)中，使用水平摇床以100 rpm室温封闭1 h。
抗体杂交：1)一抗孵育：用封闭液按说明书稀释一抗(CD9，稀释比1:1000；CD81，稀释比1:1000；TSG101，稀释比1: 10000)，转移2 mL一抗至抗体孵育盒中，对比蛋白Marker将目的条带剪下后浸泡于对应一抗中，4 ℃孵育过夜；2)二抗孵育：将目的条带用TBST清洗5min，反复3次，然后加入对应二抗，使用水平摇床以100 rpm室温孵育2 h，待孵育完成后用TBS清洗5 min，反复3次。
发光检测：将发光液A与B等比例混合制备成工作液，在暗室中在膜上滴加发光液，待目的条带发出绿色荧光时，进行曝光、显影及定影。
如图5所示，实施例2获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡的标志蛋白CD9、CD81和TSG101表达水平与未标记的细胞外囊泡基本一致，未发生显著变化。
实施例7：通过超高液相-分子排阻色谱法检测细胞外囊泡的纯度
将未标记的细胞外囊泡和实施例2获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡用PBS分别稀释10倍(浓度至少为2×1010颗粒数/mL)，通过超高液相-分子排阻色谱法(UPLC-SEC)检测细胞外囊泡纯度。检测条件：Acclaim™ SEC-1000 LC 色谱柱(7 µm，1000 Å，7.8 x 150 mm)，以pH7.2的20 mM磷酸盐缓冲液(含150 mM NaCl)为流动相，流速0.3 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为280 nm，进样量25 μL。
如图6中A图所示，实施例2获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡纯度为95.4%；如图6中B图所示，未标记的细胞外囊泡纯度为99.7%。说明实施例2获得的叠氮化修饰的细胞外囊泡纯度比未标记的细胞外囊泡纯度略有下降，但未有显著性变化。
综上，实施例2-7的结果证明，实施例2中对细胞外囊泡的一步法叠氮化修饰的方法有效，且由实施例3中通过点击化学方法对实施例2获得的细胞外囊泡进行标记的荧光标记率远高于荧光探针被动标记细胞外囊泡的荧光标记率。本发明所述的一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法能够较好地保持细胞外囊泡的形态学，不会显著改变细胞外囊泡表面蛋白标志物CD9、CD81和TSG101的表达水平，而且几乎不影响细胞外囊泡的纯度。
实施例8：通过流式细胞术检测荧光标记的细胞外囊泡被人胶质瘤细胞摄取的效果
人胶质瘤细胞(U251)的培养：在24孔培养板中以5×104个/孔种U251细胞，每孔加入500 μL的MEM完全培养基(含10% FBS和1%双抗)，在37 ℃和5%CO2条件下培养24 h后向每孔加入50 μL未修饰的细胞外囊泡或实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡，保证每孔细胞外囊泡的终浓度为50 μg/mL，混合均匀后在37 ℃和5%CO2条件下继续孵育4 h。
检测前的细胞处理：24孔培养板每孔弃去培养基后加入500 μL的PBS缓冲液洗涤细胞。弃去PBS，向每孔中加入200 μL胰酶消化细胞3 min后，直接加入300 μL的10% FBS终止消化。将每孔混合液转移至1.5 mL EP管中，以350 g的速度离心5 min。弃去上清后，加入1 mL的PBS重悬细胞，再次以350 g的速度离心5 min。弃去上清后，加入200-400 μL的PBS重悬细胞，上机检测。如图7所示，实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡能够被U251细胞中98.56%的群体摄取。
实施例9：通过流式细胞术检测荧光标记的细胞外囊泡被人肾上皮细胞摄取的效果
人肾上皮细胞(293T)的培养：在24孔培养板中以5×104个/孔种293T细胞，每孔加入500 μL的DMEM完全培养基(含10% FBS和1%双抗)，在37 ℃和5%CO2条件下培养24 h后向每孔加入50 μL未标记的细胞外囊泡或实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡，保证每孔细胞外囊泡的终浓度为50 μg/mL，混合均匀后在37 ℃和5%CO2条件下继续孵育4 h。
检测前的细胞处理：24孔培养板每孔弃去培养基后加入500 μL的PBS缓冲液洗涤细胞。弃去PBS，向每孔中加入200 μL胰酶消化细胞3 min后，直接加入300 μL的10% FBS终止消化。将每孔混合液转移至1.5 mL EP管中，以350 g的速度离心5 min。弃去上清后，加入1 mL的PBS重悬细胞，再次以350 g的速度离心5 min。弃去上清后，加入200~400 μL的PBS重悬细胞，可上机检测。
如图8所示，实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡被293T细胞中99.26%的群体摄取。
实施例10：通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记的细胞外囊泡在人胶质瘤细胞内成像
人胶质瘤细胞(U251)的培养：将U251细胞培养于24孔培养板每孔内的细胞爬片上。待细胞融合度达70~80%，向每孔加入未修饰的细胞外囊泡或实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡，保证每孔细胞外囊泡的终浓度为50 μg/mL，混合均匀后在37 ℃和5%CO2条件下继续孵育24 h。弃去培养基后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入4%的PFA固定10 min，用PBS洗涤3次后再用细胞核荧光染料DAPI染色15 min。此后用PBS再洗涤3次，可在激光共聚焦显微镜下观察实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡在U251细胞内的成像。检测条件：Ex=488 nm，Em=520~550 nm。
将对比例获得的荧光标记的细胞外囊泡用同样的方法与U251细胞共培养24 h，在激光共聚焦显微镜下观察其细胞内成像。
如图9中A图所示，实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡在U251细胞中清晰可见(绿色)，而对比例获得的荧光标记的细胞外囊泡(图9中B图)在U251细胞内成像较实施例3为弱。
实施例11：通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记的细胞外囊泡在人肾上皮细胞内成像
人肾上皮细胞(293T)的培养：将293T细胞培养于24孔培养板每孔内的细胞爬片上。待细胞融合度达70~80%，向每孔加入实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡，保证每孔细胞外囊泡的终浓度为50 μg/mL，混合均匀后在37 ℃和5%CO2条件下继续孵育24 h。弃去培养基后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入4%的PFA固定10 min，用PBS洗涤3次后再用细胞核荧光染料DAPI染色15 min。此后用PBS再洗涤3次，可在激光共聚焦显微镜下观察实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡在293T细胞内的成像。检测条件：Ex=488 nm，Em=520-550nm。
将对比例获得的荧光标记的细胞外囊泡用同样的方法与293T细胞共培养24 h，在激光共聚焦显微镜下观察其细胞内成像。
如图10中A图所示，实施例3获得的荧光标记的细胞外囊泡在293T细胞中清晰可见(绿色)，而对比例获得的荧光标记的细胞外囊泡(图10中B图)在293T细胞内成像较实施例3为弱。
由实施例2-11能够看出，通过本发明所述的一步法叠氮化修饰的细胞外囊泡的形态学未发生显著变化，表面蛋白标志物表达水平与未经修饰的细胞外囊泡基本相符，且经点击化学被荧光标记后在细胞内具有较为理想的示踪效果。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (5)

1.一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法，其特征在于：将叠氮化物和Lewis碱催化剂混合形成叠氮化修饰试剂，叠氮化物和Lewis碱催化剂的摩尔比为1:1-3，将叠氮化修饰试剂与细胞外囊泡混合孵育，叠氮化修饰试剂能够将细胞外囊泡表面醇羟基取代为叠氮基，
孵育条件为以超纯水、生理盐水或PBS缓冲液为溶剂，25-37℃反应20-24h；
修饰后能够保持细胞外囊泡的形态学、膜结构及生物学功能；
所述叠氮化物为叠氮磷酸二苯酯；所述Lewis碱催化剂为1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯；细胞外囊泡来源于奶源。
2.由权利要求1所述的一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法修饰得到的表面叠氮化修饰的细胞外囊泡。
3.权利要求2所述的叠氮化修饰的细胞外囊泡在制备荧光标记的细胞外囊泡中的应用，其特征在于：叠氮化修饰的细胞外囊泡与炔化修饰的荧光探针混合孵育，铜离子催化条件下进行偶联，得到荧光标记的细胞外囊泡。
4.根据权利要求3所述的叠氮化修饰的细胞外囊泡在制备荧光标记的细胞外囊泡中的应用，其特征在于：炔化修饰的荧光探针为罗丹明末端炔烃。
5. 根据权利要求3所述的叠氮化修饰的细胞外囊泡在制备荧光标记的细胞外囊泡中的应用，其特征在于：25-37 ℃孵育3-4 h。
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