CN115851888A - 一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用 - Google Patents

一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用 Download PDF

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CN115851888A CN202211145428.6A CN202211145428A CN115851888A CN 115851888 A CN115851888 A CN 115851888A CN 202211145428 A CN202211145428 A CN 202211145428A CN 115851888 A CN115851888 A CN 115851888A
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Abstract

本发明公开了一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用所述方法包括：将细胞外囊泡(EVs)与抗体偶联核酸复合物一起孵育，所述抗体偶联核酸复合物由EVs普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成；然后将EVs和抗体偶联核酸复合物的混合物与引物、探针一起配制成反应体系，经液滴生成仪产生微液滴，实现单个EV的包裹，将所述液滴用PCR仪进行热循环扩增反应，随后通过液滴生成仪识别读取液滴，从而对EVs亚群进行分离分析。本发明能实现EVs数字化绝对定量，只需更换抗体就可实现多种EV亚群的精准检测分析；技术简单、稳定、成熟，利用普通PCR仪就可实现临床疾病诊断，利于临床推广转化。

Description

一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的 方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由细胞向细胞外环境释放的直径在30-2000nm的具有脂质双分子层膜的膜性结构。细胞把特异的生物活性分子如微小核糖核酸、蛋白质等包裹到EVs中或结合于EVs表面，使其稳定地存在于几乎所有生物液体中，如血清、尿液、羊水、脑脊液和唾液等，可以通过非侵入性的方式获得。从EVs的首次发现至今，有关EVs的研究突飞猛进。特别是近年来，随着EVs作用机制及其与疾病之间关系的深入研究，证实EVs已成为一类具有广阔应用前景的新型生物标志物。但是，EVs可被任何有核细胞分泌，事实上，真正具有疾病诊断作用的是那些具有疾病特异蛋白或者核酸的EVs亚群。因此，对EVs特异亚群的精准检测是目前EVs用于疾病诊断中越来越受关注的一个研究方向，并且对EVs亚群的研究能推进人类个体疾病的精确化诊治。
由于传统的EVs检测技术，如纳米粒子跟踪分析(nanoparticle trackinganalysis,NTA)测定EVs浓度，酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)或免疫印迹实验(Western blot)评价EVs蛋白含量，Northern印迹、微阵列杂交、RT-PCR等检测EVs携带的核酸，需要样本量较大，操作步骤繁琐，不适用于临床检测。近年来，关于EVs检测技术日趋成熟，涌现出一批EVs检测平台，如光学、电学(电化学和电动力学)和小型微流控技术平台等，显著提高了EVs检测的灵敏度与特异度，缩短了检测时间，并将其用于前列腺癌、肝癌、结直肠癌等疾病的诊断与预后监测。然而，这些检测技术均停留在EVs批量分析水平，忽略了EVs的个体差异，会忽视、掩盖或者遗失单个EV的所携带的分子信息，限制了EVs的精准分析。
单囊泡分析技术平台可以实现EVs数字化超灵敏检测，对特异EVs亚群实现精准分析。因此，吸引了大量学者对此进行研究。目前，已有文献报道了针对EVs特异蛋白亚群的单囊泡分析平台。如：Kabe Y等报道了一个EVs计数平台(Exocounter)，它可以实现蛋白表达双阳性EVs的计数，目前该技术已有希森美康公司将其转化成商品化的仪器，然而，该技术检测费用昂贵(400-500元/样)，不适用于临床检验；He D等基于全内角反射荧光(totalinternal reflection fluorescence，TIRF)技术开发了单分子成像技术，该技术也可以实现单个EVs膜蛋白的检测，但是，该技术对荧光成像设备具有较高要求，目前仅停留在科研阶段。申请人研究团队也长期致力于单个EVs检测在疾病诊断中的研究，在前期工作中受液滴数字PCR反应(droplet digital PCR)对稀有核酸单分子数字化检测的启发，开发了一种EVs数字化检测的新方法，实现了单个EVs膜蛋白的数字化检测，并且成功用于乳腺癌的诊断(Liu C#,Xu X#,Li B,Situ B,Pan W,Hu Y,An T,Yao S*,Zheng L*,Single-Exosome-Counting Immunoassays for Cancer Diagnostics.Nano Letters,2018,18(7):4226-4232.)。然而该技术只是针对一种特异膜蛋白EVs亚群进行的分析，这极大地限制了EVs多亚群的分类分析。目前，基于液滴微流控技术对单囊泡蛋白表达谱分析用于多亚群EVs数字化检测新方法以及用于疾病早期诊断的研究仍是EVs研究领域的热点和难点。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法，包括如下步骤：
将细胞外囊泡(EVs)与抗体偶联核酸复合物一起孵育，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡(EVs)普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成；然后将细胞外囊泡(EVs)和抗体偶联核酸复合物的混合物与引物、探针一起配制成反应体系，经液滴生成仪产生微液滴，实现单个EV的包裹，将所述液滴用PCR仪进行热循环扩增反应，随后通过液滴生成仪识别读取液滴，从而对EVs亚群进行分离分析。
进一步，所述细胞外囊泡(EVs)从细胞上清液提取而得，或来源于血液/血浆样本。
进一步，所述细胞上清液来源于乳腺癌细胞；优选地，所述乳腺癌细胞选自MCF7细胞、MDA-MB-231、SKBR-3中的至少一种。
进一步，所述血液/血浆样本来源于乳腺癌患者。
进一步，从细胞上清液中提取细胞外囊泡(EVs)的方法包括如下步骤：将细胞悬液离心后去上清，加入含胎牛血清的细胞培养基，吹打混匀后转移至细胞培养皿中，进行恒温培养，待细胞生长密度达到70-80％时进行细胞传代，待细胞长密度达到60-70％时加入无血清的细胞培养基进行细胞饥饿处理，然后加入去外泌体胎牛血清的细胞培养基继续培养，接着收集细胞上清，高速离心后吸取上清，再超速离心，弃去上清，加入PBS重悬，超速离心，即可提取的到所述细胞上清液来源的细胞外囊泡(EVs)。
进一步，从细胞上清液中提取细胞外囊泡(EVs)的方法中，所述含胎牛血清的细胞培养基为含10％胎牛血清的细胞培养基，所述含外泌体胎牛血清的细胞培养基为含1-3％外泌体胎牛血清的细胞培养基，所述细胞培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、1640培养基中的至少一种。
进一步，从细胞上清液中提取细胞外囊泡(EVs)的方法中，收集到细胞上清后，首先3000g离心20min，吸取上清后，16000g离心30min，吸取上清；然后135000g超速离心70min，弃去上清，用加入PBS重悬，135000g超速离心70min，即可提取的到所述细胞上清液来源的细胞外囊泡(EVs)。
进一步，从血液/血浆样本中提取细胞外囊泡(EVs)的方法包括如下步骤：将血液样本离心，吸取血浆得血浆样本，将血浆样本用PBS稀释后离心，吸取上清后离心，吸取上清，加入PBS并进行超速离心，弃去上清，然后用PBS重悬获得血浆EVs。
进一步，从血液/血浆样本中提取细胞外囊泡(EVs)的方法包括如下步骤：将抗凝处理后的血液样本离心，吸取血浆得血浆样本，将血浆样本按照1：1的比例用PBS稀释，3000g离心20min，吸取上清后，16000g离心30min，吸取上清，加入PBS，120000g超速离心40min，弃去上清，然后用PBS重悬获得血浆EVs。
进一步，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡(EVs)普适性表达和/或特异的亲和素化抗体与生物素化核酸链偶联而成。
进一步，细胞外囊泡(EVs)普适性表达的抗体选自CD9、CD63、CD81中的至少一种，细胞外囊泡(EVs)特异的抗体选自HER2、EpCAM中的至少一种，所述核酸选自T1、T2、T3中的至少一种，所述T1、T2、T3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11所示。
进一步，所述引物选自Forward primer1与Reverse primer1、Forward primer2与Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3中的至少一种组合，所述Forwardprimer1、Reverse primer1、Forward primer2、Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示。
进一步，所述探针选自Probe1、Probe2、Probe3中的至少一种，所述Probe1、Probe2、Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14所示。
进一步，所述抗体偶联核酸复合物与引物、探针选自以下组合方式中的至少一种：
(1)CD9-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(2)CD63-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(3)CD81-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(4)EpCAM-T2复合物、Forward primer2、Reverse primer2与Probe2；
(5)HER2-T3复合物、Forward primer3、Reverse primer3与Probe3。
进一步，所述抗体偶联核酸复合物经亲和素化磁珠纯化处理过。
进一步，所述探针的5’端和3’端分别带有一个荧光基团(fluorophore)和一个荧光猝灭基团(quencher)，所述荧光基团包括不限于HEX、FAM、CY5和TAMRA等，所述猝灭基团包括但不限于MGB、BHQ1、BHQ3、IOWA等。
进一步，所述抗体偶联核酸复合物的制备方法包括如下步骤：
A1、亲和素化抗体的制备：采用链霉亲和素偶联试剂盒处理抗体，得到亲和素化抗体；
A2、抗体偶联核酸复合物的制备：将亲和素化抗体与生物素化核酸链混合反应得到抗体偶联核酸复合物。
进一步，所述步骤A1中，所述抗体选自CD9、CD63、CD81、HER2、EpCAM中的至少一种。
进一步，所述步骤A1中，所述链霉亲和素偶联试剂盒为StreptavidinConjugation Kit-
Figure SMS_1
试剂盒，抗体与所述试剂盒中的LL-modifier reagent混合后于室温避光反应3-16h，反应结束后，向所得混合液中加入LL-quencher reagent，室温反应30-60min，得亲和素化抗体。
进一步，所述步骤A2中，所述核酸链选自T1、T2、T3中的至少一种，所述T1、T2、T3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10所示。
进一步，所述步骤A2中，CD9与T1、CD63与T1、CD81与T1、EpCAM与T1、HER2与T3反应得到抗体偶联核酸复合物。
进一步，所述步骤A2中，混合反应时间为30-60min，优选为60min。
进一步，由于后续还有纯化步骤，因此所述步骤A2中，生物素化核酸的用量高于亲和素化抗体。
进一步，所述抗体偶联核酸复合物的制备方法还包括步骤A3、抗体偶联核酸复合物的纯化：将步骤A2制得的抗体偶联核酸复合物用PBS稀释，然后加入亲和素化磁珠，混匀反应，反应结束后静置，吸取上清，再加入亲和素化磁珠，并重复前述操作，纯化若干次，最后吸取上清即可。
进一步，所述步骤A3中，纯化次数为5～12次，优选为8～10次。
进一步，所述步骤A3中，加入亲和素化磁珠后反应时间为30～60min，反应结束后静置时间为2～10min。
进一步，所述步骤A3中，所述抗体偶联核酸复合物制备好后稀释1000倍，其中每100μL体系加入亲和素化磁珠1μL。
进一步，将纯化处理后的抗体偶联核酸复合物与细胞外囊泡(EVs)一起孵育，孵育结束后对细胞核染色；优选地，采用细胞核染料对细胞核进行染色；优选地，所述细胞核染料选自Hoechst、DAPI中的一种。
进一步，所述热循环扩增反应程序如下：①95℃：5min；②94℃：30s；③60℃：2min；②+③：50cycles；④4℃：∞。
本发明第二方面提供一种多重检测体系，包括细胞外囊泡(EVs)和抗体偶联核酸复合物的混合物、引物、探针，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡(EVs)普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成。
本发明第三方面提供根据第一方面所述的方法、如第二方面所述的多重检测体系在制备EVs检测试剂盒中的应用。
本发明第四个方面提供一种EVs检测试剂盒，根据第一方面方法构建而得，或者，包括第二方面所述的多重检测体系。
如上所述，本发明的单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用，具有以下有益效果：
1、本发明提供的技术可以实现EVs数字化绝对定量，可用于EVs亚群的精准分类分析；
2、本发明提供的技术平台是一个通用的检测方法，只需要更换抗体就可以实现多种EV亚群的检测分析；
3、本发明提供的技术体系简单、稳定、成熟，利用普通PCR仪就可以实现临床疾病诊断，利于临床推广和转化。
附图说明
图1显示为本发明的实验体系原理图。其中，A为EV与抗体核酸复合物孵育后经超滤去除未结合抗体核酸复合物的流程图，B为单个EV的液滴包裹及数据分析流程图。
图2显示为本发明实施例中抗体偶联核酸复合物的可行性及活性验证实验结果图。
图3显示为本发明实施例中探针浓度优化实验结果图。其中，A为优化前FAM荧光通道1D液滴散点图，B为优化后FAM荧光通道1D液滴散点图，C为优化前CY5荧光通道1D液滴散点图，D为优化后CY5荧光通道1D液滴散点图，E为优化前2D液滴散点图，F为优化后2D液滴散点图。
图4显示为本发明实施例中EV超滤次数优化实验结果图。其中，A为不同超滤次数下FAM荧光通道1D液滴散点图，B为不同超滤次数下CY5荧光通道1D液滴散点图，C为不同超滤次数下靶标的拷贝数柱状图。
图5显示为本发明实施例中将单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的线性分析结果图。其中，A为不同EV浓度下液滴荧光图，B为EV的检测线性范围。
图6显示为本发明的检测技术应用临床血浆标本对乳腺癌进行诊断分析的实验结果图。
其中，A为1例健康人和1例癌症患者血浆中不同EV亚群，B为热图展示了33例健康、24例tis-Ⅰ期、25例Ⅱ期、18例Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌患者血浆中不同EV亚群的分布，C为柱状图显示了健康人和不同癌症分期患者中7个EV亚群颗粒个数，D为韦恩图显示了健康人和tis-Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ-Ⅳ期患者中不同EV亚群颗粒个数。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供了一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法。
具体的，本发明以乳腺癌为疾病模型，选择细胞外囊泡(EVs)普适性表达的CD9/63/81和乳腺癌EVs中疾病特异的HER2、EpCAM作为研究对象，以基于液滴微流控为技术平台，利用液滴微流控技术对EVs进行单个分散包裹，实现单个EV精度的蛋白的多重检测。
本发明的实施将为疾病分子诊断研究提供新的有力工具，有助于进一步揭示疾病发生发展机制，将为推动EVs标志物在临床诊疗中的广泛应用，为疾病的早期诊断、分期、预后、疗效评估提供强有力的技术支持。
下面具体的例举实施例以详细说明本发明的实施过程。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行具体的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
1、原理
实验设计原理如图1所示。首先，经超速离心提取的EVs与抗体偶联核酸复合物一起孵育，然后经超滤管洗涤去除未特异结合的抗体偶联核酸复合物，随后将前处理好的EVs与引物探针等反应体系在微流控芯片上经液滴生成仪产生微液滴，实现单个EV的包裹，接着将装有液滴的EP管移至PCR仪器上进行热循环反应，随后将液滴转移至液滴分析芯片，通过液滴分析仪的识别读取实现特异EVs亚群的分离分析。
2、材料与方法
2.1材料
2.1.1细胞系
人乳腺癌细胞系：MCF7，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，保存于液氮中。
2.1.2实验所需要的主要试剂耗材、仪器、DNA序列表分别如表1、表2、表3所示：
表1主要试剂耗材表
Figure SMS_2
Figure SMS_3
表2仪器名称及厂家汇总表
液滴生成仪 浙江达普生物科技有限公司
液滴分析仪器 浙江达普生物科技有限公司
基因扩增仪 杭州博日科技有限公司
表3实验所需要的DNA序列表
Figure SMS_4
上述DNA序列均在生工生物工程(上海)有限公司合成。
2.2方法
2.2.1抗体偶联核酸复合物制备与验证
(1)抗体偶联核酸复合物的制备：
①亲和素化抗体的制备：按照Streptavidin Conjugation Kit-
Figure SMS_5
试剂盒制备，首先分别取10μL浓度为1mg/mL的抗体(CD9、CD63、CD81、HER2、EpCAM)与试剂盒中的LL-modifier 1μL混合，轻轻振荡混匀，加入各/>
Figure SMS_6
mix的瓶子中，室温避光反应3h，反应结束后，向上述混合液中加入1μL的LL-quencher，室温反应30min；
②抗体偶联核酸复合物的制备：分别取上述制备好的亲和素化抗体CD9、CD63、CD81、HER2、EpCAM 2μL至EP管中，其中在加了亲和素化的CD9、CD63、CD81的EP管中分别加入2μL生物素化的T1，亲和素化的EpCAM中加入2μL生物素化的T2以及在亲和素化HER2的加入2μL生物素化的T3，混匀，室温反应1h；
(2)抗体偶联核酸复合物的纯化：将上述制备好的抗体偶联核酸复合物用PBS稀释1000倍，其中每100μL体系加入1μL浓度为10mg/mL的亲和素化磁珠(已用PBS洗涤一次并重悬)，置于样品混匀器上以15rpm转速，室温下反应30min，随后置于磁力架上，静置2min，吸取上清至新EP管中，再加入1μL磁珠，重复上述操作，一共纯化8-10次，最后吸取上清液至新EP管中备用即可。
2.2.2EVs标本前处理
(1)细胞上清EV的提取：
①细胞培养：将冻存于液氮罐中的含乳腺癌MCF7细胞株的冻存管取出，迅速转移至37℃恒温水浴箱中，使之快速溶解，待其完全溶解后，在生物安全柜中将冻存管中的细胞悬液加入新的15mL离心管中，800rpm离心3min，弃去上清，加入10mL完全培养基(90％DMEM培养基，10％胎牛血清与1％双抗)，轻轻吹打混匀后转移至细胞培养皿(d＝10mm)中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养2-3天后，观察细胞状态及密度情况，待细胞生长密度达到70-80％时传代；
②细胞传代：弃去培养皿中旧的培养基，PBS清洗培养皿2-3次，随后加入1mL胰酶，轻摇培养皿使胰酶均匀分布，2min后倒置显微镜下观察，若细胞间隙明显增大，细胞形态开始变圆，则加入200μL胎牛血清终止消化，加入1mLPBS轻轻吹打细胞，将细胞悬液转移至15mL离心管，800rpm离心3min，然后弃上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，按1：4传代后置于37℃、5％CO2的湿润恒温培养箱中培养；
③细胞饥饿处理以及细胞上清的收集：待细胞生长密度达到60-70％时，弃掉皿中旧培养基，PBS清洗2-3次，加入无血清的DMEM培养基以及1％双抗，在培养箱中培养12h，随后弃去皿中旧的培养基，PBS清洗皿2-3次，加入含1-2％Exo-FBSTM(去外泌体胎牛血清)与1％双抗的DMEM培养基，继续培养48h，最后收集MCF7细胞上清；
④细胞上清预处理：首先3000g离心20min，吸取上清后，16000g离心30min，吸取上清；
⑤细胞上清超速离心：将上述上清加入超速离心管(货号：326823，Beckman)中，135000g超速离心70min，弃去上清，用加入PBS重悬，135000g超速离心70min，即可提取MCF7细胞上清来源的EV。
(2)血浆EV的提取
①取EDTA抗凝处理的全血标本，2500g离心15min两次，吸取血浆至新EP管中；
②取100μL血浆标本，按1：1比例用PBS稀释，随后3000g离心20min，吸取上清后，16000g离心30min，吸取上清；
③将上述上清加入4mL超速离心管(货号：355645，Beckman)中，用PBS补充体积至4mL，120000g超速离心40min，弃去上清，用50μL PBS重悬，获得血浆外泌体。
2.2.3单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数可行性分析
分别设置阴性对照组以及实验组，在细胞层面通过共聚焦显微镜观察，验证该方法的核心“抗体偶联核酸复合物”的活性，从而进行可行性分析：
(1)细胞培养：在共聚焦皿中培养乳腺癌MCF7细胞，密度达到80％～90％时，弃去培养基，PBS洗2次；
(2)细胞固定：
①在皿中加入1mL的4％多聚甲醛固定液，室温孵育30min；
②弃去细胞固定液，用1mL PBS，于摇床上洗涤3次；
③在皿中加入1mL的0.5％TritonX-100，于摇床上处理10min；
④弃去渗透剂，用1mL PBS，于摇床上洗涤3次；
(3)阴性对照组以及实验组处理：
①阴性对照：在MCF7细胞的共聚焦皿上加入2μL浓度为10μM的生物素化T1-FITC，孵箱孵育1h；
②实验组：在MCF7细胞的共聚焦皿上加入上述2mL纯化好的荧光基团标记的抗体偶联核酸复合物，孵箱孵育1h；
(4)细胞核染色：弃去上清液，用PBS洗涤3次，加入2ml基础培养基和2μL Hoechst原液(10mg/mL)，使终浓度为10μg/mL，置于孵箱中，孵育10-15min；
(5)PBS洗去多余的Hoechst，再加入1ml PBS覆盖细胞，最后在共聚焦显微镜下观察，结果如图2所示。由图2可知，阴性对照组FITC荧光通道无荧光，而抗体核酸偶联实验组FITC荧光通道有荧光，证明抗体与核酸成功偶联。
2.2.4单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数条件优化
(1)多重检测体系的探针浓度组合优化：
①Primer mix的配制：分别取4.5μL浓度为100μM的Forward primer1、Reverseprimer1、Forward primer2、Reverse primer2以及Forward primer 3与Reverse primer3，再加入23μL的TE缓冲液，补足体积至50μL，配制10×的Primer mix；
②设置探针不同浓度组合的实验组进行ddPCR检测，具体加样体系如表4所示：
表4不同探针浓度组合体系加样表
Figure SMS_7
结果如图3所示。由图3可知，探针浓度优化前各亚群的1D和2D荧光液滴散点图未充分分开，而探针浓度优化后各亚群的1D和2D荧光液滴散点图得到了充分分开
(2)洗涤次数优化
①对照组以及各实验组的处理：分别取经300KD滤过处理(800rpm，离心2min，取滤液)完成的CD9/63/81-T1、EpCAM-T2以及HER2-T3各2μL于各组EP管中，其中复合物用量验证组无需洗涤，混合上述复合物备用即可；其余各管分别用PBS将混合液的体积补充至500μL，加入300KD超滤管中，150rpm涡旋振荡5s，13800g离心2min，将液体完全滤过，弃去滤液，再加入500μLPBS，重复上述洗涤步骤，分别洗涤3、5、7、8、9次，最后弃去滤液，加入45μLPBS，轻轻吹打滤膜重悬，收集至新EP管中；
②按照表5配制预混液：
表5预混液加样体系-1
Figure SMS_8
随后分别在各装有预混液的EP管中分别加入步骤①对照组与实验组的混合液5μL，混匀后进行液滴生成并在热循环仪中按照以下程序进行扩增反应：
①95℃：5min；
②94℃：30s；
③60℃：2min
(②+③：50cycles)
④4℃：∞；
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析，结果如图4所示。由图4可知，超滤洗涤8次可以有效的去除非特异吸附的抗体核酸复合物。
2.2.5单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数灵敏度与线性范围
(1)外泌体的稀释：分别用PBS将健康人混合血浆来源的外泌体，稀释10倍、100倍以及1000倍；
(2)取3μL上述纯化好的CD9-T1复合物(总稀释倍数为1000倍)，分别与不同稀释倍数的健康人混合血浆来源的外泌体10μL混匀，空白对照组设置为PBS与CD9-T1复合物混合，均室温反应1h；
(3)反应结束后，用PBS将混合液的体积补充至500μL，加入300KD超滤管中，150rpm涡旋振荡5s，13800g离心2min，将液体完全滤过，弃去滤液，再加入500μLPBS至滤管中，重复上述洗涤操作7次，一共洗涤8次，最后弃去滤液，加入45μLPBS，轻轻吹打滤膜重悬，收集至新EP管中；
(4)按照表6配制预混液：
表6预混液加样体系-2
Component 20ul reaction Final concentration
mix 10 1X
Forward Primer 1 1.8 900nM
Reverse Primer 1 1.8 900nM
Probe 1(10μM) 0.6 300nM
DNase Free dH<sub>2</sub>O 0.8
随后分别在各装有预混液的EP管中分别加入步骤(3)各组重悬的液体5μL，混匀后进行液滴生成并在热循环仪中按照以下程序进行扩增反应：
①95℃：5min；
②94℃：30s；
③60℃：2min
(②+③：50cycles)
④4℃：∞；
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析，结果如图5所示。由图5可知，随着EV浓度的稀释，荧光通道下的荧光液滴个数逐渐减少，该技术对单囊泡EV表达谱分析具有良好的线性关系，线性检测范围达4个数量级。
2.2.5临床标本检测能力评估
(1)上述纯化好的CD9/63/81-T1、EpCAM-T2以及HER2-T3复合物(总稀释倍数为1000倍)经300KD超滤管8000rmp离心2min后，取滤液，各取3μL与前处理好的病人血浆EV(30例健康人、67例乳腺癌患者，其中含Tis-Ⅰ期患者24例、Ⅱ期患者25例、Ⅲ-Ⅳ期患者18例)混匀，室温反应1h；
(2)反应结束后，用PBS将混合液的体积补充至500μL，加入300KD超滤管中，150rpm涡旋振荡5s，13800g离心2min，将液体完全滤过，弃去滤液，再加入500μLPBS至滤管中，重复上述洗涤操作7次，一共洗涤8次，最后弃去滤液，加入45μLPBS，轻轻吹打滤膜重悬，收集至新EP管中；
(3)按照上述表5配制预混液
(4)随后分别在各装有预混液的EP管中加入上述重悬的液体5μL，混匀后进行液滴生成以及热循环仪中按照以下程序进行扩增反应：
①95℃：5min；
②94℃：30s；
③60℃：2min
(②+③：50cycles)
④4℃：∞；
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析，结果如图6所示。由图6可知，健康人和癌症患者血浆中的EV亚群具有一定的差异性，计数不同EV亚群的粒子个数具有乳腺癌诊断的潜力。
综上所述，本发明建立了一种可以单囊泡计数新方法，并且可以用于EV蛋白表达谱分析，实现了多种特异蛋白EV亚群的绝对计数，通过收集临床上一些血浆标本，对其进行检测分析，证明本发明的方法具有用于乳腺癌诊断的潜力。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将细胞外囊泡EVs与抗体偶联核酸复合物一起孵育，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡EVs普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成；然后将细胞外囊泡EVs和抗体偶联核酸复合物的混合物与引物、探针一起配制成反应体系，经液滴生成仪产生微液滴，实现单个EV的包裹，将所述液滴用PCR仪进行热循环扩增反应，随后通过液滴生成仪识别读取液滴，从而对EVs亚群进行分离分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞外囊泡EVs从细胞上清液提取而得，或来源于血液/血浆样本；
和/或，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡EVs普适性表达和/或特异的亲和素化抗体与生物素化核酸链偶联而成；
和/或，细胞外囊泡EVs普适性表达的抗体选自CD9、CD63、CD81中的至少一种，细胞外囊泡EVs特异的抗体选自HER2、EpCAM中的至少一种，所述核酸选自T1、T2、T3中的至少一种，所述T1、T2、T3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11所示；
和/或，所述引物选自Forward primer1与Reverse primer1、Forward primer2与Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3中的至少一种组合，所述Forwardprimer1、Reverse primer1、Forward primer2、Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示；
和/或，所述探针选自Probe1、Probe2、Probe3中的至少一种，所述Probe1、Probe2、Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述细胞上清液来源于乳腺癌细胞，所述血液/血浆样本来源于乳腺癌患者。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述抗体偶联核酸复合物与引物、探针选自以下组合方式中的至少一种：
(1)CD9-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(2)CD63-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(3)CD81-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(4)EpCAM-T2复合物、Forward primer2、Reverse primer2与Probe2；
(5)HER2-T3复合物、Forward primer3、Reverse primer3与Probe3。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述热循环扩增反应程序如下：①95℃：5min；②94℃：30s；③60℃：2min；②+③：50cycles；④4℃：∞。
6.一种多重检测体系，其特征在于：包括细胞外囊泡EVs和抗体偶联核酸复合物的混合物、引物、探针，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡EVs普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成。
7.根据权利要求6所述的检测体系，其特征在于：所述细胞外囊泡EVs从细胞上清液提取而得，或来源于血液/血浆样本；
和/或，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡EVs普适性表达和/或特异的亲和素化抗体与生物素化核酸链偶联而成；
和/或，细胞外囊泡EVs普适性表达的抗体选自CD9、CD63、CD81中的至少一种，细胞外囊泡EVs特异的抗体选自HER2、EpCAM中的至少一种，所述核酸选自T1、T2、T3中的至少一种，所述T1、T2、T3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11所示；
和/或，所述引物选自Forward primer1与Reverse primer1、Forward primer2与Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3中的至少一种组合，所述Forwardprimer1、Reverse primer1、Forward primer2、Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示；
和/或，所述探针选自Probe1、Probe2、Probe3中的至少一种，所述Probe1、Probe2、Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14所示。
8.根据权利要求7所述的检测体系，其特征在于：所述抗体偶联核酸复合物与引物、探针选自以下组合方式中的至少一种：
(1)CD9-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(2)CD63-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(3)CD81-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(4)EpCAM-T2复合物、Forward primer2、Reverse primer2与Probe2；
(5)HER2-T3复合物、Forward primer3、Reverse primer3与Probe3。
9.根据权利要求1-6任一项所述的方法、如权利要求7-8任一项所述的检测体系在制备EVs检测试剂盒中的应用。
10.一种EVs检测试剂盒，其特征在于：根据权利要求1-6任一项所述的方法构建而得，或者，包含如权利要求7-8任一项所述的检测体系。
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