CN115044653A - 基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用 - Google Patents

基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用 Download PDF

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CN115044653A
CN115044653A CN202210588597.0A CN202210588597A CN115044653A CN 115044653 A CN115044653 A CN 115044653A CN 202210588597 A CN202210588597 A CN 202210588597A CN 115044653 A CN115044653 A CN 115044653A
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郑磊
刘春辰
林慧娴
李博
潘炜伦
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Southern Hospital Southern Medical University
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用。所述方法包括：将细胞外囊泡EVs与抗体核酸复合物一起孵育得到EVs检测复合物，然后将EVs检测复合物、引物、探针与EVs裂解液配制成信号反应体系在液滴微流控芯片上产生微液滴，微液滴中裂解释放其内部的核酸分子，EVs膜上的抗体核酸复合物经PCR扩增反应产生荧光信号，EVs释放的mRNA经RT‑PCR反应产生荧光信号；随后将微液滴转移至液滴分析芯片，通过液滴分析仪识别读取实现单个EV内核酸和膜蛋白标志物联合检测的数字化分析，对相关疾病的早期诊断效能评估具有重要意义。

Description

基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标 志物的数字化分析方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是细胞通过内吞外排或膜融合等途径，向细胞外环境释放的粒径不均一的具有脂质双分子层膜的囊泡，并且广泛存在于各种体液中，包括血液、尿液、脑脊液等。EVs可被所有有核细胞分泌，具有不同的生物起源、形态大小和密度，展现了巨大异质性，尤其是其携带丰富多样的可以反映亲本细胞生理或病理状态的蛋白和核酸标志物。近年来，越来越多的研究表明EVs蛋白和核酸可作为多种疾病的标志物，包括恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等。因此，精准的分类分析这些携带特异蛋白和核酸标志物的EVs亚群是目前的研究热点。
目前，已有大量研究报道了一些特异EVs亚群检测技术，如基于比色、荧光和电化学生物传感技术等。然而，这些技术大多是批量分析技术，忽略了EVs个体的差异，并且灵敏度低，针对疾病早期特异EVs含量少，无法检测，不利于疾病的早期诊断。因此，开发一个超灵敏的，可以在单囊泡水平上实现EVs精准分析的检测新技术用于疾病诊断具有一定的临床需求。
针对单个EV的检测技术的研究进展可大致概括为三方面：一、传统检测技术，如透射电镜、原子力显微镜、纳米粒子跟踪分析等，这些常用于EVs的表型鉴定；二、光电学技术，包括超分辨荧光显微镜、全内反射荧光显微镜、纳米流式细胞术、拉曼光谱等，这些技术均需昂贵的仪器，不利于临床应用的推广；三、微流控技术，包括连续型微流控和非连续型微流控技术(微液滴或微孔)，具有集成化，智能化，便携化，具有广阔的临床应用前景。申请人研究团队更加关注液滴微流控技术，它是基于两相不相容的原理，油相提供稳定的剪切力将水相分散成一个个独立的液体反应单元，可以实现稀有靶标的数字化检测。在前期相关工作中，申请人研究团队实现了特异蛋白的单个EV数字化检测，但是该技术仅能对EVs蛋白分子实现检测，不能用于EVs核酸标志物(Liu C#,Xu X#,Li B,Situ B,Pan W,Hu Y,An T,Yao S*,Zheng L*,Single-Exosome-Counting Immunoassays for CancerDiagnostics.Nano Letters, 2018,18(7):4226-4232.)。EVs蛋白标志物反应的是功能执行层面的信息，而核酸标志物反应的是基因表达调控层面的信息，在临床检验应用中，标志物的联合检测可以提高疾病的诊断效能。因此，将EVs蛋白和核酸标志物联合检测可以从不同的功能维度上为疾病诊断提供更全面的信息，提高疾病的诊断效能。目前，针对EVs蛋白和核酸联合检测已有文献报道，近年来也逐渐从批量分析向单个EV分析转化，但是基于液滴微流控技术的单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物联合检测仍未见报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用，为临床上相关疾病的诊断提供新的技术手段。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法，包括如下步骤：
将细胞外囊泡EVs与抗体核酸复合物一起孵育、超滤管洗涤后得到EVs检测复合物，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成；然后将 EVs检测复合物、引物、探针与EVs裂解液配制成信号反应体系在双液相通道的液滴微流控芯片上产生微液滴，包裹了EVs检测复合物的微液滴中的裂解液将EVs原位裂解，释放其内部的核酸分子，EVs膜上的抗体核酸复合物在热循环仪中经PCR扩增反应产生荧光信号， EVs释放的mRNA经RT-PCR反应产生荧光信号；随后将微液滴转移至液滴分析芯片，通过液滴分析仪识别读取实现单个EV内核酸和膜蛋白标志物联合检测的数字化分析。
进一步，所述细胞外囊泡(EVs)从细胞上清液提取而得，或来源于血液/血浆样本。
进一步，所述细胞上清液来源于乳腺癌细胞；优选地，所述乳腺癌细胞选自MCF7细胞、 MDA-MB-231、SKBR-3中的至少一种。
进一步，所述血液/血浆样本来源于乳腺癌患者。
进一步，从细胞上清液中提取细胞外囊泡(EVs)的方法包括如下步骤：先进行细胞传代，待细胞长密度达到60-70％时加入无血清的细胞培养基进行细胞饥饿处理，然后加入含去外泌体胎牛血清的细胞培养基继续培养，接着收集细胞上清，高速离心后吸取上清，再超速离心，弃去上清，加入PBS重悬，超速离心，即可提取的到所述细胞上清液来源的细胞外囊泡(EVs)。
进一步，从细胞上清液中提取细胞外囊泡(EVs)的方法中，所述含去外泌体胎牛血清的细胞培养基为含1-3％去外泌体胎牛血清的细胞培养基，所述细胞培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、1640培养基中的至少一种。
进一步，从细胞上清液中提取细胞外囊泡(EVs)的方法中，收集到细胞上清后，首先 3000g离心20min，取上清，16000g离心30min，取上清；然后135000g超速离心70min，弃去上清，用加入PBS重悬，135000g超速离心70min，最后重悬沉淀，获得细胞上清液来源的细胞外囊泡(EVs)。
进一步，从血液/血浆样本中提取细胞外囊泡(EVs)的方法包括如下步骤：将血液样本离心，留取血浆样本，将血浆样本用PBS稀释后离心，取上清再离心，取上清，加入PBS并进行超速离心，弃去上清，然后用PBS重悬获得血浆EVs。
进一步，从血液/血浆样本中提取细胞外囊泡(EVs)的方法包括如下步骤：将抗凝处理后的血液样本离心，留取血浆样本，将血浆样本按照1：1的比例用PBS稀释，3000g离心20min，取上清，再16000g离心30min，取上清，加入PBS，120000g超速离心40min，弃去上清，然后用PBS重悬获得血浆EVs。
进一步，所述抗体核酸复合物由细胞外囊泡(EVs)普适性表达和/或特异的亲和素化抗体与生物素化核酸链偶联而成。
进一步，细胞外囊泡(EVs)普适性表达的抗体选自CD9、CD63、CD81中的至少一种，细胞外囊泡(EVs)特异的抗体选自HER2，所述核酸模板链选自T1、T2、T3中的至少一种所述T1、T2、T3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10所示。
进一步，所述引物选自Forward primer1与Reverse primer1、Forward primer2与Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3中的至少一种组合，所述Forwardprimer1、Reverse primer1、Forward primer2、Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3 的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。
进一步，所述探针选自Probe1、Probe2、Probe3中的至少一种，所述Probe1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4所示，所述Probe2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，所述Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示。
进一步，所述抗体核酸复合物与引物、探针选自以下组合方式中的至少一种：
(1)CD9-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(2)CD63-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(3)CD81-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(4)HER2-T3复合物、Forward primer3、Reverse primer3与Probe3。
进一步，所述抗体核酸复合物经亲和素化磁珠纯化处理过。
进一步，所述探针的5’端和3’端分别带有一个荧光基团(fluorophore)和一个荧光猝灭基团(quencher)，所述荧光基团包括不限于HEX、FAM、CY5和TAMRA等，所述猝灭基团包括但不限于MGB、BHQ1、BHQ3、IOWA等。
进一步，所述抗体核酸复合物的制备方法包括如下步骤：
A1、亲和素化抗体的制备：采用链霉亲和素偶联试剂盒处理抗体，得到亲和素化抗体；
A2、抗体核酸复合物的制备：将亲和素化抗体与生物素化核酸链混合反应得到抗体核酸复合物。
进一步，所述步骤A1中，所述抗体选自CD9、CD63、CD81、HER2中的至少一种。
进一步，所述步骤A1中，所述链霉亲和素偶联试剂盒为StreptavidinConjugation Kit- Lightning-
Figure BDA0003664113430000031
试剂盒，抗体与所述试剂盒中的LL-modifier混合后于室温避光反应3-16h，反应结束后，向所得混合液中加入LL-quencher，室温反应30-60min，得亲和素化抗体。
进一步，所述步骤A2中，所述核酸链选自T1、T2、T3中的至少一种，所述T1、T2、T3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10所示。
进一步，所述步骤A2中，CD9与T1、CD63与T1、CD81与T1、HER2与T3反应得到抗体核酸复合物。
进一步，所述步骤A2中，混合反应时间为30-60min，优选为60min。
进一步，由于后续还有纯化步骤，因此所述步骤A2中，生物素化核酸的用量高于亲和素化抗体。
进一步，所述抗体核酸复合物的制备方法还包括步骤A3、抗体核酸复合物的纯化：将步骤A2制得的抗体核酸复合物用PBS稀释，然后加入亲和素化磁珠，混匀反应，反应结束后静置，吸取上清，再加入亲和素化磁珠，并重复前述操作，纯化若干次，最后吸取上清即可。
进一步，所述步骤A3中，纯化次数为5～12次，优选为8～10次。
进一步，所述步骤A3中，加入亲和素化磁珠后反应时间为30～60min，反应结束后静置时间为2～10min。
进一步，所述步骤A3中，所述抗体核酸复合物制备好后稀释1000倍，其中每100μL体系加入亲和素化磁珠1μL。
进一步，将纯化处理后的抗体核酸复合物与细胞外囊泡(EVs)一起室温孵育1h，经超滤管洗涤8次。
进一步，裂解条件如下：EVs裂解液TritonX-100浓度为0.05～1％，优选为 0.25％～0.1％，更优选为0.25％～0.5％，最优选为0.25％；
裂解温度为4～42.7℃，优选为4～25℃，更优选为4℃、25℃、37.3℃或42.7℃，最优选为4℃；
裂解时间为20～60min，优选为20～40min，更优选为20～30min，最优选为20min。
进一步，所述PCR扩增反应程序如下：①50℃：15min；②95℃：5min；③95℃： 30s；④54～64℃：1min；③+□：45cycles；⑤4℃：∞；优选地，所述PCR扩增反应程序如下：①50℃：15min；②95℃：5min；③95℃：30s；④60℃：1min；③+□：45cycles；⑤4℃：∞。
本发明第二方面提供一种多重检测体系，包括细胞外囊泡(EVs)和抗体核酸复合物 EVs检测复合物、引物、探针、裂解液，所述EVs检测复合物由细胞外囊泡EVs与抗体核酸复合物一起孵育而得，所述抗体核酸复合物由细胞外囊泡(EVs)普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成。
本发明第三方面提供根据第一方面所述的方法、如第二方面所述的多重检测体系在制备单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物联合检测试剂盒中的应用。本发明第四个方面提供一种单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物联合检测试剂盒，根据第一方面方法构建而得，或者，包括第二方面所述的多重检测体系。
如上所述，本发明的基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法及其应用，具有以下有益效果：
1、本发明提供的技术可以在一个检测体系中实现EVs两个组学(蛋白和核酸)标志物的同时检测；
2、本发明提供的技术是单颗粒分析平台，可以实现携带靶标分子EVs的超灵敏数字化绝对定量；
3、本发明提供的技术为通用的技术平台，可以根据需要更换抗体和引物探针实现单个EV内核酸和膜蛋白标志物的同时检测。
附图说明
图1显示为本发明的实验设计原理图。
图2显示为本发明实施例中液滴微流控芯片设计图(A)和液滴生成实时图(B)。图3显示为本发明实施例中EVs核酸检测可行性分析的实验结果图。图4显示为本发明实施例中构建的EVs蛋白核酸标志物三重检测体系构建分析结果图。图5显示为退火温度优化实验结果图。
图6显示为EVs裂解条件优化实验结果图。图7显示为检测性能评价实验结果图。
图8显示为临床诊断性能评价实验结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明的实施例以乳腺癌为疾病模型，选择EVs普适性表达的CD9/CD63/CD81蛋白标志物组合和乳腺癌EVs中癌症特异的HER2蛋白标志物以及表达HER2标志物的ERBB2 mRNA为EVs蛋白和核酸标志物联合检测靶标，在液滴微流控芯片上实现EVs的包裹、原位裂解、核酸分子释放和蛋白核酸同时检测，实现单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物联合检测的数字化分析，用于评估乳腺癌的早期诊断效能。
需要注意的是，本发明的实施例以疾病以乳腺癌为例，但是本发明的方法不仅适用于乳腺癌，还适用于胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、胶质瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、动脉粥样硬化、冠心病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病等，同时，本发明的实施例检测的核酸和蛋白分别是ERBB2 mRNA和CD9/CD63/CD81、HER2，但不仅限于此，还包括 GPC-1、CD24、CD147、EpCAM、EGFR、PSA、EDIL3、GPC-3、CD144、CD31、SAA、GAP43、SNAP25、PD-L1等蛋白以及mRNA、miRNA、DNA等核酸。
具体实施过程如下：
实施例1
1、原理解释
实验设计原理如图1所示。首先，经超速离心提取的EVs与抗体核酸复合物一起孵育，然后经超滤管洗涤去除未特异结合的抗体核酸复合物，随后将前处理好的EVs检测复合物与 EVs裂解液和信号反应体系在双液相通道的液滴微流控芯片上产生微液滴，当液滴未包裹 EVs检测复合物则为阴性液滴，当微液滴中包裹了EVs检测复合物，液滴中的裂解液会将 EVs原位裂解，释放其内部的核酸分子，EVs膜上的抗体核酸复合物在一定条件下会进行PCR反应，产生荧光信号，而EVs释放的mRNA在同样的条件下会进行RT-PCR实现荧光信号的产生，随后将微液滴转移至液滴分析芯片，通过液滴分析仪的识别读取实现单个EV 内核酸和膜蛋白标志物联合检测的数字化分析。
2、材料与方法
2.1材料
2.1.1细胞系
人乳腺癌细胞系：MCF7，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，保存于液氮中。
2.1.2主要试剂耗材
表1主要试剂耗材表
Figure BDA0003664113430000061
表2仪器名称及厂家汇总表
倒置荧光显微镜尼康Ti2-U 尼康(Nikon)公司
表面等离子共振仪器(PTL-VM500) 普特勒电气科技(招远)有限公司
鼓风干燥箱(DHG-9030A) 上海一恒科学仪器有限公司
真空泵 台州藤原工具有限公司
微流恒压泵 浙江达普生物科技有限公司
液滴生成仪 浙江达普生物科技有限公司
液滴分析仪器 浙江达普生物科技有限公司
基因扩增仪 杭州博日科技有限公司
表3实验所需要的DNA序列表
Figure BDA0003664113430000062
Figure BDA0003664113430000071
上述DNA序列均在生工生物工程(上海)有限公司合成。
2.2方法
2.2.1微流控芯片制作
(1)PDMS固化：将配置好的PDMS放入真空泵中，抽取真空，当压力降至-1kg/cm2时停止，重复上述操作直至无气泡为止；用锡纸自制成一适配于芯片模具的容器，将单晶硅微流控芯片模具放至中间，随后将配置好的PDMS均匀倒入，可用洗耳球轻轻吹气除去表面的小气泡，然后85℃静置2h；
(2)打孔：随后将固化的PDMS从模具上揭下，将各PDMS芯片切割分离，并完成打孔操作；
(3)清洗与干燥：用异丙醇进行浸泡，超声清洗30min，重复洗涤操作两次，清洗完毕后置于90℃烘箱3h，使其干燥；
(4)键合：取干净的载玻片与上述PDMS芯片(含微孔道面朝上)一起放入表面等离子共振仪器(PTL-VM500)按照程序(真空压力：99.100kPa，平衡时间10s，放电时间 60s，功率100％)进行，随后将PDMS芯片含微孔道面与载玻片贴合，80℃处理20min，完成键合处理；
(5)疏水处理：随后往芯片的加样孔中加入PDMS表面处理剂使其充满芯片各微孔道， 90℃处理2h。
2.2.2 EVs核酸检测可行性分析
(1)细胞上清EV的提取：
①细胞传代：弃去原培养基，往培养皿(d＝10cm)中加入2mL PBS，轻轻洗涤2-3次，加入胰酶1mL，静置消化2-3min，随后加入胎牛血清终止消化，再加入1mL培养基，轻轻吹打使细胞脱落，收集细胞悬液，800rpm低速离心3min，然后弃去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，按1：1传至培养皿(d＝15cm)后置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；
②细胞饥饿处理以及细胞上清的收集：待细胞生长密度达到60-70％时，弃原培养基， PBS轻轻洗涤，加入不含血清的DMEM基础培养基，饥饿处理12h，再弃去培养基，PBS 轻轻洗涤，加入含1-2％Exo-FBSTM(去外泌体胎牛血清)的DMEM培养基，继续培养48 h，最后收集细胞上清；
④细胞上清前处理：3000g离心20min，取上清，16000g离心30min，取上清；
⑤细胞上清超速离心：将前处理完成的上清以离心力为135000g进行超速离心，处理 70min，弃去上清，用加入PBS重悬，135000g超速离心70min，最后重悬沉淀，获取MCF7 细胞上清来源的EVs。
(2)血浆EV的提取
①取EDTA抗凝全血标本，3500rpm离心15min，留取血浆标本；
②取100μL血浆，按1：1比例用PBS稀释，随后3000g离心20min，取上清，再 16000g离心30min，取上清；
③将上述前处理完毕的上清加入4mL超速离心管(货号：355645，Beckman)中，用PBS补充体积至4mL，120000g超速离心40min，弃上清，用50μL PBS重悬，提取血浆 EVs。
(3)可行性验证：按照下方表格配制体系：
表4可行性验证体系配制
Figure BDA0003664113430000081
Figure BDA0003664113430000091
生成液滴后，将底部的油替换成含5％PSurf-001的FC-40氟化油，随后放置4℃裂解处理60min，裂解处理后放入热循环仪，按照以下程序进行扩增反应：
①50℃：15min；
②95℃：5min；
③95℃：30s；
④60℃：1min，
(③+④：45cycles)；
⑤4℃：∞。
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析。
2.2.3EVs蛋白核酸标志物三重检测体系构建
(1)Primer Mix的配制：分别取9μL浓度为100μM的Forward primer1、Reverseprimer1、Forward primer2、Reverse primer2以及Forward primer3与Reverse primer3，再加入 46μL的TE缓冲液，补足体积至100μL，配制10×的Primer mix；
(2)设计并构建三重检测体系，具体加样体系如下表所示：
表5体系预混液加样表
Figure BDA0003664113430000092
随后按照下方表6加入不同浓度的模板链：
表6模板链浓度与加样量
Template Concentration Volume
T1、T2、T3 0.1fM 各2μL
T1、T2、T3 10fM 各2μL
随后进行液滴生成并在热循环仪中按照以下程序进行扩增反应：
①50℃：15min；
②95℃：5min；
③95℃：30s；
④60℃：1min，
(③+④：45cycles)；
⑤4℃：∞。
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析。
2.2.4退火温度优化
(1)配制体系，具体加样表如下：
表7体系配制加样表
Figure BDA0003664113430000101
随后进行液滴生成并在热循环仪中按照以下程序进行扩增反应：
①50℃：15min；
②95℃：5min；
③95℃：30s；
④分别设置54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃：1min，
(③+④：45cycles)；
⑤4℃：∞。
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析。
2.2.5EVs裂解条件优化
(1)裂解液浓度优化：
按照下方体系加样表进行体系配制；
表8裂解液浓度优化体系配制加样表
Figure BDA0003664113430000102
Figure BDA0003664113430000111
随后进行液滴生成，将底部的油替换成含5％PSurf-001的FC-40氟化油，放至4℃裂解处理60min后再在热循环仪中按照以下程序进行扩增反应：
①50℃：15min；
②95℃：5min；
③95℃：30s；
④60℃：1min，
(③+④：45cycles)；
⑤4℃：∞。
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析。
(2)裂解温度的优化：
表9体系配制表
Figure BDA0003664113430000112
其中四个实验组均按照上述体系配置表进行配制，空白对照组将MCF7-EVs替换为DNase/RNase Free Water，体系配制好后进行液滴生成，将底部的油替换成含5％PSurf-001 的FC-40氟化油后四个实验组分别放置于4℃、25℃、37.3℃以及42.7℃裂解处理60min，空白对照组置于4℃处理60min，随后放入热循环仪中按照以下程序进行扩增反应：
①50℃：15min；
②95℃：5min；
③95℃：30s；
④60℃：1min，
(③+④：45cycles)；
⑤4℃：∞。
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析。
(3)裂解时间的优化：
同表9配制实验组体系，其中空白对照组将MCF7-EVs替换为DNase/RNase FreeWater，体系配制好后进行液滴生成，将底部的油替换成含5％PSurf-001的FC-40氟化油后均置于4℃进行裂解反应，其中四个实验组分别裂解处理0、20、40、60min，空白对照组处理60min，随后放入热循环仪中按照以下程序进行扩增反应：
①50℃：15min；
②95℃：5min；
③95℃：30s；
④60℃：1min，
(③+④：45cycles)；
⑤4℃：∞。
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析。
2.2.6检测性能评价
(1)不同浓度T1、T2、T3的配制：分别用1×TE缓冲液将T1、T2、T3配制成 0.1fM、1fM、10fM以及100fM不同浓度的溶液；
(2)同表5配制预混液，再加入不同浓度0.1fM、1fM、10fM以及100fM的模板链混合液(T1+T2+T3)，配制好体系后进行液滴生成，并在热循环仪中按照以下程序进行扩增反应：
①50℃：15min；
②95℃：5min；
③95℃：30s；
④60℃：1min，
(③+④：45cycles)；
⑤4℃：∞。
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析。
2.2.7临床标本验证
(1)按照Streptavidin Conjugation Kit-Lightning-
Figure BDA0003664113430000133
试剂盒制备亲和素化抗体：首先分别取10μL浓度为1mg/mL的抗体(CD9、CD63、CD81、HER2)与试剂盒中的LL-modifier 1μL混合，轻轻振荡混匀，加入各Lightning-
Figure BDA0003664113430000132
mix的瓶子中，室温避光反应3h，反应结束后，向上述混合液中加入1μL的LL-quencher，室温反应30min；随后分别取上述制备好的亲和素化抗体CD9、CD63、CD81、HER2 2μL至EP管中，在加了亲和素化的 CD9、CD63、CD81的EP管中分别加入2μL生物素化的T1，亲和素化HER2的加入2μL生物素化的T3，混匀，室温反应1h，制备功能化的抗体核酸复合物；将上述制备好的功能化抗体核酸复合物用PBS稀释1000倍，其中每100μL体系加入1μL浓度为10mg/mL的亲和素化磁珠(已用PBS洗涤一次并重悬)，置于样品混匀器上以15rpm转速，室温下反应30min，随后置于磁力架上，静置2min，吸取上清至新EP管中，再加入1μL磁珠，重复上述操作，一共纯化8-10次，最后吸取上清液至新EP管中备用即可。
(2)取上述纯化好的CD9/63/81-T1以及HER2-T3复合物，经300KD超滤管8000g离心2min后，取滤液，分别取3μL与临床标本血浆EV混匀，室温反应1h；
(3)反应结束后，用PBS将混合液的体积补充至500μL，加入300KD超滤管中，150rpm涡旋振荡5s，13000g离心2min，将液体完全滤过，弃去滤液，再加入500μLPBS至滤管中，重复上述洗涤操作7次，一共洗涤8次，最后弃去滤液，加入45μLPBS，轻轻吹打滤膜重悬，收集至新EP管中；
(4)按照下方体系配置表配制体系：
表10临床标本检测体系加样表
Figure BDA0003664113430000131
Figure BDA0003664113430000141
(4)分别将上述配制的体系对入对应的B、C通道中，A通道加入20μL的数字PCR通用芯片&油套装的油，其中A、B、C通道的压力值分别为2、3、3psi，生成液滴后，将底部的油替换成含5％PSurf-001的FC-40氟化油，随后放置4℃裂解处理20min，裂解处理后放入热循环仪，按照以下程序进行扩增反应：
①50℃：15min；
②95℃：5min；
③95℃：30s；
④60℃：1min，
(③+④：45cycles)；
⑤4℃：∞。
最后在浙江达普生物科技有限公司的液滴分析仪器上进行信号读取与分析。
3、实验结果分析
图2A是两液相通道液滴微流控芯片设计图，进样口Ⅰ为EVs检测复合物、进样口Ⅱ为 EVs裂解液和引物探针等、进样口Ⅲ为液滴生成油、出样口Ⅳ为液滴收集；图2B是显微镜下的液滴生成实时图，可见液滴稳定均一地产生。
图3显示了EVs核酸检测可行性分析实验结果。本发明实施例选取NP40和TritonX-100 两种破膜试剂，以EVs内丰富的内参基因(GAPDH mRNA)为验证靶标，当EVs未裂解时无荧光液滴出现，当0.5％NP40和1％TritonX-100处理后荧光液滴数量显著增加，证明EVs 内部的核酸释放出来并能进行后续的检测反应。
图4显示了构建的EVs蛋白核酸标志物三重检测体系分析结果。4A为蛋白和核酸标志物对应的核酸链含量较少(0.1fM)时，每个液滴中最多只含有一个检测靶标，仅出现3个液滴团簇；4B为蛋白和核酸标志物对应的核酸链含量增高(10fM)时，液滴中出现包裹两条或者三条检测靶标的情况则出现更多的液滴团簇。
图5显示了退火温度优化实验结果。退火温度可显著影响PCR的扩增效率，因此，本发明实施例设置了6个温度梯度(分别是54℃、56℃、58℃、60℃、62℃和64℃)进行退火温度条件优化，为平衡最优的分析性能，选择60℃进行后续的实验。
图6显示了EVs裂解条件优化实验结果。6A为EVs裂解液(TritonX-100)浓度优化；6B为EVs裂解温度优化；6C为EVs裂解时间优化。后续实验拟选取0.25％TritonX-100在4℃条件下处理20min的条件进行后续的实验。
图7显示了检测性能评价实验结果。7A为CD9/CD63/CD81抗体复合物对应的核酸链的检测性能；7B为HER2抗体对应的核酸链的检测性能；7C为ERBB2 mRNA的检测性能。三个靶标的检测均具有较好的线性相关性，检测范围跨4个数量级。
临床上收取35个健康人，20例Tis-I期、35例Ⅱ期和35例Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌患者血浆进行临床诊断性能评价，结果如图8所示，A-C分别是不同分组中表达CD9/CD63/CD81蛋白复合物、HER2蛋白和ERBB2 mRNA的EVs的浓度。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分
析方法及其应用
<130> PCQNF2212660-HZ
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T1
<400> 1
caacctgaaa caactgacct acactgctat gagcaattag gtgacagctc agatgaggag 60
gatacagatg gtgtgg 76
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Forward primer1
<400> 2
caacctgaaa caactgacct acact 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Reverse primer1
<400> 3
ccacaccatc tgtatcctcc tc 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe1
<400> 4
atctgagctg tcacctaa 18
<210> 5
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T2
<400> 5
acgtttgagt ccatgcccaa tcccgagggc cggtatacat tcggcgccag ctgtgtgact 60
gcctgtccct acaactacct ttctacggac gtgggatcc 99
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Forward primer2
<400> 6
acgtttgagt ccatgcccaa 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Reverse primer2
<400> 7
ggatcccacg tccgtagaa 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe2
<400> 8
tgactgcctg tccctacaac ta 22
<210> 9
<211> 103
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> T3
<400> 9
gctgaatcct gcggacgacc cttctcgggg tcgcttggga ctctctcgtc cccttctccg 60
tctgccgttc cgaccgacca cggggcgcac ctctctttac gcg 103
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Forward primer3
<400> 10
gctgaatcct gcggacgac 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Reverse primer3
<400> 11
cgcgtaaaga gaggtgcgc 19
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe3
<400> 12
tcgtcccctt ctccgtctgc cgtt 24
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GAPDH-Forward primer
<400> 13
ctagaaaaac ctgccaa 17
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GAPDH-Reverse primer3
<400> 14
agtgggtgtc gctgttg 17
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GAPDH-Probe
<400> 15
atgatgacat caagaaggtg gt 22

Claims (10)

1.一种基于液滴微流控联合检测单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物的数字化分析方法，其特征在于，包括如下步骤：将细胞外囊泡EVs与抗体核酸复合物一起孵育得到EVs检测复合物，所述抗体偶联核酸复合物由细胞外囊泡普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成；然后将EVs检测复合物、引物、探针与EVs裂解液配制成信号反应体系在双液相通道的液滴微流控芯片上产生微液滴，包裹了EVs检测复合物的微液滴中的裂解液将EVs原位裂解，释放其内部的核酸分子，EVs膜上的抗体核酸复合物在热循环仪中经PCR扩增反应产生荧光信号，EVs释放的mRNA经RT-PCR反应产生荧光信号；随后将微液滴转移至液滴分析芯片，通过液滴分析仪识别读取实现单个EV内核酸和膜蛋白标志物联合检测的数字化分析。
2.根据权利要求1所述的数字化分析方法，其特征在于：所述细胞外囊泡EVs从细胞上清液提取而得，或来源于血液/血浆样本；
和/或，所述抗体核酸复合物由细胞外囊泡EVs普适性表达和/或特异的亲和素化抗体与生物素化核酸链偶联而成；
和/或，细胞外囊泡EVs普适性表达的抗体选自CD9、CD63、CD81中的至少一种，细胞外囊泡EVs特异的抗体选自HER2，所述核酸模板链选自T1、T2、T3中的至少一种所述T1、T2、T3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10所示；和/或，所述引物选自Forward primer1与Reverse primer1、Forward primer2与Reverse primer2、Forwardprimer3与Reverse primer3中的至少一种组合，所述Forward primer1、Reverse primer1、Forward primer2、Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12所示；
和/或，所述探针选自Probe1、Probe2、Probe3中的至少一种，所述Probe1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4所示，所述Probe2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，所述Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示。
3.根据权利要求2所述的数字化分析方法，其特征在于：所述细胞上清液来源于乳腺癌细胞，所述血液/血浆样本来源于乳腺癌患者。
4.根据权利要求2所述的数字化分析方法，其特征在于：所述抗体核酸复合物与引物、探针选自以下组合方式中的至少一种：
(1)CD9-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(2)CD63-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(3)CD81-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(4)HER2-T3复合物、Forward primer3、Reverse primer3与Probe3。
5.根据权利要求1所述的数字化分析方法，其特征在于：裂解条件如下：EVs裂解液TritonX-100浓度为0.05～1％，裂解温度为4～42.7℃，裂解时间为20～60min；
和/或，所述PCR扩增反应程序如下：①50℃：15min；②95℃：5min；③95℃：30s；④54～64℃：1min；③+④：45cycles。
6.一种多重检测体系，其特征在于：包括细胞外囊泡EVs和抗体核酸复合物EVs检测复合物、引物、探针、裂解液，所述EVs检测复合物由细胞外囊泡EVs与抗体核酸复合物一起孵育而得，所述抗体核酸复合物由细胞外囊泡(EVs)普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成。
7.根据权利要求1所述的多重检测体系，其特征在于：所述细胞外囊泡EVs从细胞上清液提取而得，或来源于血液/血浆样本；
和/或，所述抗体核酸复合物由细胞外囊泡EVs普适性表达和/或特异的亲和素化抗体与生物素化核酸链偶联而成；
和/或，细胞外囊泡EVs普适性表达的抗体选自CD9、CD63、CD81中的至少一种，细胞外囊泡EVs特异的抗体选自HER2，所述核酸模板链选自T1、T2、T3中的至少一种所述T1、T2、T3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10所示；和/或，所述引物选自Forward primer1与Reverse primer1、Forward primer2与Reverse primer2、Forwardprimer3与Reverse primer3中的至少一种组合，所述Forward primer1、Reverse primer1、Forward primer2、Reverse primer2、Forward primer3与Reverse primer3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12所示；
和/或，所述探针选自Probe1、Probe2、Probe3中的至少一种，所述Probe1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4所示，所述Probe2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，所述Probe3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示。
8.根据权利要求1所述的多重检测体系，其特征在于：所述抗体核酸复合物与引物、探针选自以下组合方式中的至少一种：
(1)CD9-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(2)CD63-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(3)CD81-T1复合物、Forward primer1、Reverse primer1与Probe1；
(4)HER2-T3复合物、Forward primer3、Reverse primer3与Probe3。
9.根据权利要求1-6任一项所述的方法、如权利要求7-8任一项所述的多重检测体系在制备单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物联合检测试剂盒中的应用。
10.一种单个细胞外囊泡内核酸和膜蛋白标志物联合检测试剂盒，其特征在于：根据权利要求1-6任一项所述的方法构建而得，或者，包含如权利要求7-8任一项所述的多重检测体系。
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