TW201608023A - 對卵巢癌具有專一性之適合體及其應用 - Google Patents

對卵巢癌具有專一性之適合體及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種對卵巢癌細胞具有專一性之適合體，其是由系統性配分子指數增益演繹程序(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)與微流體晶片系統體外篩選而得。該些適合體更可分別結合不同組織學型態的卵巢癌細胞，且具有高結合率。因此本發明之適合體不僅可用於檢測卵巢癌細胞，亦可用於識別不同組織型態之卵巢癌細胞。

Description

對卵巢癌具有專一性之適合體及其應用
本發明係關於一種對卵巢癌具有專一性之適合體，特別是關於對不同組織學型態卵巢癌細胞具專一性之適合體，以及該些適合體之應用。
癌症，或惡性腫瘤，每年在全球造成數以百萬計的死亡，其亦是臺灣地區近幾年來十大死因排名的第一位。在各種癌症中，卵巢癌(Ovarian cancer)是婦科常見的癌症之一，更是臺灣地區婦女生殖癌症第二位，僅次於子宮頸癌(cervical cancer)，然而，與子宮頸癌相比，若能早期發現並妥善治療，卵巢癌的預後及存活率通常頗高。舉例而言，被診斷為第I期卵巢癌的患者之五年存活率為89%，相對於被診斷為第IV期卵巢癌的五年存活率僅剩17%。但是，由於大部分卵巢癌的早期症狀並不明顯，通常要到腫瘤變大時，才可能會壓迫到大腸，並引起便秘、腹瀉，或出現其他如腹部疼痛、腫脹、噁心、脹氣等現象，因此，在被診斷為卵巢癌時多已屬第三期以上的晚期癌症，並可能伴隨著癌細胞的轉移，故，預後情況大多不理想。
臨床上，對於卵巢癌檢測目前常用的是陰道超音波與都卜勒 超音波，其雖然可測試出卵巢腫瘤血管的分佈以及血流動向以鑑定腫瘤的良性或惡性，但早期卵巢癌的外形、大小與正常卵巢細胞差異微小，故，利用超音波篩檢卵巢癌仍有誤判之風險。另一項常用於卵巢癌檢測的是血清腫瘤標誌，例如：人類絨毛膜性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)、A型胎兒蛋白(α-fetoprotein，α-FP)等，然而，上述血清腫瘤標誌雖可用於早期的卵巢癌篩檢，但其較佳的效果是在偵測手術後復發性腫瘤，而非專一性地辨認早期的卵巢癌細胞。
有鑑於目前為止仍然沒有一種檢驗或檢查可有效幫助早期診斷出卵巢癌，未來臨床研究與偵測上亟需具有高專一性的血清腫癌標記替代品，以利卵巢癌早期快速檢測而增加預後存活率；同時目前市面上亦缺乏一種準確、低成本、易保存、且可識別不同組織型態學卵巢癌細胞的標記及檢測技術。
緣此，本發明之一目的係提供一種卵巢癌細胞專一性之適合體，包含：(a)專一性結合卵巢癌細胞之核酸序列；以及(b)一正向引子或反向引子；其中該專一性結合卵巢癌細胞之核酸序列係選自：(i)由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或其任意組合所組成之群組；(ii)由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、或其任意組合所組成之群組；或(iii)由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、或二者之組合所組成之群組。
本發明之實施例中，該卵巢癌細胞係卵巢癌亮細胞癌細胞、卵巢癌子宮內膜狀癌細胞、及/或卵巢癌漿液性癌細胞；該正向引子係SEQ ID NO：27，該反向引子係SEQ ID NO：28。本發明之適合體具有主幹與環(stem-loop)之二級結構。
在本發明之一實施例中，當該卵巢癌細胞係卵巢癌亮細胞時，係使用SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、或其任意組合之適合體。
在本發明另一實施例中，當該卵巢癌細胞係卵巢癌子宮內膜狀癌細胞時，係使用SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、或其任意組合之適合體。
在本發明又一實施例中，當該卵巢癌細胞係卵巢癌漿液性癌細胞時，係使用SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、或其組合之適合體。
本發明之另一目的係提供一種檢測檢體中卵巢癌細胞存在之方法，其步驟包含：(a)將一檢體與至少一適合體接觸，使該檢體中的卵巢癌細胞與該適合體結合；以及(b)藉結合反應偵測該檢體中卵巢癌細胞之存在；其中，若該步驟(a)選擇SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、或SEQ ID NO：17之適合體，則決定卵巢癌亮細胞之存在；若該步驟(a)選擇SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24之適合體，則決定卵巢癌子宮內膜狀癌細胞之存在；而若該步驟(a)選擇SEQ ID NO：25、或SEQ ID NO：26之適合體，則決定卵巢癌漿液性癌細胞之存在。本發明之適合體係與一標 記結合，該標記係螢光標記、化學發光標記、放射性同位素、酶標記或生物素。在本發明之實施例中，進一步包含以該適合體修飾一磁表面，而該結合反應係該適合體修飾之磁珠抓取卵巢癌細胞，且經磁場導引分離出已與該適合體結合之卵巢癌細胞。
本發明之又一目的係提供一種微流體晶片，係包含本發明所述之適合體。
本發明之適合體對不同組織學型態的卵巢癌細胞具有高度專一性及結合率，可用於快速檢測卵巢癌，更可將卵巢癌細胞依其組織型態分型。本發明之適合體分子量小、具有熱穩定性、抗降解，可長期保存、可重覆使用並容易聯結其他分子的特性，實可取替代抗體，作為準確且低成本檢測卵巢癌之血清腫瘤標記。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1(A)-(G)圖係利用一微流體晶片執行SELEX篩選對目標細胞具專一性適合體之流程圖。
第2圖係本發明篩選適合體之二級結構圖，其中(a)-(d)係對卵巢癌亮細胞癌細胞TOV21G具專一性之適合體(SEQ ID NO：14-17)；(e)-(k)係對卵巢癌子宮內膜狀癌細胞TOV112D、IGROV1具專一性之 適合體(SEQ ID NO：18-24)；(l)-(m)係對卵巢癌漿液性癌細胞BG1具專一性之適合體(SEQ ID NO：25-26)。
第3圖係本發明之適合體連結螢光對不同組織學型態卵巢癌細胞之定性影像分析圖，其中(A)係對卵巢癌亮細胞癌細胞TOV21G具專一性之適合體(SEQ ID NO：14-17)；(B)-(C)係對卵巢癌子宮內膜狀癌細胞TOV112D、IGROV1具專一性之適合體(SEQ ID NO：18-24)；(D)係對卵巢癌漿液性癌細胞BG1具專一性之適合體(SEQ ID NO：25-26)。
第4圖係本發明之適合體聯結磁珠對不同組織學型態卵巢癌細胞及不同癌細胞之抓取率，其中(A)圖係對卵巢癌亮細胞癌具有專一性之適合體的抓取率；(B)圖係對卵巢癌子宮內膜狀癌細胞具有專一性之適合體的抓取率；(C)圖係對卵巢癌液性癌細胞具有專一性適合體的抓取率。
本發明提供一種專一性地結合不同組織型態卵巢癌細胞的適合體，係藉由系統性配分子指數增益演繹程序(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)體外篩選技術與微流體晶片技術結合篩選而得，其對不同組織型態的卵巢癌細胞有高結合率。進一步以螢光標記修飾本發明之具有專一性地結合不同組織型態卵巢癌細胞的適合體進行免疫分析並偵測螢光訊號，驗證本發明之適合體對不同組織型態卵巢癌細胞具有高專一性，且與非卵巢癌之癌症細胞之結合率低，故，不僅可用於檢測卵巢癌，更可進一步準確地將卵巢癌細胞依其組織型態分型，其 高專一性、穩定的特性更可作為卵巢癌早期檢測的血清腫瘤標誌。
定義
「核酸」、「核酸分子」、「核酸序列」、「聚核苷酸」、「核苷酸」、「聚核苷酸序列」及「核苷酸序列」一詞在本文中可互換使用，以表示任何長度之核苷酸的聚合物形式。核苷酸包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其類似物或衍生物。聚核苷酸之實例亦包含但不限於單股型式、雙股型式、主幹(stem)及環(loop)結構及類似者之所有序列型式。本文所示之核苷酸序列係以5’至3’方向排列。
「具專一性」係為當該適合體可與不同組織學型態之卵巢癌細胞結合或產生交互作用，但未顯著地與其他癌症的癌細胞結合或產生交互作用。
「微流體晶片」、「微流體裝置」、及「晶片」一詞在本文中可互換使用，以表示一獨立的整合單元，其具有一微流體反應器、一個或多個微流體流道、及一個或多個閥門(valve)。微流體晶片亦典型地具有其他微流體組件，例如：泵浦(pump)、槽(chamber)、混合器(mixer)、及其類似的組件。微流體晶片通常係由合成橡膠(elastomer)、玻璃(glass)、或矽(silicon)製成。典型地，微流體晶片係為具有一高度相較於長度及寬度為短的盒狀物，然而，晶片亦可為任意形狀，例如：立方體、圓柱體、或其他。
「抗體」一詞在本文中係包括但不限於一實質上由免疫球蛋白編碼的多胜肽或多胜肽片段，其專一性地結合且辨識一被測物(抗原)。
「檢體」一詞，係任何衍生自病患之生物檢體，包括但不限於生物液體，諸如：血液、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、淚液、唾液、 淋巴、透析液、灌洗液及其他液體樣本，以及生物來源之細胞及組織。該辭彙亦包括細胞或其衍生之細胞及其子代，包括培養物中之細胞、細胞上清液及細胞裂解物。該辭彙亦包括器官或組織培養物衍生的液體、組生檢樣本、腫瘤生檢樣本、糞便樣本、萃取自生理組織之液體以及分離自固態組織、組織切片及細胞裂解物之細胞。此一定義涵括在其獲得之後以任何方式操作之樣本，諸如：以試劑處理、溶解或使其富含某些組成份，諸如：聚核苷酸或胜肽；亦包括病患樣本之衛生物及區份。病患樣本可用於診斷或其他監測分析；亦可應用於來自非人類哺乳動物之生物檢體。該檢體可來自人類病患或非人類哺乳動物。
SELEX微流體晶片
本發明使用一種微流體晶片進行SELEX體外篩選本發明對卵巢癌細胞具專一性的適合體。該SELEX微流體晶片係自動化地執行SELEX，分離出本發明對卵巢癌細胞具專一性的適合體。本發明之SELEX微流體晶片由兩層聚二甲基矽氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS，Sylgard 184A/B，Dow Corning Corp.，美國)及一玻璃層(G-Tech Optoelectronics Corp.，臺灣)組成。
單股DNA序列庫、引子、反應試劑、及聚合酶連鎖反應(PCR)操作條件
該單股DNA序列庫係購自每得科技有限公司(Medclub Scientific Co.,Ltd.,Taiwan)，其是由人工合成的方法製成並且純化至濃度為1μM。該單股DNA序列庫中的各個單股DNA序列均為72個核酸所組成的序列，其包含一40個核酸所組成的中間區域，以及分別位於兩端的由16個核酸所組成的引子結合區域，該引子結合區域係提供PCR步驟使用。
該沖洗緩衝溶液係含有1L之杜貝可氏磷酸緩衝食鹽水(Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS)(Invitrogen Co.，美國)、4.5g之葡萄糖、以及5mL之1M氯化鎂，並且儲存於4℃備用。
結合緩衝溶液係為1L之DPBS、4.5g之葡萄糖、100mg之轉移核醣核酸(transfer ribonucleic acid)、1g之牛血清蛋白(bovine serum albumin)、與5mL之1M氯化鎂的混合。
在每次篩選循環時使用300μL之該沖洗緩衝溶液進行沖洗，並以50μL之該結合緩衝溶液進行單股DNA序列與細胞-磁珠複合體之共同培養。
該PCR反應試劑含有0.5μL的正向引子(5’-GGCAGGAAGACAAACA-3’，SEQ ID NO：27，0.5μM)、0.5μL的反向引子(5’-ACAGCACCACAGACCA-3’，SEQ ID NO：28，0.5μM)、0.5μL的去氧三磷酸核苷(deoxynucleoside triphosphates，dNTPs，0.2mM)、2μL的單股DNA(0.1μM)、0.125μL的Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase，New England Biolabs Co.,Ltd.，臺灣)，並以二次蒸餾水(double-distilled water，ddH2O)配製成總體積為25μL。
該PCR反應一開始係以94℃進行變性10分鐘，接著是二十次循環的94℃、30秒變性，接著在63℃進行15秒的黏合反應(annealing)並在72℃進行30秒的延長反應(extension)。最後一次的延長反應係最後一個循環後在72℃下進行10分鐘。經過五個SELEX篩選循環後，純化第五循環(R5)所產生之PCR產物並以TOPO TA選殖套組(TOPO TA Cloning kit，Invitrogen，美國)進行選殖。
細胞培養及磁珠之備製
在本發明之實施例中，TOV21G細胞株係用來作為卵巢癌細胞亮細胞型態(clear cell type)之目標細胞；TOV112D及IGROV1細胞株係用來作為卵巢癌細胞內膜狀細胞型態(endometrioid type)之目標細胞；BG-1細胞株係用來作為卵巢癌細胞漿液性細胞型態(serous type)之目標細胞。該些細胞株係由國立成功大學婦產學科所提供。該TOV112D、IGROV1、及TOV-21G細胞株係以RPMI-1640培養基(Invitrogen Co.，美國)培養；而該BG-1則是以杜貝可氏改良之伊格氏培養液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM，Invitrogen Co.，美國)培養。
乳癌細胞株MCF7、及小鼠胚胎纖維母細胞株NIH3T3係由中山醫學大學微生物免疫研究所提供；子宮頸癌細胞細胞株HeLa、肺癌細胞株A549、及肝癌細胞株HepG2係由國立中山大學生物醫學研究所提供；小鼠神經母細胞株M2-10B4(BCRC number：60228)係由財團法人食品工業發展研究所提供。上述非卵巢癌細胞株皆以DMEM培養基(Invitrogen Co.，美國)培養。所有培養基皆添加10%胎牛血清(fetal bovine serum)(Invitrogen Co.，美國)與100UI/mL盤尼西林-鏈黴素(penicilline-streptomycin)(Invitrogen Co.，美國)。上述所有細胞株皆培養於37℃、5%CO2環境中。
使用Dynabeads®表皮表面蛋白免疫磁珠(Epithelial Enrich immunomagnetic beads，EpiEnrich，4×108磁珠/mL，Ø=4.5μm，Invitrogen Co.，美國)與目標細胞或控制組細胞製備細胞-磁珠複合體以進行SELEX篩選。首先，以1mL PBS緩衝溶液(Merck Ltd.，德國)沖洗磁珠兩次，接著將磁珠回溶於1X PBS溶液中並製成總體積為1mL；再接著，將細胞與結合緩 衝溶液混合並配製成總體積為1mL之混合液，將該混合液置於一預先載有磁珠的試管中。細胞-磁珠複合體之計數為1×105細胞/100μL，以進行SELEX篩選。細胞與磁珠的結合比例(binding ratio)亦由顯微鏡測量。
為了測量篩選出的適合體與癌細胞株之間的選擇性結合率(binding selectivity)，本發明亦製備一適合體-磁珠複合體。首先，將100μL含有羧酸功能基團之MyOneTM磁珠(Dynabeads® MyOneTM Carboxylic Acid，6.17×107磁珠/mL,Ø=1.0μm，Invitrogen Co.，美國)載於一試管中，接著將該試管置於一磁場並去除上清液。再將磁珠以二次蒸餾水清洗兩次並去除上清液。加入二次蒸餾水、經胺基修飾的適合體(100μM)、以及N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亞胺氯化氫(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDAC，120mg/mL，Sigma Co.，美國)，並於無光照、室溫下培養18個小時。18個小時後，使用一磁場收集磁珠並去除上清液。再經過兩次1mL 0.02% Tween 20(Sigma Co.，美國)及0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS，Sigma Co.，美國)清洗後，在無光照、室溫下加入乙醇胺(ethanol amine，0.1M，Sigma Co.，美國)以阻礙適合體-磁珠複合體表面未結合之區域持續1小時。之後，將適合體-磁珠複合體以二次蒸餾水清洗兩次，再回溶於二次蒸餾水中，並置於4℃備用。
以微流道晶片系統執行SELEX篩選適合體之流程
本發明使用結合磁珠技術之SELELX晶片篩選對卵巢癌細胞具有專一性適合體的流程係如第1圖所示。首先，將一隨機的單股去氧核糖核酸(signle-stranded deoxyribonucleic acid，ssDNA)序列庫與一以磁珠包覆 的目標細胞(磁珠-目標細胞複合體)共同置於一反應槽並且培養，以進行正篩選(positive selection)，如第1圖(A)步驟所示。該單股DNA序列庫中對該目標細胞具有高度專一性的單股DNA序列會與該磁珠-目標細胞複合體結合，形成一單股DNA序列-磁珠-目標細胞複合體。接著，使用一外部磁場以收集該單股DNA序列-磁珠-目標細胞複合體，而未與該磁珠-目標細胞複合體結合之單股DNA序列則藉由一微幫浦(micropumps)以一沖洗緩衝溶液去除，如第1圖(B)步驟所示。再接著，將該目標細胞進行熱分解(thermal lysis)以釋出該與目標細胞結合的對該目標細胞具有專一性的單股DNA序列，如第1圖(C)步驟所示。再將被釋出的單股DNA序列傳送至另一個預先裝載有以磁珠包覆的控制組細胞(磁珠-控制組細胞複合體)的反應槽中，進行負篩選(negative selection)以排除未結合之單股DNA序列，如第1圖(D)步驟所示。同樣地，使用外部的磁場來收集任何與該磁珠-控制組細胞複合體結合之單股DNA序列。經由負篩選後，收集存在上清液中未與該磁珠-控制組細胞複合體結合之單股DNA序列，該些單股DNA序列對目標細胞具有高專一性而不與控制組細胞結合，即為對目標細胞具有高專一性之適合體，如第1圖(E)步驟所示。接下來進行PCR反應以放大該些對目標細胞具有高專一性之適合體，如第1圖(F)步驟所示。該PCR所產生之產物即第一篩選循環(R1)之產物，將該第一篩選循環之產物傳送回反應槽進行下一次的篩選流程，所有篩選的步驟皆以一自動化的微流體系統執行。
SELEX篩選流程中，使用一種組織學型態的卵巢癌細胞，例如：TOV21G、IGROV1、BG-1等，作為目標細胞，並且同時作為彼此篩選時的控制組細胞，本發明之篩選流程可快速、自動化、且準確地篩選出 對不同組織學型態的卵巢細胞具有高專一性的適合體。
實施例1：對不同組織學型態卵巢癌細胞具有專一性適合體之篩選
各篩選循環所增繹的單股DNA之濃度係以紫外線-可見光波長光譜儀(NanoPhotometer® P-Class，Implen GmbH，德國)測量，並調配為50ng/2μL以進行PCR放大步驟。在PCR放大步驟中，使用5’-Cy5螢光修飾引子(5’-Cy5 fluorescence-dye-modified primers，波仕特生物科技股份有限公司，臺灣)，在藉由PCR步驟附著Cy5探針於單股DNA後，並以該光譜儀測量各篩選循環之PCR產物的濃度。該含有Cy5探針的單股DNA進一步配製為500ng/50μL以分別與TOV21G、TOV112D、IGROV1、以及BG-1細胞株進行結合，並以流式細胞分析。螢光量係以流式細胞儀(BD AccuriTM C6，Becton,Dickinson and Company，美國)測量，所有實驗皆重複三次。
為了進行結合分析，於室溫下，將1×105個不同組織學型態的卵巢癌細胞(包括：BG-1、TOV112D、IGROV1、以及TOV-21G)分別與由第一至第五次循環篩選出之單股DNA適合體共同培養於200μL之結合緩衝溶液中持續30分鐘。接著以50μL的沖洗緩衝溶液手動沖洗細胞並置於微混合器(micro-mixer)1分鐘。重複該清洗與混合步驟五次。最後，以流式細胞儀分析結合有單股DNA(即，適合體)的細胞。所篩選出之適合體對不同組織學型態卵巢癌細胞的結合能力相對於整個單股DNA庫對不同組織學型態卵巢癌細胞的結合能力可由比較與不同循環(R1至R5)產生之適合體結合的結果得知。
將從上述SELEX第一至第五循環篩選出的單股DNA以PCR放大。PCR放大後，收集放大後的所篩選出的單股DNA，將其與不同組織 學型態的卵巢癌細胞結合並以流式細胞儀分析。當所篩選出的放大後的單股DNA僅專一性地與一種特定的卵巢癌細胞結合，會觀察到其螢光強度從第一至第五循環漸漸增強。對於TOV21G細胞株，第四及第五循環所篩選出單股DNA的螢光訊號的峰值顯著地增加至105a.u.，相較於第一循環篩選出單股DNA為約104a.u.；對於TOV112D細胞株，第五循環所篩選出單股DNA的螢光訊號的峰值亦從104a.u.增加至105a.u.；類似地，對於BG-1及IGROV1細胞株，篩選出單股DNA的螢光訊號的峰值亦隨第一至第五漸漸增加。本發明以螢光訊號量化測量(quantitative fluorescence signal measurement)取代傳統PCR的凝膠電泳分析(electrophoresis gel analysis)，因為凝膠電泳僅能部分地量化測量專一性適合體的結合效率。本發明之實驗結果顯示，只需五次SELEX篩選循環，因為螢光訊號在第四至第五循環間維持穩定的強度。因次，經過五次SELEX循環篩選，使用TOPO TA選殖套組選殖第五次循環之產物。
本發明隨機地依各不同組織學型態的卵巢癌細胞株選取20個適合體序列(總數為80個)以進行競爭試驗以驗證其結合率。
該競爭分析係以游離之目標細胞作為競爭對象，與包覆有或未包覆有目標細胞的表面蛋白免疫磁珠競爭上述SELEX流程所篩選出之適合體。先進行「負分析」，將適合體與表面蛋白免疫磁珠(未包覆目標細胞)共同培養，因為僅少數適合體會附著於表面蛋白免疫磁珠(未包覆目標細胞)上，故，僅會觀察到微量或觀察不到PCR訊號；接著，進行競爭分析，將游離之目標細胞、包覆有目標細胞的表面蛋白免疫磁珠(目標細胞-磁珠複合體)、適合體共同培養，雖然部分適合體會與游離的目標細胞結合，但當使 用一磁場時，其不會被收集，因此，可觀察到微弱的PCR訊號；最後進行「正分析」，將目標細胞-磁珠複合體與適合體共同培養，因為所有適合體均會與目標細胞-磁珠複合體結合，故，可預期觀察到強烈的PCR訊號。
競爭試驗後，選取具有高結合率的適合體，包括：四個對TOV21G細胞株具有專一性的適合體(SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、及SEQ ID NO：17)；四個對TOV112D細胞株具有專一性的適合體(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、及SEQ ID NO：21)；兩個對BG-1細胞株具有專一性的適合體(SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26)；三個對IGROV1細胞株具有專一性的適合體(SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24)；以及對上述TOV21G、BG-1、及IGROV1卵巢癌細胞株具有專一性的適合體(SEQ ID NO：23)。上述對不同組織學型態的卵巢癌細胞株具有專一性的適合體進一步定序並且合成(每得科技有限公司，桃園，臺灣)，各適合體的序列如表1所示：
更進一步，以MFOLD軟體(3.5版)對該些單股DNA的適合體在25℃時的結構進行預測，預測結果如第2圖所示。
上述適合體中，進一步分析其對不同組織學型態的卵巢癌細胞之專一性結合序列如表2所示：
實施例2：解離常數
為了得知所篩選適合體對不同組織學型態卵巢癌細胞的結合率，將以羧基螢光素(Carboxyfluorescein，FAM)標記之500nM至0.1nM之適合體分別與BG-1、TOV112D、IGROV1、以及TOV-21G細胞株(各為1×105個細胞)共同培養於50μL結合緩衝溶液15分鐘。接著，細胞以50μL沖洗緩衝溶液清洗六次，回溶於50μL結合緩衝溶液中，並以流式細胞儀分析。以僅含有細胞的樣本作為控制組。適合體所產生的螢光強度進一步用於計算平衡解離常數(Kd)。以螢光標記的適合體的Kd值是使用Prism軟體(GraphPad Software,Inc.，美國)計算，其繪製專一性結合強度的平均螢光強度(Y)相對於濃縮適合體(X)的的曲線圖，Y=BmaxX/(Kd+X)。
以FAM螢光修飾該些適合體並配製成不同濃度，以測量其解離常數，以及各適合體與其具有專一性的目標細胞之間的結合率。該些適合體的解離常數係介於1.8nM至201.3nM之間，故，相較於大部分抗體(解離常數為10-7至10-9M)明顯較佳。此外，SEQ ID NO：19具有與TOV112D細胞株最佳的結合率，其解離常數為22.4nM；SEQ ID NO：26具有與BG-1細胞株最佳的結合率，其解離常數為1.3nM；SEQ ID NO：23具有與IGROV1細胞株最佳的結合率，其解離常數為10.2nM。
實施例3：適合體對不同組織學型態卵巢癌細胞的結合分析
將1×105個不同組織學型態的卵巢癌細胞株，包括：BG-1、TOV112D、IGROV1、以及TOV-21G，以1X PBS緩慢的沖洗並回溶於200μL結合緩衝溶液，並加入50μL之250nM FAM標記之適合體培養30分鐘。培養後，將標記的細胞以1X PBS沖洗三次，並在冰冷的4%多聚甲醛 (paraformaldehyde)中固定5分鐘、空氣乾燥5分鐘。之後，將細胞置於顯微鏡玻片上並加入抗褪色試劑(ProLong® Gold Antifade Reagent，Invitrogen Corporation，美國)。以一準直透鏡、接物鏡之組合(Nikon LU Plan 10×/0.30 A，Nikon，日本)、三個螢光濾鏡(Nikon G-2A，Nikon，日本)、與一水銀燈(MODEL C-SHG1，Nikon，日本)來對該顯微鏡玻片進行光學分析。螢光適合體之影像係以DS-Qi1Mc攝影機(150萬像素，並配置有一Peltier冷卻裝置及一可編程增益放大器，Nikon，日本)與一配置有一數位控制模組的倒立式顯微鏡來捕捉。
以經FAM螢光綠修飾本發明之適合體取代一傳統的抗體免疫螢光分析並使其與不同組織學型態的卵巢癌細胞結合，如第4圖所示，當本發明之適合體與其具有專一性的組織學型態的卵巢癌細胞結合時，可觀察到顯著的螢光訊號。再者，螢光訊號的形式顯示該些適合體專一性地結合至其目標細胞的表面。如第3(A)圖所示，該四個對TOV21G細胞株具有專一性的適合體(SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、及SEQ ID NO：17)會與卵巢癌亮細胞型癌細胞TOV21G結合，其中，SEQ ID NO：15表現出最強的螢光訊號，因為SEQ ID NO：15具有最低的解離常數為1.8nM，所以對於TOV21G細胞株的結合率是最高的。此外，亦觀察到部分螢光訊號並非位於細胞膜，顯示對TOV21G細胞株具有專一性的適合體會透過擴散作用(diffusion)或胞飲作用(endocytosis)進入細胞中。
本發明之適合體與卵巢癌子宮內膜狀癌細胞TOV112D與IGROV1細胞株之結合效果係如第3(B)及3(C)圖所示。SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20表現相較於另外兩個對TOV112D細胞株具專一性的適合體較佳 的螢光訊號，因為其具有較低的解離常數，分別為22.4nM與34.8nM，所以對TOV112D細胞株具有較高的結合率。值得注意的是，SEQ ID NO：20可清楚的定義目標細胞的細胞膜區域，故，可應用於卵巢癌子宮內膜狀癌細胞的辨識；同樣地，對IGROV-1細胞株具有專一性的適合體亦可專一性地辨識子宮內膜狀癌細胞。觀察到部分螢光訊號位於細胞質，顯示對TOV112D細胞株與IGROV-1細胞株具有專一性的適合體會經由擴散作用或胞飲作用被吸收至細胞內。
如第3(D)圖所示，SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26均清楚的定義卵巢癌漿液性細胞BG-1細胞株的細胞膜區域，顯示SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26均專一性地結合至BG-1細胞株的細胞膜。本發明之適合體可有專一性地結合至卵巢癌漿液性細胞的細胞膜，故，可應用於卵巢癌漿液性細胞的檢測。
實施例4：本發明之適合體對卵巢癌細胞之專一性
選擇性結合檢測係所篩選之對卵巢癌細胞具高專一性適合體對多種不同癌症細胞株之抓取率(capture rate)。將不同癌症細胞株(1×105)與10μL包覆有卵巢癌專一性適合體之MyOneTM磁珠共同培養30分鐘，並以結合緩衝溶液配製為最終體積為200μL。共同培養後，以200μL沖洗緩衝溶液沖洗該多種不同癌症細胞株五次，之後回溶於200μL之結合緩衝溶液。最後，在顯微鏡下使用一血球計(hemocytometer)計數被抓取的細胞。
進一步將本發明適合體(10ng)與其他種癌細胞株作用，包括：子宮頸癌細胞細胞株HeLa、乳癌細胞株MCF7、肺癌細胞株A549、肝癌細胞株HepG2、小鼠神經母細胞株M2-B104、及小鼠胚胎纖維母細胞株 NIH3T3，以確認本發明適合體對卵巢癌細胞的專一性。
如表3所示，四個對TOV21G細胞株具有專一性的適合體(SEQ ID NO：14-17)對其目標細胞TOV21G細胞株表現顯著的高辨識率(≧+++、≧50.0%細胞抓取率)，而對於其他細胞株的辨識率低(≦++、≦49.9%細胞抓取率)；同樣地，四個對TOV112D細胞株具有專一性的適合體(SEQ ID NO：18-21)以及兩個對BG-1細胞株具有專一性的適合體(SEQ ID NO：25-26)亦對其目標細胞表現顯著的高辨識率(≧+++、≧50.0%細胞抓取率)，而對於其他細胞株的辨識率顯著地較低(≦++、≦49.9%細胞抓取率)。關於三個對IGROV1具有專一性的適合體，僅SEQ ID NO：22對其目標細胞表現較高的辨識率(+++、50.0-74.9%細胞抓取率)及對其他細胞表現低的辨識率，然而，SEQ ID NO：23對另外三種不同組織型態的卵巢癌細胞表現高的辨識率(+++、50.0-74.9%細胞抓取率)顯示其不僅可用於識別卵巢癌子宮內膜狀癌細胞，亦可用於快速但不區分組織學型態的卵巢癌檢測。
表3中，+代表0-24.9%細胞抓取率；++代表25.0-49.9%細胞抓取率；+++代表50.7-74.9%細胞抓取率；++++代表75.0-100%細胞抓取率。
再者，如第4(A)圖所示，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4對TOV21G抓取效率為68.9%、76.6%、81.8%與79.8%；如第4(B)圖所示，SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6與SEQ ID NO：7對TOV112D抓取效率為58.8%、61.6%與62.5%；SEQ ID NO：9對IGROV1抓取效率為53.0%；如第4(C)圖所示，SEQ ID NO：12與SEQ ID NO：13對BG1抓取效率為74.5%與72.8%；此外，如第4(B)圖所示，SEQ ID NO：10對TOV21G、BG1與IGROV1之抓取效率分別為51.3%、51.8%與 52.1%。本發明之適合體證實對不同組織學型態卵巢癌有53.0~81.8%高結合率，然對其他種癌細胞平均只有30%結合率，故，本發明之適合體為對卵巢癌細胞具有專一性的適合體。
結果顯示，本發明之適合體對不同組織型態卵巢癌細胞具有高專一性，其與非卵巢癌之癌症細胞之結合率低。
綜上所述，本發明之適合體分別對不同組織學型態的卵巢癌細胞具有高度的專一性及結合率。再者，適合體分子量小、可重覆使用並且容易連結其他分子，相較於抗體不僅能克服動物生產的缺點，且易於放大、能保持大量生產的精確性，故，可代替傳統檢測使用抗體的方法，用來檢測卵巢癌細胞，並且能依不同組織學型態識別卵巢癌細胞。
本發明所提供之對卵巢癌細胞具有專一性的適合體、偵測檢體中卵巢癌細胞存在之方法、及用於偵測一檢體中卵巢癌細胞存在及該卵巢癌細胞組織學型態之微流體晶片確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。
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<223> 正向引子
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<223> 反向引子
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Claims (13)

  1. 一種卵巢癌細胞專一性之適合體，包含：(a)一專一性結合卵巢癌細胞之核酸序列；以及(b)一正向引子或反向引子；其中該專一性結合卵巢癌細胞之核酸序列係選自：(i)由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或其任意組合所組成之群組；(ii)由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、或其任意組合所組成之群組；或(iii)由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、或二者之組合所組成之群組。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之適合體，其中該卵巢癌細胞係卵巢癌亮細胞、卵巢癌子宮內膜狀癌細胞、或卵巢癌漿液性癌細胞。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之適合體，其中當該卵巢癌細胞係卵巢癌亮細胞時，該適合體係SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、或其任意組合。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之適合體，其中當該卵巢癌細胞係卵巢癌子宮內膜狀癌細胞時，該適合體係SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、或其任意組合。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之適合體，其中當該卵巢癌細胞係卵巢癌漿液性癌細胞時，該適合體係SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、或其組合。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之適合體，其中該正向引子係SEQ ID NO：27。
  7. 如申請專利第圍第1項所述之適合體，其中該反向引子係SEQ ID NO：28。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之適合體，其中該適合體具有主幹與環(stem-loop)之二級結構。
  9. 一種檢測檢體中卵巢癌細胞存在之方法，其步驟包含：(a)將一檢體與至少一適合體接觸，使該檢體中的卵巢癌細胞與該適合體結合；以及(b)藉結合反應偵測該檢體中卵巢癌細胞之存在；其中，若步驟(a)選擇SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、或SEQ ID NO：17之適合體，則決定卵巢癌亮細胞之存在；若步驟(a)選擇SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24之適合體，則決定卵巢癌子宮內膜狀癌細胞之存在；而若步驟(a)選擇SEQ ID NO：25、或SEQ ID NO：26之適合體，則決定卵巢癌漿液性癌細胞之存在。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該適合體係與一標記結合，該標記係螢光標記、化學發光標記、放射性同位素、酶標記或生物素。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之方法，進一步包含以該適合體修飾一磁珠表面。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該結合反應係該適合體修飾之磁珠抓取卵巢癌細胞，且經磁場導引分離出已與該適合體結合之卵巢癌 細胞。
  13. 一種微流體晶片，係包含如申請專利範圍第1項至第7項任一項所述之適合體。
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