CN110713922A

CN110713922A - 实时监测单细胞或单细胞的活动

Info

Publication number: CN110713922A
Application number: CN201910879112.1A
Authority: CN
Inventors: 宋汝渊; 许潇楠; 姚舒怀; 周国辉
Original assignee: Zhejiang Dapu Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Dapu Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2020-01-21
Also published as: US20220041967A1; WO2020057531A1

Abstract

本发明包括的一种可以产生能够连续培养单个细胞的装置和培养单个细胞的装置和方法,利用该装置可以时时动态监测细胞的生理状况。

Description

实时监测单细胞或单细胞的活动

本发明主张美国临时申请，申请号：62/733,790申请日2018年9月20日的优先权，该临时申请的所有文字描述和附图以及说明书作为本发明的一部分。

本发明领域

本发明涉及利用微流体平台以实时方式监测或检测单个细胞的活动或特性的方法和/或装置。

本发明的背景

常规细胞研究调查了约10³-10⁶个细胞的细胞群的平均生理特征，因而仅揭示了该群体的平均基因型/表型特征。然而细胞间差异(例如，即在看似相同的细胞群体内的细胞间变异现象)实际上是生物系统的普遍特性，并且已经从单个细菌细胞到人类组织的各级生命层次中观察到。

更重要的是，疾病通常源自组织内少数细胞的异常。对足够数量的单个细胞的分析可以揭示细胞异常/表型异质性的遗传变异、及高分辨率情况下对环境刺激及化学治疗剂刺激的应答。这对了解细胞功能和功能障碍、靶向特异细胞类型、药物筛选、异常分析、酶分析和疾病早期诊断的潜在的分子机制是很重要的。由于其高成本和复杂性，依赖多孔板和机器人技术的常规的单细胞分析方法仅能处理和分析少量细胞。非常需要采用超高通量的方法来描绘百万个细胞的特征，特别当要分析或筛选的重要细胞类型在样品中以非常低的丰度存在时。

液滴微流体技术提供了以非常高通量的方式单分散性离散化来分离单个细胞和试剂，从而允许高效处理和分析数万至数百万个细胞。此外，少量液滴就可以获得非常经济的大量筛选。乳化聚合酶链式反应(ePCR)可以通过将核酸(DNA或RNA)分配到散布在油相中的小液滴进行大规模平行的单拷贝PCR反应，为单细胞的高通量基因检测提供了强大的工具，从而实现单细胞分析。基于液滴微流体的单细胞分析目前在阐明细胞群体的异质性和其潜在原因中发挥着越来越重要的作用。

基于激光的流式细胞仪已经用于单细胞的表型特征分析，例如酶、生物标志物和对药物筛选的应答能力。它使用激光分析荧光分子的存在和单个细胞的光散射属性，因为它们以每秒数万个细胞的速率通过依次通过检测器。荧光显微镜是一种更动态的方法。固定在微流体装置中的荧光显微镜为单细胞研究开辟了许多新的可能性，因为在微流体装置中可以精确控制和修改单细胞所经受的环境。然而，一些重要的单细胞分析，例如延时追踪特定细胞，分泌物的分析以及对单独的细胞或克隆的分析，由于这些技术缺乏对单个细胞稳健的离散而超出了流式细胞术和荧光显微镜方法的范围。

为了单细胞的基因型特性分析，通过荧光激活细胞分选系统将单个细胞分离到孔板的每个孔中。通过聚合酶链式反应(PCR)或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和遗传检测或全基因组测序，提取扩增单个细胞的DNA/RNA，以获得单个细胞的遗传信息。由于其成本和复杂性，该方法仅能处理和分析少量细胞。

最近，液滴微流体的高通量和卓越的可控性，大量平行的单细胞PCR或RT-PCR可以在微流体液滴中进行，用于单细胞遗传分析。这样的方法依赖终止时间检测来鉴定每一个细胞的稀有突变基因，如数字PCR技术那样。然而跨细胞群的每一个细胞的遗传信息如信使RNA(mRNA)的变化不仅在于表达的存在或缺乏，而且在于表达水平，当前技术不能以定量的方式区分mRNA表达水平。更重要的是，目前仍缺乏能确定和分析单个细胞表型和基因型特性的方法。

发明内容

本发明首次引入了利用微流体平台以实时方式监测和检测单个细胞中的活动或细胞特性的概念，从而使得对细胞功能及功能缺陷潜在的分子机制有着更深入的了解。

在一个实施例中，本发明提供了以大规模平行且实时的方式监测和检测单个细胞中的活动或细胞特性的方法和装置。

在一个实施例中，本发明提供了在单个细胞水平单独的培养并检测大量细胞的单细胞培养系统，包括离散细胞群体为很多单个凝胶微球中，而每一个凝胶微球包含单个细胞，且被加载入一个培养室用来培养和后续测试或分析。

在一个实施例中，本发明提供了以大规模平行且实时方式研究或监测单细胞对外界刺激应答的方法和装置。

在一个实施例中，本发明提供了以大规模平行且实时方式研究或监测单细胞水平药物应答的方法和装置。

图例的简要说明

图1是一个示意图，显示了本发明分析单个细胞中信使RNA(mRNA)水平的一个实施例。左图显示了封装单细胞和其他试剂的过程。混合细胞悬浮液中单个细胞，用于细胞裂解的裂解缓冲液和用于反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的引物，并封装入单个液滴中。右图显示了实时监测反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)过程中检测和定量单细胞mRNA的过程。这个以大规模平行方式在单个细胞水平进行过程包括细胞裂解、反转录和PCR反应，监测是实时的因为在PCR过程中会连续测量每一个液滴中的靶标特异荧光信号。

图2显示了本发明建立基于凝胶微球的细胞培养系统的一个实施例，该细胞培养系统包括用于细胞培养的一个腔室，用于导入流体进入该腔室的入口，用于从该腔室内去除流体(如废液)或收集细胞的出口。

图3是一个显示了本发明建立基于凝胶微球细胞培养系统的一个实施例的示意图，该系统被用于在单细胞水平进行大规模平行监测和分析。左图显示了细胞和琼脂溶液的封装过程。细胞悬浮液中的单个细胞和琼脂溶液混合，被共同封装到单个凝胶微球里。右图描绘了用于持有单个液滴的U形阵列的顶端俯视图。首先凝胶微球被加载并释放到培养室的U型阵列上，然后通过洗涤从凝胶微球去除过量的油，在具有培养液灌注的正常培养条件下，在培养室进行细胞培养。在一个实施例中，本培养系统可采用图2所示的形式。

图4显示了对液滴进行实时数字PCR结果，其利用本发明的一个实施例进行45个PCR循环的PCR过程。测量每一个循环中液滴的荧光强度，并每一次测量计数5000个液滴。

图5显示了本发明液滴产生的一个实施例。

图6显示了本发明液滴产生的另一个实施例。

图7显示了一个液滴产生装置的一个实施例，该装置包括一个流动聚焦结构，其下游与一个液滴贮藏室联接。

图8显示了液滴培养室里锚定结构的一个实施例。锚定结构在液滴培养室里的预设位置捕捉单个液滴。

图9显示了液滴培养室里的锚定结构的另一个实施例。

图10显示了通过CCD相机获得液滴的荧光图像。

图11显示了数字量化单个外泌体RNA的一个实施例

图12显示了数字量化单个外泌体RNA的过程作为本发明内容的一部分。

本发明的详细说明

本发明提供以大规模平行且实时的方式监测单个细胞中发生的活动或检测单个细胞的细胞特性的方法和装置。

本发明提供以大规模平行且实时方式监测单个细胞的表型特征和/或基因型特征的方法和装置。

在一个实施例中，本发明提供能够产生上千液滴的微流体平台，从而离散含有细胞的样品为上千个单独的液滴，每一个液滴包含单个细胞或单个以膜结合的细胞器。

在一个实施例中，本发明提供一个液滴培养室用于容纳和培养含有单个细胞或单个以膜结合细胞器的液滴，从而允许在每一个液滴中同时进行平行的独立反应，并以大规模平行且实时的方式监测每一个液滴中的反应过程。

在一个实施例中，本发明提供单细胞培养系统，用于在单细胞水平独立培养和监测大量细胞。在一个实施例中，该单细胞培养系统包括将细胞群体封装入多个单个凝胶微球，而每一个凝胶微球包含单个细胞并被加载到培养室，用于培养和后续测定或分析。

在一个实施例中，利用这里所述的装置或系统，本发明提供用于在单细胞水平单独培养大量细胞并在单细胞水平研究它们特性。

在一个实施例中，本发明提供以大规模平行且实时方式研究或监测单细胞对外界刺激的应答的方法。在一个实施例中，外界刺激包括环境刺激、压力和化学刺激。

在一个实施例中，本发明提供以大规模平行且实时方式研究或检测单细胞水平药物应答的方法。

总的来说，本发明能在每一个包含细胞的液滴中同时开展独立测定，并以实时和高通量方式监测在每一个细胞中的细胞活动或他们的表型和基因型特征，因此对研究细胞异质性是非常有用的。

液滴的产生

在一个实施例中，本发明提供了一种能产生上千液滴的液滴产生装置，然后离散含有细胞的样品为上千个单独的液滴，每一个液滴包含单个细胞或单个以膜结合的细胞器。

在一个实施例中，该液滴产生装置是一个微流体平台，能产生并离散液体样品为大量单个液滴。

本领域技术人员将容易理解，不同类型和形式的液滴产生装置均可用于本发明，只要这种装置能够产生适用于本发明用途的液滴即可。

在一个实施例中，液滴产生器提供的入口用来导入各种液体(如油，开展反应的样品和试剂)到液滴产生器。在一个实施例中，用于产生液滴的各种液体通过同一入口提供给液滴产生器。在一个实施例中，产生液滴的各种液体通过不同入口提供给液滴产生器。图5和图6显示利用本发明产生液滴的两个实施例。在图5中，用于开展后续反应的原始样品和试剂预混合，所得混合物被置于液滴产生器进行封装。在图6中，因为细胞或外泌体与裂解缓冲液的预混合将导致细胞或外泌体的裂解，包含细胞或外泌体的原始样品通过不同入口被加载到液滴产生器，那样他们被封装入液滴前它们不会接触。

本发明的液滴产生装置可以是能离散液体样品为大量液滴的任何结构或系统。

在一个实施例中，液滴产生装置包括但不限于流动聚焦结构、交叉流动、共流动、阶梯乳化和微通道乳化等结构。P.Zhu和L.Wang(2017)描述了用于产生液滴的一些技术，因此他们的内容被完整的参考引用作为本发明内容。

在一个实施例中，本液滴产生器是基于剪切的液滴产生装置，利用剪切力夹紧流线为小液滴。在一个实施例中，基于剪切的液滴产生装置包含但不限于那些由交叉流动结构、共流动结构和流动聚焦结构组成的装置。

在一个实施例中，本液滴产生装置是基于表面张力的液滴产生装置，其中表面张力在液滴分裂过程中是主导驱动力。在一个实施例中，基于表面张力的液滴产生装置包括但不限于那些由T型接合结构与阶梯乳化和微通道乳化结构组成在一个实施例中，本液滴产生装置包括如WO2016189383A1所述的液滴产生结构，因此该内容被完整的参考引用到本发明中。

在一个实施例中，能产生液滴的方法可以用于本发明来产生液滴，包括但不限于高剪切搅拌、超声乳化、高压均质化和膜乳化。

在一个实施例中，本液滴产生装置包括流动聚焦结构，能压缩流动来加强聚焦效果。在一个实施例中，流动聚焦结构是2D平面流动聚焦结构。图7显示了由流动聚焦结构和液滴贮藏室组成的液滴产生装置的实施例，该液滴贮藏室用于持有产生的液滴。在图7中，中央通道处的样品被来自侧通道的流体剪切并破碎成小液滴，然后由毛细作用力被吸入液滴贮藏室。

在一个实施例中，本液滴产生装置包括交叉流动结构，其允许连续相和分散相以某个角度θ相交。在一个实施例中，本液滴产生器包括T型、Y型、双T型、K型或V型接合结构。

在一个实施例中，本液滴产生装置包括共流动结构，在该结构中分散的流线被周围的流动连续相击打。在一个实施例中，共流动结构是2D平面共流动结构。

在一个实施例中，本液滴产生装置包括阶梯乳化结构。在一个实施例中，本液滴产生装置包括一个结合着平行或垂直的T型结构的阶梯乳化结构。

在一个实施例中，本液滴产生装置包括一个微通道乳化结构。

在一个实施例中，负责产生液滴(如样品离散化)的液滴产生结构的组分或部分具有疏水表面。其可以通过在组分或部分的表面轭合疏水基团的化学表面涂覆来实现。在一个实施例中，表面活性剂如斯盘80、吐温20或Abil EM90，PFPE-PEG-PFPE,(perfluoropolyether-polyethyleneoxide-perfluoropolyethertriblock copolymer)被加到油相或水相中来避免液滴聚结或防止分子如酶、DNA或RNA粘附到固体表面或水油界面。

在一个实施例中，产生的液滴是乳化液滴，并不限于特定类型的乳液。在一个实施例中，乳液包括但不限于水包油，油包水和水-油-水双重乳液。

在一个实施例中，油(也可以称为油相)和表面活性剂被用于产生液滴。在一个实施例中，表面活性剂与油的比例是1-5％(重量比)。在一个实施例中，油被用于产生液滴包括但不限于矿物油、硅油、氟化油、十六烷和植物油。在一个实施例中，使用的表面活性剂包括但不限于斯盘80、吐温20/80、ABIL EM 90和磷脂质、PFPE-PEG-PFPE。Baret和Jean-Christophe(2012)描述了在基于液滴的微流体中使用的表面活性剂，其内容被完整的参考引用到本发明内容中。

在一个实施例中，该液滴产生装置能以约0.1kHz至约20kHz的频率将细胞离散为油包水液滴(直径10-200μm)中。在一个实施例中，产生液滴的频率为约0.01至1kHz。

在一个实施例中，本液滴产生装置能在几分钟内离散百万个细胞为单独的液滴。在一个实施例中，本液滴产生装置能在约10分钟内离散百万个细胞为单独的液滴。

在一些实施例子中，本发明提供一种能够产生凝胶微球的产生装置，例如在图3中，该装置包括微流体通道，用于输入细胞溶液的第一入口、用于输入凝胶溶液的第二入口和用于输入油相的第三入口，第一入口、第二入口和第三入口通过微流体通道连接，在所述的连接处用于让凝胶溶液、细胞溶液形成凝胶和细胞溶液的混合液滴，然后混合液滴再和油相接触并形成油相包裹的液滴，然后液滴凝胶化形成凝胶微球，所述的至少部分凝胶微球中的每一个微球中包括单个细胞。如图3所示，形成的油相包裹的凝胶微球，细胞溶液固化在凝胶微球内。

在一些方式中，凝胶微球生成装置包含更多入口用于通入形成凝胶的不同组份，比如催化剂、单体及交联剂等。

和输入油相的第三入口。,一般,在优选的方式中,凝胶微球形成是在油包水(细胞溶液和凝胶溶液)之后，细胞溶液和凝胶溶液在油包水液滴混合冷却后，液滴才开始凝胶化形成固态。例如图3所示。

在一些方式中，所述的装置还包括出口，该出口用来输出油相包裹的凝胶微球。在一些方式中，出口与储存系统液体连通，通过出口输出的油相包裹的凝胶微球直接流动到存储系统进行存储或者进行培养。这里的储存系统和细胞培养系统可以概念互换。培养室包含例如图3中给的锚定结构，每一个锚定结构中包括一个油相包裹的凝胶微球。

在一些方式中，所述的凝胶微球产生装置还包括加热装置，该加热装置让凝胶处于液体的状态。

这里的微流体通路包括多个微流体通道，这些通道相互流体连通。所述的在微流体通路上产生凝胶包裹或者封装的细胞液滴的，或者油相封装或者包裹的凝胶微球结构是现有技术中任意的结构可以实现的。例如，交叉流动结构，其允许连续相和分散相以某个角度θ相交。在一个实施例中，本液滴产生器包括T型、Y型、双T型、K型或V型接合结构。

在储存或者培养室内的油相包裹或者封装的凝胶微球，可以通过一些方式除去油相或者与油相混合的表面活性物质，从而将凝胶微球重新释放在培养液环境中，例如在实施例子4中介绍的方法都可以进行。这样去除这些油相物质或者表面活性试剂后，可以通过细胞溶液的入口、凝胶溶液的入口、或者油相的入口来输入细胞培养液，培养液通过凝胶上的微孔进出凝胶微球来供给细胞营养物质和移除细胞新陈代谢的废物。

当然，这些入口也可以输入一些测试物质，例如测试的药物成分，这些药物成分被输入到培养室内，通过凝胶上的微孔进入到凝胶微球内与单个细胞反应，从而可以考擦细胞的活性，或者一些特异的反应以及实现实时测试和监测细胞在药物作用下的活动。

液滴特性

在一个实施例中，通过本发明产生或使用的液滴的数量、大小(如直径)、体积和乳化类型依赖于后续过程或所需的分析。

在一个实施例中，产生的液滴数目范围为几百到几百万。

在一个实施例中，产生的液滴的大小范围为约5微米到约200微米。在细胞离散的一个实施例中，产生的液滴大小为约10微米到约200微米。

在一个实施例中，产生液滴的体积范围为约0.65飞升至约4纳升

在一个实施例中，产生的液滴具有均一直径。在一个实施例中，产生的液滴具有变异系数小于5％的均一直径。在另一个实施例中，不同直径的液滴可以通过调整加载压力产生。

在一个实施例中，本发明产生的每一个液滴包含不超过一个后续步骤待分析的靶标分子(如细胞、外泌体或某种类型生物分子)。在一个实施例中，要产生的液滴的数目和导入用于产生液滴的样品体积以某种方式调整，那样产生的每一个液滴将会包含不超过一个靶标分子。将靶标分子分布成大量液滴的数字方法理论上遵循泊松分布原理(Majumdar,2015)。然后通过计数包含一个或多个拷贝靶标分子的液滴，实现靶标分子的量化。为了实现绝对量化，每一个液滴应该包含不超过一个靶标分子的拷贝。总的来说，根据泊松分布原理，如果液滴与靶标分子的数目之比大于10，超过99％的液滴将包含不超过靶标分子的一个拷贝，假如比率是约3，那么百分率将会是96％。例如，当使用本发明对外泌体进行数字定量时，使用比期望的数量多10倍的细胞来确保每一个液滴将捕捉不超过一个靶标细胞用于绝对定量。或者，每一个液滴一个靶标分子拷贝不能保证的情况下(如一些液滴可能包含超过一个靶标分子的拷贝)，采用泊松统计学计数靶标分子的绝对数目(Majumdar,2015)。

在一个实施例中，本发明液滴产生装置能实现高动态范围，是由于其产生的液滴大小和数量足够精准定量样品中靶标分子。总的来说，对于采用离散(如液滴)来检测靶标分子的数字分析技术，通过两个主要参数确定检测的动态范围(如利用数字分析技术能精准检测靶标分子的数量范围)：液滴的大小和总数，其受到液滴产生装置的离散能力的限制。据报道典型数字PCR的动态范围是0-10⁶，意味着假如靶标核酸分子的水平超过10⁶拷贝/μL的限制，典型的PCR不能确定样品中靶标核酸分子的绝对计数。从统计学来讲，比靶标分子多3-10倍的液滴具有更高的检测精度，但动态范围更小。另一方面，更大的动态范围可以通过泊松分布实现(Majumdar,2015)。

在一个实施例中，样品中的细胞浓度被调整到一个水平，那样大于90％的液滴包含不超过一个细胞。在一个实施例中，细胞浓度最佳范围主要依赖待测细胞的类型和液滴产生装置的基本尺寸。在一个实施例中，细胞浓度的范围被调节为50000-100000细胞/毫升。

含有细胞的样品

本发明可以应用于来自任何类型生物的含有细胞的任何类型的样品，包括但不限于人类、动物、植物、真菌、微生物如细菌和病毒。

在一个实施例中，本发明所述的细胞可以从生物流体、组织、器官或任何源自生物体的包含细胞的材料上获得。

在一个实施例中，样品是直接从活的生物体上获得的液体样品。在另一个实施例中，样品是直接从非活生物体上获得的液体样品。

在一个实施例中，本发明所述的细胞从生物样品上获得包括但不限于血液、血浆、血清、组织、尿液、唾液、粪便排泄物、涂片制备物和排出物如泪液，痰液，鼻咽粘液，阴道分泌物和阴茎分泌物。

在一个实施例中，这里所述的细胞可以处于任何类型、形式的分化阶段或发育阶段。在一个实施例中，这里所述的细胞包括相同或不同细胞种群。在一个实施例中，细胞包括体细胞和生殖细胞。在一个实施例中，细胞完全是分化的细胞，部分分化细胞或未分化细胞。在一个实施例中，细胞是免疫细胞、干细胞或各种癌细胞。在一个实施例中，细胞是各种细胞培养物，包括来自任何类型生物体的悬浮细胞和贴壁细胞。

在一个实施例中，除了细胞，本发明也可用于类似细胞的分子包括但不限于膜结合细胞器或细胞源囊泡如外泌体。

液滴培养室

在一个实施例中，本发明提供了微流体系统，其包括用于培养液滴的液滴培养室，用于引导流体进入液滴培养室的一个或多个入口，以及用于从液滴培养室去除流体或细胞的一个或多个出口。在一个实施例中，该微流体系统采用如图2所示的形式。

在一个实施例中，本发明提供一个液滴培养室，用于容纳并培养包含单个细胞或单个膜结合细胞器的液滴，从而允许在每一个液滴中同时开展平行的独立反应，并以大规模实时的方式监测每一个液滴中的反应过程。

在一个实施例中，液滴产生步骤后，产生的液滴被加载到液滴培养室用于后续的处理和观察。

在一个实施例中，这里所述的液滴培养室是能容纳液滴的任何模块，包括但不限于由液滴产生器产生的液滴。

在一个实施例中，这里所述的液滴培养室是能容纳液滴的任何模块，进一步使得在液滴中以可控的方式进行平行的反应或测定。

在一个实施例中，本发明的液滴培养室的设计依赖于液滴的总数，液滴的体积、封装在液滴中的细胞类型以及后续步骤中要进行的反应或测定类型。

在一个实施例中，本发明的液滴培养室是一个微流体芯片，在该芯片上面可以加载并培养非常多数量的液滴。

在一个实施例中，本发明的液滴培养室与本发明的液滴产生装置以一种方式接合，即产生的液滴通过毛细作用力被吸入液滴培养室。在一个实施例中，液滴分散在液滴贮藏室里，那样使得液滴以特殊的方式装入液滴贮藏室。在一个实施例中，液滴分散在液滴贮藏室里，那样使得液滴以松散的或随机的方式装入液滴贮藏室。

在一个实施例中，液滴以特殊或预设的方式打散，液滴贮藏室包括一些锚定结构用于锚定液滴到液滴贮藏室的预设位置。在一个实施例中，锚定结构采用柱子形式，如以捕捉单个液滴的方式排列的柱子(图8)。当液滴穿过液滴培养室，它们将在柱子间的空隙被捕捉到。在一个实施例中，锚定结构采用凹槽形式(图9)，以表面张力捕获单个液滴。在一个实施例中，本发明的液滴培养室包括锚定结构或如Abbyad(2010)和Huebner(2008)所述的本领域的等同物，其内容被完整的引用并入本发明内容。

在一个实施例中的液滴被随机封装，液滴贮藏室里没有锚定结构。

在一个实施例中，本发明的液滴培养室包括用于调节液滴培养室温度的温度控制装置。在一个实施例中，温度被控制在液滴内进行特定测定所需的温度。在一个实施例中液滴培养室被用于细胞培养，温度被控制在液滴内培训细胞所需的温度(如37℃)。

在一个实施例中，本发明的液滴培养室包括气体控制装置，用于保持液滴培养室里氧气(O₂)和二氧化碳(CO₂)的水平。在一个实施例中，液滴培养室里氧气(O₂)和二氧化碳(CO₂)的水平分别保持在20％和5％。

在一个实施例中，液滴培养室的外形尺寸是根据实际或期望持有的液滴数量挑选的，并与后续测定或要进行的细胞培养相匹配。在一个实施例中，液滴培养室的高度约为70μm至300μm。总的来说单个细胞分析需要更低的液滴培养室，而球状体培养需要更高的液滴培养室。

在一个实施例中，不会发生化学反应的执行反应或测定的样品和试剂如缓冲液、引物、探针和酶，他们可以预混合并加载，在液滴中与细胞同时封装，那样液滴中单独的平行反应可以在加载到液滴培养室后马上进行。在一个实施例中样品和试剂不会发生化学反应，他们被预混合并作为混合物通过一个入口加载到液滴产生装置。在另一个实施例中样品和一种或多种试剂反应，这些试剂和样品不能作为混合物被导入液滴产生装置但可以通过不同入口加载到液滴产生器，并在液滴产生装置的结合点被离散为液滴。如图1和例2所示，裂解缓冲液、RT-PCR混合物(包括引物、TaqMan探针或用于RT-PCR的其他试剂)和细胞悬浮液被分别提供给液滴产生器以防细胞提早裂解。这些试剂与细胞在封装时被加载到液滴，将用于mRNA检测并通过RT-PCR进行单细胞定量。要用的精准的试剂以及它们的浓度和体积将依赖于要进行的反应或测定的要求。

微流体通道

在一个实施例中，本发明装置包括多个微流体通道用于从装置的各种组件传递流体或传递流体到装置的各种组件。在一个实施例中，本发明的液滴产生装置、液滴培养、出口和/或其他本文所述的组件包括一个或多个微流体通道，其在这些组件内设置流体流动的路径。在一个实施例中，在不同组件(如液滴产生装置和液滴培养室间)之间提供了一个或多个微流体通道，从而将流体从一个组件引导到另一个组件。在一个实施例中，要用的微流体通道的精准类型或配置(如结构、长度、直径、条数和密度)依赖于具有微流体通道的用途以及独立组件想要的流阻。

在一个实施例中，组成微流体通道的材料选自硅、玻璃、塑料和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

在一个实施例中，相同类型或配置的微流体通道被用于各种本文所述的组件。在另一个实施例中，各种类型或配置的微流体通道被用于本文所述的各种组件。

在一个实施例中，本发明的液滴产生装置包括两个用于传递油的微流体通道，以及一个或多个用于传递样品流体和/或试剂的微流体通道。在一个实施例中，实际的配制依赖于选择的乳剂类型和所需的入口数目。

在一个实施例中，微流体通道用于连接液滴产生装置与液滴培养室。在另一个实施例中，微流体通道的直径是液滴直径的1-2倍。一般来说当液滴穿过通道时微流体通道的直径更大有助于稳定液滴，压缩流体在通道内流动也有助于稳定液滴。

在一个实施例中，液滴培养室没有任何微流体通道，并且产生的液滴能自组装以便在室的平坦表面伸展。液滴培养室存在孔的情况下，液滴将在室内伸展，然后通过表面张力导入孔内。

在一个实施例中，本发明的出口包含一个直径高达几百微米的微流体通道。

在一个实施例中，微流体通道是矩形(如具有一个矩形截面)。在另一个实施例中，微流体通道具有圆形截面。

多个液滴中的多重反应和检测系统

如这里所述，本发明提供一个平台用于在所有包含单个细胞的液滴中开展多重反应，并以实时方式进行测量。不同于现有的基于液滴的技术中的终点测量，这个方法对所讨论的细胞活动和细胞特性提供了实时监测和分析。

在一个实施例中，本发明提供了在包含单个细胞的液滴中开展多重反应或测定的装置和方法。通过开展适当的反应或测定，根据本文所述可以检测和分析每一个细胞中发生的活动以及每一个细胞的表型和/或基因特性。

在一个实时例中，离散一个样品(和试剂，如果有的话)为很多单独的液滴，并加载液滴到液滴培养室，本发明的装置和方法可以同时对液滴培养室里的每一个液滴开展一个反应。本发明允许一个液滴中发生的反应独立于其他液滴中的任何其他反应，因此允许在单细胞水平监测和分析细胞中发生的活动或细胞特性。

在一个实施例中，反应是本领域所用的完整的或部分可兼容生物测定。在一个实施例中，要开展的反应的选择取决于靶标生物分子的属性。

在一个实施例中，用于开展反应的试剂在液滴产生时刻与包含细胞的样品混合，从而产生同时包含细胞和试剂的液滴。在另一个实施例中，产生包含细胞的液滴后，用于开展反应的试剂被导入包含细胞的液滴中，并加载到液滴培养室。

在一个实施例中，液滴培养室内的液滴中要进行的反应是一些采用特异信号的反应监测，或以其它指示活动或细胞特性的反应的监测。在一个实施例中，能产生可检测的特异的或以其他指示出要监测的活动或细胞特性的产生信号的基团被包括在反应中。

在一个实施例中，信号产生的基团对生物分子是特异的。在一个实施例中，产生信号的基团包括但不限于化学发光、荧光、显色底物或被转换为可检测产物的其他底物。

在一个实施例中，信号产生基团的类型和他们所需的数量依赖于要监测的活动或细胞特性以及待检测或量化的生物分子。

在一个实施例中，靶标特异组分被包括在反应中以便识别及标记液滴中的靶标生物分子。在一个实施例中，靶标特异组分是分子，通过结构识别、功能识别或两者兼有的方式，其能特异识别靶标生物分子。

在一个实施例中，靶标特异组分被用于识别并标记液滴中生物分子的类型或种类。

在一个实施例中，生物分子是核酸、蛋白或小分子。

在一个实施例中，生物分子是无细胞分子包括但不限于游离DNA(cfDNA)、游离蛋白、外泌体和主体体液中的无细胞循环分子。在一个实施例中，生物分子是附着在细胞表面或包括在细胞内的分子。

在一个实施例中，生物分子是各种类型(如DNA包括cDNA、RNA包括mRNA和rRNA)、形式(如单链、双链、螺旋的、质粒、非编码的或编码的)、长度(如寡核苷酸、基因、染色体和基因组DNA)的核酸。

在一个实施例中，生物分子是蛋白质，是肽或多肽，包括一个完整蛋白分子，降解的蛋白质分子和蛋白质分子的消化片段。在一个实施例中，生物分子包括但不限于抗原、受体和抗体。

在一个实施例中，生物分子是小分子如代谢物。在一个实施例中，代谢物是疾病相关代谢物，能指示疾病的存在或程度或健康状况。在一个实施例中，代谢物是药物相关代谢物如药物副产品，主体身体消耗药物后其水平会改变。

在一个实施例中，生物分子是肿瘤或癌症产生的，或由主体身体应对肿瘤或癌症产生的分子。

在一个实施例中，生物分子一般不能在健康主体中发现。在一个实施例中，生物标记物是通常在健康主体中能发现的分子，但其水平指示特殊疾病或健康状况。

在一个实施例中，靶标特异组分是包含核酸的引物或探针，该核酸包含与靶标核酸互补的序列。在一个实施例中，靶标特异组分是探针、抗体或能特异识别靶标生物分子如蛋白、肽和病毒粒子具有的表位或空间配置的等同物。

在一个实施例中，靶标特异组分是靶标生物分子被加工后(如消化、简化、氧化或其他修饰)的分子。例如酶是靶标生物分子，靶标特异组分是小分子底物，受酶促反应作用被酶催化。

例如生物分子是核酸，可能需要聚合酶链式反应(PCR)扩增并通过互补探针标记，而生物分子是蛋白，可能需要用抗体杂交来识别蛋白的某些表位。

在一个实施例中，要检测和定量核酸的情况下，反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、反转录-PCR(RT-PCR)、实时PCR、反转录、标记、消化、印迹过程、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫测定和酶测定。

例如，ddPCR TM EGFR外显子19缺失筛选试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.)用于筛选EGFR基因外显子19中15的缺失突变。此试剂盒也可检测EGFR外显子19的该区域的其他缺失。EGFR外显子19缺失通常与黑素瘤，结肠直肠癌和肺癌有关。实施例2和3描述了使用本发明内容检测和定量RNA分子。

在一个实施例中，当要检测和量化的是蛋白性质的生物分子(如蛋白、肽、抗体)，反应包括但不限于ELISA为基础的反应，通过靶标特异信号集团标记靶标蛋白，反应通过靶标蛋白催化或抑制。

在一个实施例中，与特异订制的DNA链轭合的抗体，TaqMan^TM探针的免疫染色和实时PCR被用于蛋白检测。最初通过抗体识别靶标蛋白，抗原抗体互作与特异DNA链轭合来标记细胞膜上的蛋白。细胞被单独离散为液滴，液滴中辅以Platinum Multiplex PCR MasterMix(Thermo Fisher,USA)、识别DNA链的TaqMan^TM探针、和用于实时PCR监测的液滴稳定剂。然后通过PCR扩增DNA链，并且用TaqMan^TM探针通过实时PCR监测DNA链。

在一个实施例中，用于检测量化外泌体的反应包括但不限于标记、检测或量化外泌体特异生物分子的反应。在一个实施例中，外泌体的绝对计数可以利用ExoELISA方法从数字上确定。在一个实施例中，可以使用Liu(2018)所述的方法，其内容被完整的参考引用作为本发明内容。

在一个实施例中，用于检测和量化细菌的反应包括但不限于标记、检测或量化对要讨论细菌特异的生物分子如DNA、RNA或抗体的反应。

靶标生物分子的检测系统、数字检测和量化

在一个实施例中，本发明的液滴培养室与用于收集信号的系统或装置(如光学系统)结合，这些信号指示细胞活动、细胞特性或其他，因此允许以平行且实时方式对成千上万的单个细胞进行细胞活动的实时监测或细胞特性的检测。

在一个实施例中，本发明方法包括指示靶标生物分子存在的信号的绝对计数的测量步骤，从而以绝对计数方式对靶标生物分子量化。

在一个实施例中，本发明方法包括对来自大量液滴的特异信号独立测量和量化步骤。在一个实施例中，测量是数字的。数字的意味着信号要么是一，要么是零。例如具有荧光的液滴被称为“阳性”(即液滴包含靶标分子)，不具有荧光的液滴是“阴性”(即液滴中没有靶标分子存在)。

在一个实施例中，本发明检测系统是任何能捕捉、检测、测量和/或量化液滴培养室里每一个液滴上观察到的信号的系统，包括但不限于通过这里所述的信号产生基团产生的信号。

在一个实施例中，整个检测过程中，信号同时被捕捉、检测、测量和/或定量。在一个实施例中，信号在间隔的特定时间被规律性的捕捉、检测、测量和/或定量。在一个实施例中时间间隔是秒、分钟、小时或天。一般，监测细胞培养的扫描速度(如信号检测率)低于(如每天)检测或量化单个细胞中生物分子的扫描速度(如每2分钟检测mRNA分子)。

在一个实施例中，待测的信号是荧光信号，使用的系统或装置能捕获信号信号并测量荧光信号的强度。在一个实施例中，电荷耦合装置(CCD)被用于捕获荧光信号，对储存在室内或在芯片上的液滴产生荧光图像。通过计算荧光液滴的数量及每一个液滴的荧光信号的强度，荧光信号可以被处理和分析。图10显示了通过CCD相机获得液滴的荧光图像。在一个实施例中，测量的荧光信号用专有的图像处理编码处理和分析。在一个实施例中，该专有的图像处理编码能同时处理和解码来自大量靶标(如3000至10000靶标)的荧光信号，并输出每一个细胞的荧光信号。

在一个实施例中，一个光学系统被用于检测大量荧光信号。在一个实施例中，该光学系统包括能测量或收集荧光信号的装置包括但不限于CCD。在一个实施例中，该光学系统包括用于诱导荧光或提供可见光的多个激光或发光二极管(LED)光源，以及用于分离不同波长的波或离子的多个滤波器，从而有选择性的检测特定种类的波或粒子信号。在一个实施例中，光学系统允许自动化改变滤波器，从而使检测更有效。

在一个实施例中，每一个液滴仅一种类型的生物分子被检测和量化。在一个实施例中，每一个液滴有两种或更多类型的生物分子被检测和量化。例如在单个液滴中蛋白、核酸、外泌体和/或其他类型的生物分子一个接一个被检测并量化。

在一个实施例中，每一个液滴中相同类型的两种或更多种生物分子被检测并量化。例如每个液滴两种或更多种核酸(如一个DNA分子和一个RNA分子)被检测且量化。

在一个实施例中，当每个液滴两个或更多类型生物分子要被检测且量化时，首先对每个液滴检测和量化一个类型的生物分子，然后对每个液滴检测和量化另一种类型的生物分子，等等。例如首先对每一个液滴检测和量化一种或多种核酸，然后对每个液滴检测和量化一种或多种肽。

在一个实施例中，一个液滴中检测和量化的生物分子的类型不同于另一个液滴中的检测和量化的生物分子的类型

在一个实施例中，本发明每次运行检测1-5种类型的生物分子。在一个实施例中，本发明每次运行检测6-10种类型的生物分子。在另一个实施例中，本发明每次运行检测11-20种类型的生物分子。

在一个实施例中，本发明每次运行检测1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种类型的生物分子。

在一个实施例中，在全自动情况下，本发明所述的液滴产生装置、液滴培养室和检测系统功能上作为一个整体装置，从而允许细胞离散化、细胞液滴的培养，在这些细胞液滴中进行反应，并一个接一个紧密的进行信号检测。

单细胞培养系统

在一个实施例中，本发明提供用于在单细胞水平独立培养和监测大量细胞的单细胞培养系统。

在一个实施例中，本发明的单细胞培养系统通过离散并封装细胞群进入很多单个凝胶微球来实施。然后该凝胶微球被加载到一个细胞培养室，用于培养和后续的测定或分析。在一个实施例中，每一个凝胶微球包含一个单细胞。在另一个实施例中，每一个凝胶微球包含不超过一个单细胞。

在一个实施例中，超过90％凝胶微球包含一个单细胞。在另一个实施例中，超过95％的凝胶微球包含一个单细胞。

图3是本发明建立凝胶微球培养系统的一个实例示意图，该系统可以被用于在单分子水平大规模实施检测和分析。左图显示了细胞与凝胶溶液的封装过程。细胞悬浮液中的单个细胞和凝胶溶液混合并通过油包水乳剂共同被封装到单个凝胶微球里。

首先，通过固体琼脂糖粉溶解到升高温度的溶液中来制备凝胶溶液。然后调节产生的凝胶溶液的温度，或者凝胶溶液和细胞溶液的流速比例，以便凝胶溶液保持液态但不会太高从而损伤细胞。凝胶溶液与细胞悬浮液混合后，混合物的温度降低可能发生凝胶化。因此将细胞圈在凝胶里并形成凝胶微球。形成微球的过程可以是，先形成为凝胶微球，然后再在外面包裹一层油相，从而让油相流动带动微球运动到储存空间的培养室中，然后进行后续的去油相的处理。当然，也可以是细胞溶液和凝胶溶液混合后，此时可能处于液态的过程，在随后被油相包裹的过程中或者过程后，在被离散化或者分配到细胞培养室之前，包裹在油相内的凝胶溶液和细胞溶液中的凝胶冷却，从而凝胶溶液从液态变化为固态，形成凝胶网状的结构，细胞被包裹在网络中间，网状结构具有微孔，可以与外界进行物质的交换(例如营养物质、测试试剂物质、废物排放等等)，从而可以连续的进行细胞的培养。

所以，在一些方式中，在实际上设计尾流通道的尺寸中，也是让细胞溶液与凝胶接触形成液体的地方与下游与油相距离很短，几乎在形成液滴的0.01秒、0.1秒，0.5秒等等时间内，细胞溶液和凝胶溶液接触后，并不会立即让凝胶冷却，而是在非常短的时间内流达下游的油相接触,在接触油相的过程中或者在后续的运动过程中，或者通过一段S型的混合流道加速包裹在油相的细胞溶液和凝胶溶液混合。包裹在油相的凝胶冷却而形成固态，类似固态的网络状结构，从而被后续出口流出或者与存储腔连通，直接被离散到存储腔里多个培养室里，每一个培养室内存在一个油相包裹的凝胶微球。然后通过处理去油，最后剩下带有微孔的凝胶微球，可以连续对细胞进行培养。

形成的凝胶微球在被包裹在一层油相中，例如让凝胶微球悬浮在油相中，例如图3所示。这个时候，单个的凝胶微球之间都有油相包裹，从而让被包裹的细胞在流动和分配过程中不会相互影响，避免发生交叉反应。另外由于凝胶微球本身对水可以渗透吸收，一些营养物质可以通过凝胶层被吸收进入凝胶内部供给细胞所生长必须的营养物质。

当把含有油相包裹的凝胶微球分配到单个细胞培养室中，例如微流控芯片中有成千上万个细胞锚定结构，每一个细胞锚定结构存储一个凝胶微球，例如图3中的右边部分，然后通过冲洗的方式除去油相或者残留液体，让凝胶微球外面包裹的油相去掉，仅仅剩下凝胶微球在培养室里，这样可以不断的从入口输入营养物质，该营养物质通过凝胶上的微孔(是凝胶本身形成的一些微孔)进入到含有细胞的凝胶内部供给细胞生长。这样就可以在细胞的生长任何过程中，对细胞实现动态、实时的测试，这种测试包括活性、对药物的反应、内部的生活活性的测试。这种测试也是对成千上万个单个细胞活性的测试，可以同时一次性的获得多个测试结果，而且每一个结果对应独立的细胞。

右图显示一些处理过程，包括加载油包水乳剂形式的凝胶微球到培养室，洗涤油以及灌注培养液。凝胶微球被加载并释放到培养室的U型阵列上，从凝胶微球去除油，通过洗涤允许水溶液进入和离开凝胶微球，在培养室里正常的培养条件下通过培养液灌注进行细胞培养。在一个实施例中，U型阵列是锚定结构，其采用凹槽的形式通过如图9所示的表面张力捕获单个液滴。

在一个实施例中，本发明基于凝胶微球的细胞培养系统包括如图2所述的系统。

在一个实施例中，本发明基于凝胶微球的细胞培养系统包括这里所述的培养室。

在一个实施例中，包含细胞的凝胶微球，用于细胞培养的基质或细胞培养或测定所需的其他试剂通过微流控系统的入口被导入细胞培养室。在一个实施例中，通过微流控系统的出口从细胞培养室去除一些流体如用过的含有细胞废液的培养液质，凝胶微球或细胞等，例如图2中的入口和出口。

例4显示了使用本发明在琼脂糖凝胶微球中离散出单个细胞用于长期培养的实施例。

在一个实施例中，水凝胶材料形成水凝胶基质，其阻断细胞的迁移但允许小分子(如营养物、代谢废物)出入细胞自由的扩散。

在一个实施例中，水凝胶材料能形成水凝胶基质来封装要用的单个细胞分子。在一个实施例中，水凝胶材料是具有低凝胶温度的琼脂糖琼脂糖，凝胶温度温度应在37℃以下，以保证凝胶微球在细胞培养条件保持凝胶状态。在一个实施例中水凝胶材料是海藻酸盐，加入钙离子到海藻酸盐溶液中会发生凝胶化。

在一个实施例中，水凝胶基质的孔径大小比封装在那里的细胞的尺寸要小的多，然而又足够大能让营养物和废物通过。在一个实施例中，水凝胶基质的孔径比细胞的尺寸小约100倍。例如，水凝胶基质的孔径是100nm，而细胞的尺寸是10μm。水凝胶基质的孔径可以通过水凝胶溶液的浓度调节。更高浓度的水凝胶将导致水凝胶基质的孔径更小。

在一个实施例中，本发明所用的细胞培养条件和细胞培养所需的培养液，与传统细胞培养的标准细胞培养所用的相似。在一个实施例中，温度以及氧气和二氧化碳的水平被调节到适宜培养所讨论细胞的水平。

在一个实施例中，与细胞培养室相连的入口和出口是由一个或多个泵(如蠕动泵)驱动的，用于驱动流体或凝胶微球在细胞培养室进出。

在一个实施例中，新鲜培养液被泵入细胞培养室，用于滋养细胞培养室内的封装细胞。在一个实施例中，包含废液和未使用过营养物的培养液从细胞培养室通过由泵驱动的出口被去除，为了避免有毒底物在培养系统中积累，从而影响细胞生长。新的培养液通过入口被导入室内。

在一个实施例中，在培养液中以溶解气体的形式提供气体如空气、氧气和二氧化碳给细胞。在一个实施例中，通过直接暴露培养液到气体中，气体被灌输到培养液里。例如当培养液流入一个池子其中池子的顶端孔径充满了空气和5％的二氧化碳，培养液和顶端空间发生了气体交换。然后产生的培养液被供给当前细胞培养系统中的细胞。

在一个实施例中，被导入细胞培养室的细胞培养液、试剂和气体都用适当的过滤器(如220nm孔径)预先过滤来去除细菌或其他不可预测的微生物，避免使其进入细胞培养系统从而污染细胞。在一个实施例中，将灌输了5％CO₂和20％O₂大气的培养液过滤，然后导入细胞培养室。在一个实施例中，细胞在37℃培养。在一个实施例中，细胞用持续灌输5％CO₂/20％O₂的培养液培养。在一个实施例中，培养液每三天更新。

在一个实施例中，用于细胞培养的培养液的体积依赖于多个因素如细胞培养室的大小、培养的细胞类型以及要开展的测定类型。在一个实施例中培养液的体积是100ml。

在一个实施例中，含有细胞的凝胶微球被散布在细胞培养室，那样凝胶微球以特定的方式排列。在一个实施例中，细胞培养室配置了U型阵列以有序排列的方式来持有凝胶微球(图3，右图)。

在一个实施例中，细胞培养室配置着一些锚定结构用来在液滴培养室的预设位置锚定液滴(或凝胶微球微球)。锚定结构可以采用能捕获单个凝胶微球的方式排列(图8)的柱状物形式如柱子，或通过表面张力捕获单个凝胶微球凝胶微球的凹槽(图9)

在一个实施例中，包含细胞的凝胶微球分散在细胞培养室里，使得凝胶微球可以被随机封装。

总的来说，本发明提供了用于单细胞培养和分析的新方法。利用微流体技术的单个细胞的传统研究方法是封装每一个细胞到油包水乳剂里。然而因为包含细胞的含水小分隔室分散在油相中，外层油相的存在的情况下新试剂或新培养液不能提供给小含水分隔室，使得连续细胞培养不可行的。

当需要细胞含量的数字分析或对细胞内靶标分子的绝对量化有兴趣时，本发明是特别有用的。对每一个细胞的靶标分子数字检测和量化时，现有的数字平台仅限于终点检测(如反应结束后检测)和单一类型的反应和检测(即数字PCR反应和数字ELISA反应不能整合到一个平台，使得PCR反应和ELISA反应能在不同液滴中进行)。对于细胞中具有多个拷贝的靶标分子如RNA和蛋白(与通常以单拷贝存在于细胞基因组中的基因或单核苷酸(SNP)多态性相反)，终点检测不能精密量化这些靶标分子。这些现有的平台可以区分靶标分子的类型(如不同种类的mRNA)但不能确定每一种种类靶标分子的确切拷贝数目。因此这些当前数字平台不能实时监测多种生物分子，不能同时检测细胞的表型特性和基因型特性。

在本发明中，利用水凝胶封装单个细胞为凝胶微球，而不是用油包水乳液，细胞培养液可以供给封装的细胞，废液可以通过凝胶微球上的孔从细胞去除，因此允许每个细胞在细胞培养室存活并持续生长。同样的，细胞培养或测定必须的试剂和洗涤缓冲液也可以供给每个细胞，因此允许进行单细胞水平的各种表型和/或基因型特性的实时监测。因为需要不同类型的试剂来检测不同类型的生物分子(如基因型生物标记物如RNA或DNA以及表型生物标记物等)，因此用于添加试剂和洗涤的多个步骤是必要的，从而在相同平台标记和检测这些不同类型的生物分子。因为当前凝胶微球对水溶液是可渗透的，大大简化了测定试剂或洗涤缓冲液为封装细胞的供给和它们从封装细胞中的去除。此外，如本文所述，本发明配备有特定光学系统用于检测来自细胞的各种信号，因此允许同时检测代表不同靶标分子的信号。综合上述优点，本发明允许在单细胞水平的培养细胞，并以更简单更高效的方式实时检测每个细胞中多种靶标分子。

本发明的单细胞培养系统的应用

这里是一些用于离散细胞为液滴或凝胶微球的系统。之前的系统被用于研究细胞表型或基因型特性是通过靶标生物分子的终点测量或取得细胞终点形态学图像，但不能持续的细胞培养和细胞分析。

相反，本发明提供了单细胞培养系统，不仅能制备包含单个细胞的凝胶微球并检测每一个细胞中存在的靶标生物分子，而且允许细胞持续培养并且持续监测细胞发生的活动，以实时方式研究在单细胞水平这些细胞的表型或基因型特性。

例如，在细胞经历各种细胞周期，发展或分化时，为了在特殊细胞类型中确定信使RNA(mRNA)或小RNA(miRNA)的数量，现有系统需要多个步骤来制备从不同时间点获得的细胞样品(如细胞周期/发展/分化阶段)，纯化来自每一个细胞的核酸来获得多个核酸样品，对每个核酸样品进行RT-PCR反应确定mRNA或miRNA的数量。相反，通过持续方式在模拟传统培养系统中培养细胞，在细胞周期、发展或分红的不同阶段mRNA或miRNA的数量可以以实时方式被监测，如同在当前培养系统的细胞生长或分化一样。这个方法对细胞生长或分化过程中研究靶标生物分子的数量的变化是非常有用的，因为它建设了细胞到细胞或批次到批次的变化，所以提供了数量和分析的精准度。本发明的培养系统也简化了过程，节省时间和劳动，减少了样品损失和污染的风险。因此本发明培养系统提供了一种更精准和高效的方式研究细胞活动和细胞特性。

通过允许包含细胞的液滴单独培养，当细胞在培养室生长时，以实时和持续方式研究每个细胞对刺激的应答或应答能力是可能的。如图3和图4所示，琼脂糖被用于制成水凝胶基质，并封装单个细胞分子到凝胶微球中。然后凝胶微球被加载到当前的细胞培养室，用于培养和实时监测。

在一个实施例中，本发明被用于研究在单细胞水平细胞对药物或处理的应答。例如通过加入化疗剂到培养液并在不同时间点测量来自每一个凝胶微球的信号(如荧光探针指示细胞活性)，本发明可以监测凝胶微球内每一个癌细胞对化疗剂的应答能力。图5描述了本发明监测单个细胞对抗癌药物盐酸阿霉素(Dox)应答的实施例。

在一个实施例中，该单细胞培养系统被用于培养细胞、球状体或细胞器的单个分子。球状体，由聚集的细胞组成，该细胞的三维模型模拟活细胞的环境条件。球状体保存着分子信号和表型，使得它们成为药物筛选的理想选择，特别在个性化医疗发展中。另一方面，细胞器是源自一种或几种细胞类型(如祖细胞)的器官特异性细胞类型的集合，并拥有该器官的自然组织结构，因此是代表体内情况的优良模型。

在一个实施例中，该单细胞培养系统被用于制备和培养来自人类组织或体液的患者衍生细胞的单细胞衍生球状体。单细胞衍生球状体对微环境的异质性和化疗剂刺激的应答能力可以以实时方式监测和评估。例6表示了利用本发明从单个人类乳腺癌细胞制备球状体并在凝胶微球装置中培养球状体的实施例。例7描述了利用本发明检测球状体内的微环境的实施例。例8描述了利用本发明监测球状体对药物应答的实施例。

在一个实施例中，该单细胞培养系统用于制备并培养来自人类组织或体液的患者细胞的单细胞衍生类器官。微环境的异质性和单细胞衍生类器官对化疗剂刺激的应答能力可以以实时方式监测和评估。例6-8描述的分析单细胞衍生球状体的过程也可以用于分析单细胞衍生类器官。

应用实例

本发明说明书提供了一些实例来说明本发明内容以各种目的检测或监测单细胞水平细胞活动或分子的用途。以下是实例描述了本发明如何在单细胞水平以实时方式监测各种不同的细胞活动或监测各种不同的细胞特性。然而本领域技术人员将容易理解，提供的实例和描述仅是用于说明目的，而不意味着限制本发明的范围，本发明的范围是由后面的权利要求界定的。

监测细胞内发生的细胞的和生物化学活动

本发明可以用于检测指示单细胞中的活动发生的分子，或以实时方式指示单细胞水平细胞的表型和基因型特性，然后允许在每一个细胞中同时监测这些活动和特性。

在一个实施例中，以定性方式进行检测或监测。

在一个实施例中，以半定量、相对定量或绝对定量方式进行检测或监测。

在一个实施例中，本发明进一步以实时方式测量每个细胞中这些指示分子的数量。这将为随后的深入分析提供有用的数量信息，并对研究剂量应答关系、或预后或根本上基于参考值的诊断都是特别有用的。

在一个实施例中，本发明能检测或监测细胞内的任何活动。在一个实施例中，活动是细胞活动或生物化学活动。在一个实施例中活动发生在生理过程启动或发展过程中的任意点如细胞周期、细胞分化和免疫反应。在一个实施例中，活动是发生在疾病启动或发展过程中的任何点。在一个实施例中，活动是对环境刺激或压力的应答，这些压力可以是内质网(ER)压力，机械压力、缺氧和氧化压力。在一个实施例中，活动是对化学压力包括化疗剂刺激的应答。

检测、测量、监测细胞的表型和基因型特性

在一个实施例中，本发明提供用于在单细胞水平以实时方式检测、测量和监测细胞表型和基因型特性的方法。

在一个实施例中，表型特性是细胞的任何可观察的特征。在一个实施例中，表型特性包括但不限于对化学或环境刺激的应答，分泌蛋白的分布以及细胞膜上生物标记物的分布。

在一个实施例中，基因型特性包括但不限于核酸序列、核酸序列的改变、插入或缺少，其可以是可编辑或不可编辑序列，DNA或RNA。在一个实施例中，基因型特性是基因组大小、特点靶标的拷贝数量、基因组中靶标的绝对或相对位置、或在基因组中与特定序列装置有关的任何信息。

在一个实施例中，本发明提供了用于检测单细胞水平基因改变的方法。例9描述了在细胞培养室芯片检测每一个肿瘤细胞的基因变异。

在一个实施例中，在相同液滴培养室同时检测、测量或监测表型特性和基因型特性。在一个实施例中，表型特性和基因型特性被分开检测、测量或监测，其可以在一个相同的液滴培养室中一个接一个进行。

在一个实施例中，测量细胞的表型特性后，在相同的培养芯片进行单个细胞的基因组异质性审查。例11显示了本发明方法可以随机审查单个细胞的表型和基因型特性，这无疑促进了对细胞功能和功能障碍的潜在的分子机制的理解。

单细胞mRNA和miRNA的检测和量化

在一个实施例中，本发明提供在单细胞水平以实时方式检测和量化总的或特殊信使RNA(mRNA)的方法。

如图1和实例2所述，裂解缓冲液、RT-PCR混合物、引物、TaqMan^TM探针或其他用于RT-PCR的试剂与细胞一起被加载到液滴中，通过RT-PCR用于mRNA检测和单个细胞的量化。裂解缓冲液通过精细的挑选来最小化对RT-PCR的抑制作用，因为在RT-PCR之前将没有洗涤步骤。在一个实施例中，选择IGEPAL CA-630和牛血清白蛋白作为裂解缓冲液，因为它们优于十二烷基硫酸钠和其他基于洗涤剂的裂解缓冲液。在PCR过程中，实时监测单个液滴的荧光信号，通过光学系统来获得按时间先后顺序的荧光图像。这里所述的方法以实时方式监测PCR过程中靶标DNA分子的扩增，而不是像传统的PCR和数字PCR系统仅在PCR过程的终点监测。然后通过图像处理软件分析荧光图像，来计算和安排在PCR过程中单个液滴的荧光信号强度变化的时间函数，以便能够以单个细胞的分辨率检测和量化特定mRNA

在一个实施例中，本发明提供在单细胞水平以实时方式检测和量化总的或特殊信使RNA(miRNA)的方法。这个方法能揭示单细胞水平信使RNA(miRNA)的类型和数量。

在一个利用本发明内容培养细胞实施例中，细胞mRNA和miRNA的数量可以以持续和实时方式确定，并且可以监测整个培养过程中它们的数量变化。

实时监测单细胞水平药物应答

在一个实施例中，本发明提供了在单细胞水平以实时方式监测细胞对化学物质、治疗试剂或外部刺激的细胞应答。

这里要研究的治疗试剂或药物可以是任何性质或类型的治疗分子，无论其打算治疗的疾病类型和阶段如何。

在一个实施例中，根据一些指示药物功效、细胞内生理水平或生物化学活性、细胞活性、被药物靶向或影响的生物分子的水平、药物分子原始形式或代谢形式的水平、药物代谢物或副产物的水平等参数，可以测量出药物反应。本领域技术人员可以选择适当的参数用来测量特定药物分子的药物反应。

例5显示了使用本发明研究肿瘤细胞对抗肿瘤药物细胞应答的实例。例8显示了利用本发明来研究单细胞衍生球状体对抗肿瘤药物的细胞应答的实例。

例10描述了药物反应分析后用本发明研究单个细胞的基因信息的实例。

监测单细胞衍生球状物内的微环境

在一个实施例中，本发明提供了以实时方式监测单细胞衍生球状体内微环境的方法。

在一个实施例中，微环境指存在细胞、膜结合细胞器如外泌体、球状体或类器官中存在的化学影响因子，包括但不限于pH，离子类型和水平，活性氧种类和水平，氧水平，二氧化碳水平，营养物(如矿物质、微生物、氨基酸)水平等。

例7显示了用本发明来检测球状体中缺氧状态的实例。

在一个实施例中，本发明提供了以实时方式监测多种细胞或多细胞组织的微流体细胞培养系统，该系统包括

用于培养细胞的细胞培养室，其包括一些锚定结构，每一个锚定结构用来持有并独立培养不超过密封在凝胶微球中的一个细胞或一个多细胞组织，该凝胶微球包括用于流体进出微粒的孔；

在细胞培养的任意时间导入培养液和其他流体进入细胞培养室的一个或多个入口；

在细胞培养的任意时间从细胞培养室去除流体的一个或多个出口；

用来引导流体在系统内流动的泵；

用来调节系统内温度的温度控制器；

用来在系统内输送流体的多个微流体通道；和

用来以实时方式监测来自每一个细胞或多细胞组织的检测器，信号与细胞或多细胞组织的细胞活性或细胞特性有关。

在该系统的一个实施例中，特性是细胞或多细胞组织的一种或多种表型特征、基因型特征和微环境条件。

在该系统的一个实施例中，微环境条件是pH、氧浓度、营养成分、离子浓度、电势、或压力。在一个实施例中，细胞活性是信号传导活动的一部分。

在该系统的一个实施例中，细胞活性是细胞周期、细胞分化、免疫反应、对环境刺激的反应、对压力的反应或对化学刺激的应答。在一个实施例中，压力是内质网压力、机械压力、缺氧或氧化压力。

在该系统的一个实施例中，信号指示存在与细胞活性或特性有关的靶标分子。在一个实施例中，该靶标分子是核酸、肽、蛋白、酶、小分子或离子。

在该系统的一个实施例中，靶标分子是用信号产生探针标记的，因此有信号产生表示存在靶标分子。

在该系统的一个实施例中，来标记靶标分子的试剂通过一个或多个入口被导入细胞培养室，试剂进入凝胶微球并标记细胞培养室里的细胞或多细胞组织中的靶标分子。

在该系统的一个实施例中，当靶标分子被标记时，信号的检测是持续或间断进行的。在一个实施例中，检测信号，并转换为数值来获得每个细胞或多细胞组织中靶标分子的总数。

在一个实施例中，检测装置包括电荷耦合装置。

在该系统的一个实施例中，多细胞组织是球状体或类器官。

在该系统的一个实施例中，该凝胶微球由水凝胶基质组成。

在该系统的一个实施例中，凝胶微球是通过液滴产生装置产生的，该液滴产生装置包括流动聚焦结构、交叉流动结构、共流动结构、阶梯乳化结构或微通道乳化结构。

在该系统的一个实施例中，凝胶微球的直径范围为10μm至200μm。

在一个实施例中，本发明提供了以实时方式监测多种细胞的细胞活性或特性的方法，该方法包括培养细胞步骤，并用本发明的微流体系统确定所述细胞中分子的绝对数量，该分子与细胞活性或特性有关。

在一个实施例中，本发明提供了以实时方式培养和计数多种细胞或多细胞组织中的靶标分子的方法，该方法包括一些步骤

为微流体细胞培养系统提供封装在凝胶微球中的多种细胞或多细胞组织，每一个微粒包含不超过一个细胞或多细胞组织，微流体细胞培养系统包含细胞培养室，该室包含一些锚定结构，每一个锚定结构持有不超过一个凝胶微球；

持续灌注培养液来培养培养室中的细胞或多细胞组织；

为细胞培养室提供试剂来标记细胞或多细胞组织中的靶标分子；

允许试剂标记靶标分子，产生荧光信号；

从凝胶微球检测荧光信号；并

转换信号为数值来获得每一个细胞或多细胞组织中的靶标分子的总数。

在本方法的一个实施例中，多种细胞以一些球状体或一些类器官的形式存在。在一个实施例中，每一个凝胶微球包含不超过一个细胞、一个球状体或一个类器官。

在本方法的一个实施例中，通过为液滴产生装置提供细胞悬浮液和水凝胶溶液来产生凝胶微球，液滴产生装置包括流动聚焦结构、交叉流动结构、共流动结构、阶梯乳化结构或微通道乳化结构。在一个实施例中，液滴产生装置是微流体装置的一部分。

本方法的一个实施例中，该凝胶微球的直径范围是10μm至200μm。

本方法的一个实施例中，其中步骤(c)，从一个或多个微流体装置的入口提供试剂给细胞培养室，试剂进入凝胶微球，并标记细胞培养室内细胞的靶标分子。

本方法的一个实施例中，当靶标分子被标记时，所述信号的检测可以是持续的或间断的。

本方法的一个实施例中，通过光学系统检测荧光信号。

本方法的一个实施例中，该方法检测1-10种类型的靶标分子。在一个实施例中，靶标分子是核酸、肽、蛋白、酶、小分子或离子。

本方法的一个实施例中，每一个细胞的靶标分子的总数表示在细胞中发生的一个或多个细胞活动，或细胞的一种或多种细胞特性。在一个实施例中，特性是细胞或多细胞组织的一种或多种表型特性、基因型特性和微环境条件。在一个实施例中，微环境条件是pH、氧浓度、营养成分、离子浓度、电势、或压力。在一个实施例中，细胞活动是信号传导活动的一部分。

在一个实施例中，细胞活动是细胞周期、细胞分化、免疫反应、对环境或化学刺激的应答、对压力的应答。在一个实施例中，压力是内质网压力、机械压力、缺氧或氧化压力。

在本申请中，各种出版物被引用。这些出版物的全部公开内容通过引用结合到本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的现有技术。

在本申请中，应注意的是与“包括”、“含有”或“特征在于”同义的过渡性术语“包括”是可兼有的开放性的，不能排除其他未记载因素或方法步骤。

通过参考以下实施例将可以更好的理解本发明。然而本领域技术人员将容易理解，所提供的实例仅在于说明本发明目的，而不意味着限制本发明的范围，本发明的范围有后面的权利要求界定。

实例

例1-液滴产生器和液滴培养室的结构

液滴产生器和液滴培养室的微芯片由聚二甲硅氧烷(PDMS)、硅或塑料(聚碳酸酯、环烯烃共聚物(COC))制成。对于PDMS微芯片的制作，使用SU-8光刻胶(Microchem)在二氧化硅基板上影印成像化形成模具。模具被用于制作PDMS复制品。PDMS复制品与盖玻片粘合利用等离子处理形成PDMS芯片。芯片表面用氟硅酸盐(Aquapel)来获得疏水性。以类似的方式制作硅芯片。将具有图案蚀刻的硅片与具有用阳极焊接技术钻出入口和出口的玻璃片粘结在一起。粘结的硅片被切成单独的芯片。硅片表面用氟硅酸盐(Aquapel)处理来获得疏水性。

例2-实时多重检测和量化单细胞mRNA的表达

用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Thermofisher Scientific,USA)来处理癌细胞以制备分散在PBS(pH 7.4)溶液中的细胞悬浮液。细胞浓度通过手动计数确定并稀释到所需浓度。辅以17％OptiPre密度梯度培养(Sigma-Aldrich,USA)和1％(v/v)Pluronic F-68(LifeTechnologies)形成最终细胞溶液。裂解缓冲液由10mMTris(pH 7.4)、0.25％IGEPAL CA-630(Sigma-Aldrich)和0.1％牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich)组成，它们对后期RT-PCR的抑制作用小于其他以洗涤剂为基础的裂解缓冲液。RT-PCR混合物由1×反应混合物、1×酶混合物(Thermo Fisher,12574030,SuperScript III One-Step^TM)、引物和与辅以液滴稳定剂的一种或至多四种荧光标记TaqMan^TM探针组成。油相是含有5％PFPE-PEG-PFPE的氟化油HFE7500(3M,USA)。细胞悬浮液、裂解缓冲液、RT-PCR混合物和油相被加载到液滴产生器来分凝胶散单个细胞于单独液滴中用于RT-PCR，如图1的左图所示。含有单个细胞的液滴被加载到液滴贮藏室。液滴贮藏室被放置到温度控制板上，与板上配备的光学系统，在特定时间间隙(比如：每两个PCR循环)拍摄图像来捕获PCR过程中液滴的荧光信号。如图1右图所示，板上的温度被程序化设定来完成检测过程。板上的温度被设为37℃15分钟，细胞裂解，从细胞膜包被中释放mRNA，接着50℃30分钟，通过反转录合成mRNA的cDNA，94℃3分钟(Taq酶激活)，94℃30s，54℃30s和65℃30s，29个循环，接着最后一个PCR过程是65℃最后延伸5分钟。除了PCR结束后的荧光扫描，PCR过程也可以通过光学系统每3分钟对芯片进行扫描。如图4所示，通过图像处理软件分析按时间先后的芯片的荧光图像，来分配PCR过程中单个液滴中荧光信号强度的变化。每一个细胞中的特定mRNA的类型和相对数量可以通过相应液滴的荧光信号强度与时间的曲线来确定。

例3-实时多重检测和量化单个外泌体中的miRNA

从体液如血液或尿液提取的外泌体被分散在PBS溶液中((pH 7.4)并稀释到所需的浓度，辅以1％(v/v)Pluronic F-68(Life Technologies)。裂解缓冲液包括10mMTris(pH7.4),0.25％IGEPAL CA-630(Sigma-Aldrich)和0.1％牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich)。RT-PCR混合物由1×反应混合物、1×酶混合物(Thermo Fisher,12574030,SuperScript III One-Step^TM)、引物、、液滴稳定剂以及一种或至多四种荧光标记TaqMan^TM探针组成。油相是含有5％PFPE-PEG-PFPE的氟化油HFE7500(3M,USA)外泌体悬浮液、裂解缓冲液、RT-PCR混合物和油相被加载到液滴产生器来分离单个外泌体于单个液滴中用于RT-PCR。含有单个外泌体的液滴被加载到液滴贮藏室。如例2所述方法进行RT-PCR、光学检测和图像处理。每一个外泌体中的特定miRNA类型和相对数量可以通过相应液滴的荧光信号强度与时间的曲线来确定

在另一个实施例中，TaqMan^TM Advanced miRNAcDNA Synthesis Kit(ThermoFisher,USA)可以用于反转录来合成与信使RNA(mRNA)互补的DNA(cDNA)，并且TaqMan^TMAdvanced miRNA Assay(Thermo Fisher,USA)可以在实时PCR中检测特定序列。

为了单个细胞或外泌体的RNA的绝对计数，使用如图11所示的系统，包括两轮封装：一次用于单个外泌体，另一次用于单个mRNA分子。

如图11上图所示，单个外泌体，与靶标RNA特异的引物轭合的磁珠以及用来裂解外泌体的裂解缓冲液被液滴产生装置封装在一个液滴中。液滴产生采用如图6所示类型。液滴产生后，它们被贮藏在右边的液滴贮藏室。在每一个单个液滴中，单个外泌体被裂解，它们包含的RNA被释放，与磁珠上的靶标特异引物配对。然后从出口收集液滴用于后续分析。然后用溶剂(如氟-1-辛醇)破碎所有收集的液滴，溶解油相获得具有单细胞/外泌体RNA的磁珠的水悬浮液。然后加入洗涤溶液(如PBS)到悬浮液中，涡旋混合液。接着混合液被置于磁性架上。后续RT-PCR反应不需要的组分与洗涤溶液一起被移液去除，而保留引物轭合靶标RNA的磁珠。

如图12所示，来自一个外泌体的mRNA分子在该外泌体裂解后被释放，并与磁珠是的靶标引物轭合。不必要的组分通过洗涤步骤去除。然后生成的样品中含有引物与mRNA轭合的磁珠，该生成的样品被封装入液滴用于mRNA的数字量化。

如图12下图所示，引物轭合mRNA的磁珠与反转录混合物和PCR混合物混合，并加载到集成的液滴微流体系统用于原地反转录和PCR热循环。如图5所示的形式产生液滴，应反转录和PCR是热启动反应，因此mRNA样品和RT-PCR反应混合物能在封装之前预混合。然后通过显微相机数字检测荧光信号(图11下图的液滴贮藏室中的黑色点)，计算来自单个外泌体的RNA靶标的绝对计数。

例4-离散单个细胞到琼脂凝胶微球中来长期培养

用0.25％胰蛋白-EDTA(Thermofisher Scientific,USA)处理癌细胞来制备分散在PBS溶液(pH 7.4)中的细胞悬浮液。细胞浓度通过手动计数确定并稀释到所需的浓度。辅以17％OptiPre密度梯度培养液(Sigma-Aldrich,USA),0.1mg/ml BSA(ThermofisherScientific,USA)and 1％(wt/v)Pluronic F-68(Life Technologies)制成最后的细胞悬浮液。

3％(w/v)的低熔点琼脂溶液(Sigma-Aldrich,USA)在使用前需要先加热到60℃10分钟使得琼脂完全溶解，并且注射过程中装有琼脂溶液的注射器和连接管路被电阻丝套包裹使琼脂糖溶液维持在60℃。

然后，制备的细胞悬浮液、3％(w/v)琼脂糖溶液和含有2％PFPE-PEG-PFPE的氟化油HFE7500(3M,USA)用注射泵注射到液滴产生器，来获得凝胶液滴。例如图3中，中间的通道是输入细胞悬浮液，上面的通道是输入琼脂溶液，侧边通道输入油相，例如2％PFPE-PEG-PFPE的氟化油HFE7500，从而形成凝胶液滴琼脂溶液和细胞溶液被包裹在一个液滴里，悬浮在HFE7500的油相中，如图3所示。

热的琼脂溶液与细胞溶液在产生液滴中混合，混合液的温度迅速冷却使琼脂糖成凝胶化形成固态的凝胶微球。为了避免液滴内的温度过高影响细胞生长，细胞溶液和琼脂糖溶液的流量比应维持在2:1以上，这样就可以当形成液滴的时候，内部的温度不会影响细胞的正常生长。

在细胞培养室进行凝胶和细胞培养的加载和释放，该室可以采用芯片形式，如图3的右图所示。凝胶微球被加载到具有U型阵列来捕获凝胶微球的细胞培养室。首先，用空气去除油相HFE7500，然后用低沸点的氟化油HFE7100(3M,USA)通入培养腔室洗去表面活性剂PFPE-PEG-PFPE和HFE7500残余，接着用空气吹走细胞培养室的洗涤剂HFE7100。由于HFE7100沸点较低(61℃)，空气比较容易将HFE7100吹干净。最后，细胞培养室中注入细胞培养液液(含有细胞所需要的物质的液体培养液，这种培养液是任意合适的培养液，培养液含有任意合适的营养物质或者方便后续测试的检测试剂)以2ml/min的高流速冲洗芯片上的凝胶微球10分钟以防细胞培养室中仍有残余的油相，然后培养液的流速被调整为200μl/min的正常水平，由蠕动泵驱动。整个培养系统保持在37℃，5％CO₂。

本领域的一般技术人员可以想象到，对于不同的细胞培养可以采用任何合适的凝胶物质来包裹单个细胞，例如常用的各种熔点的琼脂，虽然熔点不同，但是只要调整细胞溶液与凝胶溶液的流速、流量或者比利，都可以在封装的时候，不足以让封装的细胞液滴温度升高而让细胞死亡。在一些方式中，凝胶一般通过加热就会成为液态，冷却成为固态，这种固态的外壳上，其实还具有多微小的空隙，例如毛细孔或者微孔，通过这些微孔实现内部液体与外部的交换，例如营养物质、氧气、二氧化碳、一些测试试剂的交换，也实现废气、废液的交换，从而让细胞可以连续的生长，维持其固有的活性。这样就可以在任何时候进行所需要的测试，例如细胞特异性的测试，例如内部反应的测试。让凝胶通过加热就会成为液态的方式具有多种方式，可以让整个液体产生器处于比较高的温度下，该温度不会让细胞死亡，但是可以维持凝胶为液体的状态下，当凝胶和含有细胞的溶液接触的时候，既封装的时候，温度可以降低，从而形成单个细胞的封装。被第一次封装结束后，在进行油相的包裹，形成具有双层包裹的液滴，等对每一个液滴进行分散后，例如加载在微流控的芯片上的锚定结构后，再进行油相的去除，从而仅仅保留凝胶本身包裹的细胞液滴，从而可以实现连续的培养。这与直接油相包裹具有显著的效果，油相包裹一般难于进行细胞的培养，特别是连续的培养并让其细胞长期处于活性的状态，这可能是应为油相包裹后，不让被包裹的细胞与外界进行营养物质的交换，或者废液、废气的交换，从而让细胞只能短暂的存货，不能实现多种不同的测试，有些测试需要长时间、在细胞存活的情况下多次进行。而本发明采用这样的方式进行，让单个细胞长期培养成为可能，可以实现很多细胞的测试，例如对药物的测试等等，可以进行细胞的活性实验。

例5实时监测单个细胞对药物的反应

如例4所述单个的肿瘤细胞(如人类乳腺种类细胞株系(MCF-7))被分离在凝胶微球中。选择抗肿瘤药物盐酸阿霉素(DOX)。

Live

Reagent(Lifetechnologies)用于给细胞核着色来识别细胞。 Cell Imaging Kit(Lifetechnologies)用于量化细胞活性。包含不同浓度的DOX和荧光探针的培养液被导入孵化器芯片。在1、3、6和9小时获取凝胶微球中细胞的明场图像和荧光图像。通过每一个细胞的延时图像分析DOX的荧光强度来量化Dox的摄取。用

Cell Imaging Kit(Lifetechnologies)探针评估不同DOX浓度下每一个细胞的凋亡。

例6-芯片上单细胞衍生球状体构造

球状体保存了分子信号和表型，使得他们是药物筛选理想选择，特别在个性化医疗开发中。人类乳腺癌细胞(MCF-7)如例4所述被离散在凝胶微球中。凝胶微球直径为～200μm。然后含有一个单独细胞的凝胶微球被加载到芯片形式的细胞培养室，并释放培养液。细胞在由蠕动泵驱动的新鲜培养液中培养10-20天。整个培养系统保持在37℃，5％CO₂。每天在相差显微镜下检查细胞的生长。约10天后球状体的直径达到～50μm。

例7-监测单细胞衍生的多细胞肿瘤球体的微环境

用荧光探针检测球状体中的微环境(像缺氧、pH)。在一个实施例中，如例6所述制备和培养单细胞衍生的多细胞肿瘤球体。当球状体大小达到～50μm-～100μm时，包含10μMImage-iT^TM Hypoxia Probe(Thermofisher Scientific,USA)的培养液被导入细胞培养室，并染色1小时。然后在Zeiss 710共聚焦显微镜上获得多细胞肿瘤球体的荧光图像。每一个单细胞衍生球状体的缺氧状态通过球状体图像的荧光强度表示。

例8-检测单细胞衍生的多细胞肿瘤球体对药物的应答

根据例6演示方法培养单细胞衍生多细胞肿瘤球体。当球状体大小达到～50μm-～100μm时，选择抗癌药物盐酸阿霉素(DOX)。

Live Reagent(Lifetechnologies)用于着色细胞核来识别细胞。

Cell Imaging Kit(Lifetechnologies)用于量化细胞活性。包含不同浓度的Dox和荧光探针的培养液被导入培养室芯片。在1、3、6、9、12和24小时捕捉凝胶微球中细胞的明场图像和荧光图像。通过每一个细胞的延时图像分析DOX的荧光强度来量化DOX的摄取。通过用

探针着色的核的荧光图像量化球状体的大小。用

Cell Imaging Kit(Life technologies)探针评估每一个单细胞衍生球状体的凋亡。

例9-实时监测单细胞基因组基因变异

如例4所述分离单个肿瘤细胞(如人乳腺癌细胞株系(MCF-7))到凝胶微球中。加载培养室到温度控制板上，板上配置光学系统，来捕获PCR终点时每一个凝胶微球的荧光信号。细胞裂解缓冲液(0.5％(w/v)十二烷基磺酸锂,10mM EDTA and 4U TE缓冲液中的蛋白酶K)导入芯片形式的细胞培养室。培养室加热至50℃30分钟来释放基因组DNA，消化溶菌产物。然后凝胶微球用含有2％(w/v)吐温20的水冲洗一次，100％酒精冲洗一次，0.02％(w/v)Tween 20的水溶液冲洗5次。为了扩增和检测，包含1×Invitrogen Platinum MultiplexPCR Master混合物(Thermo Fisher Scientific,USA),400nM引物和200nMTaqMan探针的500μLPCRmix溶液被导入培养室，凝胶微球被浸泡在溶液中30分钟来渗透PCR溶液。含有5％PFPE-PEG-PFPE的氟化油HFE7500(3M,USA)被注入培养室，通过油相分离凝胶微球形成一个个单独的PCR反应微腔。为了进行PCR，芯片板的温度被设置为94℃3min(初变性),94℃30s,54℃30s,和65℃30s,40个循环，最后65℃延伸5分钟。在PCR终点，通过光学系统获得培养芯片的荧光图像。每一个细胞的特定基因组DNA可以通过每一个凝胶微球的荧光信号确定。

例10-药物反应测定后单细胞基因信息的后期分析

例3或例6的药物反应测定后，如例9所述方法对每一个细胞进行细胞裂解、PCR和基因组DNA信息检测。每一个细胞的基因信息和药物反应可以与他们在培养芯片中的定位相关联。

例11-表型特征检测后单细胞基因信息的后期分析

检测细胞的表型特性后，可以检测相同细胞培养室内单个细胞的基因组异质性。具有蛋白酶K的裂解缓冲液用于破坏细胞膜，消化溶菌产物释放基因组DNA。释放的基因组DNA仍旧困在凝胶微球中，而裂解缓冲液和被消化的细胞残留物被洗掉来减少抑制PCR的可能性。PCR混合物、引物和TaqMan^TM探针被导入凝胶微球用于PCR和检测。含有5％PFPE-PEG-PFPE的氟化油HFE7500(3M,USA)用来隔离凝胶微球来防止不同凝胶微球之间的干扰，因为PCR热循环过程中凝胶微球被溶解为液相。指示靶标DNA分子扩增的荧光信号以实时方式被监测，来揭示细胞群体中基因组DNA的变异。基因信息和表型特性如每一个细胞的药物反应可以与他们在细胞培养室内的定位相关联。

参考文献:

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Abbyad,Paul,et al."Rails and anchors:guiding and trapping dropletmicroreactors in two dimensions."Lab on a Chip 11.5(2011):813-821.

Huebner,Ansgar,et al."Static microdroplet arrays:a microfluidicdevice for droplet trapping,incubation and release for enzymatic and cell-based assays."Lab on a Chip 9.5(2009):692-698.

Nivedita Majumdar,Thomas Wessel,Jeffrey Marks,‘Digital PCR Modelingfor Maximal Sensitivity,Dynamic Range and Measurement Precision’(2015),PLoSONE 10(3):e0118833.

Claims

1.以实时方式检测多个细胞或多细胞组织的微流体细胞培养系统包括：

a)用于培养细胞的细胞培养室，包括多个锚定结构，每一个锚定结构用于持有并单独培养不超过一个细胞或一个多细胞组织，这些细胞或多细胞组织被封装在凝胶微球中，所述的凝胶微球包括流体进出该凝胶微球凝胶的毛细孔；

b)一个或多个入口，所述的一个或多个入口能够在细胞培养的任何时候引导培养液或其他流体进入所述的细胞培养室；

c)一个或多个出口，所述的一个或多个出口用于在细胞培养的任何时候从细胞培养室去除流体；

d)用于引导流体进入系统的泵装置；

e)用于调节系统内的温度的温度控制装置

f)用于携带流体进入系统的多个微流体通道；和

g)检测装置，用于以实时方式检测来自每一个细胞或多细胞组织的信号，其中所述信号与所述细胞或多细胞组织的细胞活性或特性有关。

2.权利要求1所述的系统中，其中所述特性是细胞或多细胞组织具有的一种或多种表型特征、基因型特征和微环境条件。

3.权利要求2所述的系统中，其中所述微环境条件选自由pH、氧浓度、营养成分、离子浓度、电势和压力组成的群组。

4.任意权利要求1-3所述的系统中，其中所述细胞活性是信号传导的一部分。

5.任意权利要求1-4所述的系统中，其中所述细胞活性是选自由细胞周期、细胞分化、免疫应答、对环境刺激的应答、对应激的应答和对化学的应答。

6.权利要求5所述的系统中，其中所述压力是选自由内质网应激反应、机械力、缺氧和氧化应激组成的群组。

7.任意权利要求1-6所述的系统中，其中所述信号指示靶标分子的存在，其与所述细胞活性或特性有关。

8.权利要求7所述的系统中，其中所述靶标分子是选自由核苷酸、多肽、蛋白、酶、小分子及离子组成的群组。

9.权利要求7或8所述的系统中，其中所述靶标分子用产生信号的探针标记，然后产生指示存在所述靶标分子的信号。

10.权利要求9所述的系统中，其中用于标记所述靶标分子的试剂通过一个或多个入口被导入所述细胞培养室，其中所述试剂进入所述凝胶微球内，并标记细胞培养室内的所述细胞或多细胞组织中的所述靶标分子。

11.权利要求9或10所述的系统中，其中当靶标分子被标记时，可以连续或间歇进行所述信号的检测。

12.任意权利要求7-11所述的系统中，其中所述信号被检测并转换为数值来获得每一个细胞或多细胞组织中的靶标分子的总数。

13.任意权利要求1-12所述的系统中，其中检测装置包括一个电荷耦合装置。

14.任意权利要求1-13所述的系统中，其中所述多细胞组织是球状体或类器官。

15.任意权利要求1-14所述的系统中，其中所述凝胶微球由水凝胶基质组成。

16.任意权利要求1-15所述的系统中，其中所述凝胶微球通过液滴产生装置产生，所述液滴产生装置包括的结构选自由流体聚焦结构、交叉流动结构、共流动结构、阶梯乳液结构和微通道乳化结构组成的群组。

17.任意权利要求1-16所述的系统中，其中所述凝胶微球的直径范围是10μm至200μm。

18.以实时方式监测多个细胞的细胞活性或特性的方法，包括培养细胞，及用任意权利要求1-17所述的微流体系统确定在所述细胞中分子的绝对数量，其中所述分子与所述细胞活性或特性有关。

19.以实时方式培养和计数多个细胞或多细胞组织中靶标分子的方法，包括以下步骤：

a)为微流体细胞培养系统提供多个封装在凝胶微球中的细胞或多细胞组织，其中每一个微粒包括不超过一个细胞或多细胞组织，其中所述微流体细胞培养系统包括一个细胞培养室，所述室包括一些锚定结构，每一个锚定结构用于持有不超过一个凝胶微球；

b)通过连续灌注培养液到细胞培养室来培养细胞或多细胞组织；

c)为细胞培养室提供试剂用于标记细胞或多细胞组织中的靶标分子；

d)允许所述试剂来标记所述靶标分子，产生荧光信号；

e)从所述凝胶微球中检测荧光信号；并

f)转换所述信号为数值来获得每一个细胞或多细胞组织中所述靶标分子的总数。

20.权利要求19所述的方法中，其中所述多个细胞以多个球状体或多个类器官的形式存在。

21.权利要求20所述的方法中，其中每一个所述凝胶微球包括不超过一个细胞、一个球状体或一个类器官。

22.任意权利要求19-21所述的方法中，其中通过为液滴产生装置提供细胞和水凝胶悬浮液，产生所述凝胶微球，其中所述液滴产生装置的结构包括选自由流动聚焦结构、交叉流动结构、共流动结构、阶梯乳化结构和微通道乳化结构组成的群组。

23.权利要求22所述的方法中，其中所述液滴产生装置是微流体装置的一部分。

24.任意权利要求19-23所述的方法中，其中所述凝胶微球的直径范围是10μm至200μm。

25.任意权利要求19-24所述的方法中，其中通过一个或多个微流体装置的入口，步骤(c)所述试剂被提供给所述细胞培养室，其中所述试剂进入所述凝胶微球，并标记细胞培养室内所述细胞的所述靶标分子。

26.任意权利要求19-25所述的方法中，其中当靶标分子被标记时，可以连续或间歇性检测所述信号。

27.任意权利要求19-26所述的方法中，其中通过光学系统检测荧光信号。

28.任意权利要求19-27所述的方法中，其中所述方法能检测1-10个类型的靶标分子。

29.任意权利要求19-28所述的方法中，其中靶标分子是选自由核苷酸、多肽、蛋白、酶、小分子和离子组成的群组。

30.任意权利要求19-29所述的方法中，其中每一个细胞中的靶标分子的总数表示发生在所述细胞中的一个或多个细胞活性或一种或多种所述细胞的特性。

31.在权利要求30所述的方法中，其中所述特性是细胞或多细胞组织的一个或多个表型特征，基因型特征和微环境条件。

32.权利要求31所述的方法中，其中所述微环境条件是选自由pH、氧浓度、营养成分、离子浓度、电势或压力组成的群组。

33.任意权利要求31-32所述的方法中，其中所述细胞活性是信号传导的一部分。

34.任意权利要求31-33所述的方法中，其中所述细胞活性是选自由细胞周期、细胞分化、免疫反应、环境或化学物刺激应答，以及压力应答组成的群组。

35.权利要求34所述的方法中，其中所述压力是选自由内质网应激、机械力、缺氧和氧化压力组成的群组。