CN112300933A - 类器官成型装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提出一种类器官成型装置及方法，所述类器官成型装置包括：针头，所述针头包括内层针头和外层针头，所述内层针头的至少出料口部分被所述外层针头包围；第一泵，所述第一泵连通所述内层针头，能够使用所述第一泵通过所述内层针头泵送细胞悬液；以及第二泵，所述第二泵连通所述外层针头，能够使用所述第二泵通过所述外层针头泵送水凝胶溶液，使得所述细胞悬液能够被所述水凝胶溶液包围且所述细胞悬液形成的球体在所述水凝胶溶液中间隔地排列。通过采用上述技术方案，能够使成型后的类器官尺寸统一，数量确定，便于大规模高通量药物筛选。

Description

类器官成型装置及方法
技术领域
本申请属于生物医疗技术领域，特别涉及一种类器官成型装置及方法。
背景技术
类器官技术应用的领域十分广泛，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制研究、精准医疗以及药物毒性和药效试验等领域。
类器官是一种基于3D体外细胞培养系统建立的模型，该模型与体内来源组织或器官高度相似。这些3D体外培养系统可以复制出已分化组织的复杂空间形态，并且能够表现出细胞与细胞之间、细胞与周围基质之间的相互作用和空间位置形态。类器官包含一种以上与来源器官相同的细胞类型，表现出来源器官所特有的一些功能，并且细胞的组织方式与来源器官相似。
一种类器官的典型制备方法包括以下步骤。
首先要分离出种子细胞，例如肿瘤中的肿瘤干细胞或者是正常组织的多能干细胞。然后将它们培养在一个生物相容性良好的材料上，例如基质胶。并且在培养基中需要添加例如生长因子的诱导剂等，以激活或者抑制参与类器官形成所依赖的特定信号通路，制备不同的类器官需要添加不同的诱导剂。
如图1所示，经过一段时间的培养可以形成类器官球体300(球形细胞团簇)。
但是该制备方法有以下缺陷。
(1)因为细胞是自发组成团簇，形成团簇的细胞初始数量不受控制，所以形成的类器官大小不一致，且位置随机，导致很难进行针对性的分析，或者进行统一、批量化的药物筛选工作。
(2)诱导剂是直接添加在培养基中，为了保持后续时间相应的浓度其起始浓度较高，诱导剂中较高的生长因子浓度对细胞是有毒副作用的。而且每隔一段时间更换培养基的操作会对细胞造成多次高浓度-低浓度-高浓度的冲击，这在细胞培养过程中是非常不利的。
发明内容
本申请旨在提出一种类器官成型装置，其能够将细胞培养为类器官球体，使类器官球体的数量能够控制，并且尺寸统一。
本申请提出一种类器官成型装置，所述类器官成型装置包括：
针头，所述针头包括内层针头和外层针头，所述内层针头的至少出料口部分被所述外层针头包围；
第一泵，所述第一泵连通所述内层针头，能够使用所述第一泵通过所述内层针头泵送细胞悬液；以及
第二泵，所述第二泵连通所述外层针头，能够使用所述第二泵通过所述外层针头泵送水凝胶溶液，使得所述细胞悬液能够被所述水凝胶溶液包围且所述细胞悬液形成的球体在所述水凝胶溶液中间隔地排列。
优选地，所述第一泵为蠕动泵，所述蠕动泵能够以脉冲的方式泵送所述细胞悬液，所述第二泵为注射泵，所述注射泵能够连续地泵送所述水凝胶溶液。
优选地，所述内层针头具有内层针头进料口和内层针头出料管，所述外层针头具有外层针头进料口和外层针头出料管，所述内层针头出料管伸入所述外层针头出料管的上部，使所述外层针头出料管的下部没有所述内层针头出料管。
优选地，所述类器官成型装置还包括光固化灯，所述光固化灯设置于所述针头的周围，所述外层针头由透光的材料制成，所述光固化灯发出的光能够透过所述外层针头照射包裹有所述细胞悬液形成的球体的所述水凝胶溶液。
优选地，所述类器官成型装置还包括光学检测单元，所述光学检测单元能够透过所述水凝胶溶液固化后形成的固体凝胶检测由细胞悬液聚集形成的类器官结构的直径；
或者，所述类器官成型装置还包括光学检测装置、控制器和数据采集卡，所述控制器连接于所述数据采集卡，所述数据采集卡分别连接于所述第一泵、所述第二泵和所述光学检测单元，所述第一泵和所述第二泵连接于所述针头，所述光学检测单元能够透过由所述针头所产生的水凝胶溶液固化后形成的固体凝胶检测由细胞悬液聚集形成的类器官结构的直径。
本申请还提出一种类器官成型方法，所述类器官成型方法包括：
通过内层针头以脉冲的方式间歇地输出细胞悬液，通过外层针头连续地输出水凝胶溶液，使所述水凝胶溶液包围所述细胞悬液，使所述细胞悬液形成球体在所述水凝胶溶液中间隔地排列。
优选地，所述类器官成型方法还包括：使用光学检测单元透过所述水凝胶溶液固化后形成的固体凝胶检测由细胞悬液聚集形成的类器官结构的直径。
优选地，所述水凝胶溶液包括超疏水纳米颗粒，使所述细胞悬液中的细胞不易粘附于所述水凝胶溶液而易于聚集成团。
优选地，所述水凝胶溶液包括类器官诱导剂，所述类器官诱导剂包含一种或多种生长因子。
优选地，所述水凝胶溶液为光固化水凝胶溶液，所述水凝胶被光照射后固化为固体凝胶；或者所述水凝胶溶液为能够与交联剂进行交联固化的水凝胶溶液，所述水凝胶溶液与所述交联剂反应能够由液体变为固体凝胶。
通过采用上述技术方案，能够使成型后的类器官尺寸统一，数量确定，便于大规模高通量药物筛选。
附图说明
图1示出了现有技术的类器官培养的示意图。
图2示出了根据本申请的第一实施方式的类器官成像装置的结构示意图。
图3示出了根据本申请的第一实施方式的类器官成像装置的针头的结构示意图。
图4示出了根据本申请的第一实施方式的类器官培养方法形成的水凝胶的示意图。
图5示出了使用本申请的第一实施方式的类器官培养方法形成的结构体在细胞聚集前的示意图。
图6示出了使用本申请的第一实施方式的类器官培养方法形成的结构体在细胞聚集后的示意图。
图7示出了现有技术和根据本申请的第一实施方式的类器官成像装置在诱导过程中细胞中诱导剂浓度的示意图
图8示出了根据本申请的第二实施方式的类器官成像装置的结构示意图。
图9示出了根据本申请的第二实施方式的类器官成像装置的针头的结构示意图。
附图标记说明
1 控制器
2 数据采集卡
3 第一泵
4 第二泵
5针头 51内层针头 511内层针头进料口 512内层针头出料管 52外层针头 521外层针头进料口 522外层针头出料管
6 光学检测单元
7 培养皿
8 光固化灯
100细胞悬液 200水凝胶 300类器官球体。
具体实施方式
为了更加清楚地阐述本申请的上述目的、特征和优点，在该部分结合附图详细说明本申请的具体实施方式。除了在本部分描述的各个实施方式以外，本申请还能够通过其他不同的方式来实施，在不违背本申请精神的情况下，本领域技术人员可以做相应的改进、变形和替换，因此本申请不受该部分公开的具体实施例的限制。本申请的保护范围应以权利要求为准。
如果没有特别说明，在下面的描述中，浓度均表示质量浓度。
(第一实施方式)
如图2至图7所示，本申请提出一种类器官成型装置，其包括控制器1、数据采集卡2、第一泵3、第二泵4、针头5和光学检测单元6。
如图2和图3所示，控制器1连接于数据采集卡2，数据采集卡2连接于第一泵3、第二泵4和光学检测单元6，第一泵3和第二泵4连接于针头5。
控制器1用来控制类器官成型装置的启动、停止与数据储存。数据采集卡2用于接收控制器1发出的控制信号，并且转发给第一泵3和第二泵4，进而控制第一泵3和第二泵4的启动和停止。光学检测单元6可以实时地检测从内层针头51挤出形成的球体的尺寸，并将检测数据反馈给数据采集卡2进行处理，从而使类器官成型装置可以实现在线检测，便于随时监控实验效果。
第一泵3通过连接管路与内层针头51连通，第一泵3可以是蠕动泵，蠕动泵可以以脉动的方式精准定量地将细胞悬液从内层针头51泵出。
第二泵4通过连接管路与外层针头52连通，第二泵4可以是注射泵，注射泵可以以恒定流速将水凝胶溶液稳定地从外层针头52泵出。
如图3所示，针头5包括内层针头51和外层针头52，外层针头52包围在内层针头51的外侧。内层针头51用于输送细胞悬液，外层针头52用于输送水凝胶溶液。
内层针头51具有内层针头进料口511和内层针头出料管512，内层针头51可以为圆筒状，内层针头进料口511和内层针头出料管512可以位于内层针头51的两端。
外层针头52包围内层针头出料管512，使外层针头52输送的水凝胶溶液可以包围内层针头51输送的细胞悬液。
外层针头52具有外层针头进料口521和外层针头出料管522，外层针头进料口521可以设置有多个，例如外层针头进料口521可以设置有两个，两个外层针头进料口521相对地设置于外层针头52的侧壁。
内层针头51可以使用不锈钢材料制成，外层针头52可以使用高分子材料制成。
本申请还提出一种类器官成型方法。
准备细胞悬液和水凝胶溶液。细胞悬液中的液体是生理盐水或者是磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)；细胞悬液中细胞的浓度可以为(0.1-10)*106个/ml，细胞的种类可以为原代肿瘤细胞、干细胞或成体细胞等。
水凝胶溶液可以为明胶和海藻酸钠的混合溶液，海藻酸钠的质量体积浓度可以为0.5％至5％，明胶的质量体积浓度可以为2％至20％。
水凝胶溶液还包括超疏水纳米颗粒和类器官诱导剂，超疏水纳米颗粒均匀地混合在水凝胶溶液中，超疏水纳米颗粒可以为使用例如氯代三甲基硅烷或者三甲基硅氧烷进行疏水化处理过的二氧化硅颗粒。
使用超疏水纳米颗粒可以明显减少细胞粘附于水凝胶，从而促进细胞聚集成团，缩短诱导时间，提高诱导成功率。超疏水纳米颗粒的浓度可以为1mg/ml至20mg/ml。可以理解，不同类型的细胞的粘附特性不同，超疏水纳米颗粒的浓度可以根据不同类型的细胞相应的粘附特性进行调整。
类器官诱导剂可以包含一种或多种生长因子。以肠类器官的培养为例，可以在DMEM/F12培养基中添加浓度例如为50ng/ml的EGF，浓度例如为500ng/ml的R-spondin-1、浓度例如为50ng/ml的Wnt-3A、浓度例如为100ng/ml的Noggin、质量体积浓度例如为1％的glutamax和浓度例如为1μmol/ml的N-乙酰半胱氨酸。
细胞悬液加载于第一泵3，将细胞悬液混合均匀后吸入例如3ml的一次性注射器内，然后将该一次性注射器安置于第一泵3(蠕动泵)，蠕动泵可以脉动节拍式的挤压软管将细胞悬液输出，脉动的频率为0.5Hz至10Hz。
水凝胶溶液加载于第二泵4，将水凝胶溶液吸入例如10ml的一次性注射器内，然后将该一次性注射器安置于第二泵4(注射泵)，注射泵的流量可以设置为10ml/h至60ml/h。
类器官成型装置接通电源并开机工作。
类器官成型装置进行初始化，控制器1发出启动指令开始进行类器官的成型。第一泵3和第二泵4工作，通过第一泵3由内层针头51中输出的是细胞悬液，通过第二泵4由外层针头52输出的是水凝胶溶液。外层针头52输送的水凝胶溶液可以包围细胞悬液，并且细胞悬液在水凝胶溶液中间隔地排列。
针头5的下方设置有培养皿7，培养皿7用于接收从针头5输出的细胞悬液和水凝胶溶液。培养皿7中具有例如氯化钙的交联剂，通过针头5挤出的水凝胶溶液与培养皿7中的交联剂进行交联固化可以由液体变为固体凝胶状态。
通过光学检测单元6实时检测细胞悬液的球体大小是否一致，检测通过后，在培养过程中通过光学检测单元6检测类器官聚集、形成与成熟。类器官成熟稳定之后添加抗肿瘤药物，并通过光学检测单元6实时检测类器官直径的变化，若抗肿瘤药物有效则肿瘤类器官的体积保持稳定或收缩变小。反之，若肿瘤类器官的体积变大，则说明抗肿瘤药物是无效的。
如图4至图6所示，经过一段时间的培养与诱导可以形成大小均匀、状态稳定的类器官球体300，类器官球体300的整体尺寸统一均匀，排布规律。
图4示出了类器官培养形成的水凝胶。图5示出了类器官培养的结构体在细胞聚集前的状态。水凝胶200包围细胞悬液100，并且细胞悬液100在水凝胶200当中间隔地排列。
图6示出类器官培养的结构体在细胞聚集后的状态，细胞在水凝胶200中聚集形成了类器官球体300。
如图7所示，在直角坐标系中，横坐标表示时间，纵坐标表示细胞中的类器官诱导剂的浓度。其中实线表示使用本申请的方法获得的时间浓度曲线，虚线表示使用现有技术的典型方法获得的时间浓度曲线。
可以看出，使用现有技术的典型方法，类器官诱导剂直接添加在培养皿中，为了在一段时间内保持类器官诱导剂的浓度，类器官诱导剂的起始浓度较高。并且每隔一段时间，例如两天会更换培养皿中的液体，使类器官诱导剂的浓度突然升高，这可能对细胞造成多次高浓度的冲击，高浓度的类器官诱导剂对细胞有毒副作用。而本方法生长因子是在水凝胶之内缓慢释放的，释放过程均匀而柔和，不会因为类器官诱导剂的浓度过高而对细胞造成伤害。
(第二实施方式)
在第二实施方式的类器官成型装置中，与第一实施方式的类器官成型装置相同或相似的部件使用相同的附图标记，并且不再赘述。
如图8和图9所示，本申请提出一种类器官成型装置，其包括控制器1、数据采集卡2、第一泵3、第二泵4、针头5、光学检测单元6和光固化灯8，光固化灯8设置于针头5周围，光固化灯8能够发出使针头5形成的水凝胶溶液固化的光。
外层针头52可以由透光的材料制成，例如玻璃，使光固化灯8发出的光能够照射到外层针头52内部的溶液。
本申请还提出一种类器官成型方法。
准备细胞悬液和水凝胶溶液。细胞悬液中的液体包括生理盐水或者是磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)；细胞悬液中细胞的浓度可以为(0.1-10)*106个/ml，细胞的种类可以为原代肿瘤细胞、干细胞或成体细胞等。
水凝胶溶液可以为甲基丙烯酸化明胶(GelMA胶)，甲基丙烯酸化明胶的质量体积浓度为3％至20％。该水凝胶溶液为光固化水凝胶，经过波长为405nm的蓝光照射可以固化，由液体变为固体凝胶状态。
水凝胶溶液还包括超疏水纳米颗粒和类器官诱导剂，超疏水纳米颗粒均匀地混合在水凝胶溶液中，超疏水纳米颗粒可以为使用例如氯代三甲基硅烷或者三甲基硅氧烷进行疏水化处理过的二氧化硅颗粒。
超疏水纳米颗粒可以明显减少细胞粘附于水凝胶，从而促进细胞聚集成团，缩短诱导时间，提高诱导成功率。超疏水纳米颗粒的浓度可以为1mg/ml至20mg/ml。可以理解，不同类型的细胞的粘附特性不同，超疏水纳米颗粒的浓度可以根据不同类型的细胞相应的粘附特性进行调整。
类器官诱导剂可以包含一种或多种生长因子。以肠类器官的培养为例，可以在DMEM/F12培养基中添加浓度例如为50ng/ml的EGF，浓度例如为500ng/ml的R-spondin-1、浓度例如为50ng/ml的Wnt-3A、浓度例如为100ng/ml的Noggin、质量体积浓度例如为1％的glutamax和质量体积浓度例如为1μmol/ml的N-乙酰半胱氨酸。
细胞悬液加载于第一泵3，将细胞悬液混合均匀后吸入例如3ml的一次性注射器内，然后将该一次性注射器安置于第一泵3(蠕动泵)，蠕动泵可以脉动节拍式的挤压软管将细胞悬液输出，脉动的频率为0.5Hz至10Hz。
水凝胶溶液加载于第二泵4，将水凝胶溶液吸入例如10ml的一次性注射器内，然后将该一次性注射器安置于第二泵4(注射泵)，注射泵的流量可以设置为10ml/h至60ml/h。
类器官成型装置接通电源并开机工作。
类器官成型装置进行初始化，控制器1发出启动指令开始进行类器官的成型。第一泵3和第二泵4工作，通过第一泵3由内层针头51中输出的是细胞悬液，通过第二泵4由外层针头52输出的是水凝胶溶液。外层针头52输送的水凝胶溶液可以包围细胞悬液，并且细胞悬液在水凝胶溶液中间隔地排列。
光固化灯8照射针头5，使针头5输送的水凝胶溶液可以由液体变为固体凝胶状态并排出。
参照图9，外层针头出料管522可以为圆筒状，圆筒状的内层针头出料管512伸入外层针头出料管522的上部，外层针头出料管522的下部没有内层针头出料管512。一个或多个光固化灯8可以照射外层针头出料管522的下部，即外层针头出料管522的没有内层针头出料管512的部分，这样，可以在水凝胶溶液包裹细胞悬液之后使水凝胶溶液变为固体凝胶状态。
通过光学检测单元6实时检测细胞悬液的球体大小是否一致，检测通过后，在培养过程中通过光学检测单元6检测类器官聚集、形成与成熟。类器官成熟稳定之后添加抗肿瘤药物，并通过光学检测单元6实时检测类器官直径的变化，若抗肿瘤药物有效则肿瘤类器官的体积保持稳定或收缩变小。反之，若肿瘤类器官的体积变大，则说明抗肿瘤药物是无效的。
虽使用上述实施方式对本申请进行了详细说明，但对于本领域技术人员来说，本申请显然并不限定于在本说明书中说明的实施方式。本申请能够在不脱离由权利要求书所确定的本申请的主旨以及范围的前提下加以修改并作为变更实施方式加以实施。因此，本说明书中的记载以示例说明为目的，对于本申请并不具有任何限制性的含义。

Claims (10)

1.一种类器官成型装置，其特征在于，所述类器官成型装置包括：
针头(5)，所述针头(5)包括内层针头(51)和外层针头(52)，所述内层针头(51)的至少出料口部分被所述外层针头(52)包围；
第一泵(3)，所述第一泵(3)连通所述内层针头(51)，能够使用所述第一泵(3)通过所述内层针头(51)泵送细胞悬液；以及
第二泵(4)，所述第二泵(4)连通所述外层针头(52)，能够使用所述第二泵(4)通过所述外层针头(52)泵送水凝胶溶液，使得所述细胞悬液能够被所述水凝胶溶液包围且所述细胞悬液形成的球体在所述水凝胶溶液中间隔地排列。
2.根据权利要求1所述的类器官成型装置，其特征在于，所述第一泵(3)为蠕动泵，所述蠕动泵能够以脉冲的方式泵送所述细胞悬液，所述第二泵(4)为注射泵，所述注射泵能够连续地泵送所述水凝胶溶液。
3.根据权利要求1所述的类器官成型装置，其特征在于，所述内层针头(51)具有内层针头进料口(511)和内层针头出料管(512)，所述外层针头(52)具有外层针头进料口(521)和外层针头出料管(522)，所述内层针头出料管(512)伸入所述外层针头出料管(522)的上部，使所述外层针头出料管(522)的下部没有所述内层针头出料管(512)。
4.根据权利要求1所述的类器官成型装置，其特征在于，所述类器官成型装置还包括光固化灯(8)，所述光固化灯(8)设置于所述针头(5)的周围，所述外层针头(52)由透光的材料制成，所述光固化灯(8)发出的光能够透过所述外层针头(52)照射包裹有所述细胞悬液形成的球体的所述水凝胶溶液。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的类器官成型装置，其特征在于，所述类器官成型装置还包括光学检测单元(6)，所述光学检测单元(6)能够透过所述水凝胶溶液固化后形成的固体凝胶检测由细胞悬液聚集形成的类器官结构的直径；
或者，所述类器官成型装置还包括光学检测装置(6)、控制器(1)和数据采集卡(2)，所述控制器(1)连接于所述数据采集卡(2)，所述数据采集卡(2)分别连接于所述第一泵(3)、所述第二泵(4)和所述光学检测单元(6)，所述第一泵(3)和所述第二泵(4)连接于所述针头(5)，所述光学检测单元(6)能够透过由所述针头(5)所产生的水凝胶溶液固化后形成的固体凝胶检测由细胞悬液聚集形成的类器官结构的直径。
6.一种类器官成型方法，其特征在于，所述类器官成型方法包括：
通过内层针头(51)以脉冲的方式间歇地输出细胞悬液，通过外层针头(52)连续地输出水凝胶溶液，使所述水凝胶溶液包围所述细胞悬液，使所述细胞悬液形成球体在所述水凝胶溶液中间隔地排列。
7.根据权利要求6所述的类器官成型方法，其特征在于，所述类器官成型方法还包括：使用光学检测单元(6)透过所述水凝胶溶液固化后形成的固体凝胶检测由细胞悬液聚集形成的类器官结构的直径。
8.根据权利要求6所述的类器官成型方法，其特征在于，所述水凝胶溶液包括超疏水纳米颗粒，使所述细胞悬液中的细胞不易粘附于所述水凝胶溶液而易于聚集成团。
9.根据权利要求6所述的类器官成型方法，其特征在于，所述水凝胶溶液包括类器官诱导剂，所述类器官诱导剂包含一种或多种生长因子。
10.根据权利要求6所述的类器官成型方法，其特征在于，所述水凝胶溶液为光固化水凝胶溶液，所述水凝胶被光照射后固化为固体凝胶；或者所述水凝胶溶液为能够与交联剂进行交联固化的水凝胶溶液，所述水凝胶溶液与所述交联剂反应能够由液体变为固体凝胶。
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