WO2020262469A1 - ゼラチン短繊維、その製造方法、それを含む細胞凝集体、細胞凝集体の製造方法及び作製キット - Google Patents

ゼラチン短繊維、その製造方法、それを含む細胞凝集体、細胞凝集体の製造方法及び作製キット Download PDF

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WO2020262469A1
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WO
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gelatin
cells
short fibers
cell
fibers
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PCT/JP2020/024851
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Inventor
田畑泰彦
島田直樹
中村耕一郎
延谷公昭
Original Assignee
日本毛織株式会社
田畑泰彦
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres

Definitions

  • the present invention is a gelatin short fiber that can be used as a scaffold material for cell culture and can form cell aggregates together with cells, a method for producing the same, cell aggregates containing the same, a method for producing cell aggregates, and a preparation kit. Regarding.
  • a three-dimensional scaffolding material When performing three-dimensional cell culture such as cell aggregate culture, a three-dimensional scaffolding material is generally used, and in order to allow cells to enter the scaffold, cells move by adhering cells to the scaffold surface.
  • the cells are infiltrated into the inside of the scaffold by proliferation or proliferation, or the cells dispersed in the medium are forcibly sent into the scaffold by pressurization or suction.
  • pressurization or suction In either case, it was difficult to evenly disperse the cells inside the scaffold.
  • Patent Document 1 describes that cell aggregates are obtained by culturing cells together with fibers having a diameter of 10 to 100 ⁇ m and a length of 0.5 to 5 mm.
  • Patent Documents 2 and 3 describe that a cell aggregate is produced using a short fiber scaffold material having an average length of 10 to 500 ⁇ m and an average diameter of 200 nm to 4 ⁇ m and having a polymer brush formed on the surface. Has been done.
  • the present invention has good cell aggregate forming property when producing cell aggregates by co-culturing with cells, and cells of cell aggregates obtained by long-term culture.
  • gelatin short fibers capable of enhancing activity, a method for producing the same, cell aggregates containing the same, a method for producing cell aggregates, and a production kit.
  • the present invention is a gelatin short fiber containing gelatin as a main component, and the average fiber diameter when dispersed in water is 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, and the average fiber length is 50 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less. It relates to gelatin short fibers, which are characterized by being used to form aggregates.
  • the present invention is also the method for producing short gelatin fibers, wherein a spinning liquid containing gelatin is extruded into the air from a nozzle discharge port, is located behind the nozzle discharge port, and is not the nozzle discharge port. A pressure fluid is injected forward from a fluid injection port in a contact state, the extruded spinning liquid is associated with the pressure fluid to form fibers, and the fiber-formed fibers are accumulated to form a non-woven fabric, and the gelatin length is obtained.
  • the present invention relates to a method for producing gelatin short fibers, which comprises obtaining gelatin short fibers by cutting a fibrous nonwoven fabric.
  • the present invention is also the above-mentioned method for producing gelatin short fibers, in which a spinning liquid containing gelatin is extruded into the air from a nozzle discharge port, passed through a heated spinning cylinder, and dry-spun to obtain a gelatin filament yarn.
  • the present invention relates to a method for producing gelatin short fibers, which comprises obtaining gelatin short fibers by cutting.
  • the present invention also relates to a cell aggregate in which the gelatin short fibers and cells are aggregated, and the gelatin short fibers do not protrude on the surface of the cell aggregate.
  • the present invention is also characterized in that by culturing the gelatin short fibers and cells in a medium, the cells and gelatin fibers aggregate to form cell aggregates in which the gelatin short fibers do not protrude to the surface.
  • the present invention relates to a method for producing a cell aggregate.
  • the present invention also relates to a kit for producing a cell aggregate, which comprises the above-mentioned gelatin short fibers, cells and medium, and is used for forming a cell aggregate in which cells and gelatin short fibers are aggregated.
  • the present invention provides gelatin short fibers that have good cell aggregate forming properties when co-cultured with cells to produce cell aggregates and can improve the cell activity of the cell aggregates obtained by long-term culture. Can be provided. Further, according to the method for producing gelatin short fibers of the present invention, gelatin short fibers can be obtained hygienically and efficiently without contamination or the like. In addition, the present invention can provide cell aggregates having good formability and high cell activity. Further, according to the method for producing cell aggregates or the preparation kit of the present invention, cell aggregates can be satisfactorily formed, and cell aggregates having high cell activity can be obtained even after long-term culture.
  • FIG. 1 is an image (10 times) of an aqueous dispersion of gelatin short fibers obtained in one example of the present invention observed with an inverted microscope.
  • (A) to (d) of FIG. 2 are images (4 times) obtained by observing the aggregated state of cells and gelatin short fibers with an inverted microscope in Example A1.
  • FIG. 3 is a three-dimensional image of the cell aggregate obtained in Example 1.
  • (A) to (d) of FIG. 4 are images (4 times) of the aggregated state of cells observed with an inverted microscope in Comparative Example A1.
  • (A) to (d) of FIG. 5 are images (4 times) of the aggregated state of cells and gelatin short fibers observed with an inverted microscope in Comparative Example A2.
  • FIG. 6 is a schematic explanatory view of a gelatin long fiber nonwoven fabric manufacturing apparatus used in one embodiment of the present invention.
  • 7 (a) and 7 (b) are schematic explanatory views of the filament manufacturing apparatus used in one or more embodiments of the present invention.
  • the gelatin short fibers of one or more embodiments of the present invention contain gelatin as a main component.
  • the main component means that gelatin is contained in an amount of 90% by mass or more.
  • the gelatin short fiber of one or more embodiments of the present invention may contain 90% by mass or more of gelatin and 10% by mass or less of other components, and may contain 95% by mass or more of gelatin and 5% by mass or less of other components. It may be composed of substantially 100% by mass of gelatin. Since the gelatin short fibers of the present invention contain gelatin as a main component, which is highly safe and has excellent bioabsorbability, cell aggregates (three-dimensional cell aggregates) formed using the gelatin short fibers can be used in living organisms.
  • the gelatin short fiber of the present invention contains gelatin having high hydrophilicity as a main component, dispersibility in a medium and affinity with cells are required without forming a polymer brush having hydrophilicity on the surface. Is high, and it is easy to form cell aggregates by co-culturing with cells in the medium.
  • biocompatible polymers may be other biocompatible polymers, cross-linking agents, drugs, plasticizers, other additives and the like, if necessary.
  • the other biocompatible polymer is not particularly limited, but a biocompatible polymer having adhesiveness to a living body such as a cell can be preferably used.
  • the biocompatible polymer is not particularly limited, and for example, a natural polymer or a synthetic polymer can be used. Examples of natural polymers include proteins and polysaccharides. Examples of the protein include collagen, fibronectin, fibrinogen, laminin, fibrin and the like.
  • polysaccharide for example, natural polymers such as chitosan, calcium alginate, gellan gum, agarose, guar gum, xanthan gum, carrageenan, pectin, locust bean gum, tamarind gum, and daiyutan gum may be used, and natural heights such as carboxymethyl cellulose may be used. Derivatives of the molecule may be used. Examples of the synthetic polymer include polyethylene glycol and the like. As the other biocompatible polymers described above, one type may be used, or two or more types may be used.
  • the type and site of the animal from which collagen, which is the raw material of the gelatin, is derived are not particularly limited.
  • Collagen may be derived from, for example, vertebrates or fish.
  • collagen derived from various organs and tissues such as dermis, ligaments, tendons, bones and cartilage can be appropriately used.
  • the method for preparing gelatin from collagen is not particularly limited, and examples thereof include acid treatment, alkali treatment, and enzyme treatment.
  • the molecular weight of the gelatin is not particularly limited, and those having various molecular weights can be appropriately selected and used.
  • the gelatin short fiber may be composed of one kind of gelatin or may contain two or more kinds of gelatin.
  • the gelatin has an appropriate flexibility and hardness, and from the viewpoint of having a high effect of forming a cell aggregate, the jelly strength is preferably 100 g or more and 400 g or less, and more preferably 150 g or more and 360 g or less. In the present invention, the jelly strength is measured according to JIS K 6503.
  • the gelatin may be a commercially available product.
  • the gelatin short fibers have an average fiber diameter of 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less when dispersed in water, and an average fiber length of 50 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less.
  • the gelatin short fibers have cell adhesiveness and contain gelatin which can be a hydrogel as a main component, and the average fiber diameter and the average fiber length are within the above-mentioned ranges, so that the gelatin short fibers are contained in the medium together with the cells.
  • gelatin short fibers When cultured in, cells are likely to adhere to the surface of gelatin short fibers that are uniformly dispersed and swollen in the medium, and gelatin short fibers are arranged between the cells. Therefore, cell aggregates in which cells and gelatin fibers are aggregated are easily formed, nutrients and oxygen are easily supplied to the cells, and large-sized cell aggregates having high cell activity even after long-term culture can be obtained. it can.
  • the gelatin short fibers When the gelatin short fibers have an average fiber diameter of 5 ⁇ m or more when dispersed in water, the gelatin short fibers are easily arranged between cells, and the cells or gelatin short fibers are suppressed from being densely packed. It is easy to supply nutrients and oxygen to cells.
  • the average fiber diameter of the gelatin short fibers when dispersed in water is preferably 10 ⁇ m or more, and more preferably 15 ⁇ m or more. Further, when the gelatin short fibers have an average fiber diameter of 400 ⁇ m or less when dispersed in water, it is possible to suppress the uneven distribution of cells in the cell aggregate.
  • the average fiber diameter of the gelatin short fibers when dispersed in water is preferably 200 ⁇ m or less, more preferably 150 ⁇ m or less, further preferably 90 ⁇ m or less, and particularly preferably 60 ⁇ m or less. preferable.
  • the average fiber diameter of the gelatin short fibers when dispersed in water may be within the range of any combination of the above-mentioned lower limit value and upper limit value, and is, for example, 15 ⁇ m or more and 90 ⁇ m or less. It is preferably 15 ⁇ m or more and 60 ⁇ m or less.
  • the standard deviation of the gelatin short fibers is preferably 0.6D or less, more preferably 0.5D or less, and 0.4D. It is more preferably less than or equal to, even more preferably 0.3D or less, and particularly preferably 0.2D or less.
  • the average fiber length of the gelatin short fibers when dispersed in water is preferably 80 ⁇ m or more, more preferably 100 ⁇ m or more, further preferably 120 ⁇ m or more, and particularly preferably 150 ⁇ m or more. preferable.
  • the average fiber length of the gelatin short fibers when dispersed in water is 400 ⁇ m or less, the gelatin short fibers are easily dispersed in the medium, and the gelatin short fibers are not entangled and aggregate with cells. Since it is easy, fiber aggregates having high cell activity can be obtained even when cultured for a long period of time.
  • the average fiber length of the gelatin short fibers when dispersed in water is preferably 380 ⁇ m or less, more preferably 360 ⁇ m or less, further preferably 330 ⁇ m or less, and particularly preferably 300 m or less. preferable.
  • the average fiber length of the gelatin short fibers when dispersed in water may be within the range of any combination of the above-mentioned lower limit value and upper limit value, for example, 120 ⁇ m or more and 330 ⁇ m or less. It is preferably 150 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less.
  • the standard deviation of the gelatin short fibers is preferably 0.6 L or less, more preferably 0.5 L or less, and 0.4 L or less. Is more preferable.
  • the gelatin short fibers are not particularly limited, but the aspect ratio represented by the average fiber length / average fiber diameter when dispersed in water is preferably 3 or more, and more preferably 4 or more. The above is more preferable. When the aspect ratio is within the above-mentioned range, the effect of promoting cell aggregate formation by gelatin short fibers can be improved, and the cell activity can be further enhanced.
  • the upper limit of the aspect ratio is not particularly limited, and may be, for example, 40 or less, or 20 or less.
  • the aspect ratio is not particularly limited, and specifically, it may be within the range of any combination of the above-mentioned lower limit value and upper limit value, and is preferably 3 or more and 40 or less, for example, 4 or more and 40 or less. It is more preferably 5 or more and 40 or less, and particularly preferably 5 or more and 20 or less.
  • the average fiber diameter and the average fiber length when the gelatin short fibers are dispersed in water can be measured as follows. 5 g of gelatin short fibers were dispersed in 100 mL of distilled water, and the aqueous dispersion (suspension) after being left for 3 minutes or more was observed and photographed with an inverted microscope, and 400 fibers arbitrarily selected from the photographed photographs were photographed. The fiber diameter and the fiber length are measured, and the average of the fiber diameter and the fiber length of 400 fibers is calculated, respectively, and used as the average fiber diameter and the average fiber length.
  • the average fiber diameter and the average fiber length can be measured in the same manner as above, except that the distilled water is 20 mL per 1 g of the gelatin short fibers. ..
  • the number of fibers in the aqueous dispersion of gelatin short fibers is less than 400, the fiber diameters and fiber lengths of all the fibers in the aqueous dispersion are measured, and the average of the fiber diameters and fiber lengths is calculated respectively. do it. Unless otherwise specified in the present specification, it means that various operations are performed at room temperature (15 to 25 ° C.).
  • the gelatin short fibers are preferably crosslinked from the viewpoint of enhancing water resistance, easily maintaining the morphology in co-culture with cells in a medium, and effectively forming cell aggregates.
  • the cross-linking may be a chemical cross-linking using a compound such as a cross-linking agent, and from the viewpoint of biosafety, a cross-linking using a cross-linking agent having biosafety or a cross-linking without using a cross-linking agent is preferable.
  • the cross-linking without using a cross-linking agent include thermal cross-linking, electron beam cross-linking, radiation cross-linking such as ⁇ -ray, ultraviolet cross-linking, and the like.
  • it is a thermal dehydration crosslink.
  • the thermal dehydration crosslinking may be carried out, for example, at 100 ° C. or higher and 160 ° C. or lower for 24 hours or longer and 96 hours or shorter. Further, the thermal dehydration crosslinking may be performed under a vacuum of 1 kPa or less, for example.
  • the gelatin short fibers are not particularly limited, but can be obtained by cutting a gelatin long fiber non-woven fabric, or filamentous fibers or fiber bundles formed by wet spinning or dry spinning.
  • the gelatin long-fiber non-woven fabric dispenses a spinning liquid containing gelatin from a nozzle discharge port. Extruded, located behind the nozzle discharge port, injects pressure fluid forward from the fluid injection port in a non-contact state with the nozzle discharge port, and the extruded spinning liquid is accompanied by the pressure fluid to dry type. It is preferable to prepare the non-woven fabric of gelatin long fibers by directly fiberizing them with and accumulating the obtained gelatin long fibers. Since the pressure fluid injection port is arranged rearward independently of the nozzle discharge port and in a non-contact state, the spinning liquid is not mixed. Therefore, it is possible to prevent contamination from being mixed in the gelatin long fiber non-woven fabric.
  • gelatin alone or, if necessary, gelatin and other biocompatible polymers that can be used as the above-mentioned other components are dissolved in water to prepare a spinning solution.
  • the dissolution temperature water temperature
  • the dissolution temperature is preferably 20 ° C. or higher and 90 ° C. or lower, and more preferably 40 ° C. or higher and 90 ° C. or lower.
  • gelatin may be dissolved in water and then filtered to remove foreign substances and dust. Further, if necessary, the dissolved air may be removed by vacuum defoaming or vacuum defoaming thereafter. From the viewpoint of efficiently removing gas (air bubbles), the degree of vacuum during decompression defoaming is preferably 5 kPa or more and 30 kPa or less.
  • gelatin Since gelatin is water-soluble, it can be spun in an aqueous solution as a spinning solution, and the safety to the living body is improved.
  • water for example, pure water, distilled water, ultrapure water or the like can be appropriately used.
  • a spinning solution can be prepared by dissolving it in water at the same time as gelatin.
  • the temperature of the spinning solution containing gelatin is preferably 20 ° C. or higher and 90 ° C. or lower, and more preferably 40 ° C. or higher and 90 ° C. or lower. Within the above range, gelatin can maintain a stable sol state.
  • the gelatin concentration of the gelatin aqueous solution is preferably 30% by mass or more and 55% by mass or less when the gelatin aqueous solution is 100% by mass. A more preferable concentration is 32% by mass or more and 50% by mass or less. At the above concentration, a stable sol state can be maintained.
  • the viscosity of the gelatin aqueous solution is preferably 500 mPa ⁇ s or more and 3000 mPa ⁇ s or less. Stable spinning can be achieved if the viscosity of the gelatin aqueous solution is within the above range.
  • the spinning liquid containing gelatin is discharged from the nozzle of the spinning machine, a pressure fluid is supplied from the periphery of the nozzle, and the discharged gelatin aqueous solution is associated with the pressure fluid to form fibers, and the obtained gelatin filaments are accumulated.
  • a pressure fluid is supplied from the periphery of the nozzle, and the discharged gelatin aqueous solution is associated with the pressure fluid to form fibers, and the obtained gelatin filaments are accumulated.
  • the temperature of the pressure fluid is preferably 20 ° C. or higher and 120 ° C. or lower, and more preferably 80 ° C. or higher and 120 ° C. or lower. Although it depends on the flow velocity of the pressure fluid and the temperature of the ambient atmosphere, stable spinning can be achieved within the above temperature range.
  • Air is preferably used as the pressure fluid, and the pressure is preferably 0.1 MPa or more and 1 MPa or less. Within the above range, the spinning liquid extruded into the air from the nozzle discharge port can be blown off to form fibers.
  • the fibers In the gelatin long fiber non-woven fabric, when the fibers are accumulated (deposited) after spinning, the fibers are laminated in a state of containing water, so that they are welded or entwined with each other and integrated.
  • the density of the non-woven fabric can be easily changed by changing the collection distance when the fibers are deposited.
  • the fiber length of the gelatin long fiber may be several meters to several thousand meters.
  • the average fiber diameter of the gelatin long fibers when swollen with water is preferably 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, more preferably 10 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, and 15 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less. Is more preferable.
  • the nozzle diameter (inner diameter) and the like By appropriately adjusting the nozzle diameter (inner diameter) and the like, a gelatin long-fiber non-woven fabric having a desired average fiber diameter can be obtained.
  • the gelatin long fiber non-woven fabric is preferably crosslinked.
  • the cross-linking may be a chemical cross-linking using a compound such as a cross-linking agent, but from the viewpoint of biosafety, a cross-linking using a cross-linking agent having biosafety or a cross-linking without using a cross-linking agent is preferable.
  • Examples of cross-linking without using a cross-linking agent include thermal cross-linking, electron beam cross-linking, radiation cross-linking such as ⁇ -rays, and ultraviolet cross-linking.
  • thermal crosslinking is preferable, and thermal dehydration crosslinking is more preferable.
  • the thermal dehydration crosslinking may be carried out, for example, at 100 ° C. or higher and 160 ° C. or lower for 24 hours or longer and 96 hours or shorter. Further, the thermal dehydration crosslinking may be performed under a vacuum of 1 kPa or less, for example.
  • the gelatin long fiber non-woven fabric may be dried before being crosslinked. The drying may be air drying at room temperature or vacuum freeze drying.
  • the gelatin long fiber non-woven fabric is cut to obtain gelatin short fibers. From the viewpoint of simple operation, it is preferable to cut in water. Further, from the viewpoint of improving the cutting efficiency, the gelatin long fiber non-woven fabric is cut into a predetermined size such as 5 to 10 mm square, and then the cut gelatin long fiber non-woven fabric is further cut (crushed) in water using a mixer. ), It is preferable to obtain gelatin short fibers.
  • the obtained gelatin short fibers may contain branched gelatin short fibers having two or more fibers at intersections, but it is preferable that the individual fibers have a shape separated from each other.
  • As the water for example, pure water, distilled water, ultrapure water or the like can be used.
  • the mixer is not particularly limited as long as it does not damage the fibers and can shorten the length of the fibers.
  • the pulverization is not particularly limited, but in the case of an ultra-high-speed rotary mixer such as a P-11 Messer mill manufactured by Fritsch, for example, the pulverization can be performed for 5 seconds or more and 10 minutes or less under the condition of a rotation speed of 2000 rpm or more and 14000 rpm or less.
  • FIG. 6 is a schematic explanatory view of the nonwoven fabric manufacturing apparatus used in one embodiment of the present invention.
  • the spinning liquid 2 containing gelatin contained in the heating tank 1 is pushed out into the air from the nozzle discharge port 3.
  • a predetermined pressure is applied to the heating tank 1 by the compressor 4.
  • Reference numeral 12 is a heat insulating container.
  • the pressure fluid 7 is injected forward from the fluid injection port 5 which is located behind the nozzle discharge port 3 and is not in contact with the nozzle discharge port 3.
  • a pressure fluid (for example, compressed air) is supplied to the fluid injection port 5 from the compressor 6.
  • the distance between the fluid injection port 5 and the nozzle discharge port 3 is preferably 5 to 30 mm.
  • the extruded spinning liquid is accompanied by the pressure fluid 7 to become gelatin long fibers 8, and is deposited on the take-up roll 11 to become gelatin long fibers non-woven fabric 9.
  • the deposited long fibers contain water or are not completely solidified, the fibers in contact with each other at at least a part of the fiber intersections are welded to each other.
  • long fibers may be collected and deposited with a net or the like to form a gelatin long fiber non-woven fabric.
  • the gelatin short fibers extrude a spinning liquid containing gelatin into the air from a nozzle discharge port, pass through a heated spinning cylinder for dry spinning, and cut the obtained gelatin filament yarn. You can also get it.
  • a spinning solution containing gelatin As the spinning liquid, the same one as that used for producing the gelatin long fiber non-woven fabric can be used. Simply put, for example, gelatin alone or, if desired, gelatin and other biocompatible polymers that can be used as the other components described above are dissolved in water and then defoamed under reduced pressure to remove the dissolved air. This makes it possible to obtain a spinning solution. After being dissolved, foreign matter and dust may be removed by filtration.
  • the melting temperature is preferably 40 ° C. or higher and 90 ° C. or lower.
  • the degree of vacuum at the time of defoaming under reduced pressure is preferably 5 kPa or more and 30 kPa or less.
  • the spinning liquid containing gelatin is extruded into the air from the nozzle discharge port of the spinning machine, passed through a heated spinning cylinder, and dry-spun. It is preferable that the temperature of the heated spinning cylinder is maintained at 120 ° C. or higher and 180 ° C. or lower, and the residence time of the extruded product in the heated spinning cylinder is 5 seconds or longer. As a result, water is rapidly removed from the extruded material, and threads are formed.
  • the heated spinning cylinder is not particularly limited, but for example, a spinning cylinder having a length of 2 m in which a heater is wound around a stainless steel pipe having an inner diameter of 200 mm can be used.
  • the heat spinning cylinder 24 may be divided into a plurality of compartments, and temperature control may be performed in each compartment.
  • the heated spinning cylinder is preferably oriented in the vertical direction. Then, at the position where the heated spinning cylinder is exited, the gelatin hollow fiber is a hollow fiber, and by cutting here, the obtained gelatin filament becomes a hollow fiber.
  • the reason why it becomes hollow at the position where it comes out of the heat spinning cylinder is considered to be that water is rapidly removed in the heating spinning cylinder. By winding the yarn without cutting it, it is possible to obtain a flat yarn having a flat hollow and a flat cross section.
  • the average fiber diameter when swollen with water is preferably 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, more preferably 10 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, and more preferably 15 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less.
  • a gelatin filament having a desired average fiber diameter can be obtained by appropriately adjusting the nozzle diameter (inner diameter) and the like.
  • the fiber diameter is an average value of a major axis and a minor axis in each fiber.
  • the gelatin filament is preferably crosslinked.
  • Crosslinking can be performed in the same manner as described for the method for producing a gelatin long fiber non-woven fabric. From the viewpoint of easily obtaining the desired crosslinking effect, thermal crosslinking is preferable, and thermal dehydration crosslinking is more preferable.
  • the thermal dehydration crosslinking may be carried out, for example, at 100 ° C. or higher and 160 ° C. or lower for 24 hours or longer and 96 hours or shorter. Further, the thermal dehydration crosslinking may be performed under a vacuum of, for example, 10 kPa or less.
  • the gelatin filament may be dried before cross-linking. The drying may be air drying at room temperature or vacuum freeze drying.
  • the gelatin filament is cut to obtain gelatin short fibers. From the viewpoint of simple operation, it is preferable to cut in water. Further, from the viewpoint of increasing the cutting efficiency, the gelatin filament is cut so that the fiber length is, for example, 5 to 10 mm, and then further cut (crushed) in water using a mixer to obtain gelatin short fibers. It is preferable to obtain it.
  • the water for example, pure water, distilled water, ultrapure water or the like can be used.
  • the mixer is not particularly limited as long as it does not damage the fibers and can shorten the length of the fibers.
  • the pulverization is not particularly limited, but in the case of an ultra-high-speed rotary mixer such as a P-11 Messer mill manufactured by Fritsch, for example, the pulverization can be performed for 5 seconds or more and 10 minutes or less under the condition of a rotation speed of 2000 rpm or more and 14000 rpm or less.
  • FIG. 7 (a) and 7 (b) are schematic explanatory views of the filament manufacturing apparatus 20 used in one or more embodiments of the present invention.
  • the gelatin-containing spinning solution 22 contained in the syringe 21 is pushed out into the air from the nozzle 23.
  • 0.1 MPa of pressurized air can be sent from the end of the syringe 21 to push out the spinning liquid 22 from the nosol 23.
  • the nozzle 23 may have a normal round cross section.
  • a heat spinning cylinder 24 is directly connected under the nozzle 23.
  • the heat spinning cylinder 24 is composed of four compartments of 24a-24d, and the temperature can be controlled in each compartment. As shown in FIG.
  • a flat yarn is obtained by passing the gelatin filament 25 through the guide roll 26 and winding it on the winding machine 27.
  • a hollow fiber having a predetermined length can be obtained by cutting the gelatin filament 25 that drops by its own weight at the lower part of the heated spinning cylinder 24.
  • the gelatin short fibers may be sterilized by ethylene oxide gas sterilization, steam sterilization, electron beam irradiation, or irradiation with ⁇ -rays or the like.
  • gelatin short fibers do not protrude on the surface of the cell aggregate means that the gelatin short fibers are present inside the three-dimensional massive cell aggregate, that is, the surface of the cell aggregate is a cell. It means that it is covered.
  • gelatin short fibers having cell adhesion and capable of becoming a hydrogel as a main component, and gelatin short fibers having an average fiber diameter and an average fiber length within the above-mentioned ranges are co-cultured with cells in a medium. Then, the cells easily adhere to the surface of the gelatin short fibers that are uniformly dispersed and swollen in the medium, and the gelatin short fibers are arranged between the cells, so that the cells and the gelatin short fibers are aggregated and the gelatin short fibers are formed. It is easy to form cell aggregates that do not protrude on the surface of cell aggregates.
  • FIG. 3 shows a three-dimensional image of the cell aggregate of one example of the present invention.
  • the white part is a cell and the black part is a gelatin short fiber.
  • cells and gelatin short fibers aggregate to form a three-dimensional massive cell aggregate in which the gelatin short fibers do not protrude on the surface of the cell aggregates, and gelatin short fibers are formed between the cells. It is arranged and the cells are coated with gelatin short fibers.
  • the gelatin short fibers may be coated with a cell adhesion factor, a cell inducer, a substance that nourishes or energizes cells, or the like. Thereby, the formation rate of cell aggregates can be increased.
  • the cell adhesion factor is not particularly limited, and examples thereof include fibronectin and the like.
  • the substance that gives nutrition and energy to the cells is not particularly limited, and examples thereof include ATP and pyruvic acid.
  • the gelatin short fibers may be immersed in a solution containing a physiologically active substance such as a cell inducer or a growth factor to contain these components. In the process of forming fiber aggregates, these physiologically active substances are gradually released from gelatin short fibers, so that even large cell aggregates can be uniformly differentiated.
  • the size of the cell aggregate can be determined according to the type of cell, the use of the cell aggregate, etc., but for example, from the viewpoint of easy functioning at the transplanted site, the average diameter is, for example, 200 ⁇ m or more. Is preferable, and it is more preferably 400 ⁇ m or more.
  • the average diameter of the cell aggregate means the average of the major axis and the minor axis of the cell aggregate, and the major axis of the cell aggregate is within a straight line connecting arbitrary two points on the outer circumference of the cell aggregate.
  • the longest straight line that is, the length of the major axis
  • the minor axis of the cell aggregate is the shortest straight line, that is, the shortest straight line that connects arbitrary two points on the outer circumference of the cell aggregate and is orthogonal to the major axis. It means the length of the shaft.
  • the cell may be an animal cell, and its origin is not particularly limited.
  • the animal may be a human or a non-human animal. Examples of animals other than humans include primates such as monkeys and chimpanzees, rodents such as mice, rats and hamsters, and ungulates such as cows, sheep, goats and pigs.
  • the cells include individual cells, cell lines, cells obtained by culturing such as primary culture, and the like. The cells are not particularly limited, and examples thereof include somatic cells, stem cells, progenitor cells, germ cells and the like.
  • Somatic cells include somatic cells that make up the living body and cancer cells derived from somatic cells.
  • the somatic cells constituting the living body are not particularly limited, and are, for example, fibroblasts, muscle cells, endothelial cells, osteoblasts, endothelial cells, bladder cells, lung cells, osteoblasts, nerve cells, hepatocytes, and chondrocytes. , Epithelial cells, mesenteric cells and the like.
  • the cancer cells are not particularly limited, and examples thereof include breast cancer cells, renal cancer cells, prostate cancer cells, lung cancer cells, liver cancer cells, cervical cancer cells, esophageal epithelial cancer, pancreatic cancer, colon cancer, and bladder cancer.
  • Stem cells are cells that have the potential to differentiate into various specialized cell types.
  • the stem cells are not particularly limited, and are, for example, embryonic stem cells (ES cells), embryonic cancer tumor cells (EC), embryonic germ stem cells (EG), artificial pluripotent stem cells (iPS cells), adult stem cells, and scutellum.
  • ES cells embryonic stem cells
  • EC embryonic cancer tumor cells
  • EG embryonic germ stem cells
  • iPS cells artificial pluripotent stem cells
  • adult stem cells and scutellum.
  • Spore-derived stem cells reproductive ridge-derived stem cells, malformation-derived stem cells, oncostatin-independent stem cells (OISC), bone marrow-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, sheep water-derived mesenchymal stem cells, skin-derived mesenchymal stem cells Examples thereof include stem cells and bone membrane-derived mesenchymal stem cells.
  • Progenitor cells are cells that can develop from the stem cells and differentiate into the final differentiated cells that make up the living body.
  • germ cells examples include sperm, sperm cells, eggs, and egg cells.
  • one type may be used alone, or two or more types may be used in combination depending on the purpose and the like.
  • the medium is not particularly limited, and a medium containing components necessary for cell survival and proliferation can be appropriately used depending on the type of cells.
  • the medium may contain serum, antibiotics, growth factors and the like.
  • serum for example, bovine serum, fetal bovine serum, horse serum, human serum and the like can be appropriately used.
  • antibiotic penicillin, streptomycin, gentamicin, amphotericin, ampicillin, minocycline, kanamycin and the like can be appropriately used.
  • As the growth factor a cell proliferation factor, a differentiation inducing factor, a cell adhesion factor and the like can be appropriately used.
  • the cell seeding density (cell seeding amount / medium volume) is not particularly limited, but is preferably 1,000 cells / mL or more and 100,000 cells / mL or less, preferably 2,000. It is more preferably cell / mL or more and 50,000 cells / mL or less, and further preferably 4,000 cells / mL or more and 25,000 cells / mL or less.
  • the seeding amount of the cells is within the above-mentioned range, the cells obtained by co-culturing with the gelatin short fibers and the cell aggregates in which the gelatin short fibers are aggregated can be effectively formed, and the obtained cells can be effectively formed.
  • the cell activity of aggregates can be increased.
  • the concentration of gelatin short fibers is not particularly limited, but is preferably 0.01 mg / mL or more and 1 mg / mL or less, preferably 0.02 mg / mL. It is more preferably 0.5 mg / mL or more, and further preferably 0.04 mg / mL or more and 0.25 mg / mL or less.
  • concentration of gelatin short fibers is within the above range, the dispersibility of gelatin short fibers in the medium is high, and the cells obtained by co-culturing with the cells and the cells of the cell aggregate in which the gelatin short fibers are aggregated The activity can be increased.
  • amount ratio of seeding rate and gelatin short fibers of the cells is not particularly limited, for example, 1,000 cells / mg or 1x10 6 cells It is preferably 10,000 cells / mg or more, more preferably 8x10 5 cells / mg or less, and further preferably 20,000 cells / mg or more and 6x10 5 cells / mg or less.
  • the ratio of the seeded amount of cells to the addition amount of gelatin short fibers is within the above range, cell aggregates in which cells and gelatin short fibers are aggregated can be effectively formed, and the cells of the obtained cell aggregates can be effectively formed. The activity can be increased.
  • Culturing may be performed under low adhesive conditions capable of forming cell aggregates.
  • the culture medium has an adhesion-preventing surface and has a thin bottom. It prevents cells from adhering to the culture substrate and easily forms cell aggregates in which cells and gelatin short fibers aggregate.
  • a culture substrate such as a cell culture vessel using polystyrene or polytetrafluoroethylene (also referred to as Teflon (registered trademark)) may be used, and a cell culture vessel or the like whose surface is coated with agar, agarose, polyvinyl alcohol or the like may be used.
  • a culture substrate may be used.
  • As the cell culture vessel a dish, plate, tube, flask or the like having a thin bottom such as a U bottom (also referred to as a round bottom) or a V bottom can be used.
  • the co-culture of cells and gelatin short fibers may be carried out, for example, at 27 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, or 31 ° C. or higher and 37 ° C. or lower.
  • Carbon dioxide may be in the range of 2% or more and 10% or less.
  • the culturing time may be appropriately determined according to the cell type, the number of cells, etc. so as to form cell aggregates. For example, the culturing may be continued for 1 to 8 days, or continuously for 2 to 7 days. It may be carried out continuously for 3 to 6 days.
  • the culture may be carried out in a stationary state or in a fluid state. As the culture in a fluid state, suspension culture may be performed in which the culture is carried out with stirring or shaking. The medium may be changed every 2-3 days.
  • the above-mentioned kit containing gelatin short fibers, cells and medium can be used as a kit for producing cell aggregates, and specifically, it is used to form cell aggregates in which cells and gelatin short fibers are aggregated. Can be done.
  • the preparation kit may include a culture substrate such as a cell culture container.
  • the cell aggregate can be used for cell therapy such as growth, repair or regeneration of human or non-human animal tissue, for example.
  • the tissue is not particularly limited, and examples thereof include connective tissues such as bone, cartilage, tendon, half moon, muscle and fat.
  • the cell aggregate contains gelatin short fibers, so that the strength is increased, and therefore the handleability when used for cell therapy is improved. Further, the cell aggregate contains gelatin short fibers, so that the strength is increased, and therefore, the cell aggregate has excellent morphological retention.
  • the cell aggregate can be injected into a target place by injection, a catheter, or the like and fixed. The rate can also improve.
  • the ratio of the number of cells to the mass of fibers is 10,000 cells / mg from the viewpoint that the cell aggregate exhibits high cell activity with a large size and a small number of cells.
  • more preferably 1x10 6 is cells / mg or less, more preferably 20,000 cells / mg or 6x10 5 cells / mg or less.
  • the cell aggregate By containing gelatin short fibers, the cell aggregate can prevent cell damage due to freezing, and specifically, can suppress a decrease in cell activity due to freezing.
  • the gelatin short fibers can be suitably used as a scaffolding material for cell aggregates as described above, and for example, microcarriers for mass suspension culture, additives for bio 3D printers, and heterologous cells during three-dimensional culture. It can be used as an adhesion aid, a polar selective culture scaffolding material for cell sheets, a cell activity improving material, a cell injection scaffolding material, a seeding efficiency improving additive, a frozen cell protective material at the time of cell freezing, and the like.
  • the present invention is not particularly limited, but preferably includes the following aspects.
  • the average fiber diameter when dispersed in water is 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, and the average fiber length is 50 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less.
  • the average fiber diameter is D
  • the standard deviation is 0.6D or less
  • the average fiber length is L
  • the standard deviation is 0.6L or less.
  • gelatin short fiber according to any one of [1] to [3], wherein the gelatin short fiber has an aspect ratio represented by an average fiber length / average fiber diameter of 3 or more when dispersed in water. fiber.
  • Extrude the spinning liquid containing gelatin into the air from the nozzle discharge port A pressure fluid is injected forward from a fluid injection port located behind the nozzle discharge port and in a non-contact state with the nozzle discharge port.
  • the extruded spinning liquid is associated with the pressure fluid to form fibers, and the fiber-formed fibers are accumulated to form a gelatin long-fiber non-woven fabric.
  • a method for producing gelatin short fibers which comprises cutting the gelatin long fiber non-woven fabric to obtain gelatin short fibers.
  • a spinning liquid containing gelatin is extruded into the air from the nozzle discharge port, passed through a heated spinning cylinder, and dry-spun.
  • a method for producing gelatin short fibers which comprises cutting the obtained gelatin filament yarn to obtain gelatin short fibers.
  • the cells and gelatin fibers aggregate, and the gelatin short fibers do not protrude to the surface.
  • the measurement method is as follows. ⁇ Average fiber diameter and average fiber length> An inverted microscope (Olympus "CKX53") equipped with a digital microscope (Zeiss, product name "AxioCAM ERc5") disperses 5 g of gelatin short fibers in 100 mL of distilled water and leaves it for 3 minutes. It was observed and photographed at 4 times). Next, using computer software (PhotoRuler, The Genus Incybe), the fiber diameter and fiber length of 400 fibers arbitrarily selected from the photographed photographs were measured, and the average of the fiber diameters and fiber lengths of the 400 fibers was measured. Was calculated and used as the average fiber diameter and the average fiber length.
  • the temperature of the spinning liquid is 60 ° C
  • the nozzle diameter (inner diameter) is 250 ⁇ m
  • the discharge pressure is 0.2 MPa
  • the nozzle height is 5 mm
  • the air pressure is 0.375 MPa
  • the air temperature is 100 ° C
  • the distance between the fluid injection port 5 and the nozzle discharge port 3 is.
  • the gelatin long fiber non-woven fabric 9 was wound up by the winding roller 11 with a collection distance of 5 mm and a collection distance of 50 cm. Then, the gelatin long fiber non-woven fabric was air-dried at room temperature (20 ° C.) overnight, and then heat-crosslinked under vacuum (1 kPa) at 140 ° C. for 48 hours.
  • the obtained gelatin long-fiber non-woven fabric is cut into 5 to 10 mm squares, 100 mL of distilled water is added to 5 g of the cut gelatin long-fiber non-woven fabric, and an ultra-high-speed rotary mixer (“P-11 Messer Mill” manufactured by Fritsch) is used.
  • the gelatin long fiber non-woven fabric was cut by stirring at 2000 rpm for 3 minutes to obtain an aqueous dispersion of gelatin short fibers.
  • the average fiber diameter and the average fiber length of the gelatin short fibers were measured using the obtained aqueous dispersion (suspension) of the gelatin short fibers, and the average fiber diameter was 40 ⁇ m (standard deviation 5 ⁇ m).
  • FIG. 1 shows a photograph taken by observing an aqueous dispersion of gelatin short fibers with an inverted microscope (Olympus "CKX53", 10x) equipped with a digital microscope (Zeiss, product name "AxioCAM ERc5"). Indicated. Next, the fiber suspension was frozen in a freezer at ⁇ 30 ° C. and then vacuum freeze-dried to obtain dried gelatin short fibers.
  • Example A1 ⁇ Preparation of cell aggregates> 200 ⁇ L of medium (MEM ⁇ , 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin) and 0.02 mg (dry mass) of gelatin short fibers obtained in Example 1 were added to each well of the U-bottom 96-well plate. Then, mouse fibroblasts MC3T3-E1 cells were seeded therein so that the number of cells per well was 2 ⁇ 10 4 cells. The 96-well plate was then incubated at 37 ° C. with 5% CO 2 . As the U-bottom 96-well plate, a non-adhesive coating was used to prevent cells from adhering.
  • medium MEM ⁇ , 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin
  • 0.02 mg (dry mass) of gelatin short fibers obtained in Example 1 were added to each well of the U-bottom 96-well plate. Then, mouse fibroblasts MC3T3-E1 cells were seeded therein
  • the major axis of the cell aggregate means the longest straight line, that is, the length of the major axis among the straight lines connecting arbitrary two points on the outer circumference of the cell aggregate, and the minor axis of the cell aggregate is the outer diameter of the cell aggregate. It means the shortest straight line, that is, the length of the short axis among the straight lines connecting any two points in the above and orthogonal to the long axis.
  • Table 1 a three-dimensional image of the cell aggregate on the third day (72 hours after seeding) is shown in FIG.
  • ⁇ Cell activity of cell aggregates The amount of ATP as the cell activity of the cell aggregates obtained on the third day was measured using an ATP test kit (“mass” ATP test reagent, Toyo Beanet) according to the manufacturer's instructions. To put it simply, 100 ⁇ L of the reagent was added to the cell aggregate and allowed to stand for 10 minutes, and then the luminescence intensity was measured with a plate reader (SpectraMax i3, Molecular Devices). Using the cell aggregate obtained by forming without adding gelatin short fibers as a control sample, the luminescence intensity was set to 1, and the luminescence intensity ratio of each was calculated and used as the ATP relative luminescence intensity.
  • ⁇ Cell activity of cell aggregates after cryopreservation> The cell aggregates obtained on the third day were slowly frozen at 1 ° C. for 1 minute using a cell freezing container (Mr. Frosty, manufactured by Nalgene), frozen and stored at -80 ° C for 7 days, and then thawed at 37 ° C.
  • the cell activity of the cell aggregate was measured as described above, and the results are shown in Table 2 below.
  • Example A1 Cell aggregates were prepared in the same manner as in Example A1 except that gelatin short fibers were not added, the aggregated state was observed, and the cell activity of the cell aggregates was measured. The results are shown in FIGS. 4, Tables 1 and 2. A to d in FIG. 4 show the 0th day (immediately after sowing), the 1st day (24 hours after sowing), the 2nd day (48 hours after sowing), and the 3rd day (72 hours after sowing), respectively. ) Image.
  • Comparative Example A2 Cell aggregates were prepared and the aggregated state was observed in the same manner as in Example A1 except that the gelatin short fibers obtained in Comparative Example 1 were used instead of the gelatin short fibers obtained in Example 1. As will be described later, in Comparative Example 2, since cell aggregates were not formed, the cell activity of the cells and the mass of gelatin short fibers was measured. The results are shown in FIGS. 5, Tables 1 and 2.
  • FIGS. 5a to 5D show the 0th day (immediately after sowing), the 1st day (24 hours after sowing), the 2nd day (48 hours after sowing), and the 3rd day (72 hours after sowing), respectively. ) Image.
  • Example A1 using the gelatin short fibers of the example the cells and the gelatin short fibers are aggregated, and the gelatin short fibers do not protrude to the surface. Although aggregates were formed, in Comparative Example A2 using gelatin short fibers of Comparative Example having an average fiber length of more than 400 ⁇ m, cell aggregates could not be formed even after culturing for 3 days. On the other hand, in Comparative Example A1 in which only cells were cultured without using gelatin short fibers, cell aggregates were formed from the first day of culture, but the size of the cell aggregates decreased from the second day of culture. In addition, as can be seen from Table 2, cells proliferate by adding gelatin short fibers, and the cell activity of cell aggregates is high, whereas when gelatin short fibers are not added, cells proliferate. The cell activity of the cell aggregate was also poor.
  • Example A2 Cell aggregates were prepared in the same manner as in Example A1 except that the number of cells per well was changed to 1 ⁇ 10 4 cells, the aggregated state was observed, and the cell activity of the cell aggregates on the 8th day was observed. It was measured. The results are shown in Tables 3 and 4.
  • Example A3 In the same manner as in Example A1, the amount of gelatin short fibers obtained in Example 1 was changed to 0.04 mg (mass when dried) and the number of cells per well was changed to 1 ⁇ 10 4 cells. Cell aggregates were prepared, the aggregated state was observed, and the cell activity of the cell aggregates was measured on the 8th day. The results are shown in Tables 3 and 4.
  • Example A3 Cell aggregates were prepared in the same manner as in Example A1 except that the number of cells per well was changed to 1 ⁇ 10 4 cells without adding gelatin short fibers, and the aggregated state was observed. Day 8 cells The cellular activity of the aggregate was measured. The results are shown in Tables 3 and 4.
  • the gelatin short fibers of the present invention can be used to form cell aggregates by co-culturing with cells.
  • the cell aggregate of the present invention can be used for the growth, repair or regeneration of human or non-human animal tissues.

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Abstract

本発明は、ゼラチンを主成分とするゼラチン短繊維であって、水に分散させた際の平均繊維径が５μｍ以上４００μｍ以下であり、かつ平均繊維長が５０μｍ以上４００μｍ以下であり、細胞とともに細胞凝集体を形成するのに用いるゼラチン短繊維に関する。これにより、細胞との共培養で細胞凝集体を作製する際の細胞凝集体の形成性が良好であり、長期間培養で得られた細胞凝集体の細胞活性を高めることができるゼラチン短繊維、その製造方法、それを含む細胞凝集体、細胞凝集体の製造方法及び作製キットを提供する。

Description

ゼラチン短繊維、その製造方法、それを含む細胞凝集体、細胞凝集体の製造方法及び作製キット
　本発明は、細胞培養の足場材料として用いることができ、細胞とともに細胞凝集体を形成することができるゼラチン短繊維、その製造方法、それを含む細胞凝集体、細胞凝集体の製造方法及び作製キットに関する。
　細胞凝集体培養等の３次元細胞培養を行う際に、一般的に３次元の足場材料を用いており、足場内部に細胞を入り込ませるために、足場表面に細胞を付着させることで細胞の移動や増殖で足場内部までに細胞を浸潤させたり、或いは培地中に分散させた細胞を加圧や吸引により強制的に足場内部へ送り込む等の方法が行われている。しかし、いずれの場合も、足場内部まで細胞を均一に分散させることは困難であった。
　そこで、短繊維足場材料を用いて細胞凝集体を作製することが提案されている。例えば、特許文献１では、細胞を直径が１０～１００μｍ、かつ長さが０．５～５ｍｍである繊維と一緒に培養することで細胞凝集体を得ることが記載されている。特許文献２及び３には、平均長が１０～５００μｍ、かつ平均直径が２００ｎｍ～４μｍであり、表面にポリマーブラシが形成されている短繊維足場材料を用いて細胞凝集塊を製造することが記載されている。
特表２０１０－５３５６０５号公報 特許第５８４６５５０号 特開２０１８－４２４６９号公報
　しかし、依然として、短繊維足場材料と細胞との共培養で細胞凝集体を作製する際の細胞凝集体の形成性や、長期間培養で得られた細胞凝集体の細胞活性を改良することが求められている。
　本発明は、前記従来の問題を解決するため、細胞との共培養で細胞凝集体を作製する際の細胞凝集体の形成性が良好であり、長期間培養で得られた細胞凝集体の細胞活性を高めることができるゼラチン短繊維、その製造方法、それを含む細胞凝集体、細胞凝集体の製造方法及び作製キットを提供する。
　本発明は、ゼラチンを主成分とするゼラチン短繊維であって、水に分散させた際の平均繊維径が５μｍ以上４００μｍ以下であり、かつ平均繊維長が５０μｍ以上４００μｍ以下であり、細胞とともに細胞凝集体を形成するのに用いることを特徴とするゼラチン短繊維に関する。
　本発明は、また、前記のゼラチン短繊維の製造方法であって、ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した繊維を集積させて不織布とし、前記ゼラチン長繊維不織布を切断することでゼラチン短繊維を得ることを特徴とするゼラチン短繊維の製造方法に関する。
　本発明は、また、前記のゼラチン短繊維の製造方法であって、ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、加熱紡糸筒を通過させて乾式紡糸し、得られたゼラチンフィラメント糸を切断することでゼラチン短繊維を得ることを特徴とするゼラチン短繊維の製造方法に関する。
　本発明は、また、前記のゼラチン短繊維と細胞が凝集された細胞凝集体であり、前記ゼラチン短繊維が前記細胞凝集体の表面に突出していないことを特徴とする細胞凝集体に関する。
　本発明は、また、前記のゼラチン短繊維及び細胞を培地中で培養することで、細胞及びゼラチン繊維が凝集し、ゼラチン短繊維が表面に突出していない細胞凝集体を形成することを特徴とする細胞凝集体の製造方法に関する。
　本発明は、また、前記のゼラチン短繊維、細胞及び培地を含み、細胞とゼラチン短繊維が凝集された細胞凝集体を形成するのに用いることを特徴とする細胞凝集体の作製キットに関する。
　本発明は、細胞との共培養で細胞凝集体を作製する際の細胞凝集体の形成性が良好であり、長期間培養で得られた細胞凝集体の細胞活性を向上し得るゼラチン短繊維を提供することができる。
　また、本発明のゼラチン短繊維の製造方法によれば、コンタミ等がなく、衛生的にかつ効率よく、ゼラチン短繊維を得ることができる。
　また、本発明は、形成性が良好であり、細胞活性が高い細胞凝集体を提供することができる。
　また、本発明の細胞凝集体の製造方法又は作製キットによれば、細胞凝集体を良好に形成することができ、長期間培養後においても細胞活性が高い細胞凝集体を得ることができる。
図１は本発明の一実施例で得られたゼラチン短繊維の水分散液を倒立顕微鏡で観察した画像（１０倍）である。 図２の（ａ）～（ｄ）は実施例Ａ１において、細胞とゼラチン短繊維の凝集状態を倒立顕微鏡で観察した画像（４倍）である。 図３は実施例１で得られた細胞凝集体の３次元画像である。 図４の（ａ）～（ｄ）は比較例Ａ１において、細胞の凝集状態を倒立顕微鏡で観察した画像（４倍）である。 図５の（ａ）～（ｄ）は比較例Ａ２において、細胞とゼラチン短繊維の凝集状態を倒立顕微鏡で観察した画像（４倍）である。 図６は本発明の一実施例で使用するゼラチン長繊維不織布製造装置の模式的説明図である。 図７（ａ）及び（ｂ）は本発明の１以上の実施形態で用いるフィラメント製造装置の模式的説明図である。
　本発明の１以上の実施形態のゼラチン短繊維は、ゼラチンを主成分とする。本発明において、主成分とは、ゼラチンを９０質量％以上含むことを意味する。本発明の１以上の実施形態のゼラチン短繊維は、ゼラチンを９０質量％以上、他の成分を１０質量％以下含んでもよく、ゼラチンを９５質量％以上、他の成分を５質量％以下含んでもよく、実質的に１００質量％のゼラチンで構成されてもよい。本発明のゼラチン短繊維は、安全性が高く、生体吸収性に優れるゼラチンを主成分とすることから、該ゼラチン短繊維を用いて形成した細胞凝集体（３次元細胞凝集体）は、生体に移植して再生治療用、細胞研究及び創薬研究に必要となる三次元細胞組織体、オルガネラ等として好適に用いることができる。また、本発明のゼラチン短繊維は、親水性が高いゼラチンを主成分とすることから、表面に親水性を有するポリマーブラシを形成しなくても、培地中での分散性及び細胞との親和性が高く、培地中での細胞との共培養で細胞凝集体を形成しやすい。
　他の成分は、必要に応じて、他の生体適合性ポリマー、架橋剤、薬剤、可塑剤、他の添加剤等であってもよい。他の生体適合性ポリマーは、特に限定されないが、細胞等の生体と接着性を有する生体適合性ポリマーを好適に用いることができる。このような生体適合性ポリマーとしては、特に限定されないが、例えば、天然高分子や合成高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばタンパク質や多糖類等が挙げられる。タンパク質としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、フィブリン等が挙げられる。多糖類としては、例えばキトサン、アルギン酸カルシウム、ジェランガム、アガロース、グァーガム、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、ローカストビーンガム、タマリンドガム、ダイユータンガム等の天然高分子を用いてもよく、カルボキシメチルセルロース等の天然高分子の誘導体を用いてもよい。合成高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール等が挙げられる。上述した他の生体適合ポリマーは、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。
　前記ゼラチンの原材料となるコラーゲンが由来する動物の種類や部位は特に限定されない。コラーゲンは、例えば脊髄動物由来でもよく、魚由来でもよい。また、真皮、靭帯、腱、骨、軟骨等の様々な器官や組織由来のコラーゲンを適宜用いることができる。また、コラーゲンからゼラチンを調製する方法も特に限定されず、例えば酸処理、アルカリ処理、及び酵素処理等が挙げられる。前記ゼラチンの分子量も特に限定されず、様々な分子量のものを適宜選択して用いることができる。また、ゼラチン短繊維は、１種のゼラチンで構成されてもよく、２種以上のゼラチンを含んでもよい。
　前記ゼラチンは、適度な柔軟性及び硬さを有し、細胞集合体を形成する効果が高い観点から、ゼリー強度が１００ｇ以上４００ｇ以下であることが好ましく、より好ましくは１５０ｇ以上３６０ｇ以下である。本発明において、ゼリー強度は、ＪＩＳ　Ｋ　６５０３に準じて測定する。前記ゼラチンは、市販品であってもよい。
　前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維径が５μｍ以上４００μｍ以下であり、平均繊維長が５０μｍ以上４００μｍ以下である。前記ゼラチン短繊維が細胞接着性を有し、ハイドロゲルとなり得るゼラチンを主成分とするとともに、平均繊維径と平均繊維長が上述した範囲内であることで、該ゼラチン短繊維を細胞とともに培地中で培養した場合、培地中で均一に分散して膨潤したゼラチン短繊維の表面に細胞が接着しやすく、細胞間にゼラチン短繊維が配置される。それゆえ、細胞とゼラチン繊維が凝集された細胞凝集体が形成しやすい上、細胞に栄養や酸素が供給されやすく、長期間培養後においても細胞活性が高い大きなサイズの細胞凝集体を得ることができる。
　前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維径が５μｍ以上であることで、細胞間にゼラチン短繊維が配置されやすく、細胞同士又はゼラチン短繊維同士が密集することが抑制され、細胞へ栄養や酸素が供給されやすい。前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維径が１０μｍ以上であることが好ましく、より好ましくは１５μｍ以上である。また、前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維径が４００μｍ以下であることで、細胞凝集体における細胞の分布が偏ることが抑制される。前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維径が２００μｍ以下であることが好ましく、１５０μｍ以下であることがより好ましく、９０μｍ以下であることがさらに好ましく、６０μｍ以下であることが特に好ましい。具体的には、前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維径が、上述した下限値及び上限値の任意の組み合わせの範囲内であってもよく、例えば、１５μｍ以上９０μｍ以下であることが好ましく、１５μｍ以上６０μｍ以下であることがより好ましい。前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維径をＤとした場合、その標準偏差が０．６Ｄ以下であることが好ましく、０．５Ｄ以下であることがより好ましく、０．４Ｄ以下であることがさらに好ましく、０．３Ｄ以下であることがさらにより好ましく、０．２Ｄ以下であることが特に好ましい。
　前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維長が５０μｍ以上であることで、細胞間にゼラチン短繊維が配置されやすく、細胞同士又はゼラチン短繊維同士が密集することが抑制され、細胞へ栄養や酸素が供給されやすい。前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維長が８０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１２０μｍ以上であることがさらに好ましく、１５０μｍ以上であることが特に好ましい。また、前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維長が４００μｍ以下であることで、該ゼラチン短繊維が培地中に分散しやすく、該ゼラチン短繊維が絡まず、細胞と凝集しやすいことから、長期間培養した場合でも、細胞活性が高い繊維凝集体を得ることができる。前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維長が３８０μｍ以下であることが好ましく、３６０μｍ以下であることがより好ましく、３３０μｍ以下であることがさらに好ましく、３００ｍ以下であることが特に好ましい。具体的には、前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維長が、上述した下限値及び上限値の任意の組み合わせの範囲内であってもよく、例えば、１２０μｍ以上３３０μｍ以下であることが好ましく、１５０μｍ以上３００μｍ以下であることがより好ましい。前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維長をＬとした場合、その標準偏差が０．６Ｌ以下でることが好ましく、０．５Ｌ以下であることがより好ましく、０．４Ｌ以下であることがさらに好ましい。
　前記ゼラチン短繊維は、特に限定されないが、水に分散させた際の平均繊維長/平均繊維径で表されるアスペクト比が３以上であることが好ましく、４以上であることがより好ましく、５以上であることがさらに好ましい。アスペクト比が上述した範囲内であると、ゼラチン短繊維による細胞凝集体形成促進効果を向上させるとともに、細胞活性をより高めることができる。アスペクト比の上限は、特に限定されず、例えば、４０以下であってもよく、２０以下であってもよい。アスペクト比は、特に限定されず、具体的には、上述した下限値及び上限値の任意の組み合わせの範囲内であってもよく、例えば、３以上４０以下であることが好ましく、４以上４０以下であることがより好ましく、５以上４０以下であることがさらに好ましく、５以上２０以下であることが特に好ましい。
　本発明において、ゼラチン短繊維の水に分散させた際の平均繊維径及び平均繊維長は、下記のように測定することができる。ゼラチン短繊維５ｇを蒸留水１００ｍＬに分散させ、３分間以上放置した後の水分散液（懸濁液）を倒立顕微鏡で観察して撮影し、撮影した写真から任意に選択した４００本の繊維の繊維径と繊維長を計測し、４００本の繊維の繊維径と繊維長の平均をそれぞれ算出し、平均繊維径及び平均繊維長とする。ゼラチン短繊維の質量が５ｇ未満の場合は、ゼラチン短繊維の質量１ｇあたりに蒸留水が２０ｍＬになるようにした以外は、上記と同様にして平均繊維径及び平均繊維長を測定することができる。ゼラチン短繊維の水分散液中の繊維の本数が４００本未満の場合は、水分散液中の全ての繊維の繊維径と繊維長を計測し、それらの繊維径と繊維長の平均をそれぞれ算出すればよい。なお、本明細書において、特に指摘がない場合、各種操作は、室温（１５～２５℃）で行うことを意味する。
　前記ゼラチン短繊維は、耐水性を高め、培地中での細胞との共培養において形態を維持しやすく、効果的に細胞凝集体を形成する観点から、架橋されていることが好ましい。架橋は、架橋剤等の化合物を用いた化学架橋であってもよく、生体安全性の観点から、生体安全性を有する架橋剤を用いる架橋、又は架橋剤を用いない架橋であることが好ましい。架橋剤を用いない架橋としては、例えば、熱架橋、電子線架橋、γ線等の放射線架橋、紫外線架橋等が挙げられ、簡便に所望の架橋効果を得やすい観点から、熱架橋であることが好ましく、熱脱水架橋であることがより好ましい。熱脱水架橋は、例えば、１００℃以上１６０℃以下で、２４時間以上９６時間以下行ってもよい。また、熱脱水架橋は、例えば、１ｋＰａ以下の真空下で行ってもよい。
　前記ゼラチン短繊維は、特に限定されないが、ゼラチン長繊維不織布、或いは、湿式紡糸又は乾式紡糸によって形成されたフィラメント状の繊維や繊維束を切断することで得ることができる。
　本発明の１以上の実施形態において、ゼラチン長繊維不織布を用いる場合、夾雑物の発生を抑制し、製品汚染を防ぐ観点から、前記ゼラチン長繊維不織布は、ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から押し出し、ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて乾式でダイレクトに繊維化し、得られたゼラチン長繊維を集積させてゼラチン長繊維不織布にすることで作製することが好ましい。圧力流体噴射口は、ノズル吐出口とは独立にかつ非接触状態で後方に配置されているため、紡糸液が混入することはない。このため、ゼラチン長繊維不織布にコンタミが混入することを防止できる。
　まず、ゼラチン単独、或いは、必要に応じてゼラチンと上述した他の成分として用いることができる他の生体適合ポリマーを水に溶解して紡糸液を調製する。溶解温度（水の温度）は２０℃以上９０℃以下が好ましく、４０℃以上９０℃以下であることがより好ましい。必要に応じて、ゼラチンを水に溶解した後、フィルトレーションして異物やごみなどを除去してもよい。また、必要に応じて、その後、減圧脱泡又は真空脱泡して溶解空気を除去してもよい。効率よく気体（気泡）を除去する観点から、減圧脱泡時の真空度は５ｋＰａ以上３０ｋＰａ以下であることが好ましい。ゼラチンが水溶性であることで、紡糸液として水溶液の状態で紡糸でき、生体に対する安全性が高くなる。水としては、例えば、純水、蒸留水、超純水等を適宜用いることができる。なお、他の成分として、他の生体適合性水溶性高分子を用いる場合、ゼラチンと同時に水に溶解することで、紡糸液を調製することができる。
　前記ゼラチンを含む紡糸液（ゼラチン水溶液）の温度は２０℃以上９０℃以下であることが好ましく、４０℃以上９０℃以下であることがより好ましい。前記の範囲であればゼラチンは安定したゾル状態を維持できる。また、前記ゼラチン水溶液のゼラチン濃度は、ゼラチン水溶液を１００質量％とした時、３０質量％以上５５質量％以下であることが好ましい。さらに好ましい濃度は３２質量％以上５０質量％以下である。前記の濃度であれば安定したゾル状態を維持できる。前記ゼラチン水溶液（紡糸液）の粘度は５００ｍＰａ・ｓ以上３０００ｍＰａ・ｓ以下が好ましい。ゼラチン水溶液の粘度が上述した範囲であれば安定した紡糸ができる。
　前記ゼラチンを含む紡糸液を紡糸機のノズルから吐出し、前記ノズル周囲から圧力流体を供給し、前記吐出したゼラチン水溶液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、得られたゼラチン長繊維を集積してゼラチン長繊維不織布とする。
　前記圧力流体の温度は、２０℃以上１２０℃以下であることが好ましく、８０℃以上１２０℃以下であることがより好ましい。圧力流体の流速及び周囲雰囲気の温度にもよるが、前記の温度範囲であれば安定した紡糸ができる。圧力流体は空気を使用することが好ましく、圧力は０.１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下であることが好ましい。前記の範囲であれば、ノズル吐出口から空気中に押し出された紡糸液を吹き飛ばして繊維化できる。
　前記ゼラチン長繊維不織布は紡糸後に繊維を集積（堆積）させる時に繊維同士が、水分を含んだ状態で積層されるため、溶着したり互いに絡んで一体化されている。繊維を堆積させる際の捕集距離を変えることで、容易に不織布密度を変えることができる。ゼラチン長繊維不織布において、ゼラチン長繊維の繊維長は数メートル～数千メートルであってもよい。
　前記ゼラチン長繊維不織布において、水で膨潤した際のゼラチン長繊維の平均繊維径は、５μｍ以上４００μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以上２００μｍ以下であることがより好ましく、１５μｍ以上１５０μｍ以下であることがより好ましい。ノズル径（内径）等適宜を調整することで、所望の平均繊維径を有するゼラチン長繊維不織布を得ることができる。
　前記ゼラチン長繊維不織布は、架橋することが好ましい。これにより形態安定性及び耐水性を高めることができ、ゼラチン長繊維不織布を切断してゼラチン短繊維を得る工程の作業性が良好になる。架橋は、架橋剤等の化合物を用いた化学架橋であってもよいが、生体安全性の観点から、生体安全性を有する架橋剤を用いる架橋、架橋剤を用いない架橋であることが好ましい。架橋剤を用いない架橋としては、例えば、熱架橋、電子線架橋、γ線等の放射線架橋、紫外線架橋等が挙げられる。電子線照射、γ線等の放射線照射の場合は、滅菌と架橋を同時にすることもできる。簡便に所望の架橋効果を得やすい観点から、熱架橋であることが好ましく、熱脱水架橋であることがより好ましい。熱脱水架橋は、例えば、１００℃以上１６０℃以下で、２４時間以上９６時間以下行ってもよい。また、熱脱水架橋は、例えば、１ｋＰａ以下の真空下で行ってもよい。前記ゼラチン長繊維不織布は、架橋する前に乾燥してもよい。乾燥は、室温における風乾でもよく、真空凍結乾燥でもよい。
　次に、前記ゼラチン長繊維不織布を切断してゼラチン短繊維を得る。操作が簡便である観点から、水中で切断することが好ましい。また、切断効率を高める観点から、前記ゼラチン長繊維不織布を、例えば、５～１０ｍｍ角等の所定のサイズに切断してから、切断したゼラチン長繊維不織布を水中でミキサーを用いてさらに切断（粉砕）することで、ゼラチン短繊維を得ることが好ましい。得られたゼラチン短繊維は、２本以上の繊維が交点を有する枝分かれ形状のゼラチン短繊維を含んでもよいが、個々の繊維は互いに分離した形状であることが好ましい。水としては、例えば、純水、蒸留水、超純水等を用いることができる。ミキサーとしては、繊維にダメージを与えず、繊維の長さを短くすることができるものであればよく、特に限定されない。粉砕は、特に限定されないが、例えば、フリッチュ社製のＰ－１１メッサーミル等の超高速回転型ミキサーの場合、回転数２０００ｒｐｍ以上１４０００ｒｐｍ以下の条件下で５秒以上１０分以下行うことができる。
　図６は本発明の一実施例で使用する不織布製造装置の模式的説明図である。不織布製造装置１０において、加温槽１に入れたゼラチンを含む紡糸液２をノズル吐出口３から空気中に押し出す。加温槽１にはコンプレッサー４により、所定の圧力をかけておく。１２は保温容器である。
　また、ノズル吐出口３の後方に位置し、ノズル吐出口３とは非接触状態の流体噴射口５から前方に向けて圧力流体７を噴射させる。流体噴射口５にはコンプレッサー６から圧力流体（例えば圧空）が供給される。流体噴射口５とノズル吐出口３との距離は５～３０ｍｍが好ましい。
　押し出された紡糸液は圧力流体７に随伴されてゼラチン長繊維８となり、巻き取りロール１１上で堆積されてゼラチン長繊維不織布９となる。この時、堆積された長繊維は水分を含んでいたり、完全には固化していないので、繊維交点の少なくとも一部において接している繊維が互いに溶着する。なお、巻き取りロール以外でもネット等で長繊維を捕集し堆積してゼラチン長繊維不織布にしてもよい。
　本発明の１以上の実施形態において、ゼラチン短繊維は、ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、加熱紡糸筒を通過させて乾式紡糸し、得られたゼラチンフィラメント糸を切断することでも得ることができる。
　まず、ゼラチンを含む紡糸液を調製する。紡糸液は、ゼラチン長繊維不織布の製造に用いるものと同様のものを用いることができる。簡単に言うと、例えば、ゼラチン単独、或いは、必要に応じてゼラチンと上述した他の成分として用いることができる他の生体適合ポリマーを水に溶解した後、減圧脱泡して溶解空気を除去することで紡糸液を得ることができる。溶解した後、フィルトレーションして異物やごみなどを除去してもよい。溶解温度は４０℃以上９０℃以下が好ましい。減圧脱泡時の真空度は５ｋＰａ以上３０ｋＰａ以下であることが好ましい。
　次に、前記ゼラチンを含む紡糸液を紡糸機のノズル吐出口から空気中に押し出し、加熱紡糸筒を通過させて乾式紡糸する。前記加熱紡糸筒は、温度が１２０℃以上１８０℃以下に保持されており、かつ押し出し物の加熱紡糸筒中における滞留時間は５秒以上とするのが好ましい。これにより、押し出し物から急激に水分が除去され、糸条が形成される。
　前記加熱紡糸筒は、特に限定されないが、例えば内径が２００ｍｍステンレス管にヒーターを巻きつけた長さ２ｍの紡糸筒を用いることができる。前記加熱紡糸筒２４は、複数の区画に区分けられてもよく、それぞれの区画において温度制御を行ってもよい。前記加熱紡糸筒は鉛直方向に向いていることが好ましい。そして、加熱紡糸筒を出た位置では、ゼラチン中空糸は中空状体であり、ここでカットすることで、得られるゼラチンフィラメントは中空糸となる。加熱紡糸筒を出た位置で中空になる理由は、加熱紡糸筒内で急激に水分が除去されるためと思われる。カットせずに、巻き取ることで、中空がつぶれて断面が扁平になった扁平糸を得ることができる。
　前記ゼラチンフィラメントにおいて、水で膨潤した際の平均繊維径は、５μｍ以上４００μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以上２００μｍ以下であることがより好ましく、１５μｍ以上１５０μｍ以下であることがより好ましい。ノズル径（内径）等適宜を調整することで、所望の平均繊維径を有するゼラチンフィラメントを得ることができる。なお、前記ゼラチンフィラメントが扁平糸の場合、個々の繊維において、繊維径は、長径と短径の平均値である。
　前記ゼラチンフィラメントは、架橋することが好ましい。これにより形態安定性及び耐水性を高めることができ、前記ゼラチンフィラメントを切断してゼラチン短繊維を得る工程の作業性が良好になる。架橋は、ゼラチン長繊維不織布の製造方法について説明したのと同様に行うことができる。簡便に所望の架橋効果を得やすい観点から、熱架橋であることが好ましく、熱脱水架橋であることがより好ましい。熱脱水架橋は、例えば、１００℃以上１６０℃以下で、２４時間以上９６時間以下行ってもよい。また、熱脱水架橋は、例えば、１０ｋＰａ以下の真空下で行ってもよい。前記ゼラチンフィラメントは、架橋する前に乾燥してもよい。乾燥は、室温における風乾でもよく、真空凍結乾燥でもよい。
　次に、前記ゼラチンフィラメントを切断してゼラチン短繊維を得る。操作が簡便である観点から、水中で切断することが好ましい。また、切断効率を高める観点から、前記ゼラチンフィラメントを、例えば、繊維長が５～１０ｍｍになるように切断し、その後、水中でミキサーを用いてさらに切断（粉砕）することで、ゼラチン短繊維を得ることが好ましい。水としては、例えば、純水、蒸留水、超純水等を用いることができる。ミキサーとしては、繊維にダメージを与えず、繊維の長さを短くすることができるものであればよく、特に限定されない。粉砕は、特に限定されないが、例えば、フリッチュ社製のＰ－１１メッサーミル等の超高速回転型ミキサーの場合、回転数２０００ｒｐｍ以上１４０００ｒｐｍ以下の条件下で５秒以上１０分以下行うことができる。
　図７（ａ）及び（ｂ）は、本発明の１以上の実施形態で用いるフィラメント製造装置２０の模式的説明図である。シリンジ２１に入れたゼラチンを含む紡糸液２２をノズル２３から空気中に押し出す。具体的には、シリンジ２１の末端より０．１ＭＰａの加圧空気を送ってノゾル２３から紡糸液２２を押し出すことができる。ノズル２３は通常の丸断面でよい。ノズル２３の下には加熱紡糸筒２４が直結している。加熱紡糸筒２４は２４ａ-２４ｄの４区画からなり、それぞれの区画で温度制御が可能となっている。
　図７（ａ）に示すように、ゼラチンフィラメント２５を、ガイドロール２６を通過して巻き取り機２７に巻き取ることで、扁平糸が得られる。
　図７（ｂ）に示すように、加熱紡糸筒２４を出た下部で自重落下するゼラチンフィラメント２５をカットすることで、所定長さの中空糸が得られる。
　前記ゼラチン短繊維は、エチレンオキサイドガス滅菌、蒸気滅菌、電子線照射やγ線等の放射線照射により滅菌してもよい。
　前記ゼラチン短繊維及び細胞を培地中で培養（浮遊培養）することで、細胞とゼラチン繊維が凝集し、ゼラチン短繊維が細胞凝集体の表面に突出していない３次元の塊状の細胞凝集体を形成することができる。本発明において、「ゼラチン短繊維が細胞凝集体の表面に突出していない」とは、ゼラチン短繊維が３次元の塊状の細胞凝集体の内部に存在する、すなわち、細胞凝集体の表面は細胞で被覆されていることを意味する。上述したとおり、細胞接着性を有し、ハイドロゲルとなり得るゼラチンを主成分とするとともに、平均繊維径と平均繊維長が上述した範囲内であるゼラチン短繊維を細胞と培地中で共培養することで、培地中で均一に分散して膨潤したゼラチン短繊維の表面に細胞が接着しやすく、細胞間にゼラチン短繊維が配置されることで、細胞とゼラチン短繊維が凝集し、ゼラチン短繊維が細胞凝集体の表面に突出していない細胞凝集体を形成しやすい。また、細胞に栄養や酸素が供給されやすく、長期間培養することで得られた大きなサイズの細胞凝集体も、細胞活性が高くなる。図３に、本発明の１例の細胞凝集体の３次元画像を示している。図３において、白い部分が細胞であり、黒い部分がゼラチン短繊維である。図３から分かるように、細胞とゼラチン短繊維が凝集し、ゼラチン短繊維が細胞凝集体の表面に突出していない３次元の塊状の細胞凝集体を形成しており、細胞間にゼラチン短繊維が配置されており、細胞がゼラチン短繊維を被覆している。
　本発明の１以上の実施形態において、前記ゼラチン短繊維は、細胞接着因子、細胞誘導因子、細胞に栄養やエネルギを与える物質等でコーティングされてもよい。これにより、細胞凝集体の形成速度を高めることができる。細胞接着因子としては、特に限定されないが、例えば、フィブロネクチン等が挙げられる。細胞に栄養やエネルギを与える物質としては、特に限定されないが、例えば、ＡＴＰ、ピルビン酸等が挙げられる。また、本発明の１以上の実施形態において、前記ゼラチン短繊維を細胞誘導因子、成長因子等の生理活性物質を含む溶液に浸して、これらの成分を含ませてもよい。繊維凝集体の形成過程において、ゼラチン短繊維から、これらの生理活性物質が徐々に放出されることで、大きい細胞凝集体でも、均一に分化することができる。
　前記細胞凝集体は、細胞の種類や細胞凝集体の用途等に応じて、サイズを決めることができるが、例えば、移植した部位において機能しやすい観点から、例えば、平均径が２００μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上であることがより好ましい。本発明において、細胞凝集体の平均径は、細胞凝集体の長径及び短径の平均を意味し、細胞凝集体の長径は、細胞凝集体の外周における任意の二点を結んだ直線の内、最も長い直線すなわち長軸の長さを意味し、細胞凝集体の短径は、細胞凝集体の外周における任意の二点を結び、かつ前記長軸に直交する直線の内、最も短い直線すなわち短軸の長さを意味する。
　本発明の１以上の実施形態において、細胞は、動物細胞であればよく、その由来は特に限定されない。動物としては、ヒトでもよく、ヒト以外の動物でもよい。ヒト以外の動物としては、例えば、サル、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター等の齧歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の有蹄類等が挙げられる。また、本発明の１以上の実施形態において、細胞は、個々の細胞、細胞株、初代培養等培養で得られる細胞等を含む。前記細胞としては、特に限定されないが、例えば、体細胞、幹細胞、前駆細胞、生殖細胞等が挙げられる。
　体細胞は、生体を構成する体細胞や体細胞から派生した癌細胞を含む。生体を構成する体細胞としては、特に限定されず、例えば、線維芽細胞、筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞、内皮細胞、膀胱細胞、肺細胞、骨細胞、神経細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、中皮細胞等が挙げられる。癌細胞としては、特に限定されず、例えば、乳癌細胞、腎癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、肝癌細胞、子宮頸癌細胞、食道上皮癌、膵癌、大腸癌、膀胱癌等が挙げられる。
　幹細胞は、様々な特殊化した細胞型へ分化する可能性がある細胞である。幹細胞としては、特に限定されず、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ＥＣ）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、成体幹細胞、胚盤胞由来幹細胞、生殖隆起由来幹細胞、奇形腫由来幹細胞、オンコスタチン非依存性幹細胞（ＯＩＳＣ）、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、羊水由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞、骨膜由来間葉系幹細胞等が挙げられる。
　前駆細胞は、前記幹細胞から発生し生体を構成する最終分化細胞へ分化することができる細胞である。
　生殖細胞としては、精子、精細胞、卵子、卵細胞等が挙げられる。
　上述した細胞は、１種を単独で用いてもよく、目的等に応じて２種以上を併用してもよい。
　前記培地（液体培地）としては、特に限定されず、細胞の種類に応じて、細胞の生存増殖に必要な成分を含むものを適宜用いることができる。前記培地は、血清、抗生物質及び成長因子等を含んでもよい。血清は、例えば、ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヒト血清等を適宜用いることができる。抗生物質は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン等を適宜用いることができる。成長因子は、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子等を適宜用いることができる
　前記培地において、細胞の播種密度（細胞の播種量/培地の体積）は、特に限定されないが、例えば、１,０００細胞/ｍＬ以上１００，０００細胞/ｍＬ以下であることが好ましく、２，０００細胞/ｍＬ以上５０，０００細胞/ｍＬ以下であることがより好ましく、４，０００細胞/ｍＬ以上２５，０００細胞/ｍＬ以下であることがさらに好ましい。細胞の播種量が上述した範囲内であると、ゼラチン短繊維と共培養することで得られた細胞とゼラチン短繊維が凝集した細胞凝集体を効果的に形成することができ、得られた細胞凝集体の細胞活性を高めることができる。
　前記培地において、ゼラチン短繊維の濃度（ゼラチン短繊維の質量/培地の体積）は、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．０２ｍｇ／ｍＬ以上０．５ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、０．０４ｍｇ／ｍＬ以上０．２５ｍｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。ゼラチン短繊維の濃度が上述した範囲内であると、ゼラチン短繊維の培地中での分散性が高く、細胞と共培養することで得られた細胞とゼラチン短繊維が凝集した細胞凝集体の細胞活性を高めることができる。
　前記培地において、前記細胞の播種量とゼラチン短繊維の添加量の比（細胞の播種量/ゼラチン短繊維の添加量）は、特に限定されないが、例えば、１，０００細胞/ｍｇ以上１ｘ１０6細胞/ｍｇ以下であることが好ましく、１０，０００細胞/ｍｇ以上８ｘ１０5細胞/ｍｇ以下であることがより好ましく、２０，０００細胞/ｍｇ以上６ｘ１０5細胞/ｍｇ以下であることがさらに好ましい。細胞の播種量とゼラチン短繊維の添加量の比が上述した範囲であると、細胞とゼラチン短繊維が凝集した細胞凝集体を効果的に形成することができ、得られた細胞凝集体の細胞活性を高めることができる。
　培養は、細胞凝集体を形成することができる低接着性条件で行えばよい。例えば、培養基材として、接着防止面を有し、底が細くなっていることが好ましい。細胞が培養基材に接着することを防ぎ、細胞とゼラチン短繊維が凝集した細胞凝集体を形成しやすい。ポリスチレン又はポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標）とも称される）用いた細胞培養容器等の培養基材を用いてもよく、寒天、アガロース、ポリビニルアルコール等で表面をコーティングした細胞培養容器等の培養基材を用いてもよい。細胞培養容器は、Ｕ底（丸底とも称される）やＶ底等の底が細くなっている、ディッシュ、プレート、チューブ及びフラスコ等を用いることができる。
　細胞とゼラチン短繊維の共培養は、例えば、２７℃以上４０℃以下で行ってもよく、３１℃以上３７℃以下であってもよい。二酸化炭素は、２％以上１０％以下の範囲であってもよい。
　培養時間は、細胞凝集体を形成するよう、細胞種類、細胞数等に応じて適宜決めればよいが、例えば、１～８日継続して培養してもよく、２～７日継続して行ってもよく、３～６日継続して行ってもよい。培養は、静置状態で行ってもよく、流動状態で行ってもよい。流動状態の培養としては、撹拌又は振とうさせながら培養する懸濁培養で行ってもよい。培地は、２～３日毎に交換してもよい。
　上述したゼラチン短繊維、細胞及び培地を含むキットは、細胞凝集体の作製キットとして用いることができ、具体的には、細胞及びゼラチン短繊維が凝集された細胞凝集体を形成するのに用いることができる。前記作製キットは、細胞培養容器等の培養基材を含んでもよい。
　前記細胞凝集体は、例えば、ヒト又はヒト以外の動物の組織の増大、修復又は再生等の細胞治療に用いることができる。組織としては、特に限定されず、例えば、骨、軟骨、腱、半月、筋肉及び脂肪等の結合組織等が挙げられる。
　前記細胞凝集体は、ゼラチン短繊維を含むことにより、強度が高くなり、それゆえ、細胞治療に用いる際のハンドリング性が良好になる。また、前記細胞凝集体は、ゼラチン短繊維を含むことにより、強度が高くなり、それゆえ、優れた形態維持性を有することになり、例えば、注射やカテーテル等により目的の箇所に注入でき、定着率も向上し得る。
　前記細胞凝集体は、サイズが大きく、かつ少ない細胞数で高い細胞活性を発揮する観点から、細胞の個数と繊維の質量の比（細胞の個数/繊維の質量）は、１０，０００細胞/ｍｇ以上１ｘ１０6細胞/ｍｇ以下であることが好ましく、２０，０００細胞/ｍｇ以上６ｘ１０5細胞/ｍｇ以下であることがより好ましい。
　前記細胞凝集体は、ゼラチン短繊維を含むことにより、凍結による細胞損傷を防ぐことができ、具体的には、凍結による細胞活性の低減を抑制することができる。
　前記ゼラチン短繊維は、上述したように細胞凝集体の足場材として好適に用いることができる以外に、例えば、大量浮遊培養用のマイクロキャリア、バイオ３Dプリンターの添加材、三次元培養時の異種細胞の接着助剤、細胞シートの極性選択培養足場材、細胞活性の向上材、細胞注射用足場材、播種効率向上添加材、細胞凍結時の凍結細胞保護材等として用いることができる。
　本発明は、特に限定されないが、好ましくは以下の態様を含む。
　［１］　ゼラチンを主成分とするゼラチン短繊維であって、
　水に分散させた際の平均繊維径が５μｍ以上４００μｍ以下であり、かつ平均繊維長が５０μｍ以上４００μｍ以下であり、
　細胞とともに細胞凝集体を形成するのに用いることを特徴とするゼラチン短繊維。
　［２］　前記ゼラチン短繊維は、架橋されている、［１］に記載のゼラチン短繊維。
　［３］　前記平均繊維径をＤとした場合、その標準偏差は０．６Ｄ以下であり、かつ、前記平均繊維長をＬとした場合、その標準偏差は０．６Ｌ以下である、［１］又は［２］に記載のゼラチン短繊維。
　［４］　前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維長/平均繊維径で表されるアスペクト比が３以上である、［１］～［３］のいずれかに記載のゼラチン短繊維。
　［５］　［１］～［４］のいずれかに記載のゼラチン短繊維の製造方法であって、
　ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、
　前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、
　前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した繊維を集積させてゼラチン長繊維不織布とし、
　前記ゼラチン長繊維不織布を切断することでゼラチン短繊維を得ることを特徴とするゼラチン短繊維の製造方法。
　［６］　［１］～［４］のいずれかに記載のゼラチン短繊維の製造方法であって、
　ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、加熱紡糸筒を通過させて乾式紡糸し、
　得られたゼラチンフィラメント糸を切断することでゼラチン短繊維を得ることを特徴とするゼラチン短繊維の製造方法。
　［７］　前記加熱紡糸筒は鉛直方向に向いている、［６］に記載のゼラチン短繊維の製造方法。
　［８］　前記ゼラチン長繊維不織布又は前記ゼラチンフィラメント糸を架橋した後に、切断する、［５］～［７］のいずれかに記載のゼラチン短繊維の製造方法。
　［９］　［１］～［４］のいずれかに記載のゼラチン短繊維と細胞が凝集された細胞凝集体であり、前記ゼラチン短繊維が前記細胞凝集体の表面に突出していないことを特徴とする細胞凝集体。
　［１０］　前記細胞凝集体の平均径が０．６ｍｍ以上である、［９］に記載の細胞凝集体。
　［１１］　前記細胞凝集体において、細胞数/ゼラチン短繊維の質量は１ｘ１０4細胞/ｍｇ以上１ｘ１０6細胞/ｍｇ以下である、［９］又は［１０］に記載の細胞凝集体。
　［１２］　［１］～［４］のいずれかに記載のゼラチン短繊維及び細胞を培地中で培養することで、細胞とゼラチン繊維が凝集し、ゼラチン短繊維が表面に突出していない細胞凝集体を形成することを特徴する細胞凝集体の製造方法。
　［１３］　前記培地において、ゼラチン短繊維の濃度（ゼラチン短繊維の質量/培地の体積）は０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下である、［１２］に記載の細胞凝集体の製造方法。
　［１４］　前記培地において、細胞の播種量とゼラチン短繊維の添加量の比（細胞の播種量/ゼラチン短繊維の添加量）は１ｘ１０4細胞/ｍｇ以上１ｘ１０6細胞/ｍｇ以下である、［１２］又は［１３］に記載の細胞凝集体の製造方法。
　［１５］　［１］～［４］のいずれかに記載のゼラチン短繊維、細胞及び培地を含み、
　細胞とゼラチン短繊維が凝集された細胞凝集体を形成するのに用いることを特徴とする細胞凝集体の作製キット。
　以下、実施例を用いてさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
　測定方法は下記のとおりである。
　＜平均繊維径及び平均繊維長＞
　ゼラチン短繊維５ｇを１００ｍＬの蒸留水中に分散させ、３分間放置した後の水分散液をデジタルマイクロスコープ（Ｚｅｉｓｓ社製、品名「ＡｘｉｏＣＡＭ　ＥＲｃ５」）を搭載した倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製「ＣＫＸ５３」、４倍）で観察して撮影した。次に、コンピュータソフトウェア（ＰｈｏｔｏＲｕｌｅｒ，Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｉｎｃｙｂｅ）を使用して、撮影した写真から任意に選択した繊維４００本の繊維径と繊維長を計測し、４００本の繊維の繊維径と繊維長の平均をそれぞれ算出し、平均繊維径及び平均繊維長とした。
　（実施例１）
　＜ゼラチン長繊維不織布の作製＞
　ゼラチンとして新田ゼラチン社製（ゼリー強度２６２ｇ、原料：アルカリ処理牛骨）を使用し、ゼラチン：水＝３：５の質量比（ゼラチン濃度３７．５質量％）とし、温度６０℃で溶解した。ゼラチン水溶液の６０℃における粘度は９６０～９７０ｍＰａ・ｓであった。このゼラチン水溶液を紡糸液とし、図６に示す不織布製造装置を使用してゼラチン長繊維不織布を製造した。紡糸液の温度は６０℃、ノズル直径（内径）２５０μｍ、吐出圧０．２ＭＰａ、ノズル高さ５ｍｍ、エアー圧力０．３７５ＭＰａ、エアー温度１００℃、流体噴射口５とノズル吐出口３との距離は５ｍｍ、捕集距離５０ｃｍとし、巻き取りローラ１１でゼラチン長繊維不織布９を巻き取った。
　次いで、ゼラチン長繊維不織布を室温（２０℃）で一晩風乾し、その後、真空下（１ｋＰａ）、１４０℃で４８時間熱架橋させた。
　＜ゼラチン短繊維の作製＞
　得られたゼラチン長繊維不織布を５～１０ｍｍ角に切断し、切断したゼラチン長繊維不織布５ｇに蒸留水を１００ｍＬ加えて、超高速回転型ミキサー（フリッチュ社製の「Ｐ－１１メッサーミル」）を用いて２０００ｒｐｍで３分間撹拌することで、ゼラチン長繊維不織布を切断してゼラチン短繊維の水分散液を得た。得られたゼラチン短繊維の水分散液（懸濁液）を用いて、上述したとおり、ゼラチン短繊維の平均繊維径と平均繊維長を測定したところ、平均繊維径が４０μｍ（標準偏差５μｍ）であり、平均繊維長が２３０μｍ（標準偏差１２０μｍ）であり、アスペクト比は５．７５であった。図１に、ゼラチン短繊維の水分散液をデジタルマイクロスコープ（Ｚｅｉｓｓ社製、品名「ＡｘｉｏＣＡＭ　ＥＲｃ５」）を搭載した倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製「ＣＫＸ５３」、１０倍）で観察して撮影した写真を示した。
　次に、繊維懸濁液を－３０℃の冷凍庫で凍結させた後、真空凍結乾燥を行い、乾燥したゼラチン短繊維を得た。
　（比較例１）
　得られたゼラチン長繊維不織布を５～１０ｍｍ角に切断し、切断したゼラチン長繊維不織布５ｇに蒸留水を１００ｍＬ加えて、超高速回転型ミキサー（フリッチュ社製の「Ｐ－１１メッサーミル」）を用いて２０００ｒｐｍで１分間撹拌することで、ゼラチン短繊維の水分散液における平均繊維長が８２８μｍ（標準偏差０．５７μｍ）になるようにした以外は、実施例１と同様にして乾燥したゼラチン短繊維を得た。
　（実施例Ａ１）
　＜細胞凝集体の作製＞
　Ｕ底の９６ウェルプレートの各ウェルに培地（ＭＥＭα、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）２００μＬと、実施例１で得られたゼラチン短繊維０．０２ｍｇ（乾燥時の質量）を添加した後、そこへマウス線維芽細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を１ウェル当たりの細胞数が２×１０4細胞となるように播種した。その後、９６ウェルプレートを３７℃、５％のＣＯ2の条件でインキュベートした。
　なお、Ｕ底の９６ウェルプレートは、細胞が接着するのを防ぐために非接着コートを行ったものを用いた。具体的には、各ウェルにポリビニルアルコール１質量（ｗ／ｖ）％水溶液を２００μＬ加えて３７℃で一晩インキュベートした後、ポリビニルアルコール水溶液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄したＵ底の９６ウェルプレートを用いた。
　＜凝集状態の観察＞
　細胞とゼラチン短繊維の凝集状態を倒立顕微鏡（オリンパス社製「ＣＫＸ５３」）で観察し、顕微鏡カメラ（カールツァイスマイクロスコピー社製の「Ａｘｉｃａｍ　ＥＲｃ　５Ｓ」）で画像を記録した。０日目（播種直後）、１日目（播種から２４時間後）、２日目（播種から４８時間後）、及び３日目（播種から７２時間後）の画像を、それぞれ、図２のａ～ｄに示した。得られた画像から、細胞凝集体の長径及び短径を計測し、平均径（＝（長径＋短径）／２）を算出した。細胞凝集体の長径は、細胞凝集体の外周における任意の二点を結んだ直線の内、最も長い直線すなわち長軸の長さを意味し、細胞凝集体の短径は、細胞凝集体の外周における任意の二点を結び、かつ前記長軸に直交する直線の内、最も短い直線すなわち短軸の長さを意味する。その結果を下記表１に示した。また、３日目（播種から７２時間後）の細胞凝集体の３次元化画像を図３に示した。
　＜細胞凝集体の形態維持性＞
　細胞及びゼラチン短繊維を共培養して３日目に、注射針１７Ｇ（Φ１．１ｍｍ）を付けた１ｍＬのシリンジを用いて細胞凝集体と培地を吸って吐き出すことを５回繰り返した後、細胞凝集体の長径及び短径を計測し、平均径（＝（長径＋短径）／２）を算出した。その結果を下記表１に示した。
　＜細胞凝集体の細胞活性＞
　３日目に得られた細胞凝集体の細胞活性としてのＡＴＰ量を、ＡＴＰ測定キット（「塊の」ＡＴＰ測定試薬、東洋ビーネット）を用いて製造者の説明書にしたがって測定した。簡単に言うと、細胞凝集体に１００μＬの試薬を加えて１０分間静置したのち、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　ｉ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）で発光強度を測定した。ゼラチン短繊維を添加せずに形成して得られた細胞凝集体を対照サンプルとして、その発光強度を１とし、それぞれの発光強度比を算出し、ＡＴＰ相対発光強度とした。
　また、得られた細胞凝集体にトリプシンを加えて凝集体を解離し、細胞懸濁液とした。血球計算板を用いて細胞数を計数した。ＡＴＰ相対発光強度を細胞数で割って、細胞凝集体の細胞一個当たりのＡＴＰ相対発光強度を算出した。その結果を下記表２に示した。また、細胞凝集体の細胞数／ゼラチン短繊維の質量を算出し、その結果を表２に示した。
　＜凍結保存後の細胞凝集体の細胞活性＞
　３日目に得られた細胞凝集体を細胞凍結容器（ミスターフロスティー、Ｎａｌｇｅｎｅ社製）を用いて１分間１℃で緩慢凍結し、－８０℃で７日凍結保存した後、３７℃で解凍した後の細胞凝集体の細胞活性を上述したとおりに測定し、その結果を下記表２に示した。
　（比較例Ａ１）
　ゼラチン短繊維を添加しない以外は、実施例Ａ１と同様にして、細胞凝集体を作製し、凝集状態を観察し、細胞凝集体の細胞活性を測定した。その結果を図４、表１及び２に示した。図４のａ～ｄは、それぞれ、０日目（播種直後）、１日目（播種から２４時間後）、２日目（播種から４８時間後）、及び３日目（播種から７２時間後）の画像である。
　（比較例Ａ２）
　実施例１で得られたゼラチン短繊維の代わりに比較例１で得られたゼラチン短繊維を用いた以外は、実施例Ａ１と同様にして、細胞凝集体を作製し、凝集状態を観察した。なお、後述するように、比較例２では、細胞凝集体を形成していなかったため、細胞とゼラチン短繊維の塊の細胞活性を測定した。その結果を図５、表１及び２に示した。図５のａ～ｄは、それぞれ、０日目（播種直後）、１日目（播種から２４時間後）、２日目（播種から４８時間後）、及び３日目（播種から７２時間後）の画像である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図２、図４、図５及び表１から分かるように、実施例のゼラチン短繊維を用いた実施例Ａ１では、細胞とゼラチン短繊維が凝集し、ゼラチン短繊維が表面に突出していない細胞凝集体が形成されたが、平均繊維長が４００μｍを超える比較例のゼラチン短繊維を用いた比較例Ａ２では、３日間培養しても細胞凝集体を形成することができなかった。一方、ゼラチン短繊維を用いず細胞のみを培養した比較例Ａ１では、培養１日目から細胞凝集体を形成するものの、培養２日目から細胞凝集体の大きさが減少していた。また、表２から分かるように、ゼラチン短繊維を添加することで細胞が増殖しており、細胞凝集体の細胞活性が高いのに対し、ゼラチン短繊維を添加していない場合、細胞は増殖しておらず、細胞凝集体の細胞活性も悪かった。
　（実施例Ａ２）
　１ウェル当たりの細胞数を１×１０4細胞に変更した以外は、実施例Ａ１と同様にして、細胞凝集体を作製し、凝集状態を観察し、８日目の細胞凝集体の細胞活性を測定した。その結果を表３及び表４に示した。
　（実施例Ａ３）
　実施例１で得られたゼラチン短繊維の添加量を０．０４ｍｇ（乾燥時の質量）及び１ウェル当たりの細胞数を１×１０4細胞に変更した以外は、実施例Ａ１と同様にして、細胞凝集体を作製し、凝集状態を観察し、８日目細胞凝集体の細胞活性を測定した。その結果を表３及び表４に示した。
　（比較例Ａ３）
　ゼラチン短繊維を添加せず１ウェル当たりの細胞数を１×１０4細胞に変更した以外は、実施例Ａ１と同様にして、細胞凝集体を作製し、凝集状態を観察し、８日目細胞凝集体の細胞活性を測定した。その結果表３及び表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３及び表４から分かるように、実施例のゼラチン短繊維を用いた実施例Ａ２及びＡ３では、ゼラチン短繊維を添加することで細胞が増殖しており、細胞凝集体の細胞活性が高いのに対し、ゼラチン短繊維を添加していない比較例Ａ３では、細胞は増殖しておらず、細胞凝集体の細胞活性も悪かった。
　本発明のゼラチン短繊維は、細胞と共培養することで細胞凝集体を形成するのに用いることができる。また、本発明の細胞凝集体は、ヒト又はヒト以外の動物の組織の増大、修復又は再生に用いることができる。
１　加温槽
２、２２　紡糸液
３　ノズル吐出口
４，６　コンプレッサー
５　流体噴射口
７　圧力流体
８　ゼラチン長繊維
９　ゼラチン長繊維不織布
１０　不織布製造装置
１１　巻き取りロール
１２　保温容器
２０　フィラメント製造装置
２１　シリンジ
２３　ノズル（吐出口）
２４　加熱紡糸筒
２５　ゼラチンフィラメント
２６　ガイドロール
２７　巻き取り機

Claims (15)

  1. 　ゼラチンを主成分とするゼラチン短繊維であって、
    　水に分散させた際の平均繊維径が５μｍ以上４００μｍ以下であり、かつ平均繊維長が５０μｍ以上４００μｍ以下であり、
    　細胞とともに細胞凝集体を形成するのに用いることを特徴とするゼラチン短繊維。
  2. 　前記ゼラチン短繊維は、架橋されている請求項１に記載のゼラチン短繊維。
  3. 　前記平均繊維径をＤとした場合、その標準偏差は０．６Ｄ以下であり、かつ、前記平均繊維長をＬとした場合、その標準偏差は０．６Ｌ以下である請求項１又は２に記載のゼラチン短繊維。
  4. 　前記ゼラチン短繊維は、水に分散させた際の平均繊維長/平均繊維径で表されるアスペクト比が３以上である請求項１～３のいずれかに記載のゼラチン短繊維。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載のゼラチン短繊維の製造方法であって、
    　ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、
    　前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、
    　前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した繊維を集積させてゼラチン長繊維不織布とし、
    　前記ゼラチン長繊維不織布を切断することでゼラチン短繊維を得ることを特徴とするゼラチン短繊維の製造方法。
  6. 　請求項１～４のいずれかに記載のゼラチン短繊維の製造方法であって、
    　ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、加熱紡糸筒を通過させて乾式紡糸し、
    　得られたゼラチンフィラメント糸を切断することでゼラチン短繊維を得ることを特徴とするゼラチン短繊維の製造方法。
  7. 　前記加熱紡糸筒は鉛直方向に向いている請求項６に記載のゼラチン短繊維の製造方法。
  8. 　前記ゼラチン長繊維不織布又は前記ゼラチンフィラメント糸を架橋した後に、切断する請求項５～７のいずれかに記載のゼラチン短繊維の製造方法。
  9. 　請求項１～４のいずれかに記載のゼラチン短繊維と細胞が凝集された細胞凝集体であり、前記ゼラチン短繊維が前記細胞凝集体の表面に突出していないことを特徴とする細胞凝集体。
  10. 　前記細胞凝集体の平均径が０．６ｍｍ以上である請求項９に記載の細胞凝集体。
  11. 　前記細胞凝集体において、細胞数/ゼラチン短繊維の質量は１ｘ１０4細胞/ｍｇ以上１ｘ１０6細胞/ｍｇ以下である請求項９又は１０に記載の細胞凝集体。
  12. 　請求項１～４のいずれかに記載のゼラチン短繊維及び細胞を培地中で培養することで、細胞とゼラチン繊維が凝集し、ゼラチン短繊維が表面に突出していない細胞凝集体を形成することを特徴する細胞凝集体の製造方法。
  13. 　前記培地において、ゼラチン短繊維の濃度（ゼラチン短繊維の質量/培地の体積）は０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下である請求項１２に記載の細胞凝集体の製造方法。
  14. 　前記培地において、細胞の播種量とゼラチン短繊維の添加量の比（細胞の播種量/ゼラチン短繊維の添加量）は１ｘ１０4細胞/ｍｇ以上１ｘ１０6細胞/ｍｇ以下である請求項１２又は１３に記載の細胞凝集体の製造方法。
  15. 　請求項１～４のいずれかに記載のゼラチン短繊維、細胞及び培地を含み、
    　細胞とゼラチン短繊維が凝集された細胞凝集体を形成するのに用いることを特徴とする細胞凝集体の作製キット。
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