JP7362652B2 - 細胞シート、その製造方法及び作製キット - Google Patents
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Description
本発明の製造方法によれば、培養基材から剥離した後の収縮が抑制されるとともに、細胞活性も高い細胞シートを効率よく簡便に作製することができる。
本発明の作製キットによれば、培養基材から剥離した後の収縮が抑制されるとともに、細胞活性も高い細胞シートを効率よく簡便に作製することができる。
また、ノズル吐出口3の後方に位置し、ノズル吐出口3とは非接触状態の流体噴射口5から前方に向けて圧力流体7を噴射させる。流体噴射口5にはコンプレッサー6から圧力流体(例えば圧空)が供給される。流体噴射口5とノズル吐出口3との距離は5~30mmが好ましい。
押し出された紡糸液は圧力流体7に随伴されてゼラチン長繊維8となり、巻き取りロール11上でゼラチン長繊維不織布9となって堆積される。この時、堆積された長繊維は水分を含んでいたり、完全には固化していないので、繊維交点の少なくとも一部において接している繊維が互いに溶着する。なお、巻き取りロール以外でもネット等で長繊維を捕集し堆積して不織布にしてもよい。
図6(a)に示すように、ゼラチンフィラメント25を、ガイドロール26を通過して巻き取り機27に巻き取ることで、扁平糸が得られる。
図6(b)に示すように、加熱紡糸筒24を出た下部で自重落下するゼラチンフィラメント25をカットすることで、所定長さの中空糸が得られる。
[1] ゼラチンを主成分とするゼラチン短繊維が細胞シート中に分散しており、
前記ゼラチン短繊維は、平均繊維径が1μm以上400μm以下であり、かつ平均繊維長が10μm以上2000μm以下であることを特徴とする細胞シート。
[2] 前記ゼラチン短繊維は、架橋されている、[1]に記載の細胞シート。
[3] 前記細胞シートにおいて、細胞数とゼラチン短繊維の質量の比(細胞数/ゼラチン短繊維の質量)は、1x105細胞/mg以上2.5x106細胞/mg以下である、[1]又は[2]に記載の細胞シート。
[4] 前記ゼラチン短繊維は、平均繊維長/平均繊維径で表されるアスペクト比が3以上である、[1]~[3]のいずれかに記載の細胞シート。
[5] 細胞及びゼラチンを主成分とするゼラチン短繊維を培地中で培養することで、前記ゼラチン短繊維が分散している細胞シートを形成しており、
前記ゼラチン短繊維は、平均繊維径が1μm以上400μm以下であり、かつ平均繊維長が10μm以上2000μm以下であることを特徴とする細胞シートの製造方法。
[6] 培養基材から剥離する前の細胞シートの直径をDS1とし、培養基材から剥離した後の細胞シートの直径をDS2とした場合、DS2/DS1は0.56以上1以下である、[5]に記載の細胞シートの製造方法。
[7] 前記細胞の播種量とゼラチン短繊維の添加量の比(細胞の播種量/ゼラチン短繊維の添加量)は、特に限定されないが、例えば、0.1x105細胞/mg以上7x105細胞/mg以下である、[5]又は[6]に記載の細胞シートの製造方法。
[8] 前記ゼラチン短繊維は、ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した繊維を集積させてゼラチン長繊維不織布とし、前記ゼラチン長繊維不織布を切断することで得られる、[5]~[7]のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
[9] 前記ゼラチン短繊維は、ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、加熱紡糸筒を通過させて乾式紡糸し、得られたゼラチンフィラメント糸を切断することで得られる、[5]~[7]のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
[10] 前記ゼラチン長繊維不織布又はゼラチンフィラメント糸は架橋した後に切断する、[5]~[9]のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
[11] 前記ゼラチン短繊維は、平均繊維長/平均繊維径で表されるアスペクト比が3以上である、[5]~[10]のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
[12] 細胞、ゼラチン短繊維及び培地を含み、
前記ゼラチン短繊維は、平均繊維径が1μm以上400μm以下であり、かつ平均繊維長が10μm以上2000μm以下であり、
細胞シート中にゼラチン短繊維が分散している細胞シートを形成するのに用いることを特徴とする細胞シートの作製キット。
[13] 前記ゼラチン短繊維は、架橋されている、[12]に記載の細胞シートの作製キット。
[14] 前記ゼラチン短繊維は、平均繊維長/平均繊維径で表されるアスペクト比が3以上である、[12]又は[13]に記載の細胞シートの作製キット。
<平均繊維径及び平均繊維長>
ゼラチン短繊維5gと水100mLを含む水分散液をデジタルマイクロスコープ(Zeiss社製、品名「AxioCAM ERc5」)を搭載した倒立顕微鏡(Olympus社製、CKX53、4倍)で観察して撮影した。次に、コンピュータソフトウェア(PhotoRuler,The Genus Incybe)を使用して、撮影した写真から任意に選択した繊維400本の繊維径と繊維長を計測し、400本の繊維の繊維径と繊維長の平均をそれぞれ算出し、平均繊維径及び平均繊維長とした。
<ゼラチン長繊維不織布の作製>
ゼラチンとして新田ゼラチン社製(ゼリー強度262g、原料:アルカリ処理牛骨)を使用し、ゼラチン:水=3:5の質量比(ゼラチン濃度37.5質量%)とし、温度60℃で溶解した。ゼラチン水溶液の60℃における粘度は960~970mPa・sであった。このゼラチン水溶液を紡糸液とし、図5に示す不織布製造装置を使用してゼラチン長繊維不織布を製造した。紡糸液の温度は60℃、ノズル直径(内径)250μm、吐出圧0.2MPa、ノズル高さ5mm、エアー圧力0.375MPa、エアー温度100℃、流体噴射口5とノズル吐出口3との距離は5mm、捕集距離50cmとし、巻き取りローラ11でゼラチン長繊維不織布9を巻き取った。
次いで、ゼラチン長繊維不織布を室温(20℃)で一晩風乾し、その後、真空下(1kPa)、140℃で48時間熱架橋させた。
得られたゼラチン長繊維不織布を5~10mm角に切断し、切断したゼラチン長繊維不織布5gに蒸留水を100mL加えて、超高速回転型ミキサー(フリッチュ社製の「P-11メッサーミル」)を用いて2000rpmで3分間撹拌することで、ゼラチン長繊維不織布を切断してゼラチン短繊維の水分散液を得た。得られたゼラチン短繊維の水分散液(懸濁液)を用いて、上述したとおり、ゼラチン短繊維の平均繊維径と平均繊維長を測定したところ、平均繊維径が40μm(変動係数0.13)であり、平均繊維長が230μm(変動係数0.52)であり、アスペクト比は5.75であった。図4に、ゼラチン短繊維の水分散液をデジタルマイクロスコープ(Zeiss社製、品名「AxioCAM ERc5」)を搭載した倒立顕微鏡(Olympus社製「CKX53」、10倍)で観察して撮影した写真を示した。
次に、繊維懸濁液を-30℃の冷凍庫で凍結させた後、真空凍結乾燥を行い、乾燥したゼラチン短繊維を得た。
製造例1と同様にして、ゼラチン長繊維不織布を作製した。
得られたゼラチン長繊維不織布を、5~10mm角に切断し、切断したゼラチン長繊維不織布5gに蒸留水を100mL加えて、超高速回転型ミキサー(フリッチュ社製の「P-11メッサーミル」)を用いて2000rpmで1分間撹拌することで、ゼラチン短繊維の水分散液を得た。得られたゼラチン短繊維の水分散液(懸濁液)を用いて、上述したとおり、ゼラチン短繊維の平均繊維径と平均繊維長を測定したところ、平均繊維径が40μm(変動係数0.13)であり、平均繊維長が828μm(変動係数0.58)であり、アスペクト比は20.7であった。
次に、繊維懸濁液を-30℃の冷凍庫で凍結させた後、真空度凍結乾燥を行い、乾燥したゼラチン短繊維を得た。
製造例1と同様にして、ゼラチン長繊維不織布を作製した。
得られたゼラチン長繊維不織布を、5~10mm角に切断し、切断したゼラチン長繊維不織布5gに蒸留水を100mL加えて、超高速回転型ミキサー(フリッチュ社製の「P-11メッサーミル」)を用いて2000rpmで10秒間撹拌することで、ゼラチン短繊維の水分散液を得た。得られたゼラチン短繊維の水分散液(懸濁液)を用いて、上述したとおり、ゼラチン短繊維の平均繊維径と平均繊維長を測定したところ、平均繊維径が40μm(変動係数0.13)であり、平均繊維長が1469μm(変動係数0.47)であり、アスペクト比は36.7であった。
次に、繊維懸濁液を-30℃の冷凍庫で凍結させた後、真空度凍結乾燥を行い、乾燥したゼラチン短繊維を得た。
<細胞シートの作製>
24ウェルプレート(コーニング社製、平底、培養面の面積1.9cm2)の各ウェルにアスコルビン酸リン酸塩を10μMとなるように添加した培地(MEMα、10%牛胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)1mLと、製造例1で得られたゼラチン短繊維を下記表1に示す配合量で添加した後、マウス線維芽細胞MC3T3-E1細胞を1ウェル当たりの細胞数が1.0×105細胞となるように播種した。その後、24ウェルプレートを37℃、5%のCO2の条件でインキュベートした。培地の交換は2日に一回行った。5日間培養し細胞シートを作製した。
ゼラチン短繊維として製造例2で得られたゼラチン短繊維を用い、配合量を1mgにした以外は、実施例1と同様にして細胞シートを作製した。
ゼラチン短繊維として製造例3で得られたゼラチン短繊維を用い、配合量を1mgにした以外は、実施例1と同様にして細胞シートを作製した。
ウェルプレートを温度感応性培養皿(UpCell、CellSeed社)の12ウェルプレート(平底、培養面の面積3.8cm2)に変更し、製造例3で得られたゼラチン短繊維の配合量を0.4mgとした以外は、実施例6と同様にして細胞シートを作製した。
ゼラチン短繊維を添加していない以外は、実施例1と同様にして細胞シートを作製した。
ゼラチン短繊維に変えてポリエチレンテレフタレート(PET)短繊維[平均繊維径54.1μm(変動係数0.10)、平均繊維長1700μm(変動係数0.51)]を用い、配合量を1mgとした以外は、実施例1と同様にして細胞シートを作製した。
ゼラチン短繊維を添加していない以外は、実施例7と同様にして細胞シートを作製した。
まず、細胞シートを剥離する前に、デジタルカメラ(オリンパス社製「VH-515」)で撮影した。得られた画像から、細胞シートの直径(DS1)を測定した。
次に、ウェルプレートと細胞シートの界面に、ピペットを用いて培地を吐出した。その液流によりウェルプレートから細胞シートを剥離した。ウェルプレートから培地を除去して、細胞シートをウェルプレート底面に広げ、デジタルカメラ(オリンパス社製「VH-515」)で撮影した。得られた画像から、細胞シートの直径(DS2)を測定した。
次に、剥離した後の細胞シートの直径DS2と剥離する前の細胞シートの直径DS1の比、DS2/DS1を求め、細胞シートの収縮性を評価した。その結果を下記表1に示した。
剥離した細胞シートを培地とともに新しい24ウェルプレートに移動した。その後、培地を除去し、培地がない状態で37℃、5%CO2の条件で、30分間インキュベートして細胞シートをウェルプレートに接着させた。アスコルビン酸リン酸塩を10μMとなるように添加した培地(MEMα、10%牛胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を2mL加えて、37℃、5%CO2の条件で培養した。24時間目に培養上清を回収し、回収した培養上清中のグルコース濃度をグルコース測定キット(グルコースCII-テストワコー、富士フイルム和光純薬)を用いて定量し、未使用の培地のグルコース濃度と比較することで、グルコース消費量を計算した。その結果を下記表2に示した。
グルコース消費量の測定で用いた24ウェルプレートから培地を除去し、トリプシンEDTA溶液を0.6mL加えて10分間37℃でインキュベートした。その後マイクロピペットでピペッティングをして細胞シートを解離し、さらに10分間37℃でインキュベートした。0.4mLの培地を加えたあと、トリパンブルーで染色し、血球計算板で細胞数を計測した。
実施例7及び比較例3において、細胞シートが形成した温度感応性培養皿(UpCell、CellSeed社)を、振盪機(ThermoMixerC、エッペンドルフ社)の上に置き25℃、300rpmで振盪させた。細胞シートが培養皿から剥がれて、培地中で浮遊するまでの時間を剥離時間として計測した。その結果を下記表3に示す。
2、22 紡糸液
3 ノズル吐出口
4,6 コンプレッサー
5 流体噴射口
7 圧力流体
8 ゼラチン長繊維
9 ゼラチン長繊維不織布
10 不織布製造装置
11 巻き取りロール
12 保温容器
20 フィラメント製造装置
21 シリンジ
23 ノズル(吐出口)
24 加熱紡糸筒
25 ゼラチンフィラメント
26 ガイドロール
27 巻き取り機
Claims (14)
- ゼラチンを主成分とするゼラチン短繊維が細胞シート中に分散しており、
前記ゼラチン短繊維は、平均繊維径が1μm以上400μm以下であり、かつ平均繊維長が10μm以上2000μm以下であることを特徴とする細胞シート。 - 前記ゼラチン短繊維は、架橋されている請求項1に記載の細胞シート。
- 前記細胞シートにおいて、細胞数とゼラチン短繊維の質量の比(細胞数/ゼラチン短繊維の質量)は、1x105細胞/mg以上2.5x106細胞/mg以下である請求項1又は2に記載の細胞シート。
- 前記ゼラチン短繊維は、平均繊維長/平均繊維径で表されるアスペクト比が3以上である請求項1~3のいずれかに記載の細胞シート。
- ゼラチンを主成分とするゼラチン短繊維が細胞シート中に分散している細胞シートの製造方法であって、
細胞及びゼラチンを主成分とするゼラチン短繊維を培地中で培養する工程を含み、
前記ゼラチン短繊維は、平均繊維径が1μm以上400μm以下であり、かつ平均繊維長が10μm以上2000μm以下であることを特徴とする細胞シートの製造方法。 - 培養基材から剥離する前の細胞シートの直径をDS1とし、培養基材から剥離した後の細胞シートの直径をDS2とした場合、DS2/DS1は0.56以上1以下である請求項5に記載の細胞シートの製造方法。
- 前記細胞の播種量とゼラチン短繊維の添加量の比(細胞の播種量/ゼラチン短繊維の添加量)は、0.1x105細胞/mg以上7x105細胞/mg以下である請求項5又は6に記載の細胞シートの製造方法。
- 前記ゼラチン短繊維は、ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した繊維を集積させてゼラチン長繊維不織布とし、前記ゼラチン長繊維不織布を切断することで得られる請求項5~7のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
- 前記ゼラチン短繊維は、ゼラチンを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、加熱紡糸筒を通過させて乾式紡糸し、得られたゼラチンフィラメント糸を切断することで得られる請求項5~7のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
- 前記ゼラチン長繊維不織布又はゼラチンフィラメント糸は架橋した後に切断する請求項8又は9に記載の細胞シートの製造方法。
- 前記ゼラチン短繊維は、平均繊維長/平均繊維径で表されるアスペクト比が3以上である請求項5~10のいずれかに記載の細胞シートの製造方法。
- 細胞、ゼラチン短繊維及び培地を含み、
前記ゼラチン短繊維は、平均繊維径が1μm以上400μm以下であり、かつ平均繊維長が10μm以上2000μm以下であり、
細胞シート中にゼラチン短繊維が分散している細胞シートを形成するのに用いることを特徴とする細胞シートの作製キット。 - 前記ゼラチン短繊維は、架橋されている請求項12に記載の細胞シートの作製キット。
- 前記ゼラチン短繊維は、平均繊維長/平均繊維径で表されるアスペクト比が3以上である請求項12又は13に記載の細胞シートの作製キット。
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中村耕一郎ほか,ゼラチンハイドロゲル不織布の細胞シートキャリア膜としての活用,第18回日本再生医療学会総会 抄録集,2019年02月22日,p.560 (P-02-043) |
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