CN114432498B - 一种骨修复材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了骨修复材料，包括促成骨因子1、羟丁基壳聚糖和负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒和羟丁基壳聚糖分散于促成骨因子1溶液中获得所述骨修复材料；所述骨修复材料植入体内后，羟丁基壳聚糖凝胶化并释放促成骨因子1；通过近红外光照射可控制促成骨因子2从负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒中释放出来。本申请的骨修复材料实现了对成骨过程的时空序列调控，通过时间与空间的精准调控实现对促成骨因子的按需递送，促进高效成骨，从而降低药物副作用并有效降低成本。

Description

一种骨修复材料及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种骨修复材料及其制备方法和应用。
背景技术
注射型骨缺损修复材料因具有创伤小、便于修复不规则骨缺损的优势，在骨再生与骨组织工程领域展现出广阔的应用前景。为了提高生物材料的骨修复效果，常需要负载药物、细胞因子及蛋白等生物活性分子以促进新骨形成。然而，如何实现负载药物的时序控释与按需精准释放，使得材料中所负载的药物或因子在最低载荷量发挥最大效果，从而降低成本，减小药物副作用，是目前亟待解决的问题。例如，材料植入后需要募集自体干细胞到达缺损区域，随后促进干细胞的成骨向分化。因此，在骨损伤修复与骨再生过程中，若能够在适当时间序列、按需精准递送生物活性分子，时序调控干细胞趋化与成骨分化过程，可使载药效果最大化，不仅能够高效修复骨缺损，并且能够降低成本，减小药物副作用，减轻社会经济负担。
然而，现有的骨修复材料在诱导因子递送方面存在以下问题：1)多采用缓释设计策略，虽能够使得负载药物缓慢长期释放，但并不能够根据需要按时释放；2)双重或多重载药系统的两种或多种药物由于载体材料的限制常为同时释放，难以根据成骨过程的不同阶段实现序列递送；3)部分双重或多重载药系统虽然利用不同材料的降解特性实现序列递送，但递送时间与剂量依赖于材料的降解特性，具有不可控性。如何实现双重因子的时序按需控释，即在所需时间、按照需要精准释放，是目前尚未解决的难题。
刺激释放的设计理念为解决上述问题、实现因子的时序按需释放带来可能。相比于PH改变、温度改变、超声刺激等方法，近红外光(NIR)刺激作用温和，避免不必要的刺激损伤。目前，近红外光刺激释放多用于抗肿瘤，例如专利申请“一种近红外光响应的纳米颗粒及控释系统(申请号：CN202010616171.2)”和专利申请“一种基于黑磷的水凝胶近红外光可控释药系统及其制备方法(申请号：CN201711307308.0)”。近红外光刺激释放体系尚未应用于骨再生领域。
发明内容
本发明提供了一种时空序列调控与按需精准释放的骨修复材料，该材料包括促成骨因子1、羟丁基壳聚糖和负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒和羟丁基壳聚糖分散于促成骨因子1溶液中获得所述骨修复材料。
羟丁基壳聚糖(HBC)，在4℃时为液态，在37℃下转换为凝胶态。骨修复材料植入体内后，羟丁基壳聚糖凝胶化并释放促成骨因子1。负载可通过近红外光控制释放的促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒具有近红外光响应的特性。在空间位置上，促成骨因子2位于材料内部分散的nHA@PDA表面，在时间上在近红外光刺激下按时按需精准释放促成骨因子2，实现晚期按需递送促成骨因子2。另外，羟基磷灰石纳米颗粒(nHA)为新骨形成提供必须的无机原料。具体的，(1)将羟基磷灰石纳米颗粒分散于多巴胺盐溶液中获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒：多巴胺盐溶液与所述羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为5:2；多巴胺盐溶液为多巴胺-Tris盐酸盐溶液；采用超声震荡和/或磁力搅拌使得所述羟基磷灰石纳米颗粒分散于所述多巴胺盐溶液中，然后离心去除未反应的多巴胺分子，获得所述聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒。
(2)促成骨因子1为骨修复早期能够促进骨修复进程的药物或营养物、促成骨因子2为骨修复后期能够促进骨修复进程的药物或营养物；优选的，促成骨因子1为趋化间充质干细胞的药物、促成骨因子2为通过表观遗传调控促成骨的药物；更优选的，促成骨因子1为辛伐他汀、促成骨因子2为帕吉林。
(3)将聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒分散于促成骨因子2溶液中获得负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒。当促成骨因子2为帕吉林时，帕吉林与聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为25.5:1。
(4)近红外光刺激强度为0.2W/cm2。
更具体的，每100mg羟基磷灰石纳米颗粒分散于20mL2 mg/mL多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，超声震荡10min使羟基磷灰石纳米颗粒均匀分散于多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，然后使用磁力搅拌600rpm继续在室温条件下反应6h；反应结束后，通过12000rpm离心20min除去未反应多巴胺分子，所得沉淀用去离子水洗涤3次，每次通过12000rpm离心10min除去上清，获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒。
用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液配制浓度为10mM帕吉林盐酸盐溶液，将50mg聚多巴胺包裹的纳米羟基磷灰石颗粒分散于1mL上述帕吉林溶液中，超声震荡10min使聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒充分分散于帕吉林溶液中；随后置于旋转摇床中60rpm室温反应6h，12000rpm离心5min弃上清，冻干，获得负载帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒。
10mM的辛伐他汀乙醇溶液用1×磷酸缓冲液溶液稀释，获得终浓度为0.2μM的辛伐他汀溶液；称取50mg负载盐酸帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒加入1mL辛伐他汀溶液中，反复吹打使其充分混匀，然后加入50mg冻干羟丁基壳聚糖，4℃静置过夜使羟丁基壳聚糖充分溶解，即配制完成负载辛伐他汀与盐酸帕吉林的双重刺激响应性骨修复材料。
本发明还提供一种骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将羟基磷灰石纳米颗粒分散于多巴胺盐溶液中获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
(2)将聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒分散于促成骨因子2溶液中获得负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
(3)负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒和羟丁基壳聚糖分散于促成骨因子1溶液中获得骨修复材料；
骨修复材料植入体内后，羟丁基壳聚糖凝胶化并释放促成骨因子1，通过近红外光照射可控制促成骨因子2从所述负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒中释放出来。
具体的，(1)将羟基磷灰石纳米颗粒分散于多巴胺盐溶液中获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒：多巴胺盐溶液与所述羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为5:2；多巴胺盐溶液为多巴胺-Tris盐酸盐溶液；采用超声震荡和/或磁力搅拌使得所述羟基磷灰石纳米颗粒分散于所述多巴胺盐溶液中，然后离心去除未反应的多巴胺分子，获得所述聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒。
(2)促成骨因子1为骨修复早期能够促进骨修复进程的药物或营养物、促成骨因子2为骨修复后期能够促进骨修复进程的药物或营养物；优选的，促成骨因子1为趋化间充质干细胞的药物、促成骨因子2为通过表观遗传调控促成骨的药物；更优选的，促成骨因子1为辛伐他汀、促成骨因子2为帕吉林。
(3)将聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒分散于促成骨因子2溶液中获得负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒。当促成骨因子2为帕吉林时，帕吉林与聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为25.5:1。
(4)近红外光刺激强度为0.2W/cm2。
更具体的，(1)每100mg羟基磷灰石纳米颗粒分散于20mL2 mg/mL多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，超声震荡10min使羟基磷灰石纳米颗粒均匀分散于多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，然后使用磁力搅拌600rpm继续在室温条件下反应6h；反应结束后，通过12000rpm离心20min除去未反应多巴胺分子，所得沉淀用去离子水洗涤3次，每次通过12000rpm离心10min除去上清，获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
(2)用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液配制浓度为10mM帕吉林盐酸盐溶液，将50mg聚多巴胺包裹的纳米羟基磷灰石颗粒分散于1mL上述帕吉林溶液中，超声震荡10min使聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒充分分散于帕吉林溶液中；随后置于旋转摇床中60rpm室温反应6h，12000rpm离心5min弃上清，冻干，获得负载帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒；
(3)10mM的辛伐他汀乙醇溶液用1×磷酸缓冲液溶液稀释，获得终浓度为0.2μM的辛伐他汀溶液；称取50mg负载盐酸帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒加入1mL辛伐他汀溶液中，反复吹打使其充分混匀，然后加入50mg冻干羟丁基壳聚糖，4℃静置过夜使羟丁基壳聚糖充分溶解，即配制完成负载辛伐他汀与盐酸帕吉林的双重刺激响应性骨修复材料。
本发明还提供一种前述的骨修复材料或前述的制备方法制备的骨修复材料在骨缺陷修复以及骨再生领域的应用，该应用为将所述骨修复材料注射到待修复部位附近。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明采用羟丁基壳聚糖(HBC)温敏性水凝胶作为骨修复材料的载体，羟丁基壳聚糖仅通过温度变换即可实现溶胶-凝胶转换，不依赖紫外交联、化学交联等转换方式，具有良好的生物相容性与合适的降解特性；同时，相比于其他温敏性水凝胶，其溶胶-凝胶转换温度为37℃，与体温最为接近。羟丁基壳聚糖可在低于临界溶液温度时呈溶胶状态，适合作为注射剂型，适用于不规则、非承重部位的骨缺损修复，在低于体温条件下以液态形式保存与运输，在植入体内后转换为凝胶态，在注射即刻以溶胶态快速充盈骨缺损，在凝胶转换后成型并保持在骨缺损局部。本发明中，随着羟丁基壳聚糖的凝胶化与体内降解，其负载的促成骨因子1得到释放。
(2)本发明采用近红外光(NIR)作为控制释放的激发方式，近红外光刺激释放与其他刺激释放方式(如PH改变、温度改变、超声震荡等)相比，更加温和，不仅对周围健康组织无不良影响，且近红外光本身也具有一定的促成骨作用。
(3)本发明制备聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒(nHA@PDA)作为近红外光响应材料，其不仅可以在近红外光刺激下释放负载的药物，且羟基磷灰石为骨组织的基本无机成分，释放药物后随着纳米羟基磷灰石颗粒的降解为新骨形成提供必须的原材料。另外，聚多巴胺作为一种仿生型生物大分子，具有良好的生物相容性和可忽略的毒性，其注射或植入活生物体后无明显抗原反应。同时，溶血实验及血常规分析已证实，生物提取和化学合成的聚多巴胺均具有良好的血液相容性。
(4)本发明的骨修复材料，外层羟丁基壳聚糖水凝胶与内部分散的nHA@PDA负载的双重促成骨因子实现了按需的空间分布，通过近红外光刺激实现了按需精准的时序调控，从而实现对成骨过程的时空序列调控与按需精准控释，促进高效成骨，从而降低药物副作用并有效降低成本，从而为骨缺损患者带来福音，提供社会经济价值。
(5)本申请中采用的促成骨因子辛伐他汀能够趋化干细胞，帕吉林能够通过表观遗传学调控促进干细胞成骨，并且辛伐他汀与盐酸帕吉林按照时间顺序先后递送，不仅能够趋化干细胞，并且能够协同促进成骨，使得促成骨效果最大化。另外，这两种药物都是小分子化合物，负载于材料中易于生产和保存。
附图说明
图1为羟基磷灰石纳米颗粒(nHA)及聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒(nHA@PDA)扫描电镜(SEM)及透射电镜(TEM)图；
图2为本发明骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA-PGL)及对照材料的溶胶-凝胶转变示意图；
图3为本发明骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA-PGL)及对照材料的扫描电镜图；
图4为本发明骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA-PGL)在不同近红外光刺激强度下温度随时间变化曲线图；
图5为本发明骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA-PGL)及对照材料在0.2W/cm2近红外光刺激强度下光热效应图；
图6为辛伐他汀与帕吉林释放曲线图，其中图6A为帕吉林载荷于纳米羟基磷灰石颗粒表面的近红外光控释骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA-PGL)与帕吉林载荷于HBC中的非近红外光控释对照组材料(HBC+SIM+PGL+nHA@PDA)的帕吉林释放曲线图；图6B为本发明骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA-PGL)的辛伐他汀释放曲线；
图7为辛伐他汀、帕吉林趋化小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的能力检测，其中图7A为不同辛伐他汀浓度趋化小鼠BMMSCs能力的结晶紫染色图；图7B为辛伐他汀(浓度为0.2μM)、帕吉林趋化BMMSCs迁移能力结晶紫染色图及穿膜细胞数量比较；图7C为辛伐他汀(浓度为0.2μM)、帕吉林趋化BMMSCs在纤维蛋白凝胶内垂直向迁移能力的细胞核DAPI染色图；
图8为负载辛伐他汀、帕吉林骨修复材料体外促进小鼠BMMSCs成骨向分化能力检测，其中图8A为7天碱性磷酸酶染色(ALP)图；图8B为qPCR检测不同种类骨修复材料促进BMMSCs成骨相关基因Alp、Runx2、Ocn、Col-1的表达情况；
图9为采用不同骨修复材料小鼠BMMSCs二甲基化H3K4在骨钙素(Ocn)启动子区域的表达水平；
图10为注射型骨修复材料体内修复C57小鼠颅骨缺损的情况，其中图10A为注射型骨修复材料修复C57小鼠颅骨双侧3mm骨缺损的实验流程图；图10B为骨修复材料修复颅骨缺损的Micro-CT扫描三维重建图；图10C为Micro-CT定量分析图；
图11为骨修复材料体内趋化C57小鼠颅骨缺损部位间充质干细胞(MSCs)的情况，其中图11A为流式细胞仪筛选CD45阴性、Ter119阴性、CD140a阳性及Sca-1阳性(CD45-Ter119-CD140a+Sca-1+)的MSCs细胞群；图11B为无辛伐他汀骨修复材料(HBC+nHA@PDA)及载荷辛伐他汀骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA)趋化C57小鼠颅骨缺损部位CD45-Ter119-CD140a+Sca-1+的MSCs细胞数；
图12为本发明骨修复材料制备及应用原理图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种骨修复材料
其制备方法如下:
(1).羟丁基壳聚糖的制备
羟丁基壳聚糖(HBC)的合成分为壳聚糖的碱化、改性、后处理三个步骤：称取1g壳聚糖(Sigma,美国)粉末分散于20mL NaOH溶液(50％，w/w)中进行碱化处理，室温搅拌48h，过滤去除多余碱液。将碱化完成的壳聚糖加入异丙醇/水(1:1，v/v)溶液中室温分散24h至碱化壳聚糖在异丙醇体系中完全分散。将20mL 1,2-环氧丁烷(Aladdin，中国)缓慢滴加入反应瓶中，置于加热磁力搅拌器中55℃反应48h。反应完毕后，冷却至室温，向反应液中滴加0.1M HCl溶液调节体系pH至中性。将溶液装入透析袋中(8000-14000D)，蒸馏水充分透析3～4天，每隔8h更换蒸馏水。透析完成后取出透析的液体，过滤去除不溶杂质，放置于-20℃冰箱中冷冻24h以上，冷冻干燥约60h获得羟丁基壳聚糖(HBC)样品。
(2).聚多巴胺包裹羟基磷灰石纳米颗粒(nHA@PDA)的制备
配制10mM Tris-HCl盐溶液，使用1M NaOH溶液调节Tris-HCl盐溶液pH至8.5。称取40mg多巴胺盐酸盐粉末溶于20ml Tris-HCl盐溶液，得到2mg/mL多巴胺-Tris盐酸盐溶液。称取100mg羟基磷灰石纳米颗粒(Sigma，美国，货号677418)(Nano-hydroxyapatite,nHA)分散于20mL多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，超声震荡10min使nHA均匀分散于多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，然后使用磁力搅拌(600rpm)继续在室温条件下反应6h。反应结束后，通过高速离心(12000rpm，20min)除去未反应多巴胺分子，所得沉淀用去离子水洗涤3次，每次通过高速离心(12000rpm，10min)除去上清，获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒(nHA@PDA)。
具有邻苯二酚及氨基功能团的多巴胺分子在弱碱条件下可自发聚合形成聚多巴胺涂层，因此，nHA分散于pH＝8.5的多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，体系内的多巴胺分子聚合在nHA表面，形成聚多巴胺包裹的nHA颗粒(nHA@PDA)，其在扫描电镜及透射电镜下图像如图1所示，其粒径大致分布在30-50nm。在透射电镜下，nHA@PDA颗粒较nHA颗粒粒径稍大，表面能观察到约5-10nm厚度的聚多巴胺涂层。
(3).聚多巴胺包裹羟基磷灰石纳米颗粒载荷盐酸帕吉林
用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液配制浓度为10mM(1.957mg/mL)帕吉林(PGL)盐酸盐(Sigma,美国)溶液。将50mg聚多巴胺包裹的纳米羟基磷灰石颗粒分散于1mL上述帕吉林溶液中(其中颗粒与帕吉林质量比为25.5:1)，超声震荡10min使聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒充分分散于帕吉林溶液中。随后置于旋转摇床中(60rpm)，室温反应6h，12000rpm离心5min弃上清，冻干，获得负载帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒(nHA@PDA-PGL)。
(4).负载辛伐他汀及盐酸帕吉林的温度、近红外双重响应性骨修复材料的制备
以乙醇为溶剂配制浓度为10mM的辛伐他汀(SIM)溶液，使用1×磷酸缓冲液溶液稀释，获得终浓度为0.2μM的辛伐他汀溶液。称取50mg负载盐酸帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒加入1mL辛伐他汀溶液中，反复吹打使其充分混匀，然后加入50mg冻干HBC，4℃静置过夜使HBC充分溶解，即配制完成负载辛伐他汀与盐酸帕吉林的双重刺激响应性骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA-PGL)。
实施例2、骨修复材料的温敏特性及形貌分析
(1).骨修复材料的温敏特性检测
HBC、HBC+nHA@PDA(分散有聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒的羟丁基壳聚糖温敏性水凝胶)、HBC+SIM+nHA@PDA-PGL在4℃条件下均为半透明、流动性良好的溶胶状，倾斜玻璃瓶可见其液面与水平面保持平行(图2)。将玻璃瓶置于37℃恒温水浴锅中，随时间增加，水凝胶体系逐渐浑浊，将玻璃瓶倾斜45°水凝胶液面不再移动，倒置玻璃瓶，水凝胶展现为不可流动的固态凝胶(图2)。HBC在体温(37℃)条件下成功实现由流动溶胶态向成型凝胶态的转换，加入nHA及促成骨因子1、2均未影响HBC的溶胶-凝胶转变特性。
(2).形貌分析
使用真空冷冻干燥机将HBC、HBC+nHA@PDA、HBC+SIM+nHA@PDA-PGL水凝胶冻干，用刀片切开水凝胶暴露截面，真空喷金，通过SU8010场发射扫描电镜(Hitachi，日本)观察水凝胶截面形貌及内部微结构，电压为5.0kV。利用图像分析软件Image J分析水凝胶内部孔隙结构，并拍摄3个视野计算平均孔隙直径。
水凝胶的表面形貌经扫描电镜表征，如图3显示，HBC、HBC+nHA@PDA、HBC+SIM+nHA@PDA-PGL水凝胶内部疏松多孔，形貌较好，经Image J软件分析，三种水凝胶内部孔径均为50～100μm，此孔径大小有利于细胞的爬入、营养物质的吸收与细胞代谢废物的排除，加入nHA及促成骨因子1、2后对HBC的疏松微孔尺寸没有产生明显的影响。
实施例3、骨修复材料的近红外光刺激响应性及因子释放情况检测
为检测骨修复材料的近红外光(NIR)刺激响应性与光照强度的关系，实验使用808nm波长的近红外激光激发器(长春新产业，中国)对HBC+SIM+nHA@PDA-PGL水凝胶进行不同强度的近红外光照，同时，使用热成像仪(Testo，德国)记录水凝胶的温度变化。结果如图4显示，0.2W/cm2红外刺激强度下，水凝胶温度升高不超过10℃，考虑该骨修复材料将应用于体内，局部组织的升温过高不利于骨组织再生，因此后续实验选取的近红外光刺激强度为0.2W/cm2。
为进一步检测不同种类水凝胶在0.2W/cm2红外光照强度下的温度变化是否存在差异，采用热成像仪记录10分钟内不同种类水凝胶的温度变化。如图5显示，HBC水凝胶本身不具有光热特性，HBC+nHA@PDA具有光热效应，载入辛伐他汀和帕吉林不影响水凝胶的光热特性。
为检测近红外光刺激对骨修复材料释放帕吉林的影响，使用Transwell小室将HBC+SIM+nHA@PDA-PGL水凝胶注射入小室上室并浸泡于PBS溶液中，HBC+SIM+PGL+nHA@PDA水凝胶(该水凝胶中PGL与SIM同时载荷于外层HBC内，PGL不是NIR控释)作为非NIR控释对照组。在释放第3、7、11天分别增加近红外光照刺激，通过紫外分光光度计检测不同时间点溶液中帕吉林的浓度，计算并绘制帕吉林的释放曲线。如图6A所示，非NIR控释对照组(HBC+SIM+PGL+nHA@PDA)，水凝胶持续快速释放帕吉林，并在第11天释放超过80％的帕吉林。NIR控释骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA-PGL)在HIR刺激下按照需要的时间开启帕吉林的快速释放，非刺激条件下释放缓慢，实现按需的NIR刺激响应释放特性。实验同时采用高效液相色谱仪记录不同时间点骨修复材料(HBC+SIM+nHA@PDA-PGL)的辛伐他汀释放浓度，并绘制辛伐他汀释放曲线。如图6B所示，水凝胶在24小时内可释放大于5％的辛伐他汀，72小时内辛伐他汀释放率约10％，随后随时间的不断增加，辛伐他汀释放减慢。因此，水凝胶在早期快速释放低浓度辛伐他汀的特性有利于其在注射入骨缺损部位早期迅速招募间充质干细胞，晚期按需释放帕吉林精准调控趋化的间充质干细胞向成骨向分化。
实施例4、骨修复材料的体外间充质干细胞趋化效果及促成骨效果检测。
使用Transwell法检测体外不同浓度辛伐他汀趋化小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的能力，细胞培养24小时后擦去Transwell小室上室上表面细胞，并结晶紫染色。光学显微镜下观察穿膜细胞的多少，结果如图7A所示，辛伐他汀趋化BMMSCs迁移具有浓度依赖特性，最优浓度为0.2μM。采用相同方法检测检测帕吉林是否具有协同趋化BMMSCs的能力，结晶紫染色及Image J计算穿膜细胞数量结果显示(图7B)，帕吉林不具有明显趋化BMMSCs的能力，而0.2μM浓度的辛伐他汀具有明显趋化BMMSCs迁移的能力，且与帕吉林共同作用时，其趋化能力不受影响。为进一步观察辛伐他汀趋化BMMSCs垂直向迁移的能力，将BMMSCs均匀接种于纤维蛋白凝胶中，细胞凝胶上层添加不同种类的培养基，细胞培养24小时及72小时后，通过DAPI染色观察细胞在凝胶内垂直向分布情况。结果如图7C所示，0.2μM浓度的辛伐他汀具有明显趋化BMMSCs垂直向迁移的能力，BMMSCs逐渐迁移至凝胶上层，而基础培养基、含帕吉林培养基组，BMMSCs在凝胶内均匀分散，未发生明显迁移。
使用Transwell法，将BMMSCs接种于小室上室，下室添加置有骨修复材料或对照材料的培养基。培养至24小时，擦去Transwell小室上表面细胞，培养第3天对HBC+nHA@PDA-PGL+NIR组进行近红外光照刺激。7天碱性磷酸酶染色(图8A)结果显示，添加辛伐他汀组(SIM(+))相较于不添加辛伐他汀组(SIM(-))具有明显更多的细胞数量，载荷帕吉林的骨修复材料碱性磷酸酶的表达量更多，近红外光照刺激进一步促进骨修复材料释放帕吉林，增加了碱性磷酸酶的表达。
同样，使用qPCR检测骨修复材料及对照材料促进BMMSCs成骨相关基因Alp、Runx2、Ocn、Col-1的表达。结果如图8B所示，相较于未载荷药物的骨修复材料及载荷辛伐他汀的骨修复材料，载荷帕吉林的骨修复材料可明显促进BMMSCs成骨相关基因的表达，近红外光照刺激组进一步提高帕吉林的释放浓度，促进成骨相关基因的表达。小分子药物帕吉林具有更为显著的促进BMMSCs成骨向分化能力，近红外光控释骨修复材料可调节帕吉林的释放，进一步促进BMMSCs成骨向分化。
实施例5、骨修复材料的通过表观遗传学途径促进间充质干细胞的成骨向分化。
使用Transwell法，BMMSCs细胞接种于Transwell下室孔板内，HBC+nHA@PDA及HBC+nHA@PDA-PGL水凝胶注射入Transwell小室内。培养第3天，对HBC+nHA@PDA-PGL水凝胶施加近红外光照刺激。培养第7天，通过染色质免疫共沉淀检测二甲基化H3K4在骨钙素(Ocn)启动子区域的表达水平。结果如图9所示，HBC+nHA@PDA-PGL+NIR组二甲基化H3K4在骨钙素启动子区域的表达水平约为HBC+nHA@PDA组的两倍，两组间组蛋白H3的表达水平(阳性对照)并无较大差异。同时，检测阴性对照IgG组以排除假阳性结果的可能性。因此，帕吉林作为单胺氧化酶抑制剂可抑制赖氨酸特异性脱甲基酶LSD1的活性，通过提高成骨相关基因启动子区H3K4的二甲基化水平，使得成骨相关基因转录激活来促进BMMSCs的成骨分化。
实施例6、骨修复材料的体内注射型应用实例及体内间充质干细胞趋化、促成骨效果检测。
如图10A所示，使用6-8周龄雄性C57小鼠，制备双侧颅骨缺损模型，缺损直径为3mm，缺损部位注射入骨修复材料，注射后第3、7、11天对缺损部位进行近红外光照刺激。12周后取材，进行Micro-CT及组织学分析。Micro-CT扫描三维重建显示(图10B)，颅骨缺损部位边缘到中心出现了不同程度的新骨形成，载荷辛伐他汀与帕吉林的骨修复材料较非载药组新骨形成量更多，且近红外光控释组新生骨组织明显更多。同时，对各组的骨体积/组织体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁数量(Tb.N)进行分析，结果显示(图10C)，近红外光控释帕吉林组BV/TV及Tb.N明显高于非载药组，具有更快和更好的骨整合能力，以促进成新骨形成。帕吉林非控释组较非载药组促进新骨形成能力增强不明显，表明通过近红外光照刺激适当调控帕吉林的释放，可有效调节MSCs的成骨分化并增强骨再生。
为验证辛伐他汀体内趋化间充质干细胞(MSCs)迁移的能力，使用C57小鼠颅骨缺损模型，在缺损部位注射入骨修复材料。骨修复材料注射后第3天，获取缺损部位骨组织及骨修复材料，通过流式细胞仪筛选CD45阴性、Ter119阴性、CD140a阳性及Sca-1阳性(CD45-Ter119-CD140a+Sca-1+)的MSCs细胞群。结果如图11所示，载荷SIM组CD45-Ter119-CD140a+Sca-1+细胞数明显高于无SIM组，表明SIM在体内可有效趋化MSCs迁移至骨缺损部位，为骨缺损局部骨组织再生提供基础。

Claims (10)

1.一种骨修复材料，其特征在于，所述材料包括促成骨因子1、羟丁基壳聚和负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒和羟丁基壳聚糖分散于促成骨因子1溶液中获得所述骨修复材料；所述骨修复材料植入体内后，羟丁基壳聚糖凝胶化并释放促成骨因子1；通过近红外光照射可控制促成骨因子2从所述负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒中释放出来。
2.根据权利要求1所述的骨修复材料，其特征在于，包括如下（1）-（4）的一项或多项：
（1）将羟基磷灰石纳米颗粒分散于多巴胺盐溶液中获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（2）所述促成骨因子1为骨修复早期能够促进骨修复进程的药物或营养物、所述促成骨因子2为骨修复后期能够促进骨修复进程的药物或营养物；或者所述促成骨因子1为趋化间充质干细胞的药物、所述促成骨因子2为通过表观遗传调控促成骨的药物；
（3）将聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒分散于促成骨因子2溶液中获得所述负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（4）近红外光刺激强度为0.2 W/cm2。
3.根据权利要求2所述的骨修复材料，其特征在于，包括如下（1）-（5）的一项或多项：
（1）所述多巴胺盐溶液与所述羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为5:2；
（2）所述多巴胺盐溶液为多巴胺-Tris盐酸盐溶液；
（3）采用超声震荡和/或磁力搅拌使得所述羟基磷灰石纳米颗粒分散于所述多巴胺盐溶液中，然后离心去除未反应的多巴胺分子，获得所述聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（4）所述促成骨因子1为辛伐他汀、所述促成骨因子2为帕吉林；
（5）所述促成骨因子2为帕吉林时，帕吉林与聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为25.5:1。
4.根据权利要求3所述的骨修复材料，其特征在于，包括如下（1）-（3）的一项或多项：
（1）每100 mg羟基磷灰石纳米颗粒分散于20mL 2mg/mL多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，超声震荡10 min使羟基磷灰石纳米颗粒均匀分散于多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，然后使用磁力搅拌600 rpm继续在室温条件下反应6 h；反应结束后，通过12000 rpm离心20 min除去未反应多巴胺分子，所得沉淀用去离子水洗涤3次，每次通过12000 rpm离心10 min除去上清，获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（2）用pH=8.5的Tris-HCl缓冲液配制浓度为10 mM帕吉林盐酸盐溶液，将50 mg聚多巴胺包裹的纳米羟基磷灰石颗粒分散于1mL上述帕吉林溶液中，超声震荡10 min使聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒充分分散于帕吉林溶液中；随后置于旋转摇床中60 rpm室温反应6 h，12000rpm离心5min弃上清，冻干，获得负载帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒；
（3）10 mM的辛伐他汀乙醇溶液用磷酸缓冲液溶液稀释，获得终浓度为0.2 μM的辛伐他汀溶液；称取50 mg 负载盐酸帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒加入1 mL辛伐他汀溶液中，反复吹打使其充分混匀，然后加入50 mg 冻干羟丁基壳聚糖，4℃静置过夜使羟丁基壳聚糖充分溶解，即配制完成负载辛伐他汀与盐酸帕吉林的双重刺激响应性骨修复材料。
5.一种骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将羟基磷灰石纳米颗粒分散于多巴胺盐溶液中获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（2）将聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒分散于促成骨因子2溶液中获得负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（3）负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒和羟丁基壳聚糖分散于促成骨因子1溶液中获得所述骨修复材料；
所述骨修复材料植入体内后，羟丁基壳聚糖凝胶化并释放促成骨因子1，通过近红外光照射可控制促成骨因子2从所述负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒中释放出来。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下（1）-（4）的一项或多项：
（1）将羟基磷灰石纳米颗粒分散于多巴胺盐溶液中获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（2）所述促成骨因子1为骨修复早期能够促进骨修复进程的药物或营养物、所述促成骨因子2为骨修复后期能够促进骨修复进程的药物或营养物；或者所述促成骨因子1为趋化间充质干细胞的药物、所述促成骨因子2为通过表观遗传调控促成骨的药物；
（3）将聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒分散于促成骨因子2溶液中获得所述负载促成骨因子2的聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（4）近红外光刺激强度为0.2 W/cm2。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括如下（1）-（5）的一项或多项：
（1）所述多巴胺盐溶液与所述羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为5:2；
（2）所述多巴胺盐溶液为多巴胺-Tris盐酸盐溶液；
（3）采用超声震荡和/或磁力搅拌使得所述羟基磷灰石纳米颗粒分散于所述多巴胺盐溶液中，然后离心去除未反应的多巴胺分子，获得所述聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（4）所述促成骨因子1为辛伐他汀、所述促成骨因子2为帕吉林；
（5）所述促成骨因子2为帕吉林时，帕吉林与聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒的质量比为25.5:1。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括如下（1）-（3）的一项或多项：
（1）每100 mg羟基磷灰石纳米颗粒分散于20 mL 2mg/mL多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，超声震荡10 min使羟基磷灰石纳米颗粒均匀分散于多巴胺-Tris盐酸盐溶液中，然后使用磁力搅拌600 rpm继续在室温条件下反应6 h；反应结束后，通过12000 rpm离心20 min除去未反应多巴胺分子，所得沉淀用去离子水洗涤3次，每次通过12000 rpm离心10 min除去上清，获得聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒；
（2）用pH=8.5的Tris-HCl缓冲液配制浓度为10 mM帕吉林盐酸盐溶液，将50 mg聚多巴胺包裹的纳米羟基磷灰石颗粒分散于1mL上述帕吉林溶液中，超声震荡10 min使聚多巴胺包裹的羟基磷灰石纳米颗粒充分分散于帕吉林溶液中；随后置于旋转摇床中60 rpm室温反应6 h，12000rpm离心5min弃上清，冻干，获得负载帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒；
（3）10 mM的辛伐他汀乙醇溶液用1×磷酸缓冲液溶液稀释，获得终浓度为0.2 μM的辛伐他汀溶液；称取50 mg 负载盐酸帕吉林的聚多巴胺包裹纳米羟基磷灰石颗粒加入1 mL辛伐他汀溶液中，反复吹打使其充分混匀，然后加入50 mg 冻干羟丁基壳聚糖，4℃静置过夜使羟丁基壳聚糖充分溶解，即配制完成负载辛伐他汀与盐酸帕吉林的双重刺激响应性骨修复材料。
9.权利要求1-4任一项所述的骨修复材料或权利要求5-8任一项所述的制备方法在制备骨修复、骨再生材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述应用为将所述骨修复材料作为注射剂，注射到待修复部位附近。
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Injectable and body temperature sensitive hydrogels based on chitosan and hyaluronic acid for pH sensitive drug release;Wei Zhang et al.;《Carbohydrate Polymers》;20180203;第186卷;第82-90页 *
Patient-specific Scaffolds with a Biomimetic Gradient Environment for Articular Cartilage−Subchondral Bone Regeneration;Cuidi Li et al.;《ACS Appl. Bio Mater.》;20201231;第3卷;第4820-4831页 *
Synthesis and characterization of a chitosan based nanocompositeinjectable hydrogel;Qianqian Wang et al.;《Carbohydrate Polymers》;20151022;第136卷;第1228-1237页 *
壳聚糖/富含血小板血浆凝胶促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究;吴广升等;《口腔颌面修复学杂志》;20200710(第04期);第16-19+45页 *
壳聚糖基可注射型温度敏感性水凝胶;汤玉峰等;《化学进展》;20080324;第57-62页 *

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