CN113699216B - 基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法 - Google Patents

基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于固相捕获靶标，结合滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法。所述检测方法通过将待测分析样本与至少一种固体支持物相连，然后将靶标特异性结合组合物与待测分析样本中的靶标相连，该靶标特异性结合组合物包含有寡核苷酸，以该寡核苷酸为引物介导环状核酸分子的滚环复制得到球状滚环复制产物，通过对滚环复制产物的量化分析从而实现对分析物的定量检测。本发明还涉及显微成像检测和流式细胞术对样本进行定量分析。

Description

基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法
技术领域
本发明属于分析物鉴定与量化检测的领域，具体涉及基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法。
背景技术
据世界卫生组织最新数据表明，2020年中国平均每分钟有8人被确诊癌症，并且该组织指出，约1/3的癌症可以通过早期诊断发现，从而能及时利用特定的医疗措施延长患者生命、减轻癌症痛苦，甚至治愈疾病。例如，在医学界被称为“癌症之王”的胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道肿瘤，大部分胰腺癌患者被确诊时已经伴有至少一处远端转移，并且已不适合开展治愈性手术切除，而对于进展期的胰腺癌患者仍然缺乏行之有效的治疗方式，预后较差。因此，癌症的早期筛查及诊断对于提高癌症治愈率、延长患者生命、提高患者生存质量、改善疾病预后状态均具有非常重要的临床意义。
近几年，外泌体因其在指示癌症病理信息方面的重要作用而受到特别关注，正逐渐成为肿瘤早期诊断和预后的生物标志物之一。外泌体是30～150nm的细胞外囊泡，由正常细胞、肿瘤细胞等主动分泌到体液中。大量的证据表明，肿瘤细胞比正常细胞分泌更多的外泌体，它们携带肿瘤特异性的蛋白质和核酸，并可将这些分子运送到远端受体细胞，重新编程受体细胞以促进肿瘤生长和转移、血管生成等。因此，肿瘤来源外泌体数量水平具有作为液体活检对象的潜力，可为肿瘤早期筛查、治疗反应监测和预后提供评估信息。鉴于外泌体在肿瘤研究中的价值，它促使研究者寻找一种快速有效的肿瘤来源外泌体定量检测方法。蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)等传统的生物学方法已经被用于外泌体的相对定量，但是这些方法需要批量的样本，灵敏度低，不适合肿瘤早期诊断中外泌体含量很低的样本检测。Nanosight主导的纳米粒子追踪分析(NTA)技术也逐渐应用到外泌体定量，但这种方法难以应用于区分不同来源的外泌体或其它类型的粒子，尤其是蛋白质聚集体，只能作为辅助分析技术。此外，流式细胞术是常用的粒子分析技术，具有样本高通量分析优势，但是难以直接分析尺寸只有几十到上百纳米的外泌体。因此，以上技术的这些缺点限制了它们在临床诊断中的应用。目前，尚需要开发能够用于如肿瘤来源外泌体等诊断标志物鉴定与量化的方法，尤其是外泌体绝对定量的技术方法。
发明内容
发明目的：本发明将提供一种用于鉴别检测感兴趣分析物，尤其是对分析物(如外泌体)进行绝对定量的方法。该方法通过检测待分析物上特异性表达的生物分子靶标如蛋白质，实现不同细胞来源分析物如外泌体的种类鉴别，并通过在待分析物上进行靶标特异性的核酸扩增形成的DNA纳米球及其对应的点状信号分析，实现待分析物的高灵敏度检测及绝对定量。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，所述定量检测方法通过将待测分析样本与至少一种固体支持物相连，然后将靶标特异性结合组合物与待测分析样本中的靶标相连，该靶标特异性结合组合物包含有寡核苷酸，以该寡核苷酸为引物介导环状核酸分子的滚环复制得到球状滚环复制产物，通过对滚环复制产物的量化分析从而实现对分析物的定量检测。
其中，所述待测分析样本包括细胞或细胞分泌物，所述细胞包括循环肿瘤细胞，所述细胞分泌物包括外泌体，所述固体支持物包括微球、微粒、成型的聚合物、薄膜、玻璃制品或金属制品或它们的组合。
其中，所述靶标包括DNA、RNA、蛋白质、多肽或蛋白多糖。
其中，所述靶标特异性结合组合物是非共价或共价偶联或连接到寡核苷酸的特异性结合分子，所述特异性结合分子是一种抗体、抗体片段，一种适体，一种寡核苷酸或一种小分子，并且具有靶标结合特异性。
其中，所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸每经过一次环状单链DNA分子长度大小的延伸之后，就会在其3’端增加一段与环状单链DNA分子互补的序列，最终经过多次扩增延伸，靶标特异性结合分子中的寡核苷酸形成一条具有多段序列与所述环状单链DNA分子互补的长单链DNA扩增产物，该长单链DNA扩增产物能够自发卷曲形成几百纳米尺寸的DNA纳米球结构即为球状滚环复制产物。
其中，所述DNA纳米球结构的尺寸与分析样本的尺寸相当。
其中，所述滚环复制中使用具有DNA连接活性的酶和链置换活性的DNA聚合酶使特异性单链DNA分子连接成环并进一步使成环的单链DNA分子扩增延伸形成长单链DNA扩增产物，并形成DNA纳米球。
其中，所述量化分析采用显微成像检测和流式细胞术分析实现。
其中，所述显微成像检测技术采用落射荧光或共聚焦显微镜检术。
具体的，本发明的定量检测方法包括以下步骤：
1)使一个有待分析的样本(例如：可能含一种或多种类型待测分析物的样本)中的分析物与至少一种固体支持物相连；选定每种待测分析物表达的至少一种标志靶标生物分子，使至少一种靶标特异性结合组合物与所述标志靶标接触，并在促进所述靶标特异性结合组合物与所述标志靶标结合的条件下进行孵育，其中每种靶标特异性结合组合物包含一种结合分子以及一种序列的寡核苷酸(可以作为扩增引物在后续过程引发自身的扩增延伸，也可以作为一段起桥连作用的序列以连接单独合成或工程化的单链核酸扩增产物)，其中每种结合分子能够特异性地与特定种类的靶标直接或间接地作用结合，并且其中一种结合分子只与一种序列的寡核苷酸组合形成靶标特异性结合组合物；
2)在步骤1)之前、同时或之后，使所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸与核酸扩增模板接触，并在促进所述寡核苷酸与所述核酸扩增模板结合的条件下进行孵育。其中所述每个核酸扩增模板包含一个单链DNA分子，该分子的序列两端至少各包含一段与所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸序列互补的部分；
3)在步骤2)之后，在促进所述核酸扩增模板连接成环的条件下，使之连接成环状单链DNA分子(例如：通过使用T4 DNA连接酶)。其中，若在步骤2)中，所述核酸扩增模板已经是环状的单链DNA分子，则可以省去第3)步骤。
4)在步骤2)或3)之后，在促进所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸扩增延伸的条件下，使之以所述环状单链DNA分子为模板进行扩增延伸(例如：通过使用phi29 DNA聚合酶，复制反应时间优选40-50分钟或80-100分钟，更优选50-60分钟)。其中，所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸每经过一次环状单链DNA分子长度的延伸之后，就会在其3’端增加一段与环状单链DNA分子互补的序列，最终经过多次扩增延伸，靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸能够形成一条具有多段序列与所述环状单链DNA分子互补的长单链DNA扩增产物。其中该长单链DNA扩增产物能够自发卷曲形成几百纳米尺寸的DNA纳米球结构。其中检测出DNA纳米球序列表明相应靶标的存在，也即表明靶标对应分析物的存在。
5)在步骤4)之后，使所述DNA纳米球与特异性经标记材料接触，并在促进DNA纳米球与特异性经标记材料结合的条件下进行孵育。其中所述经标记材料包含一段与DNA纳米球互补的寡核苷酸序列，并包含信号发射部分。
6)每次使用一种或多种DNA纳米球特异性的经标记材料结合不同种类的DNA纳米球，通过经标记材料发射不同的信号区分不同的分析物特异性DNA纳米球。
7)在步骤6)之后，将该分析样本进行所述信号检测，其中检测到稳定结合有所述经标记材料的DNA纳米球表明分析样本中相应靶标的存在，也即表明靶标对应分析物的存在。其中DNA纳米球的尺寸与某些分析物(如外泌体)的尺寸相当，在分析物表面空间位阻的限制下，一个分析物表面只能形成一个DNA纳米球，与特异性的经标记材料稳定结合后，能够在成像显微镜下形成与背景明显区分的点状信号亮点，因此根据检测到的DNA纳米球形成的点状信号的数目对待分析物进行量化分析。
8)在步骤6)之后，可以不进行步骤7)，将所述分析样本通过流式细胞术检测DNA纳米球的荧光。其中检测到荧光表明分析样本中相应分析物的存在，并且其中分析样本中分析物特异性DNA纳米球的荧光总量与DNA纳米球的数量成线性关系，利用这种对应关系实现通过荧光强度对分析物进行定量分析。其中所述分析样本中的分析物是与微球相连的，但不限于微球。
9)在步骤1)之后，在步骤5)之前，并且不进行步骤2)、3)和4)，使所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸与单独合成的DNA纳米球接触，并在促进所述寡核苷酸与DNA纳米球结合的条件下进行孵育。其中，该DNA纳米球是单独合成的核酸扩增产物，核酸扩增方式与步骤4)中涉及的核酸扩增方式一致，具有多个重复序列单元，除此之外，该DNA纳米球至少包含一段与所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸杂交结合的序列，并且一种DNA纳米球只能与一种所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸杂交结合。
其中，步骤1)中所述有待分析的样本是从血液、尿液、唾液、脑脊液、母乳或细胞培养液中分离得到，来源于非人类或人类。分离方法是至少一种滤膜过滤、离心、商业试剂盒提取纯化、共沉淀或尺寸排阻色谱。
其中，步骤1)中所述有待分析的样本是可能含一种或多种类型待测分析物的样本，应当理解，在分析样本之前，其包含分析物是已知的、怀疑的、未知的或不被怀疑的。对分析物的鉴定依赖于分析物上特异性表达的标志靶标生物分子，该生物分子可以是至少一种蛋白质、蛋白多糖、糖脂、多肽、脂质、核酸以及小分子，应当理解，在鉴定分析物之前，其表达的所述标志靶标生物分子种类是已知的。
其中，在步骤1)中，使所述有待分析样本中的分析物与至少一种固体支持物连接，是至少一种直接连接或间接连接。直接连接是将所述有待分析的样本与至少一种功能化的固体支持物接触，其中若分析物存在于有待分析样本中，则分析物与至少一种固体支持物上的功能基团直接相互作用。功能基团至少是一种化学基团或起连接作用的生物分子。间接连接是将所述有待分析的样本与至少一种捕获剂接触，其中若分析物存在于有待分析样本中，则分析物与至少一种捕获剂直接相互作用，然后将接触捕获剂后的有待分析样本与至少一种固体支持物接触，其中捕获剂能够与至少一种固体支持物直接作用。
其中，在步骤1)中，所述固体支持物是至少一种皿、纤维、微球、微粒、成型的聚合物、薄膜、玻璃制品、金属制品或它们的组合。
其中，在步骤3)中，使用T4 DNA连接酶使所述酸扩增模板连接成环，但不限于T4DNA连接酶。
其中，在步骤4)中，使用phi29 DNA聚合酶使所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸以所述环状单链DNA分子为模板进行扩增延伸，但不限于phi29 DNA聚合酶。
其中，在步骤5)中，所述特异性经标记材料可以是相同的标记，包括被相同的荧光团标记。这种方法只需要单一激发波长和检测器。在其它实施例中，具有不同序列的成像链可以是不同的标记。这种方法可以利用多种激发波长的多通道检测器。
其中，在步骤4)与9)中，所述DNA纳米球通过靶标特异性结合组合物上的寡核苷酸与靶标相连，因此，检测到靶标特异性DNA纳米球表明相应靶标的存在，纳米球的个数能够指示相应靶标在对应分析物中的含量，也因此，该发明能够指示特定分析物(如循环肿瘤细胞)的特定表型(如蛋白质表型)状态。此外，靶标特异性DNA纳米球的存在指示了相应分析物的存在，靶标特异性DNA纳米球大小与一些分析物(如外泌体)的尺寸相当，在分析物表面空间位阻的限制下，一个分析物表面只能最终形成一个DNA纳米球，因此，通过对DNA纳米球的计数实现对分析物的绝对量化分析。
用这种方法可以检测、鉴定并且/或者量化待分析样本中的一种或多种分析物。靶标特异性结合组合物上的寡核苷酸复制延伸的DNA纳米球与经荧光标记成像链杂交后在传统荧光显微镜下能够形成与背景明显区分的分散的点状信号亮点，通过亮点的计数能够对特定的分析物进行量化分析。因此，本发明提供了一种易于实现分析物绝对定量的方法。
同一个有待分析样本中，无论分析物的位置如何，包括不同分析物的相互位置如何接近，本方法都可以通过分析物特有标志靶标对应的DNA纳米球进行区分。DNA纳米球的尺寸可以达到亚微米级别，因此，本发明提供的检测方法不依赖高分辨显微镜进行成像定位分析。本方法可以对多种靶标进行表征，并在分析物原位形成靶标特异性的DNA纳米球，通过对DNA纳米球计数或其结合的经标记材料信号强度定量，能够实现对分析物中靶标的量化分析。因此，本发明提供了一种分析物(如循环肿瘤细胞)特定表型(如蛋白质表型)状态的量化分析。
应当理解，在分析样本之前，靶标特异性结合组合物能否结合在分析样本上，取决于待分析样本中是否存在给定分析物以及所述标志靶标在给定分析物中的表达含量(例如：当给定分析物存在于待分析样本上，并且分析物中包含给定标志靶标，则靶标特异性结合组合物能够与待分析样本结合)。“结合在分析样本上”是指靶标特异性结合组合物结合在其对应标志靶标上。
靶标特异性结合组合物上的特异性结合分子可以是一种抗体或抗体片段。当该特异性结合分子是一种抗体或抗体片段时，步骤1)中所述寡核苷酸可以偶联到其恒定区域。
其中，在步骤1)中，所述寡核苷酸可以通过一个中间接头连接至特异性结合分子。在一些实施例中，一个中间接头包含链霉亲和素和/或生物素。
在一些实施例中，经标记材料可以标记的荧光团是一个、多个或更多个。
该分析样本可以是细胞或者细胞分泌物与至少一种固体支持物相连。该靶标可以是蛋白质或者多肽。
因此可以获知，本发明提供了一种用于检测待分析样本中分析物及分析物中靶标含量的方法，该方法是通过将分析样本中潜在的待分析靶标结合靶标特异性结合组合物，并且通过检测靶标特异性经标记材料，确定分析样本中分析物的存在及该分析物中对应靶标的含量。
在一些实施例中，该样本在步骤1)中与多于一个的靶标特异性结合组合物接触。
在一些实施例中，使用落射荧光或共聚焦显微镜检术在步骤7)将该样本成像。
在一些实施例中，通过对单个DNA纳米球的成像可以达到对单个分析物的检测。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明的方法提出了基于寡核苷酸标签的固相滚环扩增策略，该方法能够在温和的条件如常温下进行，可实现靶标信号约1000倍放大的检测，极大地提高了检测灵敏度，弥补了现有一些方法如外泌体检测灵敏度低的不足；该方法中靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸能够进行靶标种类特异性的设计，因此能够实现不同种类分析物的同时鉴别和量化分析。此外，该方法能够在一些分析物如外泌体表面形成数百纳米尺寸的DNA纳米球，并通过其结构特性和尺寸优势，构建其与外泌体的数量关系，实现通过DNA纳米球与荧光报告探针形成的荧光亮点数量，对外泌体数量绝对定量的目的。这突破了现有一些方法只能通过荧光强度进行外泌体相对定量的限制，使本方法更加契合基于外泌体数量进行精准诊断的要求。也因此，本方法的检测不依赖高分辨显微镜即可对亚微尺寸的荧光亮点信号进行检测分析。
附图说明
图1是一种与固体支持物连接的待分析样本中分析物的量化检测的一个原理示意图。
图2是本披露提供的实施例1中基于蛋白定量法测定的蛋白标准品及外泌体提取物蛋白浓度测定结果。
图3是在本披露中提供的一种待测分析物(如外泌体)与固体支持物(如微球)连接的一个实施例。
图4是一个利用荧光显微成像检测的实施例。
图5是一个利用流式细胞术检测的实施例。
具体实施方式
本发明特别提供了例如基于核酸扩增及经标记材料的待分析样本中分析物及分析物上表达的特定靶标(如蛋白质)定量检测的方法。此方法涉及分析特定样本(例如：连接在固体支持物上的生物样本)中一种或多种分析物包含的至少一种靶标(如蛋白质)。在一些情况下，分析物是否存在样本中是未知的，一个样本可能含有一种或多种给定的待分析物。因此，本披露的方法可以用于确定一种或多种给定的分析物(如循环肿瘤细胞、外泌体)是否存在特定样本中。
本发明提供了一种基于核酸扩增和经标记材料的待分析物多重检测的方法。此方法依赖于采用一种正交DNA标签，这些标签可以稳定地结合在靶标特异性结合分子上(如抗体上连接的寡核苷酸)，然后通过添加与这些DNA标签互补的核酸或单独合成的核酸扩增产物DNA纳米球形成稳定的部分双链杂交结构。若添加了与这些DNA标签互补的核酸则可以继续发生成环反应和后续核酸扩增延伸反应，继而形成DNA纳米球。形成的DNA纳米球，或添加的与所述DNA标签互补的DNA纳米球是通过靶标特异性结合组合物上的寡核苷酸与靶标相连，在一些实施例中，DNA纳米球与待分析物尺寸相当，在待分析物表面位阻的限制下，一个待分析物上形成一个DNA纳米球，因此能够实现对待分析物的量化检测，可参见图1，分析物如外泌体与微球相连，通过靶标特异性结合组合物检测分析物表面的特异性表达的标志靶标，如蛋白质，并介导环状模板的扩增延伸，最终在分析物表面形成与分析物数量相当的靶标特异性扩增延伸后的DNA纳米球产物。
此外，在一个实施例中，这些方法通过同时进行多种靶标特异性结合组合物与多种靶标的接触，最终能够同时形成多种靶标特异性的DNA纳米球。
在另一个实施例中，靶标特异性的经标记材料(如荧光成像探针链)与DNA纳米球之间的杂交可以通过添加缓冲液(如破坏DNA双链氢键的缓冲液)而破坏，从而将结合在DNA纳米球上的特异性荧光成像探针链去除，以实现除去来自荧光成像探针链的荧光。随后重复荧光成像探针链的杂交和成像过程，以便进行另一种或多种DNA纳米球的成像。从而实现多重靶标的检测，也即实现对多种分析物的检测。
在一些实施例中，本发明披露的多重检测，不会受到荧光成像显微镜的有限检测通道数的限制。此方法可以通过重复步骤地多轮成像实现多个靶标的检测与分析。
在一些实施例中，本发明方法具有在例如医疗诊断(如肿瘤标志物外泌体的检测、循环肿瘤的检测与表征)中的适用性。此方法允许在使用流式细胞术或显微镜检术的同时，对连接在固体支持物上的生物样本进行单分子分析物检测或快速多重检测。
在本发明中，术语“靶标”是希望用来观察或量化待分析样本中待分析物的任何生物成分。在一些实施例中，靶标可以是非天然存在的或人工合成的生物分子。此“生物分子”是由一种活体生物产生的任何分子，包括大分子，如糖蛋白、蛋白质、多肽、糖脂、脂质以及核酸、小分子。生物分子的实例包括但不限于：DNA、RNA、cDNA、或经受逆转录的RNA的DNA产物。
在一些实施例中，“生物分子”是一种细胞环境的蛋白质(例如：细胞质蛋白、细胞膜蛋白或细胞核蛋白)。蛋白质的实例包括但不限于：纤维状蛋白质，诸如细胞支架蛋白质，以及细胞外基质蛋白；球状蛋白质，诸如血浆蛋白质、凝血因子，以及急性期蛋白质，诸如C反应蛋白质；血红素蛋白；细胞粘附蛋白；跨膜运输蛋白质，诸如离子通道，同向运输/反向运输蛋白质；激素和生长因子；受体，诸如跨膜受体和细胞内受体；DNA结合蛋白质；转录调节物；免疫系统蛋白质；营养物储存/转运蛋白质(例如，铁蛋白)等。
实施例1
(1)实验材料及试剂：
人胰腺癌细胞系PANC-1购自上海ATCC细胞库；DMEM培养基及DMEM完全培养基(含青霉素-链霉素双抗，10％胎牛血清)购自江苏南京凯基生物；胰蛋白酶、磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液，1×，pH 7.4)购自美国Gibco；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自美国Amresco；生物素(biotin)购自美国Sigma-Aldrich；dNTPs购自北京赛百盛；抗体Anti-GPC1(GPC1即Glypican-1，磷脂酰肌醇聚糖-1)购自上海Abcam(ab199343)，并由北京博奥森完成抗体的生物素修饰，最终合成为生物素化抗体Anti-GPC1；T4 DNA ligase连接酶及其配套反应缓冲液、phi29 DNA polymerase聚合酶及其配套反应缓冲液购自New EnglandBiolabs；实验用去离子水(出水测量值18.2MΩ)来自净水仪器Explorer纯化水系统，购自美国Blue Water；细胞级实验用水来自经高压灭菌的去离子水；其它分子生物学实验用水购自屈臣氏蒸馏水；所有寡核苷酸探针、生物素化寡核苷酸探针、磷酸化寡核苷酸探针、荧光基团修饰寡核苷酸探针均由上海生工生物有限公司合成制备，纯化级别为HPLC级；MolecularAldehyde/Sulfate latex(4％w/v，4μm)微球购自赛默飞世尔科技；超薄碳支持膜(230目)购自中镜科仪；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天。
寡核苷酸标签1：Biotin-AAAAA AAAAA AAAAA GAGAG CGACA CTATG AGACA GGTGATCCCA TCCTG AGC
单链DNA分子(Padlock分子)1：PO4-GTCTC ATAGT GTCGC TCTCT GA TTC GCGCCGAGGT TGTCT CAGCT TTAGT TTAAT ACGCG CCGAG GTAGG GCTCA GGATG GGATC ACCT
荧光成像探针1：Alexa Fluor 488-CGCGC CGAGG T
(2)细胞培养实验步骤、内容及条件：
人胰腺癌细胞系PANC-1使用含10％胎牛血清和50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素双抗混合溶液的DMEM培养基培养，培养条件为37℃、95％相对湿度及5％二氧化碳气体。
(3)寡核苷酸标签标记抗体修饰实验步骤、内容及条件：
取25μL的2.5μM寡核苷酸标签1与25μL的2.5μM链霉亲和素充分混合，在37℃下孵育30分钟。然后，在反应混合液中加入50μL的1.25μM生物素化抗体Anti-GPC1，充分混匀，在25℃下孵育30分钟。最后加入1mM生物素，25℃下孵育20分钟。该过程中的反应液为AssayBuffer(8mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，150mM NaCl，0.1％BSA，0.025％Tween 20，pH 7.4)。
(4)待分析样本(含待分析物外泌体的样本)的分离实验步骤、内容及条件：
待人胰腺癌细胞系PANC-1细胞生长至80％细胞融合度，1×PBS润洗两次，换成无血清DMEM培养基继续培养约36小时，收集全部细胞培养基上清液，并及时进行外泌体的分离提取，提取步骤包括：将所述收集到全部细胞培养基上清液经4℃，800×g离心5分钟，取上清，继续在4℃，2000×g离心10分钟，取上清，0.22μm微孔滤膜进行过滤，得到的滤液在4℃，100,000×g超高速离心2小时，小心弃去大部分上清并保留离心管底部约200μL溶液，经PBS重悬后，继续在4℃，100,000×g超高速离心2小时，小心弃去全部上清，400μL PBS重悬，并收集全部重悬液，即得到含待分析物外泌体的样本混悬液(分别命名为样本1和样本2，浓度测定参见步骤5))。
(5)基于BCA蛋白浓度测定法的外泌体样本混悬液浓度初步表征
BCA蛋白浓度测定操作具体为：取10μL 25mg/mL蛋白标准品储备液，加入490μLPBS缓冲液，浓度稀释为0.5mg/mL的蛋白标准品工作溶液。另取3.5mL BCA试剂A，加入70μLBCA试剂B，充分混合均匀，配制成3.57mL BCA测定工作液。各浓度标准品与样本配制如表1所示，各管分别加入200μL BCA测定工作液，37℃下恒温孵育20～30分钟。利用超微量紫外分光光度仪测定562nm附近波长的吸光度(平行重复测定3次)。根据标准曲线和样本体积计算外泌体样本混悬液实际蛋白浓度。样本1与样本2蛋白浓度测定结果参见图2，其中样本1的蛋白浓度为0.2436mg/mL，样本2的蛋白浓度为0.2063mg/mL。
表1标准品与样本配制方案
注：蛋白标准品为提前配制好的0.5mg/mL浓度蛋白标准品工作溶液；样
本1与2是外泌体样本混悬液。
实施例2
在该实施例中，具体实验材料及试剂、实验步骤、内容及条件参见实施例1。
(1)以下为外泌体提取物与固相支持物(醛基微球)连接反应操作细节：取10μLAldehyde/Sulfate latex微球(在本实施例中作为固相支持物，购自赛默飞世尔科技Molecular4％w/v，4μm)加入到200μL离心管中，加入1mL 1×PBS，用移液器吹打10秒，13,000×g离心2分钟，弃去上清；加入约30μg(浓度按BCA蛋白测定浓度计算，可参见实施例1步骤5)，蛋白浓度为0.2063mg/mL及其粒子数量浓度为3.22×109个/mL)外泌体提取物(由实施例1步骤4制备得到)重悬该微球，室温下连续旋转孵育30分钟；然后用1×PBS补足体积至1mL，室温下继续旋转孵育2.5小时；加入100mM甘氨酸及2％BSA的1×PBS溶液中止反应，室温下继续旋转孵育45分钟；13,000×g离心2分钟，弃去上清；加入含有2％BSA的1×PBS溶液洗涤，重复两次；加入含有10％BSA的1×PBS溶液，室温下旋转孵育70分钟；13,000×g离心2分钟，弃去上清；加入含有2％BSA的1×PBS溶液洗涤，重复两次；13,000×g离心2分钟，弃去上清；最后重悬在1×PBS中，即得到待分析样本(对应所述外泌体蛋白浓度为0.2063mg/mL及其粒子数量浓度为3.22×109个/mL)。其中所述外泌体提取物粒子数量浓度是通过商业仪器NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪测定，版本为NTA3.3 Dev Build 3.3.104，通过SOP Standard进行分析。
(2)将上述得到的待分析样本轻轻滴加在清洁的透射电镜专用超薄碳支持膜上，使之均匀分布，待液体自然挥干上机检测。透射电子显微镜JEOL JEM-2100购自日本JEOL公司。
实验结果参见图3，在该实施例中，待测分析物表面的蛋白质与固体支持物表面预先修饰的基团(如醛基)非特异性地结合，因此待测分析物被连接到固体支持物的表面。具体的，从人胰腺癌细胞系PANC-1的细胞培养液中分离得到含待分析物外泌体的样本之后，需要将样本中的待分析物外泌体连接到固相支持物上，然后才能进行本发明方法的进一步检测。在本实施例中，固体支持物为醛基化微球，将含待分析物外泌体的样本与醛基化微球接触孵育后，样本中的待分析物外泌体能够与微球上的醛基直接发生相互作用而连接。通过透射电镜进行拍摄成像后可以观察到纳米尺寸的外泌体结合在了微球的表面。这样利于后续待分析物检测中通过洗涤的方式去除非特异性的探针，又解决了外泌体的纳米级尺寸超过流式细胞术检测极限而不能被直接检测的问题。透射电镜试验结果表明，外泌体能够比较均匀地分散在醛基微球的表面，并且外泌体能够暴露出一部分膜质结构，这样利于使用本发明的方法对其表面特异性表达的标志靶标(如标志蛋白质)开展进一步的检测。
实施例3
在该实施例中，参见实施例1中的实验材料及试剂、实验步骤、内容及条件获得三份含有待分析物外泌体的样本，对照样本为未连接外泌体的醛基微球。
参见实施例2，将上述含有待分析物三份外泌体样本与醛基微球接触孵育(孵育条件参见实施例2中步骤1)，并相互连接，得到三份待分析样本1、样本2和样本3。然后利用本发明方法分别对样本1、样本2、样本3以及对照样本进行检测分析，参加图4。具体实验步骤、内容及条件包括：各取2uL上述样本1、样本2、样本3以及对照样本，13,000×g离心2分钟，弃去上清，重悬在寡核苷酸标签1标记的anti-GPC1抗体中，33℃下旋转孵育3小时；加入含有2％BSA的1×PBS溶液洗涤，重复三次，13,000×g离心2分钟，弃去上清，重悬在100nM单链DNA分子(Padlock分子)1的Assay Buffer(8mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，150mM NaCl，0.1％BSA，0.025％Tween 20，pH 7.4)中，33℃下旋转孵育30min；加入1×PBS溶液洗涤，重复两次，13,000×g离心2分钟，弃去上清；加入T4 DNA连接酶体系(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，pH 7.5)及0.133U/μL T4 DNA ligase重悬，33℃恒温孵育40分钟；加入1×PBS溶液洗涤，重复两次，13,000×g离心2分钟，弃去上清；加入RCA反应体系(0.5mMdNTPs，0.2mg/mL BSA，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mM DTT，pH 7.5)及0.25U/μL phi29 DNA polymerase，33℃恒温孵育60分钟；加入1×PBS溶液洗涤，重复两次，13,000×g离心2分钟，弃去上清；加入0.5μM荧光成像探针1溶液重悬，33℃恒温孵育30分钟；加入1×PBS溶液洗涤，重复两次，13,000×g离心2分钟，弃去上清，重悬在1×PBS溶液中，最终得到四组反应后的样本，即对照样本(未连接外泌体的醛基微球，5.5×107个/mL)、样本1(对应所述外泌体蛋白浓度0.0052mg/mL及其粒子数量浓度3.2×108个/mL)、样本2(对应所述外泌体蛋白浓度0.0104mg/mL及其粒子数量浓度6.4×108个/mL)以及样本3(对应所述外泌体蛋白浓度0.0260mg/mL及其粒子数量浓度1.6×109个/mL)。其中所述外泌体粒子数量浓度是通过商业仪器NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪测定，版本为NTA 3.3 DevBuild 3.3.104，通过SOP Standard进行分析。
将10μL所述最终反应后的样本分别分散在载玻片上，然后利用荧光显微镜进行成像检测。在该实施例中，待分析物外泌体是来源于人胰腺癌细胞系PANC-1的细胞培养液，而GPC1在人胰腺癌细胞系PANC-1来源的外泌体表面高度特异性表达，并且已经在公开的研究报道中得到证明。因此，本实施例采用GPC1蛋白质作为人胰腺癌细胞系PANC-1来源外泌体的标志靶标。实验结果参见图4，在该实施例中，待分析物(外泌体)预先与固体支持物(微球)连接，然后与靶标特异性结合组合物接触(其中所述靶标为待分析物中特异性表达的标志靶标)，在靶标特异性结合组合物上寡核苷酸介导的扩增延伸作用下形成靶标特异性的DNA纳米球产物，并使DNA纳米球与特异性荧光成像探针接触，以形成稳定的杂交体，在荧光显微镜下成像检测到固体支持物表面的荧光亮点，表明待分析物中标志靶标的存在，也即表明待分析物的存在；该实施例检测了包含阴性对照样本(未连接外泌体的醛基微球)在内的四个不同待分析样本，成像结果显示本发明方法能够清晰容易地观测到在不同样本(样本1、2和3)中的点状信号，并且在阴性对照样本中没有观测到非特异性的假阳性信号。这些结果证明了图1中方法原理的可行性。
实施例4
(1)在该实施例中，参见实施例1、2、3的实验材料及试剂、实验步骤、内容及条件，获得如实施例3所述的最终反应后的样本两份，即对照样本、包含待分析物的样本(样本1)。利用流式细胞术进行样本信号检测，结果参见图5。
(2)在该实施例中，待分析物外泌体预先与醛基微球连接(具体连接步骤参见实施例2中步骤1)，然后与靶标特异性结合组合物接触(其中所述靶标为待分析物中的标志物GPC1蛋白)，在靶标特异性结合组合物上寡核苷酸介导的环状模板扩增复制作用下，形成靶标特异性的DNA纳米球复制产物。使DNA纳米球与特异性荧光成像探针接触，以形成稳定的杂交体，利用流式细胞术对微球样本进行靶标特异性荧光强度的测定。
其中，几百纳米尺寸的DNA纳米球产物大小与外泌体的尺寸相当，并且已经在公开的研究报道中得到证明，在空间位阻的限制下，一个外泌体表面只能形成一个DNA纳米球。因此，每个微球上面的靶标特异性DNA纳米球产物数量是与所检测外泌体含量正相关的，所以经过荧光标记的DNA纳米球在每一个微球上的总荧光强度也是与外泌体含量正相关的。也即是本实施例所述最终反应后的样本可以通过流式细胞术进行每个微球荧光强度的高通量检测，并通过每个微球的荧光强度大小估计每个微球上的外泌体个数。
在该实施例中，待分析物(外泌体)预先与固体支持物(微球)连接，然后与靶标特异性结合组合物接触(其中所述靶标为待分析物中的标志物)，在靶标特异性结合组合物上寡核苷酸介导的环状模板扩增复制作用下形成靶标特异性的DNA纳米球复制产物，并使DNA纳米球与特异性荧光成像探针接触，以形成稳定的杂交体，利用流式细胞术对微球样本进行靶标特异性荧光强度的测定；与没有连接待分析物的对照微球样本相比，含有待分析物的样本中能够检测到特异性荧光强度的增加。
(3)在本实施例中，实验证明了利用流式细胞术进行所述最终反应后样本检测的可行性。实验结果参见图5A，流式细胞术检测结果显示与对照样本相比，包含待分析物的样本中微球荧光明显增强，并且能够通过阈值划定(参见图5B)计算出每簇荧光强度下荧光增强的微球数量百分比。在图5B中，对照样本为未连接外泌体的醛基微球，由于其没有连接外泌体，该样本中就没有该外泌体特异性表达的靶标GPC1蛋白，则靶标特异性结合组合物(所述靶标为该外泌体表达的标志物GPC1蛋白)就不能与对照样本结合，也就不能通过固相滚环扩增产生DNA纳米球，所以最终检测不到荧光增强(相比于包含待分析物的样本检测结果)。而包含待分析物的样本是外泌体与醛基微球连接后的样本，则靶标特异性结合组合物(所述靶标为该外泌体表达的标志物GPC1蛋白)就能与微球上表达GPC1蛋白的外泌体结合，也因此能够触发该靶标特异性结合组合物上寡核苷酸标签1的滚环扩增，最终能够形成DNA纳米球，该DNA纳米球与荧光成像探针1杂交后，既能在荧光显微镜下观测到荧光亮点(参见图4样本1结果)，又可以通过流式细胞术观测到所有微球上的荧光(参见图5A和B)。基于流式细胞术的检测能够高通量地分析样本进样中的所有微球上的荧光，并通过荧光增强微球(相比于对照样本)的占比可计算出荧光增强微球的个数。在图5B中，包含待分析物的样本(即实施例3中的样本1)共计数分析了约10000个微球，其中荧光增强的微球占比63.3％，也即是约6330个微球是荧光增强的。而样本1通过荧光显微镜检测发现在每个微球上最多检测到一个荧光亮点(参见图4)，表明样本1(参见图5B)的流式结果中，所有荧光增强的微球，都是形成了一个荧光亮点(对应一个DNA纳米球)的微球，即6330个，而外泌体的数量与固相滚环扩增形成的DNA纳米球是一一对应的，因此在样本1的进样分中，共计有6330个表达了GPC1蛋白的外泌体被检测到，也即表明本发明的方法能够对特定外泌体进行定量分析。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 寡核苷酸标签1(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaagagag cgacactatg agacaggtga tcccatcctg agc 53
<210> 2
<211> 89
<212> DNA
<213> 单链DNA分子（PADLOCK分子）1(Artificial Sequence)
<400> 2
gtctcatagt gtcgctctct gattcgcgcc gaggttgtct cagctttagt ttaatacgcg 60
ccgaggtagg gctcaggatg ggatcacct 89
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> 荧光成像探针1(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcgccgagg t 11

Claims (5)

1.基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述检测方法为非疾病的诊断和治疗目的，所述检测方法通过将待测分析样本与至少一种固体支持物相连，然后将靶标特异性结合组合物与待测分析样本中的靶标相连，该靶标特异性结合组合物包含有寡核苷酸，以该寡核苷酸为引物介导环状核酸分子的滚环复制得到球状滚环复制产物，通过对滚环复制产物的量化分析从而实现对分析物的定量检测；
所述待测分析样本为人胰腺癌细胞系PANC-1细胞的外泌体，所述固体支持物为醛基微球；所述靶标为所述外泌体表达的标志物GPC1蛋白；
靶标特异性结合组合物，具体包括：寡核苷酸标签1、单链DNA分子1和荧光成像探针1；
所述寡核苷酸标签1：SEQ ID NO.1：Biotin-AAAAA AAAAA AAAAA GAGAG CGACA CTATGAGACA GGTGA TCCCA TCCTG AGC；
单链DNA分子1：SEQ ID NO.2：PO4-GTCTC ATAGT GTCGC TCTCT GA TTC GCGCC GAGGTTGTCT CAGCT TTAGT TTAAT ACGCG CCGAG GTAGG GCTCA GGATG GGATC ACCT；
荧光成像探针1：SEQ ID NO.3：Alexa Fluor 488-CGCGC CGAGG T。
2.根据权利要求1所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸每经过一次环状单链DNA分子长度的延伸之后，就会在其3’端增加一段与环状单链DNA分子互补的序列，最终经过多次扩增延伸，靶标特异性结合组合物中的寡核苷酸形成一条具有多段序列与所述环状单链DNA分子互补的长单链DNA扩增产物，该长单链DNA扩增产物能够自发卷曲形成几百纳米尺寸的DNA纳米球结构即为球状滚环复制产物。
3.根据权利要求2所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述滚环复制中使用具有DNA连接活性的酶和链置换活性的DNA聚合酶使特异性单链DNA分子连接成环并进一步使成环的单链DNA分子扩增延伸形成长单链DNA扩增产物，并形成DNA纳米球。
4.根据权利要求2所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述量化分析采用显微成像检测和流式细胞术分析实现。
5.根据权利要求4所述的基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，其特征在于，所述显微成像检测技术是落射荧光或共聚焦显微镜检术。
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