CN113774008A - 一种外泌体的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体的提取方法，主要包括将血清/血浆(枸橼酸钠采血管)过LDLR亲和层析柱以及对收集液采用氧化物进行富集浓缩的操作步骤。本发明采用LDLR亲和层析首先除去血清/血浆中的低密度脂蛋白，并采用氧化物对收集的缓冲液进行了浓缩，建立了一种从血清中纯化外泌体的方法。纳米流式检测颗粒数、蛋白质免疫印迹检测外泌体表面标志物、透射电子显微镜检测表明提取的外泌体得率高，本发明所提取的外泌体进一步结合裂解方法，将外泌体内部物质释放出来，核酸与蛋白层面均可以做后续研究。本发明具有操作步骤简单、提取时间短，制备获得的外泌体纯度高、并且适用于小量样本以及性价比高的优点，适合在体外诊断领域推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种外泌体的提取方法及其应用。
背景技术
相较传统的组织活检技术，液体活检作为癌症的一种检测手段，具有非侵入性、准确性高、取样简便、价格低廉等多种显著优势。取血进行的液体活检损伤小，因此成为了癌症诊断领域热门技术。
其中，在液体活检中采用外泌体具有更多的优势，如能够全面反馈信息，创伤小，特异性更高，以及具有高稳定性。
外泌体作为定量和定性信息的来源时，可以告知恶性疾病和肿瘤负担的存在。外泌体液体活检的检测样本可以是血液、尿液、唾液或脑脊液等有肿瘤相关生物标志物的体液。癌细胞衍生的外泌体含有能反映癌细胞起源的特异性核酸和蛋白质。外泌体在体液中广泛分布，数量丰富，具有较好的稳定性。因此比ctDNA和CTC更易得到理想的检测浓度。
外泌体是由含有膜蛋白的脂质双层膜构成的小囊泡，其内含有蛋白、核酸、脂质等物质。
外泌体携带大量核酸物质，包括miRNA、mRNA、DNA、长链非编码RNA、核糖体RNA及转运RNA等。外泌体主要包含以下脂质：(1)脂筏相关脂质(如胆固醇)；(2)鞘脂(如鞘磷脂和神经酰胺)；(3)磷脂；(4)甘油磷脂类(如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)。
因此基于外泌体的液体活检技术需要在小样本量基础上提高不同方法的检测灵敏度可达到对疾病辅助诊断的作用。
目前外泌体的分离提取技术中，主要包括超速离心法、体积排阻色谱法、超滤法、免疫亲和捕获、聚合物沉淀、微流体衍生的芯片分离技术法等。但是，上述方法存在要么提取纯度不高，要么处理时间过长、或者对于提取的样本量有特定的要求，或者涉及大型仪器的使用，或者提取的成本过高，不能够被广泛的推广应用。
因此，外泌体提取方法的局限给外泌体的液体活检带来了困扰，因此，建立和探索新的外泌体提取方法对于体外诊断具有较大的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中外泌体提取方法所存在的问题，提供一种一种新型提取外泌体的方法，并将其应用于疾病的辅助检测中。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明公开了一种外泌体的提取方法，包括：
(1)取待检测血清/血浆(枸橼酸钠采血管)，过LDLR亲和层析柱，PBS缓冲液冲洗，收集流穿液；
(2)对步骤(1)中的收集的流穿液采用氧化物进行富集浓缩。
优选的，所述氧化物选自二氧化钛(TiO2)、ZrO2、Y2O3、ITO、In2O3或Mn2O3中的一种或几种。
优选的，所述氧化物为ZrO2。
优选的，其中所述的步骤(2)为：将步骤(1)中的收集的流穿液与氧化物沉淀混匀，震荡孵育30min，离心，弃上清，沉淀中加入PBS缓冲液洗涤，离心弃上清，加入PBS后混匀沉淀，即为外泌体与氧化物的混合物。
优选的，其特征在于，采用PBS缓冲液洗涤的次数为2-3次。
优选的，所述氧化物的用量为2mg对应100μl血清/血浆(枸橼酸钠采血管)。
优选的，所述氧化物沉淀的制备方法为：氧化物采用PBS预先配成0.05mg/μl的混悬液并超声打散1h，弃上清液，加入PBS洗涤两遍后，瞬离并弃上清获得。
本发明进一步公开了miRNA181在外泌体提取中的用途。
优选的，所述miRNA181为miRNA181-5p。
本发明进一步提供了用于评价外泌体的的标志物。
优选的，所述标志物包括：miR-221、let-7a、miR-181a、miR-181c、miR-26a中的一种或几种。
优选的，所述标志物为miR181a-5p。
优选的，miRNA181的上游扩增引物为：CATTCAACGCTGTCGGTGAGT。
优选的，采用的是miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit(天根)加尾法试剂盒进行反转录。
优选的，本发明进一步公开了扩增所述标志物的引物。
本发明公开了一种外泌体RNA的提取方法，包括：包括：
(1)取待检测血清/血浆(枸橼酸钠采血管)，过LDLR亲和层析柱，PBS缓冲液冲洗，收集流穿液；
(2)对步骤(1)中的收集的流穿液采用氧化物进行富集浓缩。
(3)对步骤(2)的富集浓缩产物采用Triton裂解。
优选的，所述氧化物选自二氧化钛(TiO2)、ZrO2、、Y2O3、ITO、In2O3或Mn2O3中的一种或几种。
优选的，所述氧化物为ZrO2。
优选的，其中所述的步骤(2)为：将步骤(1)中的收集的流穿液与氧化物沉淀混匀，震荡孵育30min，离心，弃上清，沉淀中加入PBS缓冲液洗涤，离心弃上清，加入PBS后混匀沉淀，即为外泌体与氧化物的混合物。
优选的，其特征在于，采用PBS缓冲液洗涤的次数为2-3次。
优选的，所述氧化物的用量为2mg对应100μl血清/血浆(枸橼酸钠采血管)。
优选的，所述氧化物沉淀的制备方法为：氧化物采用PBS预先配成0.05mg/μl的混悬液并超声打散1h，弃上清液，加入PBS洗涤两遍后，瞬离并弃上清获得。
本发明公开了一种外泌体的提取试剂盒，所述试剂盒包括：LDLR亲和层析柱，PBS缓冲液，氧化物，所述氧化物选自二氧化钛(TiO2)、ZrO2、、Y2O3、ITO、In2O3或Mn2O3中的一种或几种。
优选的，所述试剂盒进一步包括Triton试剂。
优选的，所述Triton试剂为Triton X-100。
优选的，所述试剂盒进一步包括用于评价外泌体的标志物。
优选的，所述标志物包括：miR-221、let-7a、miR-181a、miR-181c、miR-26a中的一种或几种。
优选的，所述标志物为miR181a-5p。
优选的，所述试剂盒进一步包括扩增所述标志物的引物。
优选的，所述试剂盒进一步包括anti-TSG101。
本发明公开了一种外泌体RNA的提取试剂盒，所述试剂盒包括：LDLR亲和层析柱，PBS缓冲液，氧化物，Triton试剂，所述氧化物选自二氧化钛(TiO2)、ZrO2、、Y2O3、ITO、In2O3或Mn2O3中的一种或几种。
优选的，所述标志物为miR181a-5p。
优选的，所述试剂盒进一步包括扩增所述标志物的引物。
优选的，所述试剂盒进一步包括anti-TSG101。
本发明采用LDLR亲和层析首先除去血清/血浆(枸橼酸钠采血管)中的脂蛋白，并采用氧化物对收集的缓冲液进行了浓缩，并进一步通过WB，免疫荧光，纳米流式检测来鉴定外泌体。对于外泌体中包含的RNA与蛋白质，分别选取有关肝癌疾病的内参基因miRNA181以及阿尔兹海默症标志物TAU蛋白，作为对通过本方法提取出的外泌体的下游分析目标。并采用所述标志物进一步优化了提取的步骤和条件，建立了一种从血清/血浆(枸橼酸钠采血管)中纯化外泌体的方法，纳米流式检测颗粒数、蛋白质免疫印迹检测外泌体表面标志物、透射电子显微镜检测表明提取的外泌体得率高，可以进一步应用于各种疾病的检测。本发明具有操作步骤简单、提取获得的外泌体纯度高、并且适用于小量样本以及性价比高的优点，适合在体外诊断领域推广应用。
本发明所提取的外泌体，既可以用于蛋白质方法的研究，也可以用于RNA方面的研究，因为，本发明所提取的外泌体加上我们选取的裂解方法，将外泌体内部物质释放出来，核酸(方法：qPCR)与蛋白(ELISA)层面均可以做后续研究，具有一定价值与意义。
附图说明
图1.样品过LDLR层析柱去除低密度脂蛋白示意图。
图2.人血液外泌体中miRNA含量示意图
图3.不同裂解物提取外泌体RNA扩增曲线示意图
图4.不同裂解物提取外泌体Ct值测定示意图
图5.不同重悬氧化物与外泌体混合物不同体积的Ct值测定示意图
图6.不同氧化物富集以及不同裂解物处理正交实验的ct值测定示意图
图7.不同氧化物富集以及不同裂解物处理正交实验的扩增曲线示意图
图8.外泌体中TAU蛋白检测结果
图9.外泌体电镜检测结果图
图10.Western blot检测外泌体中标志性蛋白TSG101结果示意图
图11.外泌体纳米流式检测示意图
图12.外泌体纳米流式检测示意图
图13.ZrO2连接外泌体混合物的免疫荧光检测示意图
图14.外泌体内部包含的miRNA181a-5p扩增批间差异示意图
图15.荧光标记的牛奶外泌体加入到血清/血浆(枸橼酸钠采血管)中，过柱前后阳性率变化
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1 样品的LDLR亲和层析预处理
取400μl正常人血清/血浆(枸橼酸钠采血管)，与PBS溶液1∶1稀释备用。将LDLR柱用其缓冲液冲洗3遍，自然重力降落。将备用液分批多次加入LDLR柱中，重力降落，收集过柱后的液体。LDLR层析柱处理样本的示意图参见附图1。
验证LDLR柱对LDL蛋白有一定的去除能力，可达到去除脂蛋白，纯化外泌体的效果。由于过柱后溶液体积变大，选取后续的富集外泌体方法就变得极为重要，浓缩外泌体溶液可提高检测灵敏度便于后续的下游分析检测。
实施例2洗脱液的氧化物富集浓缩
取8mg的氧化物，加入200μlPBS溶液清洗，瞬离10s，弃上清液。重复该步骤两次。氧化物预先配成0.05mg/μl的混悬液并超声打散1h。由于初始血清量为400μl，取160μl的氧化物混悬液瞬离10s，弃上清液，加入PBS洗涤两遍后，瞬离并弃上清。
将过柱后的液体加入到氧化物沉淀中并混匀，震荡孵育30min。孵育结束后，瞬离10s，弃上清加入PBS溶液洗涤两遍，瞬离弃上清。加入PBS混匀沉淀，即为外泌体与氧化物的结合物。
实施例3提取的外泌体的评价标志物的确定
5S和U6被排除在基因组学建议的参考基因之外，基于基因组分析，推荐选择作为内参基因包括miR-221、miR-128、miR-451、let-7a、miR-221、miR-16、miR-181c、miR-26a。
因此基于在外泌体中含量要高，且稳定表达的特点，我们目前选取了miR181a-5p作为外泌体的定量标准以及后续的内参基因选择，人血液外泌体中部分miRNA的含量参见附图2。
实施例4外泌体RNA提取方法的比较
将浓度为3E12的milk外泌体(牛奶外泌体与血清/血浆(枸橼酸钠采血管)外泌体中都含有miRNA181a-5p)作为外泌体的标准品进行裂解方法的比较，将所述浓度的外泌体分为三组，其中一组采用直接添加trizol裂解，其中一组采用直接添加triton裂解，最后一组采用trizol+triton裂解。Triton终浓度为1％，向外泌体溶液中加入10％的triton溶液(例：200μl溶液中加入20μl的10％triton)。Trizol与外泌体溶液体积比为1∶1。
对于裂解后的物质进行RT-PCR的扩增miR181a-5p，以检测采用何种裂解试剂合适。不同裂解物提取外泌体RNA扩增曲线参见图3。不同裂解物提取外泌体Ct值测定示意图参见附图4。从扩增的结果来看，在高浓度及相对较纯的外泌体溶液下，Triton直接裂解进行下游分析的效果比其他两种方法要好(P＜0.001)。
原因可能在于Trizol的提取效率有限且并不能较好的裂解外泌体。Trizol主要是破坏细胞的骨架结构从而导致脂质膜的裂解。由于外泌体表面并不具有细胞的结构而只具有单纯的脂质膜，而triton却是直接的“膜打孔剂”。因此，对于提取的外泌体采用直接添加triton的裂解方式裂解。
实施例5不同洗脱体积对于血清样本的提取外泌体的效果
取三份体积均为400μl的正常人血清/血浆(枸橼酸钠采血管)分别与PBS体积比1∶1混合后，过LDLR柱。过柱后的液体均加入8mg的ZrO2颗粒孵育30min，弃上清，分别加入50μl、100μl、200μl的PBS重悬沉淀。在加入终浓度为1％TritonX-100溶液4℃消化1h，瞬离后吸上清液，各取4μl进行反转录以及qPCR实验。
不同洗脱体积之间无显著差异(P＝0.061＞0.05)，200μl洗脱液Ct值最小，溶液体积可覆盖氧化物沉淀，使其上面连接的外泌体可充分在溶液中裂解。后续实验均选取200μl的洗脱体积。不同重悬氧化物与外泌体混合物不同体积的Ct值参见图5。
实施例6血清样本不同提取方法的比较
大量的miRNA存在于外泌体当中，miRNA181在目前外泌体miRNA数据库中含量排名第八，且在后续研究的肝癌疾病中可作为内参基因表达稳定，因此选取该指标来评判外泌体提取方法优劣。
以外泌体提取方法和外泌体中RNA提取方法为筛选条件，分别选取Umibio试剂盒、本方法(不同材料)和传统trizol提取RNA法、tritonX-100消化外泌体法进行正交试验，对提取出的外泌体中RNA进行反转录与qPCR实验。血清/血浆(枸橼酸钠采血管)初始量均为400μl。
结果：Ct值越小说明RNA初始浓度越高，对相同指标进行方法学的评判，可看出本方法最终提取出的外泌体中miRNA181较高，进而证明本方法中提取外泌体含量较高，且本方法操作步骤简单，时长短，不依赖仪器。
后续对Umibio以及本方法提取出的外泌体又进行纳米流式检测，得到外泌体颗粒浓度均在同一数量级。
不同氧化物富集以及不同裂解物处理正交实验的ct值参见图6。不同氧化物富集以及不同裂解物处理正交实验的扩增曲线参见图7。
实施例7提取外泌体总Tau蛋白的ELISA检测
选择10058-RP01和10058-T16两种TAU抗体，并进行正反配对，采用双抗夹心法测TAU蛋白含量。
选取正常人血清50μl、1ml血清通过本方法提取出外泌体，氧化物孵育后洗脱体积为50μl，并加入终浓度为1％tritonX-100的裂解液消化1h、高、低浓度的TAU蛋白标准品50μl，以及稀释液50μl作为阴性对照。分别在包被抗体后的96孔板中加入上述体积的不同样本37℃孵育30min后，洗板5次，在加入所配对的抗体100μl，30℃孵育30min，洗板5次，加入显色液100μl，37℃孵育15min，最后加入终止液50μl，酶标仪测量吸光度。
结果：从1ml正常人血清中富集的外泌体裂解后与TAU蛋白抗体反应，吸光值较高，而正常人血清几乎无反应。说明本方法可有效富集外泌体且可提高ELISA检测TAU蛋白的灵敏度。本方法提取出的外泌体溶液具有外泌体表面标志物蛋白。外泌体中TAU蛋白检测结果如图8。
实施例8提取的外泌体透射电子显微镜观察
由于血清/血浆(枸橼酸钠采血管)过柱后再与氧化物富集后，无法洗脱得到的是外泌体与氧化物的结合物，因此选择分开表征，第一步对过柱后去除脂蛋白的外泌体溶液进行电镜、纳米流式检测、WB实验。第二步通过免疫荧光实验证明ZrO2氧化物的确有效富集了外泌体。
电镜实验：首先使用含有2.5％戊二醛的PBS溶液对外泌体溶液进行固定，吸取20μl滴在200目的铜网formvar碳支持膜上静置10min，多余溶液用滤纸贴边吸干，在室温下用饱和乙酸双氧铀溶液负染1min，用滤纸贴边吸干剩余溶液后用透射电镜表征。提取的外泌体电镜检测结果如图9。
实施例9提取的外泌体Western blot实验
采用BCA法测定蛋白浓度。取两个外泌体样本各30μl外泌体溶液分别加入上样缓冲液与具有还原剂的上样缓冲液，用12％SDS-PAGE分离后转移至0.45μm PVDF膜上，室温下用含5％牛血清白蛋白的封闭液封闭1h。分别加入外泌体标志蛋白抗体anti-TSG101(1∶1000)和anti-CD 81(1∶200)、于4℃孵育过夜。经1×TBST缓冲液洗脱后，在室温下加入二抗孵育90min，经TBST洗3次后，显影液显色。检测结果请参见附图10。
实施例10提取的外泌体纳米流式检测
使用nanofcm仪器进行检测。操作方法参照nanofcm仪器的使用说明。检测结果请参见附图11和图12。
| 样本 | 初始量/μl | 颗粒数浓度Particles/mL |
| 1 | 400 | 1.01E+10 |
| 2 | 400 | 9.24E+9 |
本方法提取的外泌体浓度可达109/ml以上，已知文献报道，EVP以＞109vesicles/mL的浓度释放到外周血循环中(Colombo et al.，2014)。且外泌体尺寸为30-150nm之间，纳米流式图中颗粒尺寸主要集中在50-100nm之间。
实施例11提取的外泌体免疫荧光观察
将富集有外泌体的ZrO2微球重悬于1mL 2.5％的戊二醛PBS溶液并静置30min(对于膜内蛋白TSG101的免疫荧光标记，需要在戊二醛固定后，额外用O.2％Triton X-100的PBS溶液通透处理5min)。PBS清洗3次后，在室温下用含有5％牛血清白蛋白的封闭溶液封闭1h。分别加入外泌体标志蛋白抗体anti-TSG101(1∶500)和anti-CD 81(1∶1，000)，4℃孵育过夜。PBS清洗3次后，加入荧光标记的二抗(1∶100)，在室温下避光孵育1h。激光共聚焦显微镜下扫描。ZrO2连接外泌体混合物的免疫荧光检测参见图13。
实施例12提取的外泌体批间差异
取本方法提取的多个批次的外泌体，采用设计的引物进行不同批次间的miRNA181a-5p的扩增，具体的扩增结果请参见附图。根据自己设计的引物。可使qPCR体系的批间差异低至2.16％。外泌体内部包含的miRNA181a-5p扩增批间差异参见图14。
实施例13荧光标记的牛奶外泌体加入到血清/血浆中，过柱前后阳性率变化
加入200μl染色后的牛奶外泌体到血清/血浆中，观察过柱前后阳性率变化，用nanofcm仪器检测样本荧光值。
结果：血清/血浆过柱后荧光信号均有提高，说明LDLR柱有效去除基质中杂蛋白，且均适应血清与血浆(枸橼酸钠采血管)样本。具体检测结果请参见附图15。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种外泌体的提取方法，其特征在于，包括：
(1)取待检测血清/血浆，过LDLR亲和层析柱，PBS缓冲液冲洗，收集流穿液；
(2)对步骤(1)中的收集的流穿液采用氧化物进行富集浓缩。
2.根据权利要求1所述的外泌体的提取方法，其特征在于：所述氧化物选自二氧化钛(TiO2)、ZrO2、、Y2O3、ITO、In2O3或Mn2O3中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的外泌体的提取方法，其特征在于：所述氧化物为ZrO2。
4.根据权利要求2所述的提取方法，其中所述的步骤(2)为：将步骤(1)中的收集的洗脱缓冲液与氧化物沉淀混匀，震荡孵育30min，离心，弃上清，沉淀中加入PBS缓冲液洗涤，离心弃上清，加入PBS后混匀沉淀，即为外泌体与氧化物的混合物。
5.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，采用PBS缓冲液洗涤的次数为2-3次。
6.根据权利要求2-5任一权利要求所述的提取方法，其特征在于，所述氧化物的用量为2mg对应100μl血清/血浆。
7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述氧化物沉淀的制备方法为：氧化物采用PBS预先配成0.05mg/μl的混悬液并超声打散1h，弃上清液，加入PBS洗涤两遍后，瞬离并弃上清获得。
8.miRNA181在外泌体提取中的用途，优选的，所述miRNA181为miRNA181-5p。
9.一种外泌体提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：LDLR亲和层析柱，PBS缓冲液，氧化物，所述氧化物选自二氧化钛(TiO2)、ZrO2、、Y2O3、ITO、In2O3或Mn2O3中的一种或几种。
10.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括Triton试剂和miR181-5p。
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2021
- 2021-08-14 CN CN202110951789.9A patent/CN113774008A/zh active Pending
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