CN105779586A - 一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法 - Google Patents

一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法，主要步骤为：首先用PBS溶液以1:1的比例稀释血浆；通过离心去除血浆中的细胞成分和细胞碎片；通过超高速离心沉淀外泌体；使用250μl PBS溶液悬浮外泌体；使用Trizol LS抽提外泌体悬浮液中的总RNA；对抽提出的总RNA进行poly(A)反转和相关基因的定量，并对纯度进行检测。该发明有利于日后对血浆外泌体内容物和外泌体相关功能的研究。

Description

一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法。
背景技术
外泌体(exosome)是一种直径约50～200nm的膜性囊泡。细胞通过内吞作用产生小囊泡，小囊泡融合形成早期核内体(earlyendosome)，并逐渐变为晚期核内体(lateendosome)。随着胞质内miRNA、酶分子、热休克蛋白等一些“货物”的进入，晚期核内体会产生很多小囊泡(intraluminalvesicles，ILVs)，并逐渐演变成多泡体(multivesicularbody，MVB)；随后，这些小囊泡会被释放到胞外，形成外泌体。外泌体存在于细胞培养液和体液中，主要包括唾液、胸膜液、脑脊液、腹水、尿液、血浆、血清等体液。外泌体中包含多种生物分子，如mRNA、miRNA、mtDNA、蛋白质、脂质等。最近的文献表明，外泌体广泛参与了细胞交流的过程，对于远距离细胞通讯具有很重要的意义。除此之外，不同生理条件下或疾病条件下的体液中也会含有不同的种类和含量的miRNA种类，这为疾病的检测提供了新的方向和方法。因此，对于外泌体的研究已经变得越来越广泛和深入。
外泌体提取常用的方法主要有超高速离心、过滤等方法。超高速度的方法主要是通过差速离心的办法先去除细胞和细胞碎片，最后利用超高速离心的方法分离外泌体，因此无法对外泌体的直径进行合适的筛选；而过滤是一种与膜孔径大小相关的筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以膜为过滤介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及特定孔径的小分子物质通过而成为透过液，而原液中孔径大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的分离和浓缩的目的。常用于进行exosome分离的滤膜孔径为0.22μm，可以对直径为50～200nm的exosome进行有效的分离。尽管过滤法能够对exosome进行孔径的筛选，但是不能对exosome进行有效的提纯。
外泌体的分离是进行外泌体研究的基础，是一切后续试验的保证。由于外泌体纯度的鉴定需要用到电子显微镜等一些格昂贵的仪器，这对很对实验室是一个极大的限制。因此，本发明用q-PCR的方法对外泌体的纯度进行了初步的检测。
发明内容
本发明针对上述存在的问题做出改进，即本发明要解决的技术问题是提供一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法，该方法可以有效的分离、提纯外泌体，并检测外泌体的纯度。
本发明采用如下技术方案：
本发明提出了这样一种从动物血浆中分离外泌体以及检测外泌体纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，首先用PBS溶液以稀释血浆，接着通过离心去除血浆中的细胞成分和细胞碎片，然后通过超高速离心沉淀外泌体；
步骤2，使用PBS溶液悬浮外泌体，然后使用TrizolLS抽提外泌体悬浮液中的总RNA；
步骤3，对抽提出的总RNA进行相关基因的定量，并对纯度进行检测。
步骤1具体为：
(1)将血浆用PBS溶液以1:1-1.5的比例稀释；
(2)在4℃条件下2,000g离心30min，以去除血浆中的细胞成分，离心后保留上清液；
(3)将上清液收集入离心管，在4℃条件下12,000g离心30min，以去除细胞碎片，如果血浆需要冷冻保存，则在此步骤结束后置于-80℃保存；
(4)将上清液收集到离心管中，使用0.22μm的滤膜过滤上清液，使得小于0.22μm的微囊体能够穿过过滤膜，并收集滤液；
(5)收集滤液，置入超高速离心管中，在超高速离心机下110,000g-160,000g离心2h；
(6)超高速离心完毕后，倒掉上清液，用100μl-250μlPBS溶液重新溶解悬浮外泌体。
步骤2具体为：
(1)每250μl外泌体悬浮液样本加0.75mLTrizolLSReagent(Invitrogen，美国)，用漩涡仪混合均匀；
(2)为了使核酸蛋白复合物完全分离，通常将混匀样品在室温放置5min；
(3)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min；
(4)12,000g4℃离心15min后，样品会自动分成三层：无色的上清液、下层有颜色的有机相和中间薄薄的白色蛋白层。轻轻吸取上清液转移至一个新的离心管中(切忌吸出白色中间层)；
(5)向装有上清液的离心管中加入等体积的异丙醇，离心管盖严后上下颠倒使其充分混匀，室温静置10min；
(6)12,000g4℃离心10min。大部分样品在离心后，试管底部出现少量白色的沉淀物；
(7)RNA沉淀的清洗。在白色沉淀物出现的离心管中含有大量的氯仿和异丙醇，这些有机物对后续的实验具有影响。弃去上清液保留沉淀，沿离心管壁缓慢地加入75％的乙醇1mL(切勿触及沉淀)，上下颠倒离心管洗涤管壁使有机物溶解于乙醇中，随后7,500g4℃离心5min，弃去乙醇保留沉淀；
(8)RNA的溶解。室温干燥沉淀2min左右(切忌时间过长会增加RNA的降解)，加入20-40μl的RNase-free水溶解沉淀，可用移液枪轻轻吹打务必使所有的沉淀全部溶解，完全溶解后的RNA溶液于-80℃保存。
步骤3具体为：
(1)按照SYBRPrimeScriptmiRNART-PCRKit(TaKaRa，中国)的说明书进行反转录，反应体系为：2×miRNAReactionBufferMix10.0μl、0.1％BSA2.0μl、miRNAPrimeScriptRTEnzymeMix2.0μl、TotalRNA1.0μl、RNaseFreedH2O5.0μl，反应条件为37℃60min；
(2)向得到的反转录反应液中添加RNaseFreedH2O补足至100μl，稀释5倍；
(3)选取在人血浆中已经鉴定出的高表达miRNA(miR-93a-3p，miR-451a-5p，miR-21-5p，miR-16-5P，miR-181-5p，miR-92a)以及细胞核内基因(U6和5S)进行定量，并检测外泌体纯度)。取1μl稀释液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，进行定量检测，反应体系为：2xSYBRGreenmixExTaq12.5μl、10μMPCRForwardPrimer1μl、10μMPCRReversePrimer1μl、超纯水9.5μl、cDNA1μl，重复3次，每次每板上设置样品、一个阳性对照和一个阴性对照；(4)根据荧光定量结果，对miRNA和细胞内基因的相对表达量进行计算。根据多次试验的经验，当平均差异倍数大于20倍时，exosome具有较好的纯度。
本发明步骤1分离得到的外泌体还可以用于原子力显微检测，具体步骤的为：
(1)以去离子水1:500稀释所获得的血浆外泌体溶液后，转移放置到新鲜切开的云母片上10min。使用去离子水彻底冲洗云母片，以冲掉未结合的外泌体；
(2)用滤纸仔细地吸收清除周边残留的溶液。在AFM检测之前，再进一步以缓慢的氮气流吹动干燥云母片；
(3)在相同条件下以AFM检测乳汁exosome的3D表面形态，并从多个角度拍摄乳汁外泌体的AFM图象；
(4)使用Nanoscope软件(Nanoscopesoftware,Nanotec,Spain)的标准线性尺度对外泌体的AFM图像进行测定，以准确确定乳汁外泌体的大小。
本发明有益效果：
本发明采用超高速离心和过滤相结合的方法，提供了一种快速高效的外泌体分离方法，该方法具有如下特点：
①本发明采用了0.22μm的过滤柱，能够对外泌体的直径进行直接筛选，因此能够更有效的分离出外泌体。
②超高速离心能够对较大的血浆样本进行外泌体的分离，且分离出的外泌体具有更高的生物活性，从而不会影响后续的实验。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明实施例1中血浆外泌体抽提示意图；
图2为本发明实施例1血浆中分离出exosome的3D原子力显微镜图；
图3为本发明实施例1中外泌体的直径统计分布图；
图4为本发明实施例2中miRNA荧光定量溶解曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将一只2.7Kg的兔子，采用颈静脉采血的方式采血10ml，抗凝剂采用EDTA。抗凝后的血液转入2ml的离心管中，3000rpm条件下离心30min分离血浆。分离后的血浆用于外泌体的抽提。
从兔子血浆中分离外泌体的方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)将2ml血浆用PBS溶液以1:1的比例稀释；
(2)在4℃条件下2000g离心30min，以去除血浆中的细胞成分，离心后保留上清液；
(3)将滤液再次收集入离心管，在4℃条件下12000g离心30min，以去除细胞碎片，如果血浆需要冷冻保存，则在此步骤结束后置于-80℃保存；
(4)将上清液收集到离心管中，使用0.22μm的滤膜过滤上清液，使得小于0.22μm的微囊体能够穿过过滤膜，并收集滤液；
(5)收集上清液，置入超高速离心管中，在超高速离心机下160,000g离心2h；
(6)超高速离心完毕后，倒掉上清液，用250μlPBS溶液重新溶解悬浮外泌体。
将本发明步骤所分离得到的外泌体用于原子力显微检测，具体步骤为：
(1)以去离子水1:500稀释所获得的血浆外泌体溶液后，转移放置到新鲜切开的云母片上10min。使用去离子水彻底冲洗云母片，以冲掉未结合的外泌体；
(2)用滤纸仔细地吸收清除周边残留的溶液。在AFM检测之前，再进一步以缓慢的氮气流吹动干燥云母片；
(3)在相同条件下以AFM检测乳汁exosome的3D表面形态，如图2所示，并从多个角度拍摄乳汁外泌体的AFM图象；
(4)如图3所示，使用Nanoscope软件(Nanoscopesoftware,Nanotec,Spain)的标准线性尺度对外泌体的AFM图像进行测定，以准确确定乳汁外泌体的大小。
实施例2
将实施例1中分离得到的外泌体进行totalRNA的抽提、miRNA的定量以及纯度的检测，对实施例1中所抽得的miRNA进行poly(A)反转录和定量。
本发明利用在人血浆中已经鉴定出的6个高表达miRNA进行miRNA定量检测，分别为miR-93a-3p，miR-451a-5p，miR-21-5p，miR-16-5P，miR-181-5p，miR-92a；另外使用两个细胞内基因：U6和5S。U6是核小分子RNA，它主要存在于细胞核内。5SrRNA是核糖体大亚基的一个组份，原核生物和真核生物都有5SrRNA，而且结构相似。这两类基因都不会出现在外泌体中，因此可以作为阴性对照。12个基因的引物序列表所示。具体步骤如下：
Poly(A)加尾反应将miRNA反转录合成cDNA。具体步骤如下：
(1)Poly(A)加尾反应合成cDNA，反应体系如表1。
表1miRNAs反转录体系
试剂 体积(uL)
2×miRNA Reaction Buffer Mix(for Real Time) 10.0μL
0.1％BSA 2.0μL
miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2.0μL
Total RNA 1.0μL
RNase Free dH2O 5.0μL
(2)逆转录反应条件为：37℃60min(Poly-A加尾和反转录反应)→85℃5s(酶失活反应)
(3)向得到的反转录反应液中添加RNaseFreedH2O补足至100μl(稀释5倍)。
(4)取1μl稀释液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，进行定量检测。反应体系如表2，每次每板上设置样品(重复3次)、一个阳性对照和一个阴性对照，表3为miRNA定量Ct值比较，如图4所示miRNA定量检测采用takara的SYBRGreenI染料法。
表2miRNA荧光定量反应体系
试剂 体积(uL)
SYBR Green mix Ex TaqTM(2×) 12.5μl
PCR Forward Primer(10μM) 1μl
PCR Reverse Primer(10μM) 1μl
超纯水 9.5μl
cDNA 1μl
共计 25ul
表3miRNA定量Ct值比较
通过原子力显微镜检测，我们鉴定出实例1中分离的外泌体直径在50nm-200nm之间，这完全符合外泌体典型的直径分布特征，表明超高速离心结合过滤的方法能够高效快速的分离出血浆中的外泌体。
实施例2对实施例1中分离的外泌体进行了RNA的抽提及miRNA和细胞内RNA的定量，结果表明分离出的外泌体miRNA表达量很高，Ct值从20.7到27.88不等，另外两个细胞内基因5s和U6则表达量很低Ct值高达32。miRNA表达量与细胞内基因表达量的差异倍数从22到3292不等，平均差异倍数高达685倍，表明外泌体纯度确实是很高的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，首先用PBS溶液以稀释血浆，接着通过离心去除血浆中的细胞成分和细胞碎片，然后通过超高速离心沉淀外泌体；
步骤2，使用PBS溶液悬浮外泌体，然后使用TrizolLS抽提外泌体悬浮液中的总RNA；
步骤3，对抽提出的总RNA进行相关基因的定量，并对纯度进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
(1)将血浆用PBS溶液以1:1-1.5的比例稀释；
(2)在4℃条件下2,000g离心30min，以去除血浆中的细胞成分，离心后保留上清液；
(3)将上清液收集入离心管，在4℃条件下12,000g离心30min，以去除细胞碎片，如果血浆需要冷冻保存，则在此步骤结束后置于-80℃保存；
(4)将上清液收集到离心管中，使用0.22μm的滤膜过滤上清液，使得小于0.22μm的微囊体能够穿过过滤膜，并收集滤液；
(5)收集滤液，置入超高速离心管中，在超高速离心机下110,000g-160,000g离心2h；
(6)超高速离心完毕后，倒掉上清液，用100μl-250μlPBS溶液重新溶解悬浮外泌体。
3.根据权利要求1所述的一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：
(1)每250μl外泌体悬浮液样本加0.75mLTrizolLS试剂，用漩涡仪混合均匀；
(2)为了使核酸蛋白复合物完全分离，通常将混匀样品在室温放置5min；
(3)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min；
(4)12,000g4℃离心15min后，样品会自动分成三层：无色的上清液、下层有颜色的有机相和中间薄薄的白色蛋白层，轻轻吸取上清液转移至一个新的离心管中；
(5)向装有上清液的离心管中加入等体积的异丙醇，离心管盖严后上下颠倒使其充分混匀，室温静置10min；
(6)12,000g4℃离心10min，大部分样品在离心后，试管底部出现少量白色的沉淀物；
(7)RNA沉淀的清洗，在白色沉淀物出现的离心管中含有大量的氯仿和异丙醇，这些有机物对后续的实验具有影响，弃去上清液保留沉淀，沿离心管壁缓慢地加入75％的乙醇1mL，上下颠倒离心管洗涤管壁使有机物溶解于乙醇中，随后7,500g4℃离心5min，弃去乙醇保留沉淀；
(8)RNA的溶解，室温干燥沉淀2min左右，加入20-40μl的RNase-free水溶解沉淀，可用移液枪轻轻吹打务必使所有的沉淀全部溶解，完全溶解后的RNA溶液于-80℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法，其特征在于，所述步骤3具体为：
(1)进行反转录，反应体系为：2×miRNAReactionBufferMix10.0μl、0.1％BSA2.0μl、miRNAPrimeScriptRTEnzymeMix2.0μl、TotalRNA1.0μl、RNaseFreedH2O5.0μl，反应条件为37℃60min；
(2)向得到的反转录反应液中添加RNaseFreedH2O补足至100μl，稀释5倍；
(3)选取在人血浆中已经鉴定出的高表达miRNA：miR-93a-3p，miR-451a-5p，miR-21-5p，miR-16-5P，miR-181-5p，miR-92a，以及细胞核内基因U6和5S进行定量，并检测外泌体纯度；取1μl稀释液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，进行定量检测，反应体系为：2xSYBRGreenmixExTaq12.5μl、10μMPCRForwardPrimer1μl、10μMPCRReversePrimer1μl、超纯水9.5μl、cDNA1μl，重复3次，每次每板上设置样品、一个阳性对照和一个阴性对照；
(4)根据荧光定量结果，对miRNA和细胞内基因的相对表达量进行计算。根据多次试验的经验，当平均差异倍数大于100倍时，exosome具有较好的纯度。
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