CN110511902A

CN110511902A - 基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法

Info

Publication number: CN110511902A
Application number: CN201910639939.5A
Authority: CN
Inventors: 周卫; 赵立波; 孔关义; 王德键; 王耀杰; 闵力
Original assignee: Beijing Ezawa Yasutai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Ezawa Yasutai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110511902B

Abstract

本发明提供一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法，包括：将荧光染料与体液混合，加样至排阻色谱柱，根据荧光强度收集馏分并合并，合并的馏分依次用蛋白酶K和RNaseA处理，最后超滤浓缩。本发明将排阻色谱法与超滤法相结合解决了排阻色谱法产物浓度偏低的问题，同时引入荧光染料作为示踪外参，不仅能够准确定位EVs所处的馏分，在进入下一步操作前还能排除因滤膜破损导致的EVs损失。本发明还提供能从体液中分离富集高纯度细胞外囊泡的试剂盒。本方法无需超速离心，即可从体液中分离获得高纯度的EVs，同时配合蛋白酶K和RNaseA处理，能有效消除体液中非囊泡来源的核酸污染，从而大幅提高细胞外囊泡的核酸纯度。

Description

基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法。

背景技术

细胞能向外分泌具有磷脂双分子层结构的囊泡(EVs)，因其富含核酸、蛋白质、磷脂等多种生物大分子，胞外囊泡在疾病诊断和治疗方面有着广泛的应用前景。目前，胞外囊泡的提取方法主要包括，超速离心法、聚合物沉淀法、免疫捕获法、静电吸附法，排阻色谱法以及超滤法等。超速离心法因设备昂贵、操作步骤繁琐，且回收率偏低等问题，难以满足临床检验的需求。聚合物沉淀法操作简单且成本低廉，但产物纯度偏低，存在大量非囊泡来源的蛋白质及核酸。免疫捕获价格昂贵，而且受抗原表达量差异的影响显著。静电吸附法操作步骤简单，但在吸附EVs的同时也会吸附非囊泡来源的蛋白以及蛋白复合体。排阻色谱法能够根据EVs的粒径，将其与杂蛋白分离开，产物纯度高但是浓度(单位体积的EVs个数)偏低。超滤法是根据截留分子量将体液中的EVs与杂蛋白分离开，但体液中成分复杂容易堵塞滤膜，当发生滤膜破损时会导致EVs大量损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法，包括以下步骤：

1)将粒径30-120nm的荧光染料与体液混合；

2)将1体积含荧光染料的体液加至平衡好的排阻色谱柱中，然后用流动相洗脱，以0.5体积为一个馏分，依次收集共14个馏分，并检测每个馏分的荧光强度，将荧光强度大于400的第1个馏分及其后2～3个馏分合并；

3)向合并后的馏分中依次加入蛋白酶K和RNaseA进行处理；

4)将步骤3)所得处理液加入到截留分子量100KDa的超滤管中浓缩，收集的截留物中含有富集的囊泡。

前述的方法，步骤1)所述荧光染料的制备方法如下：

用250μL密封的玻璃注射器将50～150μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加20～50μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱150～250μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺30～50μL和11mg/mL胆固醇酯10～30μL依次加入上述玻璃瓶内；加入占磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯总摩尔量1％～20％的FluoresceinDHPE；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30分钟去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入PBS缓冲液1～5mL，通过孔径50～800nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体。将上述得到的脂质体转入超速离心管，100000～200000g进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存；优选地，将上述得到的脂质体悬浮液转入50KD或100KD的超滤管，用PBS缓冲液反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。

优选地，步骤1)中荧光染料与体液按1:250体积比混合。

前述的方法，所述排阻色谱柱的填料为琼脂糖(Sepharose 2B，Sepharose 4B)或交联琼脂糖(Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B)。排阻色谱柱填料优选为交联琼脂糖Sepharose 2B。

优选地，排阻柱容积为6mL，填料用量5mL。

前述的方法，步骤2)中所述流动相为PBS，流速为约200～500μL/min。

前述的方法，步骤3)向合并后的馏分中添加终浓度10～200μg/ml的蛋白酶K，在37℃孵育10～60min，进行蛋白消化；蛋白酶K消化后，直接添加终浓度2～20μg/ml的RNaseA，室温作用10～30min，得到处理液。

前述的方法，步骤4)是将步骤3)所得处理液加入到超滤管中，4000g离心15min，收集到的截留物用PBS缓冲液重悬，用于后续蛋白或核酸提取。

本发明中，所述体液选自血浆、血清、乳汁、浓缩后的尿液、细胞培养上清、脑脊液或胸腹水等。

第二方面，本发明提供一种用于胞外囊泡分离提取的荧光脂质体，其制备方法如下：

第三方面，本发明提供一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离、富集和提取试剂盒，所述试剂盒包括但不限于排阻色谱柱、上述荧光脂质体、超滤管、蛋白酶K、RnaseA。

本发明原理如下：排阻色谱是一种根据待测物尺寸进行分离的色谱技术。色谱柱的固相填料是表面惰性、含有不同尺寸孔穴的立体网状凝胶。当流动相经过时，尺寸较小的物质能够渗入到孔穴中，而尺寸较大的物质因无法渗入孔穴中而被排除在外。其结果是尺寸较小的物质在色谱中停留时间会显著大于尺寸较大的物质，因此尺寸/分子量不同的颗粒会落入不同的馏分中。为确保收集正确的馏分，向体液中加入粒径30-120nm的荧光脂质体，用于EVs示踪。由于荧光脂质体与EVs具有相似的粒径尺寸，通过检测荧光强度就能够获知该馏分中EVs的丰度高低。

尽管排阻色谱能有效分离EVs和杂质蛋白，但无法实现EVs的富集，最后收集的馏分体积可能高达体液起始体积的2-5倍，对于后续的核酸提取构成了较大挑战。为有效富集产物中的EVs，使用截留分子量100KDa的超滤管，对上述馏分中分子量大于100KDa的颗粒进行浓缩富集，从而有效降低了核酸提取的样本起始体积。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明将排阻色谱法与超滤法相结合解决了排阻色谱法产物浓度偏低的问题，同时通过引入荧光脂质体作为示踪外参，一方面能够准确定位EVs所处的馏分，同时能够在进入下一步操作前排除因滤膜破损导致的EVs损失。

本发明提供的试剂盒能够从体液中分离、富集得到高纯度的细胞外囊泡(EVs)，包括尺寸排阻色谱柱、内标(类似囊泡粒径大小的荧光脂质体)、超滤管、蛋白酶K工作液、RNaseA工作液五部分组成。此外，本发明还公开了试剂盒的具体使用方法，本方法无需超速离心，即可从体液中分离获得高纯度的EVs，同时配合蛋白酶K和RNaseA处理，能够有效消除体液中非囊泡来源的核酸污染，从而大幅提高细胞外囊泡的核酸纯度。

附图说明

图1为本发明实施例1中荧光脂质体的粒径分析结果。

图2为本发明实施例2中荧光脂质体示踪下不同馏分中的RNA和蛋白质相对比例。

图3为本发明实施例3中不同方法提取的EVs产物的NTA结果。

图4为本发明实施例3中不同方法提取的EVs产物的Western Blot结果。

图5为本发明实施例3中不同方法提取的EVs产物的RT-PCR结果。

图6为本发明实施例4中超滤管滤膜完整和破损情况下滤出液的荧光强度。

图7为本发明实施例4中蛋白酶K和RNaseA消化前后的比较。

图8为本发明实施例5中不同馏分的荧光脂质体的荧光强度与蛋白质含量。

图9为本发明实施例5中细胞上清及尿液Evs产物的Western Blot结果。

图10为本发明实施例6中不同填料分离血浆Evs不同馏分中的荧光脂质体的强度和蛋白质含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的容积6mL排阻色谱柱购自深圳逗点生物技术有限公司，填料为琼脂糖(Sepharose 2B，Sepharose 4B)或交联琼脂糖(Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B)，上述四种填料均购自索莱宝生物科技有限公司。

实施例1荧光脂质体的制备

1、试剂耗材准备

恒压力控制挤出装置(Avestin LiposoFast Basicn)购自加拿大Avestin。磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、氯仿及甲醇购自Sigma-Aldrich。PBS购自索莱宝。Fluorescein DHPE购自Thermo Fisher Scientific。超滤管购自millipore。

2、通过恒压力控制挤出的方法制备脂质体

用250μL密封的玻璃注射器将100μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加30μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱216μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺42μL和11mg/mL胆固醇酯20μL依次加入上述玻璃瓶内；加入0.2mmol的Fluorescein DHPE；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30min去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入PBS缓冲液2mL，通过孔径100nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体。

3、游离荧光染料的去除

将上述得到的脂质体转入超速离心管，100000g进行超速离心70min，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存；优选地，将上述得到的脂质体悬浮液转入100KDa的超滤管中，用PBS缓冲液反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。

4、荧光脂质体的表征

根据上述方法制备得到荧光脂质体后，分别用动态光散射仪ZS90(马尔文)和透射电镜JEM-1400(JEOL)对产物粒径进行表征。如图1显示，制备的荧光脂质体粒径介于30-120nm之间，平均粒径约为80nm。经多功能酶标仪Tecan Infinite M1000PRO确认，脂质体在激发光作用下能够发射绿色荧光。

实施例2基于荧光脂质体示踪的排阻法纯化EVs

1、试剂准备

将商用人血浆在1300g条件下离心15min，然后将上清转移到新离心管中3000g离心15min。然后将血浆上清用0.8μm滤膜过滤，去除细胞浆残骸。取0.5mL血浆上清，按250:1的体积比向其中加入2μl荧光脂质体溶液。

2、排阻色谱法纯化血浆EVs

向6mL排阻柱中装填5mL Sepharose 2B填料。用PBS缓冲液充分平衡后，向排阻柱中加入0.5mL含荧光脂质体的血浆上清。然后用流动相洗脱，按250μL体积依次收集14个馏分。所用流动相为PBS缓冲液，洗脱流速约为200～500μL/min。

3、组分分析

使用Qubit测定各个馏分的荧光强度。采用BCA法检测各个馏分的蛋白质总量。每个馏分取200μl，使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)提取RNA，并使用q-PCR法对三种看家基因mRNA进行定量分析。三种看家基因为：SLC25A6、β-Actin、PGK1。

4、RT-PCR

取3μL的外泌体RNA样品进行后续看家基因检测，采用Takara公司生产的一步法反转录PCR检测试剂盒进行反转录与荧光定量PCR检测(货号为RR064A)，具体操作流程如下：

①在冰上配制如下反应体系：

②混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

③逆转录和扩增PCR的反应程序为：

第一阶段，逆转录：45℃,30min，95℃,10min。

第二阶段，PCR扩增：95℃5s，60℃20s，10个循环，不收集荧光；95℃5s，

60℃20s，40个循环,收集荧光。

三个看家基因的引物和探针序列如下(SEQ ID NO:1-9)：

β-Actin Forward Primer 5′-CAGGCACCAGGGCGTGAT-3′

Reverse Primer 5′-CCATGTCGTCCCAGTTGGT-3′

Probe 5’-CY5-ATGCCTCTCTTGCTCTGGGCCTCGT-3’BHQ1

PGK1 Forward Primer 5′-GAAGGAGCTGAACTACTTTGCAA-3′

Reverse Primer 5′-TTTGTCCAGCATATTATTGATGAGC-3′

Probe 5’-HEX-CAACTTTAGCTCCGCCCAGGATG-3’BHQ1

SLC25A6 Forward Primer 5′-GGCCTACTTCGGCGTGTAC-3′

Reverse Primer 5′-GAAGGGGTAGGACACCACG-3′

Probe 5’HEX-TCACGGTCTGCGCGATCATCCA-3'BHQ1

结果如图2所示，在不同馏分中，荧光脂质体和EVs内含mRNA分布高度一致主要集中在2-5号馏分中(在收集的所有14个馏分中，2-5所对应的第1个荧光峰为EVs和荧光脂质体所在的馏分，第6个馏分之后会出现代表血浆杂蛋白自发荧光的若干个馏分，使用者可以根据自己样品的实际情况，考察了所有馏分的荧光强度后，决定哪几个馏分合并进入后续实验)。需要注意的是，由于血浆蛋白有自发荧光，导致6号馏分之后出现了第2个荧光峰，且这个峰与BCA蛋白总量的结果很好地吻合，说明血浆杂蛋白主要分布在6号之后的馏分中。

实施例3基于排阻色谱和超滤的EVs提取法与其他方法的比较

1、试剂准备

将商用人血浆在1300g条件下离心15min，然后将上清转移到新离心管中3000g离心15min。然后将血浆上清用0.8μm滤膜过滤，去除细胞浆将残骸待用。

2、排阻色谱和超滤的EVs提取法(SEC)

取3只6ml排阻色谱柱(含5mL Sepharose 2B填料)。平衡后，各加入0.5mL过滤后的血浆上清(合计1.5mL血浆)，按1000:4的体积比向其中加入2μl荧光脂质体溶液。按250μL体积依次收集14个馏分。参照实验例2，收集对应馏分混合后加入到截留分子量100KDa的超滤管中，4000g离心15min，将捕获的EVs重悬到300μl PBS中。

3、超速离心法提取EVs(UC)

将1.5mL过滤后的血浆上清与13.5mL PBS混合，100000g离心70min，弃上清。将底部沉淀重悬到3mL PBS中，100000g离心70min，弃上清，并将沉淀重悬到300μl PBS中。

4、使用ExoQuick(SBI)和ExoEasy(Qiagen)商用试剂盒提取EVs

取1.5mL过滤后的血浆上清，按照ExoQuick试剂盒说明书的详细操作要求，并将产物EVs重悬到300μl PBS中。

取1.5mL过滤后的血浆上清，分别加入到3根ExoEasy柱提装置中，按照ExoEasy试剂盒说明书的详细操作要求提取。其中1根使用ExoEasy专用elution buffer洗脱，并用于NTA检测。1根直接提取RNA。1根直接裂解并用于后续蛋白质检测。

5、比较超离、ExoQuick、exoEasy和排阻色谱/超滤法提取的EVs产物

分别取等量血浆提取的EVs，采用NTA、Western Blot和RT-PCR三种方法对产物EVs的粒径、浓度、蛋白质纯度以及RNA含量进行比较。

结果如图3所示，采用聚合物沉淀法的ExoQuick试剂盒提取的EVs颗粒数量最多，但平均粒径显著小于其他三种方法，说明其中含有大量非EVs来源的颗粒，导致产物纯度较低。剩余的三种方法中，排阻色谱/超滤法提取的EVs颗粒较其它两种方法略高一些，这三种方法提取的EVs颗粒粒径分布没有显著差异。

结果如图4所示，采用上述四种方法提取的EVs产物中，排阻色谱/超滤法提取的EVs所含的两种杂蛋白(AGO2和HSA)显著低于其他三种方法，这其中ExoQuick试剂盒的HSA杂蛋白含尤其高。结合NTA实验结果，说明排阻色谱/超滤法提取的EVs纯度在优于其它三种方法。

结果如图5所示，采用上述四种方法提取的EVs RNA，对2条mRNA看家基因，以及4条miRNA进行了PCR检测。mRNA扩增结果显示，排阻色谱/超滤法分离的EVs含量最高。考虑到血浆中除EVs外还存在其它来源的miRNA，在选择的4条miRNA中，miR-146b-5p、miR-150和miR-18A具有不同程度的囊泡特异性，而U6没有囊泡特异性。结果显示，ExoEasy和ExoQuick都富集了大量非EVs来源的miRNA，而排阻色谱-超滤法主要富集的是EVs来源的miRNA。miRNA的荧光定量PCR，采用Takara公司生产的反转录剂盒进行反转录(货号为RR037A)，采用Takara公司生产的荧光定量PCR扩增试剂盒(货号为RR390Q)进行PCR扩增，具体操作流程如下：

①在冰上配制如下反转录反应体系：

②混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

③逆转录反应程序为：37℃,60min；85℃,5s。

④在冰上配制如下荧光定量PCR反应体系：

⑤荧光定量PCR扩增检测程序为：95℃30s；95℃5s，55℃30s，10个循环，不收集荧光；95℃5s，55℃30s，40个循环,收集荧光。

四个小RNA基因的引物和探针序列如下(5′-3′)：

miR-146b-5p逆转录引物GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACCAGCCTForward Primer TGTTTTTTTTTGTGAGAACTGAATTCCATReverse PrimerGTGCAGGGTCCGAGGTProbe FAM-ATTCGCACCAGAGCCAACCAGCCT-BHQ1

miR-150逆转录引物GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACCACTGGForward Primer TGTTTTTTTTCTCCCAACCCTTGTAReverse Primer GTGCAGGGTCCGAGGTProbeFAM-ATTCGCACCAGAGCCAACCACTGG-BHQ1

miR-18a逆转录引物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTATCTForward Primer CGCTAAGGTGCATCTAGTGCReverse Primer GTGCAGGGTCCGAGGTProbe FAM-TCGCACTGGATACGACCTATCTGCA-BHQ1

U6逆转录引物AACGCTTCACGAATTTGCGTForward PrimerCTCGCTTCGGCAGCACAReverse Primer AACGCTTCACGAATTTGCGTProbe FAM-AGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCA-BHQ1

实施例4利用基于荧光脂质体示踪的排阻色谱-超滤法提取高纯度血浆EVs RNA

1、试剂准备

将商用人血浆在1300g条件下离心15min，如何将上清转移到新离心管中3000g离心15min。然后将血浆上清用0.8μm滤膜过滤，去除细胞浆将残骸。取0.5mL血浆上清，按250:1的体积比向其中加入2μl荧光脂质体溶液。

2、排阻色谱法纯化EVs

向6mL排阻柱中装填5mL Sepharose 2B填料。用PBS缓冲液充分平衡后，向排阻柱中加入0.5mL含荧光脂质体的血浆上清。然后用流动相洗脱，按250μL体积依次收集14个馏分。所用流动相为PBS缓冲液，洗脱流速约为200～500μL/min。使用Qubit测定各个馏分的荧光值，根据荧光分布，确定EVs馏分。

3、蛋白酶K和RNaseA消化

合并EVs馏分，添加终浓度100μg/mL的蛋白酶K，在37℃孵育30min，进行蛋白消化。蛋白酶K消化后，直接添加终浓度10μg/mL的RNaseA，室温作用10min，消化游离核酸。

4、超滤法富集EVs

将消化处理后的EVs悬液加入100KDa超滤管中，4000g离心15min，使终体积浓缩至200μl左右。

5、滤膜破损检测

用Qubit检测超滤管滤出液，结果如图6所示，如果超滤管滤膜完整无破损，滤出液荧光值应低于200。如果滤膜发生破损，滤出液荧光值会显著提高。

6、蛋白质或核酸提取

向超滤管中加入PBS液吹打后将EVs悬液吸出，用于后续蛋白或核酸提取操作。

结果如图7所示，使用等体积血浆上清提取的EVs产物中，排阻色谱/超滤法得到的总蛋白量显著低于ExoQuick试剂盒提取的EVs。与此同时，排阻色谱/超滤法消化前后，无论mRNA还是microRNA的含量都没有发生显著变化，而ExoQuick试剂盒提取的产物microRNA发生了显著变化，说明其中含有许多非EVs来源的microRNA。

实施例5利用基于荧光脂质体示踪的排阻色谱-超滤法提取细胞上清和尿液EVs

1、试剂准备

取20mL细胞上清或尿液，3000g离心15min。取上清，用0.22μm滤膜过滤后，使用100KDa的超滤管浓缩，终体积0.5mL。按250:1的体积比向其中加入2μl荧光脂质体溶液。

2、排阻色谱法纯化EVs

向6mL排阻柱中装填5mL Sepharose 2B填料。用PBS缓冲液充分平衡后，向排阻柱中加入0.5mL含荧光脂质体的血浆上清。然后用流动相洗脱，按250μL体积依次收集14个馏分。所用流动相为PBS缓冲液，洗脱流速约为200～500ul/min。使用Qubit测定各个馏分的荧光值，根据荧光分布，确定EVs馏分。

3、组分分析

使用Qubit测定各个馏分的荧光强度。采用BCA法检测各个馏分的蛋白质总量。，将荧光强度大于400的第1个馏分及其后2个馏分合并，加入到截留分子量100KDa的超滤管中浓缩，至终体积200μL。收集的截留物中含有富集的EVs，并进行Western blot实验对EVs蛋白标志物CD63进行检测。

如图8所示，根据Qubit检测的荧光结果，浓缩后的尿液和细胞上清与血浆结果类似，荧光脂质体主要集中在第2、3和4馏分中。杂蛋白则主要集中在第6个之后的馏分中。

如图9所示，Western Blot结果显示将2、3和4馏分合并浓缩后得到的EVs产物中，能检出CD63蛋白。说明该方法能够从浓缩的尿液和细胞上清中提取到高纯度的EVs。

实施例6排阻色谱法的填料优化实验

1、试剂准备

将商用人血浆在1300g条件下离心15min，如何将上清转移到新离心管中3000g离心15min。然后将血浆上清用0.8μm滤膜过滤，去除细胞浆将残骸。取2mL血浆上清，按250:1的体积比向其中加入8μl荧光脂质体溶液。使用四种不同填料制备排阻柱，分别为琼脂糖(Sepharose 2B，Sepharose 4B)或交联琼脂糖(Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B)，上述四种填料均购自索莱宝生物科技有限公司。向6mL排阻柱中装填5mL填料。

2、排阻色谱法纯化EVs

用PBS缓冲液充分平衡后，向排阻柱中加入0.5mL含荧光脂质体的血浆上清。然后用流动相洗脱，按250μL体积依次收集14个馏分。所用流动相为PBS缓冲液，洗脱流速约为200～500μL/min。使用Qubit测定各个馏分的荧光值，根据荧光分布，确定EVs馏分。

3、组分分析

使用Qubit测定各个馏分的荧光强度。采用BCA法检测各个馏分的蛋白质总量。

结果如图10所示，使用填料Sepharose 2B的排阻柱，荧光脂质体和杂蛋白的分离效果最佳，使用填料Sepharose CL-2B的排阻柱效果其次。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

[1]Arroyo JD,Chevillet JR,Kroh EM,et al.Argonaute2 complexes carry apopulation of circulating microRNAs independent of vesicles in humanplasma.Proc Natl Acad Sci U S A 2011；108:5003-8.

序列表

<110> 北京恩泽康泰生物科技有限公司

<120> 基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法

<130> KHP191111732.6

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggcaccag ggcgtgat 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccatgtcgtc ccagttggt 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgcctctct tgctctgggc ctcgt 25

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaaggagctg aactactttg caa 23

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tttgtccagc atattattga tgagc 25

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<212> DNA

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caactttagc tccgcccagg atg 23

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ggcctacttc ggcgtgtac 19

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaaggggtag gacaccacg 19

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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Claims

1.基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将粒径30-120nm的荧光染料与体液混合；

3)向合并后的馏分中依次加入蛋白酶K和RNaseA进行处理；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述荧光染料的制备方法如下：

用250μL密封的玻璃注射器将50～150μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加20～50μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱150～250μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺30～50μL和11mg/mL胆固醇酯10～30μL依次加入上述玻璃瓶内；加入占磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯总摩尔量1％～20％的Fluorescein DHPE；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30分钟去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入PBS缓冲液1～5mL，通过孔径50～800nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体；将上述得到的脂质体转入超速离心管，100000～200000g进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存；优选地，将上述得到的脂质体悬浮液转入50KD或100KD的超滤管，用PBS缓冲液反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中荧光染料与体液按1:100～1:1000体积比混合，优选的体积比为1:250。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述排阻色谱柱的填料为琼脂糖Sepharose2B、Sepharose4B，或交联琼脂糖Sepharose CL-2B、Sepharose CL-4B；

优选地，排阻柱容积为6mL，填料用量5mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述流动相为PBS，流速为200～500μL/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)向合并后的馏分中添加终浓度10～200μg/ml的蛋白酶K，在37℃孵育10～60min，进行蛋白消化；蛋白酶K消化后，直接添加终浓度2～20μg/ml的RNaseA，室温作用10～30min，得到处理液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)是将步骤3)所得处理液加入到超滤管中，3000～6000g离心10～30min，收集到的截留物用PBS缓冲液重悬。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述体液选自血浆、血清、乳汁、浓缩后的尿液、细胞培养上清、脑脊液或胸腹水。

9.用于胞外囊泡分离提取的荧光脂质体，其特征在于，其制备方法如下：

10.基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离、富集和提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括排阻色谱柱、权利要求9所述荧光脂质体、超滤管、蛋白酶K、RNaseA。