CN113388520A - 胞外囊泡纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种大体积样液的胞外囊泡纯化方法。所述方法包括提供待制备胞外囊泡的样液，提取胞外囊泡；所述样液的体积以升计；将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分；选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分；将混合所得物转移至超滤管中离心，留取截留液，得到纯化胞外囊泡。所得胞外囊泡纯度高、可溶性杂蛋白污染小，实用性更加广泛，可满足后续NTA、电镜和蛋白组等分析。且操作简便，耗时短。

Description

胞外囊泡纯化方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种胞外囊泡纯化方法。
背景技术
胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称。基于其生物发生、大小和生物物理性质，可以进一步分类(例如外泌体、微泡等)。是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体，具有重要的应用前景。
现有的胞外囊泡在制备过程中，容易产生蛋白污染，无法满足后续的NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)纳米微粒追踪分析术、电镜观察或蛋白组分析等的需求。对于大体积样液的胞外囊泡通常采用梯度密度法进行纯化，然而该方法成本高、操作繁琐且操作时间长。
发明内容
有鉴于此，本公开的目的在于提出一种胞外囊泡纯化方法。
基于上述目的，本公开提供了一种胞外囊泡纯化方法，包括：
提供待制备胞外囊泡的样液，提取胞外囊泡；所述样液的体积以升计；
将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分；
选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分；
将混合所得物转移至超滤管中离心，留取截留液，得到纯化胞外囊泡。
在一些实施例中，所述选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分具体包括：
分别检测每份流下组分的平均粒径或者游离蛋白浓度；
筛选平均粒径符合目标粒径或游离蛋白浓度符合目标浓度的流下组分。
在一些实施例中，每份流下组分的体积为1～1.25ml；所述目标粒径为大于30～200nm；所述游离蛋白目标浓度为小于2.0ug/mL。
在一些实施例中，所述样液选自细菌培养液、藻细胞培养液和植物裂解液中的至少一种。
在一些实施例中，所述提取胞外囊泡具体包括：
将样液进行离心，得到上清液；离心条件为，离心力9800～10200g，离心时间为10～20min；
将上清液进行第一过滤处理和第二过滤处理，得到过滤液；其中，第二过滤处理的滤膜粒径小于第一过滤处理；
将过滤液进行超速离心处理或者进行试剂盒提取，得到胞外囊泡。
在一些实施例中，所述第一过滤处理的滤膜粒径为0.4～0.5um；所述第二过滤处理的滤膜粒径为0.20～0.22um。
在一些实施例中，所述将过滤液进行超离处理之前还包括：
将过滤液用小型切向流超滤设备进行浓缩，得到浓缩液；其中，浓缩条件为截留分子量100kDa；
将浓缩液进行第三过滤处理，得到滤液；其中，所述第三过滤处理的滤膜粒径与所述第二过滤处理的滤膜粒径相同；
超速离心处理包括将所述滤液进行超速离心，并用PBS缓冲液重悬沉淀；超速离心的条件为，离心力99950～100050，离心时间为1.8～2.2h。
在一些实施例中，所述将过滤液进行试剂盒提取之前还包括：将过滤液在超滤管中离心浓缩；所述离心浓缩的条件为截留分子量100kDa，离心力2800～3200g，离心时间为5～10min；
试剂盒提取具体包括:用细菌膜囊泡分离试剂盒提取离心浓缩所得产物。
在一些实施例中，将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分具体包括：
用8～12ml的PBS缓冲液洗涤排阻色谱柱；
将所述胞外囊泡加入洗涤后的排阻色谱柱中，等体积收集流下组分，并加入PBS缓冲液洗涤。
在一些实施例中，所述将混合所得物转移至超滤管中离心的条件为：超滤管的截留分子量为100kDa；离心力2800～3200g，离心时间为5～10min。
从上面所述可以看出，本公开提供的通过提供待制备胞外囊泡的样液，提取胞外囊泡；所述样液的体积以升计；将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分；选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分；将混合所得物转移至超滤管中离心，留取截留液，得到纯化胞外囊泡。所得胞外囊泡纯度高、可溶性杂蛋白污染小，实用性更加广泛，可满足后续NTA、电镜和蛋白组等分析。且操作简便，耗时短。
附图说明
为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本公开实施例的胞外囊泡纯化方法的流程示意图；
图2为本公开实施例的胞外囊泡在排阻色谱柱中收集流下组分的流程示意图；
图3a为实施例2中的超速离心得到的胞外囊泡的电镜观察图；
图3b为实施例2中经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊泡的电镜观察图；
图4为实施例2中的超速离心得到的胞外囊泡和经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊的颗粒浓度柱状图；
图5为实施例2中的超速离心得到的胞外囊泡和经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊的蛋白浓度柱状图；
图6为实施例2中的超速离心得到的胞外囊泡和经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊的纯净度柱状图；
图7a为实施例3中的试剂盒提取得到的胞外囊泡的电镜观察图；
图7b为实施例3中的经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊泡的电镜观察图；
图8为实施例3中的试剂盒提取得到的胞外囊泡和经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊的蛋白浓度柱状图；
图9为实施例3中的试剂盒提取得到的胞外囊泡和经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊的颗粒浓度柱状图；
图10为实施例3中的试剂盒提取得到的胞外囊泡和经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊的纯净度柱状图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本公开实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开实施例中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
请参阅图1，本公开实施例提供一种胞外囊泡纯化方法，包括：
S100，提供待制备胞外囊泡的样液，提取胞外囊泡；所述样液的体积以升计；
S200，将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分；
S300，选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分；
S400，将混合所得物转移至超滤管中离心，留取截留液，得到纯化胞外囊泡。
本公开实施例提供的胞外囊泡纯化方法，通过提供待制备胞外囊泡的样液，提取胞外囊泡；所述样液的体积以升计；将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分；选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分；将混合所得物转移至超滤管中离心，留取截留液，得到纯化胞外囊泡。所得胞外囊泡纯度高、可溶性杂蛋白污染小，实用性更加广泛，可满足后续NTA、电镜和蛋白组等分析。且操作简便，耗时短。
在一些实施例中，在步骤S100中，所述样液为大体积样品，也即所述样液的体积以升计。大体积样品，指能够人工获得的几升至数百升的样品，如细菌培养液、藻细胞培养液或植物裂解液等。而小体积样品，通常指几mL至几十mL的样品，如血液、血清、唾液或组织液等，由于其来源珍贵，难以大量获取。
在一些实施例中，所述样液选自细菌培养液、藻细胞培养液和植物裂解液中的至少一种。细菌培养液可以例如大肠杆菌培养液。
在一些实施例中，样液为大肠杆菌培养液，提供待制备胞外囊泡的样液可以具体包括：将大肠杆菌在培养基中培养至指数期后期，使OD600值为1.2。
在一些实施例中，提取胞外囊泡可以具体包括：将样液进行离心，得到上清液；将上清液进行第一过滤处理和第二过滤处理，得到过滤液；将过滤液进行超速离心处理或者进行试剂盒提取，得到胞外囊泡。其中，离心条件为离心力9800～10200g，离心时间为10～20min。
在一些实施例中，第一过滤处理和第二过滤处理时，滤膜粒径变小，且均为微孔滤膜。也即，第二过滤处理的滤膜粒径小于第一过滤处理。所述第一过滤处理的滤膜粒径可以为0.4～0.5um；所述第二过滤处理的滤膜粒径可以为0.20～0.22um。通过两次过滤处理，且第二过滤处理的滤膜粒径小于第一过滤处理，能够得到杂质较少的过滤液。
在一些实施例中，将过滤液进行超离处理之前还包括：
将过滤液用小型切向流超滤设备进行浓缩，得到浓缩液；其中，浓缩条件为截留分子量100kDa。也即，小型切向流超滤设备采用的超滤膜的截留分子量为100kDa。
将浓缩液进行第三过滤处理，得到滤液；其中，所述第三过滤处理的滤膜粒径与所述第二过滤处理的滤膜粒径相同；也即，第三过滤处理的滤膜粒径为0.20～0.22um。通过上述的采用浓缩和第三超滤处理，能够得到杂质较少的滤液。
在一些实施例中，超速离心处理包括将所述滤液进行超速离心，并用PBS重悬沉淀；超速离心的条件为，离心力99950～100050，离心时间为1.8～2.2h。其中，PBS缓冲液可以为1xPBS缓冲液，其体积可以为300～400uL。
在一些实施例中，所述将过滤液进行试剂盒提取之前还包括：将过滤液在超滤管中离心浓缩；所述离心浓缩的条件为截留分子量100kDa，离心力2800～3200g，离心时间为5～10min。
在一些实施例中，试剂盒提取具体包括:用细菌膜囊泡分离试剂盒提取离心浓缩所得产物，并用洗脱液洗脱。
在一些实施例中，步骤S200中，将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分具体可以理解为：在收集流下组分时，将所有的流下组分按照体积来收集为若干份。也即，每份流下组分的体积是相同的。每份流下组分的体积可以为1～1.25ml。通过将流下组分等体积收集，可以便于后续对流下组分的筛选，减少流下组分中的杂质等。
请参阅图2，在一些实施例中，将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分具体包括：
S210，用8～12ml的PBS缓冲液洗涤排阻色谱柱；
S220，将所述胞外囊泡加入洗涤后的排阻色谱柱中，等体积收集流下组分，并加入PBS缓冲液洗涤。
在一些实施例中，所述排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)柱的制备方法可以为：
洗涤琼脂糖凝胶CL-2B(Sepharose)(Sepharose CL-2B琼脂糖凝胶CL-2B，货号S8731-100mL)3-4次；10mL一次性注射器，取下针头，底部放置20μm滤膜(Mollipore)，竖直放在架子上。将洗涤后的CL-2B慢慢加入注射器，保证下方滤出液体清澈透明。最后用10mLPBS洗涤。SEC柱可在4℃冰箱保存1周。
在一些实施例中，步骤S300中，所述选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分具体可以包括：
分别检测每份流下组分的平均粒径或者游离蛋白浓度；
筛选平均粒径符合目标粒径或游离蛋白浓度符合预设浓度的流下组分。
在一些实施例中，所述目标粒径可以为30～200nm。具体筛选时，可以根据检测平均粒径的精度，进行筛选，选择30～200nm范围内的平均粒径。应当说明的是，该平均粒径对应的是纳米流式检测仪的检测标准。在实际应用中，可以采用DLS(Dynamic LightScattering)动态光散射进行粗筛，也可以选择纳米流式检测仪进行精确筛选。由于DLS(Dynamic Light Scattering)动态光散射的精度小于纳米流式检测仪，对于50nm以下的粒径检测精度灵敏度较低。在选用DLS(Dynamic Light Scattering)动态光散射的检测方式时，可以以30～200nm为基准，选择相对该范围的端点数值较大的范围，例如70～220nm。
在一些实施例中，所述游离蛋白目标浓度可以为小于2.0μg/mL，也即OD562的值接近0。通过筛选符合目标粒径或游离蛋白浓度符合目标浓度的流下组分，能够将杂质较多的流下组分排除，提高纯化效率。
在一些实施例中，可以根据提取胞外囊泡的方法来确定每份流下组分的具体检测对象。例如，当提取胞外囊泡的方法中采用超速离心处理时，可以检测每份流下组分的平均粒径。而当提取胞外囊泡的方法中采用试剂盒处理时，可以检测每份流下组分的游离蛋白。由于大体积的样品采用试剂盒处理提取胞外囊泡时，杂质可能会相对较多，游离蛋白浓度可能会比较高，粒径分布不够准确。
在一些实施例中，步骤S400中，所述将混合所得物转移至超滤管中离心的条件为：超滤管的截留分子量为100kDa；离心力2800～3200g，离心时间为5～10min。
实施例1SEC柱(排阻色谱柱)的制备
洗涤琼脂糖凝胶CL-2B(Sepharose)(Sepharose CL-2B琼脂糖凝胶CL-2B，货号S8731-100mL)3-4次；10mL一次性注射器，取下针头，底部放置20μm滤膜(Mollipore),竖直放在架子上。将洗涤后的CL-2B慢慢加入注射器，保证下方滤出液体清澈透明。最后用10mLPBS洗涤。SEC柱可在4℃冰箱保存1周。
实施例2对超速离心提取的胞外囊泡的纯化
A1、大肠杆菌E.Coil E4742在5L LB培养基中37℃150rpm/min培养至指数期后期(OD600＝1.2)；
A2、将A1所得菌液进行离心，离心条件：4℃，10000g，15mins，得到上清液；
A3、将A2所得上清液用0.45μm滤膜进行第一过滤处理，收集过滤液；
A4、将A3所得过滤液用0.22μm滤膜进行第二过滤处理，收集过滤液；
A5、将A4所得过滤液用小型切向流设备(100kDa cutoff,Amicon,Merck)进行浓缩，最终得到78mL浓缩液；
A6、将A5所得浓缩液过0.22μm针头滤器(Merck Millipore,Ireland)进行第三过滤处理，收集滤液；
A7、将A6得滤液转移至超离管中，配平后，4℃100000g超速离心2h；
A8、超速离心结束后，移去离心管中上清液，加入300-400μL 1×PBS重悬沉淀，初步得到胞外囊泡；
A9、用10mL PBS洗涤SEC柱，待柱子上方液体流尽时，将上述胞外囊泡加入SEC柱中，并开始收集样品，并加入PBS洗涤，收集流下组分，每个组分1.25mL,分别记为S1-S12，共12组分；
A10、用Zeta电位及纳米/亚微米粒度分析仪(DLS)测A9所得各个组分的粒径分布(也即平均粒径)，根据粒径分布(也即平均粒径)，将S2-S6组分样品混在一起；粒径分布可以如下述表1。具体选择时，先根据洗脱时对应的粒径变化规律，即大粒径的先洗出，小粒径的后洗出，将S8～S12组排除。再筛选符合目标粒径的流下组分，由于DLS检测的粒径的精度小于纳米流式检测仪，该检测结果中，主要选择30～200nm，且粒径稍大于该标准范围的端点值的范围进行选择，去除粒径明显大于200nm的S1组，和粒径明显小于30nm的S7组，最终选取得到S2-S6组。
表1每份流下组分的平均粒径
Sample(流下组分编号) AVE(平均粒径)(nm)
S1 361.7
S2 214
S3 140.5
S4 106.4
S5 104.1
S6 71.42
S7 25.54
S8 56.21
S9 52.27
S10 36.9
S11 -
S12 80.41
A11、将上述S2-S6混样转移至100KD超滤管(Merck Millipore,Ireland)，4℃3000g离心5-10mins，留取截留液1800μL，即得到纯化胞外囊泡。
分别将步骤A8中经过超速离心处理得到的胞外囊泡和步骤A11中经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊泡按照常规的方法(即现有的方法)进行电镜观察(见图3a和图3b)、蛋白浓度检测(见图5)、平均粒径检测(采用纳米流式检测仪检测)、颗粒浓度检测(见图4)和纯净度检测(见图6)，具体数据见表2，比较纯化结果。
表2超速离心处理所得胞外囊泡和经SEC柱纯化后所得纯化胞外囊泡比较
检测指标 超离得到的胞外囊泡 SEC纯化得到的胞外囊泡
电镜图 可以进行电镜观察分析 可以进行电镜观察分析
蛋白浓度(μg/ml) 323.06 164.95
平均粒径(nm) 68.92 67.04
颗粒数(particles/ml) 9.74E+10 8.05E+10
纯净度(particles/mg) 3.01E+11 4.88E+11
请参阅图3a,图3b和表2，其中，箭头为非囊泡杂质，直线为囊泡。可以看出，经过实施例1方法纯化后，能够去除囊泡外杂蛋白，蛋白浓度降低49％，纯净度增加62％。且纯化前后，平均粒径几乎未发生变化，未发生囊泡数量级变化。综上，实施例1的纯化方法能够有效纯化胞外囊泡。
实施例3对试剂盒(细菌膜囊泡分离试剂盒(细菌培养基)10ml，润基生物，Catnumber:BacMV10-10)提取的胞外囊泡的纯化
B1、大肠杆菌E.Coil E4742在1L LB培养基中37℃150rpm/min培养至指数期后期(OD600＝1.2)；
B2、将B1所得菌液进行离心，离心条件：4℃，10000g，15mins，得到上清液；
B3、将B2所得上清用0.45μm滤膜进行第一过滤处理，收集过滤液；
B4、将B3所得滤液用0.22μm滤膜进行第二过滤处理，收集过滤液；
B5、将B4所得过滤液用100KD超滤管(Merck Millipore,Ireland)，4℃3000g离心5-10mins进行浓缩，最终得到20mL浓缩液；
B6、将浓缩液分2管，按照细菌膜囊泡分离试剂盒(润基生物，货号BacMV10-10)要求提取胞外囊泡，最后用300μL洗脱液洗脱；
B7、用10mL PBS洗涤SEC柱，待柱子上方液体流尽时，将上述胞外囊泡加入SEC柱中，并开始收集样品，并加入PBS洗涤，收集流下组分，每个组分1mL,分别记为S1-S16，共16组分；
B8、用DLS分别测各组分粒径分布，同时，直接测各组分游离蛋白的浓度，最后选择S1-S3组分样品混在一起；粒径分布可以如下述表3。具体选择时，先根据S2组的平均粒径明显大于胞外囊泡的常规粒径，选择根据游离蛋白浓度进行筛选。游离蛋白浓度如下述表4。可以看出，编号S1到S3组的游离蛋白浓度接近于均小于2.0ug/mL。因此，选取S1到S3组。
B9、将上述S1-S3混样转移至100KD超滤管(Merck Millipore,Ireland)，4℃3000g离心5-10mins，留取截留液300μL，即得到纯化胞外囊泡。
分别将步骤A8中经过超速离心处理得到的胞外囊泡和步骤A11中经过SEC柱纯化后所得纯化胞外囊泡按照常规的方法(即现有的方法)进行电镜观察(见图7a和图7b)、蛋白浓度检测(见图8)、颗粒浓度检测(采用纳米流式检测仪检测，结果见图9)和纯净度检测(见图10)，具体数据见表5，比较纯化结果。
表3每份流下组分的平均粒径
Figure BDA0003119015250000101
表4每份流下组分的游离蛋白浓度
Figure BDA0003119015250000102
表5试剂盒提取所得胞外囊泡和经SEC柱纯化后所得纯化胞外囊泡比较
Figure BDA0003119015250000111
请参阅图7a和图7b和表5，其中，箭头为非囊泡杂质，直线为囊泡。可以看出，经过实施例1方法纯化后，能够去除囊泡外杂蛋白，蛋白浓度减少近1/8，纯净度增加近5倍。综上，实施例2的纯化方法能够有效去除游离蛋白，纯化胞外囊泡。
本公开实施例的方法，通过对大体积样液进行离心处理，得到上清液；再将上清液经过两次过滤处理，且第二过滤处理的滤膜粒径小于第一过滤处理，能够得到杂质较少的过滤液。配合过滤液进行浓缩和与所述第二过滤处理的滤膜粒径相同的第三过滤处理再经过超速离心，能够提取得到胞外囊泡。或者配合将过滤液在超滤管中离心浓缩并通过试剂盒提取，能够提取得到胞外囊泡。再将胞外囊泡加入排阻色谱柱中，将流下组分等体积收集，通过筛选符合目标粒径或游离蛋白浓度符合目标浓度的流下组分，能够将杂质较多的流下组分排除，提高纯化效率。最终能够有效去除游离蛋白，纯化胞外囊泡，满足NTA、电镜观察或蛋白组分析等对胞外囊泡的需求，为后期的试验提供保障。且具有操作简单，时间短，成本低廉等优势。
需要说明的是，上述对本公开的一些实施例进行了描述。其它实施例在所附权利要求书的范围内。在一些情况下，在权利要求书中记载的动作或步骤可以按照不同于上述实施例中的顺序来执行并且仍然可以实现期望的结果。另外，在附图中描绘的过程不一定要求示出的特定顺序或者连续顺序才能实现期望的结果。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
另外，为简化说明和讨论，并且为了不会使本公开实施例难以理解，在阐述了具体细节以描述本公开的示例性实施例的情况下，对本领域技术人员来说显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下或者这些具体细节有变化的情况下实施本公开实施例。因此，这些描述应被认为是说明性的而不是限制性的。
尽管已经结合了本公开的具体实施例对本公开进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胞外囊泡纯化方法，其特征在于，包括：
提供待制备胞外囊泡的样液，提取胞外囊泡；所述样液的体积以升计；
将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分；
选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分；
将混合所得物转移至超滤管中离心，留取截留液，得到纯化胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选择并混合具有目标粒径或游离蛋白目标浓度的流下组分具体包括：
分别检测每份流下组分的平均粒径或者游离蛋白浓度；
筛选平均粒径符合目标粒径或游离蛋白浓度符合目标浓度的流下组分。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每份流下组分的体积为1～1.25ml；所述目标粒径为30～200nm；所述游离蛋白目标浓度为小于2.0ug/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样液选自细菌培养液、藻细胞培养液和植物裂解液中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取胞外囊泡具体包括：
将样液进行离心，得到上清液；离心条件为，离心力9800～10200g，离心时间为10～20min；
将上清液进行第一过滤处理和第二过滤处理，得到过滤液；其中，第二过滤处理的滤膜粒径小于第一过滤处理；
将过滤液进行超速离心处理或者进行试剂盒提取，得到胞外囊泡。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一过滤处理的滤膜粒径为0.4～0.5um；所述第二过滤处理的滤膜粒径为0.20～0.22um。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述将上清液进行第一过滤处理和第二过滤处理，得到过滤液之后，将过滤液进行超速离心处理之前还包括：
将过滤液用小型切向流超滤设备进行浓缩，得到浓缩液；其中，浓缩条件为截留分子量100kDa；
将浓缩液进行第三过滤处理，得到滤液；其中，所述第三过滤处理的滤膜粒径与所述第二过滤处理的滤膜粒径相同；
所述将过滤液进行超速离心处理包括将所述滤液进行超速离心，并用PBS缓冲液重悬沉淀；超速离心的条件为，离心力99950～100050，离心时间为1.8～2.2h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述将过滤液进行试剂盒提取之前还包括：将过滤液在超滤管中离心浓缩；所述离心浓缩的条件为截留分子量100kDa，离心力2800～3200g，离心时间为5～10min；
所述将过滤液进行试剂盒提取具体包括:用细菌膜囊泡分离试剂盒提取离心浓缩所得产物。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述胞外囊泡加入排阻色谱柱中，等体积收集流下组分具体包括：
用8～12ml的PBS缓冲液洗涤排阻色谱柱；
将所述胞外囊泡加入洗涤后的排阻色谱柱中，等体积收集流下组分，并加入PBS缓冲液洗涤。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将混合所得物转移至超滤管中离心的条件为：超滤管的截留分子量为100kDa；离心力2800～3200g，离心时间为5～10min。
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