KR102170903B1 - 유체 샘플로부터 세포 외 소포체를 고농축하는 크기 기반 분리법 - Google Patents

유체 샘플로부터 세포 외 소포체를 고농축하는 크기 기반 분리법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유체 샘플로부터 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 농축하는 방법으로서, 구체적으로 20 내지 100 nm 필터를 사용하고, 유체 샘플의 조성 및 용리 완충액 사용법을 조절하여 단시간 내에 높은 효율로 세포 외 소포체를 농축하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 세포 외 소포체 농축법을 이용할 경우 농축 공정을 간편화하면서 농축 시간을 줄이고, 높은 효율로 세포 외 소포체를 농축할 수 있다. 이는 종래 농축 방법에 비하여 시간과 비용을 절감하고 농축 효율을 높인 것으로서 세포 외 소포체에 적합한 경제적인 농축 방법을 제시한 것이다.

Description

유체 샘플로부터 세포 외 소포체를 고농축하는 크기 기반 분리법 {A size-based separation method for high concentration of extracellular vesicle from fluid sample}
본 발명은 유체 샘플로부터 세포 외 소포체(Extracellular vesicle)를 농축하는 방법으로서, 구체적으로 평균 기공 크기가 20 내지 100 nm인 필터를 사용하고, 계면활성제가 포함된 유체 샘플과 가스가 포함된 용리 완충액으로 필터에 결합된 세포 외 소포체를 용리하는 새로운 방식으로 단시간 내에 높은 효율로 세포 외 소포체를 농축하는 방법에 관한 것이다.
현재 불치/난치 질환을 치료하기 위한 새로운 패러다임으로 성체줄기세포 치료법이 다양하게 임상 적용되고 있다. 그러나, 환자 혹은 공여자로부터 추출 과정, 선별된 줄기세포를 증식시키기 위해 체외 배양하는 과정 중 발생할 수 있는 이종 혈청(Xenogenic serum)의 인터널리제이션에 의한 인수전염(Zoonosis)의 문제, 줄기세포가 체내 이식되었을 때 왕성한 증식력과 상대적으로 큰 세포 사이즈 등의 줄기세포 특성으로 인해 발생할 수 있는 종양 형성(Tumor formation) 문제, 혈관 폐쇄 유발 경색(Vascular occlusion causing infarcts) 등의 위험 요소가 존재한다.
따라서, 앞서 언급한 살아있는 줄기세포를 직접 이용한 치료에서 발생할 수 있는 다양한 위험 요소 혹은 문제들을 회피하는 방안이 활발히 연구되고 있으며, 그 일환으로 줄기세포로부터 유래된 세포 외 소포체로 줄기세포 치료 기능을 대신할 수 있다는 연구 결과들이 나오고 있다(Cell. Mol. Life Sci. (2011)68: 2667-2688).
세포 외 소포체는 미세소포체(Microvesicle)와 엑소좀(Exosome)등으로 구분되며, 세포간의 상호 정보교환의 역할을 하고 암세포의 전이, 면역, 조직의 재생 등과 연관되어 바이오마커(Bio-maker)의 기능을 한다.
특히, 혈관 내에서 순환하는 세포 외 소포체를 혈액과 분리하는 분리장치가 개발되었는데 원심분리장치를 그 예로 들 수 있다. 원심분리장치는 원심력을 이용하여 펠렛으로 형성된 나노사이즈의 물질들에서 소포체를 포집한다. 그러나, 미크론 크기 범위에서 입자의 침강 속도는 매우 낮으므로 결과적으로 이들 입자의 원심 분리는 수 분에서 수 시간이 걸리게 되며, 이로 인한 문제로 펠렛을 풀어내는 과정에서 많은 인력과 시간이 필요하다는 점과 소포체가 응집되어 침전물이 발생할 수 있다는 점이 있다.
또한, 원심분리방법을 이용할 경우, 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 유체에 포함된 세포 외 소포체 전체량 중 약 5%~25%만을 분리할 수 있고, 이를 제외한 대부분(75%~95%)의 세포 외 소포체를 잃어버리게 된다. 이와 함께 초고속 원심분리장치가 필요한 원심분리 방법은 장비의 고비용 측면뿐만 아니라, 한 회에 허용되는 유체의 양이 현재까지 최대 0.6 L 수준이라는 한계가 있다(Sci Rep. (2015) Aug 14;5:13103).
상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 단 시간 내에 높은 효율로 세포 외 소포체를 농축하는 방법을 개발하고자 연구하였고, 특정 기공 크기 필터 및 유체 샘플 조성 변화 및 용리 완충액의 사용 조절을 통해 많은 양의 세포 외 소포체를 단시간 내에 농축하고 세포 외 소포체의 손실을 줄일 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다. 특히, 본 발명에서 사용한 필터, 유체 샘플 및 용리 완충액의 특성은, 특정 장비에 국한되지 않고 공지된 여러 장비에 적용하여 사용 가능하다는 점에서 유용하다.
본 발명의 목적은 유체 샘플로부터 단시간 내에 높은 효율로 세포 외 소포체를 농축하는 방법으로서, 구체적으로 평균 기공 크기가 20 내지 100 nm인 필터를 사용하고 유체 샘플 조성 및 용리 완충액의 사용법을 조절하여 세포 외 소포체를 고효율로 농축하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제1양태는 유체 샘플로부터 세포 외 소포체(Extracellular vesicle)를 농축하는 방법으로서,
(ⅰ) 유체 샘플을 담는 용기;
(ⅱ) 평균 기공 크기가 20 내지 100 nm인 필터, 개구부, 및 배출구를 포함하는 농축 피펫 팁; 및
(ⅲ) 상기 농축 피펫 팁을 통해 유체 샘플을 흡입하고 농축된 세포 외 소포체를 농축 피펫 팁으로부터 회수하도록 구성된 농축 유닛;
을 포함하는 장치를 이용하여,
상기 농축 피펫 팁을 통하여 (ⅰ)의 용기에 담긴 유체 샘플을 흡입하고, 농축 피펫 팁의 필터에 포집된 세포 외 소포체를 용리시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
세포 외 소포체를 분리하는 원심 분리 방법을 대체하는 방법 중 하나는 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol, PEG)이라는 폴리머를 이용하여 세포 외 소포체를 농축하는 방법으로서, 이는 PEG가 세포 외 소포체의 용해도를 낮춰 용출시키고 가라앉히는 침전 현상을 이용한다. PEG와 세포 외 소포체의 반응 시간을 높일수록 많은 양의 세포 외 소포체를 침전시키며, 보통 4시간에서 24시간의 반응 시간을 필요로 한다. PEG에 의한 용출 방식을 사용하는 대표적 제품으로는 ExoQuick이 알려져 있다. 본 발명의 세포 외 소포체 분리 방식은 ExoQuick과 비교해 분리량이 2배 가까이 높고 비용이 20배 이상 저렴하여 생산성의 측면에서 효율적이다.
침전 방식 외에 자주 활용되는 세포 외 소포체 분리 방식은 필터를 이용하는 방식이다. 필터 방식은 세포 외 소포체보다 기공 크기가 작거나 유사한 필터를 사용하여 세포 외 소포체를 걸러내는 방법이다. 세포 외 소포체는 필터에 걸러지고 그 외 단백질들은 배출되기에 유체의 속도에 따라 분리 속도를 조절할 수 있으며, 반응 시간을 요구하지 않아 분리 시간은 빠르다. 하지만, 필터에 결합하거나 빠져나가는 세포 외 소포체의 비율이 높아 최종 회수율은 높지 않은 한계점이 있는 것으로 생각되어 왔다. 본 발명에서는 기존의 필터 방식을 사용하여 이의 장점을 가지면서도, 필터 크기와 용리 완충액의 구성 성분을 조절함으로써, 필터에 결합하거나 빠져나가는 세포 외 소포체의 비율을 낮추어 최종 분리 효율을 높인 것이 특징이다.
종래 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 저비용으로 단시간 내에 세포 외 소포체를 농축하는 방법을 개발하고자 연구하였으며, (ⅰ) 평균 기공 크기가 20 내지 100 nm인 필터를 사용하고, (ⅱ) 트리스 용리 완충액(Tris elution buffer) 또는 피비에스 용리 완충액(PBS　elution buffer), 거품 형성용 가스가 포함된 용리 완충액을 반복 사용하여 용리하고, (iii) 세포 외 소포체가 함유된 유체 샘플에 계면활성제를 추가로 포함할 경우, 종래 농축법에 비해 시간과 비용을 줄이면서도 고효율로 세포 외 소포체를 농축할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명은 이에 기초한다.
구체적으로, 본 발명은 필터와 용리 완충액을 이용한 세포 외 소포체의 농축 방법이다. 본 발명에서 이용하는 농축 장치는 (ⅰ) 유체 샘플을 담는 용기; (ⅱ) 평균 기공 크기가 20 내지 100 nm인 필터, 개구부, 및 배출구를 포함하는 농축 피펫 팁; 및 (ⅲ) 상기 농축 피펫 팁을 통해 유체 샘플을 흡입하고 농축된 세포 외 소포체를 농축 피펫 팁으로부터 회수하도록 구성된 농축 유닛;을 포함하는 장치이다.
본 발명의 장치에서, 농축 피펫 팁은 용출 포트를 별도로 포함하는 것일 수 있다. 즉, 농축 피펫 팁에 포함된 개구부가 샘플의 흡입 및 용리 작용을 동시에 하는 것일 수 있으나, 농축 피펫 팁에 용출 포트가 추가로 포함되어 있는 경우 유체 샘플 및 용리액이 서로 다른 부분을 통해 흡입될 수 있다.
본 발명의 농축방법에 사용된 장치를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
도 1(a)는 농축 피펫 팁(100)을 나타낸 것이다. 구체적으로, 개구부(105), 및 필터(101)를 포함하는 농축 피펫 팁(100)을 나타낸다. 또한, 농축 피펫 팁(100)은 필터(101), 투과물 퍼지(107), 투과물 드로(109)의 포팅(103)을 포함한다. 농축 피펫 팁(100)에 도시된 연결부(113)는 농축 피펫 팁(100)이 농축 피펫 팁(100)의 동작을 위한 농축 유닛에 연결되게 한다.
도 1(b)는 3개의 포트가 포함된 연결부(113)를 나타낸 것이다. 연결부(113)의 구성으로는 투과물 퍼지(107)에 연결된 제1 포트(115), 필터(101)에 연결된 제2 포트(117) 및 투과물 드로(109)에 연결된 제3 포트(119)가 있다. 상기 연결부(113)를 통해 제1 포트(115), 제2 포트(117) 및 제3 포트(119)는 농축 유닛과 연결되고, 농축 피펫 팁(100)은 농축 유닛에 연결된다. 유체 샘플은 하부 개구부(105) 내로 흡입되어 제3 포트(119)를 통해 투과물 드로(109)에 연결된 펌프를 사용하여 필터(101)의 다공성 표면을 통과한다. 필터(101) 또는 다른 박막 필터는 건조한 친수성 필터, 글리세린이 채워진 친수성 필터, 또는 처음에는 공기가 통과할 수 있게 해주는 또 다른 유형의 필터이며, 액체와 접촉할 경우 액체를 통과시킨다. 즉, 공기는 하부 개구부(105)로 흡입되고, 유체 샘플이 하부 개구부(105)로 흡입되어 필터(101)와 접촉하여 다공질 표면을 통과할 때까지 필터(101)의 다공질 표면을 통과한다.
본 발명에서 사용된 농축 시스템은 다음과 같다. 일회용 농축 피펫 팁(100)이 농축 유닛에 결합하는 튜브 모두가 농축 피펫 팁(100)의 상단에 위치한 단일 연결점에서 연결된다. 농축 유닛과 유체 샘플을 포함한 시스템과 함께 농축 피펫 팁(100)이 기능한다. 농축 피펫 팁(100)의 개구부(105)가 적절한 샘플 용기 내에 포함된 유체 샘플에 침지하여 농축 유닛이 작동한다. 이어서 유체 샘플이 농축 피펫 팁(100)에 흡입되고 필터(101)와 접촉하게 된다. 액체는 필터(101)를 통과하는 한편, 필터(101)의 기공 크기와 유사하거나 큰 입자는 필터(101)에 포집되어 유지된다. 모든 샘플이 필터(101)를 통과한 후 유체를 제거하여 포집된 샘플만 남게 되면, 농축 피펫 팁(100)의 하부 개구부(105)를 적절한 용기에 담그고 용리액을 이용하여 포집된 물질을 용리시킴으로써, 농축된 세포 외 소포체를 수득한다.
본 발명의 세포 외 소포체를 농축하는 방법은 상기 농축 피펫 팁을 통하여 유체 샘플을 흡입하고, 농축 피펫 팁의 필터에 포집된 세포 외 소포체를 용리시키는 단계를 포함한다.
상기 유체 샘플은 0.05 내지 5 중량%의 계면활성제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 계면활성제를 0.1 내지 4 중량%, 0.3 내지 3 중량%, 0.5 내지 2 중량%, 0.75 내지 1.5 중량%, 보다 구체적으로 1 중량% 포함하는 것일 수 있다. 이와 같이 유체 샘플에 계면활성제를 추가로 포함하는 경우, 필터에 결합된 세포 외 소포체가 쉽게 분리되어 농축되도록 유도하여, 세포 외 소포체 분리 효율을 향상 시킬 수 있다.
본 발명의 계면활성제는 폴록사머, 폴리소르베이트, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 그 예로, 계면활성제는 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 (Tween 20), 폴리소르베이트 40 (Tween 40), 폴리소르베이트 60 (Tween 60), 폴리소르베이트 80 (Tween 80) 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 대표적인 계면활성제로 트윈 20을 사용하여 실시하였다.
상기 용리는 트리스 용리 완충액(Tris elution buffer) 또는 피비에스 용리 완충액(PBS　elution buffer)을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 수행되는 것일 수 있다. 또한, 용리 횟수는 1회 내지 5회일 수 있다.
또한, 상기 용리 완충액은 거품 형성용 가스를 추가로 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 이산화탄소, 질소, 아르곤, 공기, 액화석유가스, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
계면활성제가 포함된 유체 샘플과 거품 형성용 가스가 포함된 용리 완충액이 혼합되는 경우, 상기 기체는 계면활성제와 반응하여 미세 방울을 만들어 마주치는 필터의 부피를 증가시킴으로써 빈 공간 없이 용리 완충액이 필터의 세포 외 소포체를 용리하도록 유도한다.
본 발명의 농축방법에서, 세포 외 소포체의 포집에 사용되는 필터(101)의 평균 기공 크기는 20 내지 100 nm, 보다 구체적으로 30 내지 80 nm, 40 내지 60 nm, 또는 50 nm일 수 있다. 이는 세포 외 소포체를 보다 효과적으로 포집하기 위한 적절한 크기이다.
세포 외 소포체의 크기는 20 nm 내지 1 um로 알려져 있다. 평균 20 nm 미만의 기공 크기를 가진 필터를 사용할 경우, 세포 외 소포체를 제외한 기타 액체나 단백질들이 필터를 빠져나가는 시간이 길어지거나 혹은 필터를 막게 되어 세포 외 소포체 농축이 진행되지 않는 어려움이 있다. 또한, 필터의 평균 기공 크기가 세포 외 소포체보다 큰 경우에 있어서는 세포 외 소포체가 손실되는 비율이 증가하게 되는 문제점이 있다. 특히, 필터의 평균 기공 크기가 100 nm 이상일 경우, 세포 외 소포체 중 20 내지 100 nm 정도의 크기를 가지는 작은 세포 외 소포체(엑소좀)의 비율이 줄어들어 문제가 된다.
따라서, 액체 및 단백질이 제거되는 효율을 높이면서 세포 외 소포체의 손실율을 줄이는 효율적인 회수를 위해서는, 최적의 기공 크기를 가지는 필터를 사용해야 한다. 본 발명에서는 회수되는 세포 외 소포체의 총량을 가장 높일 수 있는 효율적인 필터로서 20 내지 100 nm의 평균 기공 크기를 가지는 필터를 선별한 것이 특징이다.
즉, 본 발명은 세포 외 소포체를 농축시키기에 적합한 평균 기공 크기를 가지는 필터의 평균 기공 크기, 유체 샘플의 조성 변화 및 용리 완충액의 조성, 용리 횟수 등의 조건을 결정하여, 최적의 농축 방법을 위한 조합을 찾아낸 것이다.
또한, 본 발명의 필터의 표면적은 5 cm2 내지 20 m2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 20 내지 100 nm의 평균 기공 크기를 가지는 필터라면 표면적에 구애되지 않고 본 발명의 농축 방법에 적용 가능하다.
본 발명의 농축방법에서, 필터(101)에 포집된 세포 외 소포체를 용리시키기 위한 용액으로는, 트리스 용리 완충액(TRIS elution buffer) 또는 피비에스 용리 완충액 (PBS elution buffer)을 사용할 수 있다 용리액을 사용하기 위해서는 용리액 내부의 작은 불순물(nanoparticle)의 농도를 확인 후 선별하여 이후 농축되는 세포 외 소포체에 섞이는 양을 최소로 줄이는 것이 중요하다.
또한 용리액의 사용 횟수는 세포 외 소포체의 용리 효율을 높이는데 중요하다. 본 발명에서는 상기 설명한 평균 기공 크기의 필터를 사용하면서, 용리액의 사용 횟수, 즉 용리 횟수가 1회 ~ 5회일 경우 세포 외 소포체를 최적의 효율로 분리할 수 있음을 확인하였다. 용리 횟수가 5회를 초과할 경우, 분리되는 세포 외 소포체의 양은 증가할 수 있으나, 세포 외 소포체의 농도를 희석시키거나 형태를 망가뜨리는 문제점이 나타날 수 있다.
본 발명의 세포 외 소포체(Extracellular　vesicle)는 세포에서 생성되어 세포 밖으로 분비되는 소포체로서, 세포에서 세포 외 환경으로 방출(분비)되는 다양한 기능의 단백질, 예컨대, 각종 성장인자(Growth factors), 케모카인(Chemokines), 사이토카인(Cytokines), 전사인자(Transcription factors), RNAs(mRNA, miRNA 등), 지질 등의 다양한 생체 분자가 이것이 유래된 세포의 세포막과 동일한 지질 이중층의 세포막으로 봉입된 입자 형태의 구조체를 의미한다. 엑소좀(Exosome), 마이크로베시클(Microvesicle), 마이크로파티클(Microparticle) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
농축된 세포 외 소포체는 해당 기술분야에서 통상적으로 사용되는 분석 방법에 적용될 수 있다. 예컨대, 면역분석법(Immunoassay), 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction: PCR), 전기화학(Electrochemical), 마이크로어레이(Microarray), 유세포 분석(Flow cytometry), 바이오센서, 랩온어칩(Lab-on-a-chip) 및 빠른 성장 검출(Rapid growth based detection) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특히, 본 발명의 농축방법에서 주요한 기술적 특징은 필터의 종류, 용리 완충액의 종류 및 사용 횟수에 있다. 당해 기술분야에서 입수 가능한 필터를 이용한 다양한 농축 방법의 실시양태가 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 상기 방법은 세포 외 소포체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 용리된 세포 외 소포체는 공지된 다양한 세포 외 소포체 분리 방법에 추가로 결합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 상기 세포 외 소포체 분리 방법은 폴리머 기반 분리법, 원심분리 기반 분리법, 농축 기반 분리법 및 여과 기반 분리법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 세포 외 소포체 농축법을 이용할 경우 농축 공정을 간편화하면서 농축 시간을 줄이고, 높은 효율로 세포 외 소포체를 농축할 수 있다. 이는 종래 농축 방법에 비하여 시간과 비용을 절감하고 농축 효율을 높인 것으로서 세포 외 소포체에 적합한 경제적인 농축 방법을 제시한 것이다.
도 1는 본 발명에서 사용하는 농축 피펫 팁을 나타낸 것이다.
도 2는 50 nm 필터를 사용한 방식에서 세포 외 소포체와 분리되는 배양액의 총 부피를 나타낸 것이다.
도 3는 울트라필터(ultrafilter, ≤ 20 nm)를 사용한 방식에서 세포 외 소포체와 분리되는 배양액의 총 부피를 나타낸 것이다.
도 4은 필터의 종류에 따른 단위 부피당 농축된 세포 외 소포체 입자수를 나타낸 것이다. 배수(Fold)는 배양액(culture medium)과 비교하여 농축된 비율을 확인한 값이다.
도 5는 필터의 종류에 따라 수득한 세포 외 소포체의 총 입자수를 나타낸 것이다.
도 6은 용리 완충액의 종류에 따른 불순물 함유량을 상대적으로 나타낸 것이다.
도 7은 용리 완충액의 종류에 따른 불순물 크기를 측정한 그래프이다.
도 8는 용리 완충액의 사용 횟수(1회, 3회)에 따른 세포 외 소포체의 수득 효율 (recovery efficiency)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 용리 완충액의 사용 횟수(3회)는 고정하고, 필터 크기(≤ 20 nm, 50nm, 100nm 및 200nm)에 따른, 농축된 세포 외 소포체의 수득 효율 (Concentration EVs) 및 농축되지 않고 필터를 통과하여 배출된 세포 외 소포체 (Filtrared EVs)의 제거 효율을 함께 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 농축 방법과 ExoQuick을 이용한 농축 방법으로 농축한 세포 외 소포체의 수득 효율을 비교한 그림이다.
도 11은 본 발명의 농축 방법과 ExoQuick을 이용한 농축 방법으로 농축한 세포 외 소포체의 모습을 확인한 이미지이다.
도 12은 본 발명의 농축 방법과 ExoQuick을 이용한 농축 방법으로 농축한 세포 외 소포체의 크기를 비교한 그림이다.
도 13은 본 발명의 농축 방법과 ExoQuick을 이용한 농축 방법으로 세포 외 소포체를 농축할 시 요구되는 비용을 나타낸 그림이다.
도 14는 유체 샘플 내에 계면활성제의 포함 농도(0%, 0.05%, 1%, 5% 및 10%)에 따른 세포 외 소포체의 수득 효율을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포 배양과 배양액 획득
본 연구에서는 지방 줄기세포를 배양한 배양액(Culture medium)을 활용하였다.
구체적으로, 지방 줄기세포를 약 80~90%로 배양 접시에 배양한 후 혈청 대체물(Serum replacement, Gibco) 10%가 함유된 MEM-alpha(Gibco) 배지로 교체해 주었다. 이틀 후, 지방 줄기세포의 배양액을 튜브에 모아서 원심분리기(3,000g, 20분)로 죽은 세포를 가라앉혀주고 상층액을 분리하였다. 수득한 상층액을 하기 실시예에 활용하였으며, 이하 '배양액(Culture medium)'으로 지칭한다.
실시예 2. 시간 경과에 따른 농축 부피 분석
필터 크기를 다르게 하였을 때, 시간 경과에 따라 필터를 통과한 배양액의 총 부피를 측정하고 도 2 및 도 3에 나타내었다.
50 nm 기공 크기의 필터를 사용한 경우, 필터의 막힘이 적고 시간이 경과함에 따라 필터를 통과하는 배양액의 총 부피가 꾸준히 증가하여 55 ml/6.5분의 평균 속도로 농축이 가능하였다. 또한, 최종적으로 농축 가능한 배양액 총량은 약 60 ml임을 확인하였다(도 2). 반면, 울트라필터를 사용한 경우, 최대 농축 가능한 배양액의 양이 약 30 ml에 불과하여 시간이 경과하여도 농축 부피가 일정 수준 이상으로는 증가하지 않았고, 최종적으로 27 ml/6.5분의 평균 속도로 농축한 것으로 계산되었다(도 3).
즉, 전체적인 농축 속도와 농축양을 비교할 때, 50 nm 기공 크기의 필터를 사용할 경우 약 2배 가까이 높은 효율을 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 울트라필터 (≤ 20 nm)의 경우, 필터가 쉽게 막히는 현상을 확인하였다.
실시예 3. 단위 부피당 함유된 세포 외 소포체의 개수 확인 (농축 정도 확인)
30 ml의 배양액을 50 nm 필터 또는 울트라필터를 통하여 흡입한 후, 트리스 용리 완충액으로 한번 용출하였다. 각각의 용출된 농축액 내의 세포 외 소포체의 농도를 Nanoparticle tracking analysis 장비(Malvern, LM10)로 측정하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 단일 부피당 존재하는 세포 외 소포체의 개수가 농축 전 배양액의 약 38배인 것을 확인하였다. 30 ml의 배양액을 울트라필터를 사용하여 농축한 경우, 단일 부피당 존재하는 세포 외 소포체의 개수가 배양액의 약 32배인것으로 확인되었다. 이를 통해, 50 nm 기공 크기의 필터를 사용할 경우, 울트라필터에 비하여 더 높은 비율로 농축할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 회수된 세포 외 소포체의 총 개수 확인
10 ml의 배양액을 50 nm 필터 또는 울트라필터를 통하여 흡입한 후 트리스 용리 완충액을 사용하여 한번 용출하였다. 각각의 용출된 농축액 내의 세포 외 소포체의 농도를 Nanoparticle tracking analysis 장비(Malvern, LM10)로 측정하여 도 6에 나타내었다. 회수율(Recovery efficiency)은 배양액(culture medium)에 함유되어 있던 전체 세포 외 소포체 대비 분리한 세포 외 소포체의 비율을 나타낸 것이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 50 nm 필터를 사용한 경우 기존 배양액에 존재하는 세포 외 소포체의 70%를 회수하였지만, 울트라필터를 사용한 경우 55% 정도의 회수율이 나타남으로써, 50 nm 크기의 필터를 사용한 것과 비교하여 회수율이 현저히 낮아짐을 알 수 있었다.
실시예 5. 용리 완충액에 따른 불순물 비교
액상의 물질에는 세포 외 소포체와 유사한 크기의 불순물이 함유될 가능성이 높다. 따라서, 용리 완충액 내에 불순물의 존재를 확인 시험하였다. 각 용리 완충액 내의 불순물의 상대적 양과 크기를 Nanoparticle tracking analysis 장비(Malvern, LM10)로 측정하였다. Buffer 1과 3은 피비에스(PBS) 용리 완충액이고, Buffer 2와 4는 트리스(Tris) 용리 완충액이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 동일한 용리 완충액일지라도 불순물이 함유된 정도가 다양하였다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이 그 불순물들은 나노 크기인 20 nm부터 1 um까지 다양한 범위의 크기를 가지므로, 세포 외 소포체와 구분이 어려울 가능성이 높다. 따라서, 불순물이 적은 용리 완충액을 선별하여 시험을 수행하였다.
실시예 6. 용리 완충액의 사용 횟수에 따른 총 수득률 증가 확인
10 ml의 배양액을 50 nm 필터에 흡입 후 트리스 용리 완충액을 한번 사용하여 필터에 묶여있는 세포 외 소포체를 용출한 제1그룹, 및 10 ml의 배양액을 50 nm 필터에 흡입 후 트리스 용리 완충액을 세번 사용하여 필터에 묶여있는 세포 외 소포체를 용출한 제2그룹을 대상으로, Nanoparticle tracking analysis 장비(Malvern, LM10)로 세포 외 소포체를 측정하여 회수율을 비교하였다. 회수율은 배양액(culture medium)에 함유되어 있던 전체 세포 외 소포체 대비 분리한 세포 외 소포체의 비율을 나타낸 것이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 용리 완충액을 한번 사용한 그룹에서는 회수율이 60%, 세번 사용한 그룹에서는 90%의 회수율이 나타났다. 즉, 용리 횟수를 3회로 증가시킴으로써 회수율이 높아진 것이다.
실시예 7. 다양한 필터의 크기에 따른 총 수득률 비교
울트라필터(≤ 20 nm), 50 nm 필터, 100 nm 필터 및 200 nm 필터를 이용하여, 필터의 크기에 따른 총 수득률을 비교하였다.
10 ml의 배양액을 울트라필터, 50 nm 필터, 100 nm 필터 및 200 nm 필터에 흡입 후 트리스 용리 완충액을 세 번 사용하여 필터에 묶여있는 세포 외 소포체를 용출하였다. 농축된 세포 외 소포체를 측정할 뿐만 아니라 필터를 통과하여 농축되지 않고 배출된 세포 외 소포체도 함께 비교하였다. 각 세포 외 소포체를 Nanoparticle tracking analysis 장비(Malvern, LM10)로 측정하여 회수율을 비교하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 50 nm 필터는 약 90%에 가까운 높은 회수율(검은색 그래프, Concentrated EVs)을 나타냈으며, 그 외 울트라 필터, 100 nm 필터 및 200 nm 필터는 약 50% 수준의 낮은 회수율을 나타냈다.
이로부터, 100 nm 필터 및 200 nm 필터의 경우, 배출된 세포 외 소포체(흰색 그래프, Filtrated EVs)가 많음을 알 수 있었다. 또한, 울트라 필터의 경우 농축된 세포 외 소포체와 배출된 세포 외 소포체의 양을 합쳐도 기존 배양액에 존재하던 세포 외 소포체의 총 양에 한참 부족하였는데, 이는 울트라 필터 내부에 세포 외 소포체가 갇혀 용출되지도 필터를 통과하지도 못하는 것(점선 그래프, Trapped EVs)임을 알 수 있었다.
실시예 8. ExoQuick과의 총 수득률 비교
종래 알려진 PEG가 섞여있는 액체인 ExoQuick(제품명: ExoQuick-TCTM)을 이용한 농축방법과, 본 발명의 농축방법의 분리 효율을 비교하였다.
본 발명의 농축 방법의 경우, 10 ml의 배양액을 50 nm 필터에 흡입 후 트리스 용리 완충액을 세번 사용하여 용출하였다. 또한, 배양액 10 ml을 ExoQuick 2 ml과 섞어준 후 24시간 동안 배양액으로부터 세포 외 소포체가 용출되기를 기다렸다. 용출된 세포 외 소포체를 30분 동안 원심분리기(1500 g)에서 가라앉혀 분리하였다. 각각의 분리된 세포 외 소포체는 Nanoparticle tracking analysis 장비(Malvern, LM10)로 분석하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 50 nm 필터와 용리 완충액으로 3회의 용리를 거친 본 발명의 농축방법의 경우, 90.1% 효율로 세포 외 소포체를 분리하였다. 반면, ExoQuick을 사용한 경우 47.4%에 불과한 회수율을 확인하였다.
또한, Nanosight로 측정된 세포 외 소포체 이미지에서는 본 발명의 농축 방법에 따라 분리 된 세포 외 소포체가 배양액 및 Exoquick을 사용하여 분리 된 세포 외 소포체와 동일함을 알 수 있었으며(도 11), 세포 외 소포체의 크기 측정 결과에서도 본 발명의 농축 방법에 따라 분리된 세포 외 소포체의 크기와 배양액 및 Exoquick을 사용하여 분리 된 세포 외 소포체의 크기가 유사함을 알 수 있었다(도 12). 이러한 결과는 본 발명의 농축 피펫은 기존 방식에 비해 분리 수율은 높이고, 세포 외 소포체에 변형 또한 주지 않음을 의미한다.
ExoQuick은 소포품으로 ExoQuick kit 와 원심분리 장비를 필요로 한다. 농축 피펫의 경우, 소모품으로 필터와 용리 완충액이 필요하고 장비로는 펌프를 필요로 한다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 소모품의 비용으로 비교해보면 60 ml의 배양액에서 세포 외 소포체를 농축하는 비용이 Exoquick은 약 60만원이고 농축 피펫은 약 4만원 이내 수준으로 확인되었다. ExoQuick에 비해 본 발명의 농축 피펫을 사용할 경우 최소 15배 가량 비용 절감할 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. 계면활성제 농도에 따른 세포 외 소포체의 수득률 비교
유체 샘플에 포함된 계면활성제의 농도(0%, 0.05%, 1%, 5% 및 10%)에 따른 총 수득률을 비교하였다.
10 ml의 배양액에 tween 20을 0%, 0.05%, 1%, 5%, 10%로 만들어 주었다. 각각의 배양액을 50 nm 필터에 흡입 후 트리스 용리 완충액을 세 번 사용하여 필터에 묶여있는 세포 외 소포체를 용출하였고 이를 Nanoparticle tracking analysis 장비(Malvern, LM10)로 세포 외 소포체를 측정하여 회수율을 비교하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 유체 샘플에 1%의 계면활성제가 포함된 경우, 가장 높은 세포 외 소포체 수득률을 나타냄을 확인하였다. 5% 및 10%의 계면활성제가 포함된 경우, 세포 외 소포체를 녹여서 파괴하기 때문에 사용하기 적절하지 않은 농도임을 알 수 있었다. 즉, 유체 샘플에 계면활성제를 추가로 포함하여 분리하는 방법은 세포 외 소포체 분리 효율을 증가 시킬 수 있지만, 이에 적절한 농도는 1% 내외임을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 유체 샘플로부터 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 농축하는 방법으로서,
    (ⅰ) 유체 샘플을 담는 용기;
    (ⅱ) 평균 기공 크기가 50 nm인 필터, 개구부, 및 배출구를 포함하는 농축 피펫 팁; 및
    (ⅲ) 상기 농축 피펫 팁을 통해 유체 샘플을 흡입하고 농축된 세포 외 소포체를 농축 피펫 팁으로부터 회수하도록 구성된 농축 유닛;
    을 포함하는 장치를 이용하여,
    상기 농축 피펫 팁을 통하여 (ⅰ)의 용기에 담긴 유체 샘플을 흡입하고, 농축 피펫 팁의 필터에 포집된 세포 외 소포체를 용리시키는 단계를 포함하는, 방법으로,
    상기 세포 외 소포체의 용리는 트리스 용리 완충액(Tris elution buffer) 을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 3회 수행되며,
    상기 유체 샘플은 1 중량%의 계면활성제를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 농축 피펫 팁은 용출 포트를 포함하는 것인, 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 용리 완충액은 이산화탄소, 질소, 아르곤, 공기, 액화석유가스 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 필터의 표면적은 5 cm2 내지 20 m2인, 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 세포 외 소포체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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