CN217773804U - 分离外泌体的装置、自动化仪器和手动设备 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供了一种分离外泌体的装置,其包括:样品容器、初滤容器和废液容器;位于样品容器和初滤容器之间的第一级过滤装置和第一电磁泵;位于初滤容器和废液容器之间的第二级过滤装置和第二电磁泵。本实用新型还提供了一种分离外泌体的自动化仪器。本实用新型还提供了一种分离外泌体的手动设备。本实用新型提供的分离外泌体的装置、自动化仪器和手动设备装置结构简单、操作方便和快速,可适于实验室和临床的手工操作,并且可实现在封闭的环境中处理生物样品,污染可能性小。
Description
本申请要求以下中国专利申请的优先权:2020年11月24日提交的、申请号为202022763556.X、发明名称为“分离外泌体的装置、仪器和设备”,其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本实用新型涉及生物技术和医疗器械领域,具体而言,本实用新型涉及一种用于分离生物样品中的外泌体的装置、自动化仪器和手动设备。
背景技术
囊泡(multivesicular bodies,MVBs)是由磷脂双分子层构成的双层膜纳米级颗粒。所有的真核和原核细胞都会分泌囊泡。囊泡内包含蛋白质,脂类,RNA和DNA。囊泡具有各自生物功能,例如在细胞之前传递信号。根据囊泡的大小和功能可分为不同观点种类。其中,外泌体是由细胞分泌到胞外的,内含RNA和蛋白质,直径30-200nm的囊泡。外泌体在运送物质,传递细胞信号等方面,具有突出的生物功能。外泌体膜上表达CD9,CD63 和CD81。在培养的细胞时,外泌体从细胞内分泌出来,游离在培养基的上清液中。
常见的外泌体分离技术有超速离心、PEG沉淀、超滤法以及磁珠法等。这些方法通常需要用到各型的离心机,存在操作时间久,处理的样品少,效率较低等问题。
超滤法为利用不同截留分子量(MWCO)的超滤膜进行选择性分离的方法。为了达到过滤效果,需要在给经过滤膜的液体,施加强大的压力。传统的超滤法是利用离心机,以达到3800g这样的高转速度,从而产生强大的压力。现有的超速离心法,操作过程冗长,并不适合临床使用。
本领域还需要更方便和快递地分离外泌体的方法和装置。
实用新型内容
本实用新型提供了一种能够方便和快速地分离外泌体的装置、仪器和设备。
具体的,本实用新型提供了一种分离外泌体的装置,其特征在于,包括:
用于接收和容纳待处理液体样品的样品容器、初滤容器和废液容器,其中所述样品容器、初滤容器和废液容器通过导管形成流体连通;
位于样品容器和初滤容器之间的第一级过滤装置,位于样品容器和第一级过滤装置之间的第一电磁泵和位于样品容器和第一电磁泵之间的第一阀门;其中所述第一级过滤装置可容不大于约200纳米的颗粒通过;
位于初滤容器和废液容器之间的第二级过滤装置,位于初滤容器和第二级过滤装置之间的第二电磁泵和位于样品容器和第二电磁泵之间的第二阀门;其中所述第二级过滤装置可容不大于约20纳米的颗粒通过。
在工作中,待处理液体样品通入样品容器,可沿导管通过第一阀门、第一电磁泵和第一级过滤装置进入初滤容器,然后可沿导管通过第二阀门、第二电磁泵和第二级过滤装置进入废液容器。待分离目标(即外泌体)可通过第一级过滤装置,但不能通过第二级过滤装置,因此停留在第二级过滤装置上游的导管中。
在本实用新型的其中一个方面,所述装置还包括收集容器,所述收集容器通过支流道导管与位于第二电磁泵和第二级过滤装置之间的导管形成流体连通,支流道与收集容器之间以及支流道与第二电磁泵之间分别设置阀门。在本实用新型的其中又一个方面,所述收集容器为或具有抽吸装置。所述收集容器例如为注射器。在工作中,所述收集容器可收集和转移含有富集了待分离目标(即外泌体)的液体。
在本实用新型中,待处理液体样品为含有外泌体的生物液体样品,例如为细胞培养液或血浆等。所述待处理液体样品通常可进行预处理,例如通过低速离心或简单过滤去除尺寸较大的杂质,例如细胞或细胞残渣。
在本实用新型的其中一个方面,所述样品容器、初滤容器和废液容器为可变形容器。在本实用新型的其中又一个方面,所述可变形容器为塑料制成,例如为引流袋。在本实用新型的其中又一个方面,所述样品容器、初滤容器和废液容器的体积为约100-2000ml,例如为约1000ml。
在本实用新型的其中一个方面,所述第一级过滤装置和第二级过滤装置为具有滤芯或滤膜的过滤器。所述滤芯或滤膜为固定的或可更换的。在本实用新型的其中又一个方面,所述滤膜为高聚物材料制成,例如为醋酸纤维素类、醋酸纤维素酯类、聚乙烯类、聚砜类及聚酰胺类等聚合物制成。
在本实用新型的其中又一个方面,所述第一级过滤装置中的滤膜为 0.22μm纤维素酯膜,可阻隔直径大于约220nm的杂质。
在本实用新型的其中又一个方面,所述第二级过滤装置中的滤膜为 100KDa纤维素滤膜,允许分子量小于约100KDa的蛋白质或相似尺寸的颗粒通过,达到去除溶液中的蛋白质和核酸等小分子,以及具有小于约20nm的颗粒的目的。
在本实用新型的其中一个方面,所述第一电磁泵和第二电磁泵的工作压强为约0.1-10.0bar。本实用新型使用的电磁泵可通过施加足够的压力使得液体通过滤膜。同时,本实用新型使用的电磁泵的工作压强不能破坏过滤装置中的滤芯或滤膜。
本实用新型还提供了一种分离外泌体的自动化仪器,其特征在于,包括前述本实用新型的分离外泌体的装置。前述本实用新型的装置中的容器、导管和阀的开关都可以通过自动控制,因此整个工作流程容易实现自动化。
本实用新型还提供了一种分离外泌体的手动操作设备,其特征在于,包括前述本实用新型的分离外泌体的装置。前述本实用新型的装置结构简单、操作方便和快速,可适于实验室和临床的手工操作。
本实用新型提供的分离外泌体的装置、自动化仪器和手动设备可实现在封闭的环境中处理生物样品,快速完成外泌体的分离和提取,污染可能性小。同时,本实用新型的装置中的各个部件,包括容器、导管、阀和过滤系统都可设置成可拆卸连接的方式,便于更换,提高使用寿命和提升卫生标准。
本实用新型提供的分离外泌体的装置、自动化仪器和手动设备以及其用于分离外泌体的方法与传统方法相比,还具有以下优点:a)能够有效获得生物样品中的外泌体;b)操作时间极短:完成1000ml样品的处理,全部操作能在少于40min内完成;c)可室温操作;d)对其他实验设备基本无需求,可在现代化的细胞实验室使用,也可以在基层医院,甚至家庭中使用;e)便于携带;f)所采用的耗材成本低,适合推广使用;g)能平行进行大量样本操作,能够满足临床大规模应用的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本实用新型实施方式的技术方案,下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本实用新型的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本实用新型的一种示例性实施方式的分离外泌体的设备的示意图。
具体实施方式
为使本实用新型实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本实用新型实施方式中的附图,对本实用新型实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式是本实用新型一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本实用新型中的实施方式,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本实用新型保护的范围。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
图1为本实用新型提供的分离外泌体的装置的一种示例性实施方式的示意图。如图1所示,本实用新型提供的分离外泌体的装置具有:用于接收和容纳待处理液体样品的样品容器1、初滤容器5和废液容器13,其中所述样品容器、初滤容器和废液容器通过导管形成流体连通。在其中一种实施方式中,所述样品容器、初滤容器和废液容器为可变形容器,例如为塑料制成的引流袋。所述样品容器、初滤容器和废液容器的体积可为约 100-2000ml,例如为约1000ml。
在图1所示的示例性装置中,所述样品容器1具有输入液体样品的入口 17。该入口可被封闭,例如随时入口具有螺旋接口和螺帽。
在图1所示的示例性装置中,所述废液容器13具有出口18。该出口可与具有阀14的导管连接,用于释放其中的液体。
如图1所示,本实用新型提供的分离外泌体的装置还具有位于样品容器 1和初滤容器5之间的第一级过滤装置4,位于样品容器和第一级过滤装置之间的第一电磁泵3和位于样品容器1和第一电磁泵3之间的第一阀门2。其中所述第一级过滤装置可容不大于约200纳米的颗粒通过。
如图1所示,本实用新型提供的分离外泌体的装置还具有位于初滤容器 5和废液容器13之间的第二级过滤装置12和位于初滤容器5和第二级过滤装置10之间的第二电磁泵7;其中所述第二级过滤装置可容不大于约20纳米的颗粒通过。
在本实用新型的其中一个方面,所述第一电磁泵和第二电磁泵的工作压强为约0.1-10.0bar。本实用新型使用的电磁泵可通过施加足够的压力使得液体通过滤膜。同时,本实用新型使用的电磁泵的工作压强不能破坏过滤装置中的滤芯或滤膜。
如图1所示,在本实用新型的其中一个方面,所述装置还包括收集容器 11,所述收集容器通过支流道导管19与位于第二电磁泵和第二级过滤装置之间的导管形成流体连通。在图1所述的示例性装置中,支流道导管19与位于第二电磁泵和第二级过滤装置之间的导管通过三通管9形成流体连通。支流道与收集容器之间以及支流道与第二电磁泵之间分别设置阀门10和阀门8。在本实用新型的其中又一个方面,所述收集容器为或具有抽吸装置。所述收集容器例如为注射器11。在工作中,所述收集容器可收集和转移含有富集了待分离目标(即外泌体)的液体。
在本实用新型中,待处理液体样品为含有外泌体的生物液体样品,例如为细胞培养液或血浆等。所述待处理液体样品通常可进行预处理,例如通过低速离心或简单过滤去除尺寸较大的杂质,例如细胞或细胞残渣。
在本实用新型的其中一个方面,所述第一级过滤装置和第二级过滤装置为具有滤芯或滤膜的过滤器。所述滤芯或滤膜为固定的或可更换的。在本实用新型的其中又一个方面,所述滤膜为高聚物材料制成,例如为醋酸纤维素类、醋酸纤维素酯类、聚乙烯类、聚砜类及聚酰胺类等聚合物制成。
在图1所示的示例性装置中,所述第一级过滤装置4中的滤膜15为 0.22μm纤维素酯膜,可去除直径大于220nm的杂质。
在图1所示的示例性装置中,所述第二级过滤装置12中的滤膜16为 100KDa纤维素滤膜,用于允许分子量小于约100Kda的蛋白质或更小尺寸的颗粒通过,达到去除蛋白质和核酸分子的目的。
在使用图1所示的示例性提取外泌体的设备时,先关闭所有阀门,包括阀门2、阀门6和阀门8、阀门10和阀门14。关闭阀门2后,将待处理液体样品通入样品容器1后,关闭样品容器的入口17。然后打开阀门2,使第一电磁泵3工作,液体样品在电磁泵推动下可沿导管通过阀门2、电磁泵 3和第一级过滤装置4(在本实施例中,具有0.22μm纤维素酯膜15)进入初滤容器5,由此初滤容器5中为去除尺寸大于约200nm的颗粒的初步过滤的样品。然后打开阀门6和阀门8,使第二电磁泵7工作,初步过滤的样品沿导管通过阀门6、电磁泵7和第二级过滤装置12(在本实施例中,具有 100Kda纤维素滤膜16)进入废液容器。待分离目标(即外泌体)可通过第一级过滤装置,但不能通过第二级过滤装置,因此停留在第二级过滤装置上游的导管中。通过关闭阀门8,打开阀门10,使用注射器11吸走含有富集的外泌体的液体。
材料
引流袋为扬州得尔康医疗器械厂所生产。二通管,三通管,以及管道的主体部分,由宁波奇迪电器集团有限公司生产。鲁尔接头由浙江海宁亿诚五金有限公司生产。过滤器由上海市新亚净化器件厂生产。0.22μm纤维素酯膜,100Kda滤膜由默克密理博公司生产。电磁泵由余姚电磁阀厂生产,型号:YCBP-E13150。
方法
外泌体的存在和含量通过蛋白质印迹法,电子显微镜,RNA检测来鉴定。
3、蛋白质印迹
对外泌体进行蛋白质定量之后,将等量的总蛋白裂解物上样至10% SDS-PAGE胶,并转移到聚偏二氟乙烯膜上,用5%脱脂牛奶封闭后,将膜与抗CD9,CD63,CD81和CALNEXIN的一抗在4℃孵育过夜。然后将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1小时。然后通过增强化学发光剂将进行发光,并记录光信号。外泌体表现为CD9,CD63,CD81阳性,以及CALNEXIN阴性。
2、电子显微镜
将外泌体液体用2.5%戊二醛固定,置于铜网上,进行1%乙酸铀酰染色,待干燥后,用扫描电子显微镜进行观察。外泌体直径在约30-200nm的范围内。
3、RNA检测
使用miRCURYTM RNA分离试剂盒(Exiqon,Vedbaek,丹麦)分离出外泌体中的RNA,再用毛细管电泳法分析RNA的大小。RNA的峰值在21-23nt。
以上结果显示,在注射器11中可富集生物液体样品中的外泌体。
本实用新型还提供了一种分离外泌体的自动化仪器,其特征在于,包括前述本实用新型的分离外泌体的装置。前述本实用新型的装置中的容器、导管和阀的开关都可以通过自动控制,因此整个工作流程容易实现自动化。
本实用新型还提供了一种分离外泌体的手动操作设备,其特征在于,包括前述本实用新型的分离外泌体的装置。前述本实用新型的装置结构简单、操作方便和快速,可适于实验室和临床的手工操作。
在本实用新型中,除非另有明确的规定和限定,术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解,例如,可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或成一体;可以是机械连接,也可以是电连接;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连,可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言,可以根据具体情况理解上述术语在本实用新型中的具体含义。
以上所述仅为本实用新型的优选实施方式而已,并不用于限制本实用新型,对于本领域的技术人员来说,本实用新型可以有各种更改和变化。凡在本实用新型的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种分离外泌体的装置,其特征在于,包括:
用于接收和容纳待处理液体样品的样品容器、初滤容器和废液容器,其中所述样品容器、初滤容器和废液容器通过导管形成流体连通;
位于样品容器和初滤容器之间的第一级过滤装置,位于样品容器和第一级过滤装置之间的第一电磁泵和位于样品容器和第一电磁泵之间的第一阀门;其中所述第一级过滤装置可容不大于200纳米的颗粒通过;
位于初滤容器和废液容器之间的第二级过滤装置和位于初滤容器和第二级过滤装置之间的第二电磁泵;其中所述第二级过滤装置可容不大于20纳米的颗粒通过。
2.根据权利要求1所述的分离外泌体的装置,其特征在于,其还包括收集容器,所述收集容器通过支流道导管与位于第二电磁泵和第二级过滤装置之间的导管形成流体连通,所述支流道与所述收集容器之间以及所述支流道与所述第二电磁泵之间分别设置阀门。
3.根据权利要求2所述的分离外泌体的装置,其特征在于,所述收集容器为抽吸装置。
4.根据权利要求3所述的分离外泌体的装置,其特征在于,所述收集容器为注射器。
5.根据权利要求1所述的分离外泌体的装置,其特征在于,所述样品容器、初滤容器和废液容器为可变形容器。
6.根据权利要求5所述的分离外泌体的装置,其特征在于,所述样品容器、初滤容器和废液容器为引流袋。
7.根据权利要求1所述的分离外泌体的装置,其特征在于,所述第一级过滤装置和第二级过滤装置为具有固定或可更换的滤膜的过滤器。
8.根据权利要求7所述的分离外泌体的装置,其特征在于,所述第一级过滤装置中的滤膜为0.22μm纤维素滤膜。
9.根据权利要求7所述的分离外泌体的装置,其特征在于,所述第二级过滤装置中的滤膜为100KDa纤维素滤膜。
10.根据权利要求1所述的分离外泌体的装置,其特征在于,所述第一电磁泵和第二电磁泵的工作压强为0.1ˉ10.0bar。
11.一种分离外泌体的自动化仪器,其特征在于,包括权利要求1-10中任一项所述的分离外泌体的装置。
12.一种分离外泌体的手动设备,其特征在于,包括权利要求1-10中任一项所述的分离外泌体的装置。
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