JPH02150295A - 溶菌成分採取方法及び細菌検査法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、溶菌成分採取方法及び細菌検査法に関する
。さらに詳しくは、糞便等の水不溶性固型分と細菌を共
存する試料中の細菌の溶菌成分を迅速かつ簡便に採取し
うる方法、及びこの溶菌成分の特定のＤＮＡの増幅に基
づいて試料中の細菌を同定しうる細菌検査法に関する。

（ロ）従来の技術 臨床診断や研究の分野において、生物試料中の細菌の種
類を同定したり、その構成成分を分針するために、細菌
を種々の方法で溶菌させて各種分析処理に付すことが従
来から行われている。

ここで生物試料の中でも、糞便等の水不溶性固型分（食
物残香や腸内剥離細胞等）を含む試料中の細菌の溶菌成
分を得る手法として試料の懸濁液を培地に植え付けて数
日間培養を行うことより得られたコロニーを採取し、こ
れを遠心分離に付して菌体を分離回収し、これを液中で
酵素もしくは界面活性剤あるいは苛性ソーダを用いて溶
菌させたり、液中で超音波によって破壊したり又はガラ
スピーズによってミルで破壊する方法が行われている。

また細菌の種類の同定法としては、従来から例えば、１
）ある特定の抗生物質を含有した寒天等の培地に上記試
料をまき、その結果生えてくる菌体群を分別し、この分
別された菌体群をまた別の抗生物質によって分別するこ
とを繰返して分離する分離培養法、２）ラテックスビー
ズにある菌体に固有の抗体を充填し、これを上記試料中
に浸漬し、このビーズ表面の抗体が菌体を認識し、これ
が連鎖して凝集することにより検出するラテックス凝集
法、３）定まった個数の小孔を有するポリスチレン製プ
レートの」二記各小孔の表面に標早抗体をつけ、これに
菌体（または菌体成分）を作用させ、抗原−抗体反応に
より結合するものとしないものとをより分け、さらに酵
素標識された特異流体を作用させ、標識に対する発色に
より分離同定するＥｔｌＳＡ法、４）特異的なりＮＡの
断片に酵素標識されたＤＮＡプローブを用いハイブリダ
イズさせて分離同定するＤＮＡプ【１−ブ法等がある。

（ハ）発明が解決しようとする課題 しかし上記従来法においては、培養に長時間を要するた
め、溶菌成分を迅速に得ることは困難であると共に、遠
心分離操作を必要とするため操作が煩雑で操作条件が変
動し易いという問題があった。

また上記のごとく試料中に含有される細菌または調製さ
れた溶菌成分の前記同定法においては、りの分離培養法
では検出感度は高いが培養を伴うので長時間（１週間程
度）を必要とすること、２）や３）の抗体を用いる方法
の場合はカンピロバクタ−ジエジュイ（Ｃａ５ｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ　Ｊ　ｅｊｕｉ）４Ｘ１０’個／ｇ・５ｔ
ｏｏｌまでの検出の報告がある程度で検出感度が悪いこ
と、４）のＤ　Ｎ　Ａプローブ法では細菌を対象とした
とき、通常の細菌ではゲノ１、　Ｄ　Ｎ　Ａは１個であ
り、かなりのＤＮＡｆｔ１ｔがないと検出が困難なこと
から大量の検体を必要とすること等、それぞれ試料のｊ
ｌｔＪ、同定法共に問題があった。

この発明は、かかる状況下なされたらのであり、ことに
遠心分離等の煩雑な操作を用いることなく、迅速かつ簡
便に前記生物試料等の試料から溶菌成分を得ることがで
きる方法、及びこの溶菌成分を用いて簡便に同定しうる
細菌検査法を提供しようとするものである。

（ニ）課題を解決するための手段及び作用本発明者らは
上記観点から、濾紙等のフィルターを利用して菌体を分
離すると共に同じく濾紙等のフィルターを利用して簡便
に溶菌成分を採取する方法について鋭意研究を行った。

その結果、特定のフィルターを用いることにより、極め
て短時間で効果良く溶菌成分が採取できる事実を見出し
た。

一方、近年ポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙ−ｓｅｒ
ａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下ｐｃｎ法
という）なるＤＮＡの増幅法が開発されており、この手
法を用いると目標画のＤＩ’ＪＡに特異的にハイブリダ
イズするプライマを選んで反応をすすめれば、目標画の
ＤＮＡのみ増幅され、検出することができ、１−１００
個最初にあれば充分増幅可能なことから、供与する検体
量が少なくてすむという利点がある。

そこで、生物試料から簡便にＤＮＡを回収する手法とＰ
ＣＲ法とを併せて用いることにより、生物試料中の菌を
高感度にかつ迅速簡便に検出することが可能であること
に想到し、この発明に到達した。

かくしてこの発明によれば、水不溶性固型分と細菌を共
存する糞便等の試料を水系媒体に懸濁させ、この懸濁液
を孔径約０．４５μ量以上の膜状フィルターを有する濾
過器で濾過処理し、得られた細菌含有濾液を孔径約０．
２〜１．６μ調の膜状フィルターに通過させてこの膜状
フィルターに細菌を保持させた後、この膜状フィルター
に溶菌液を流通させることにより、細菌の溶菌液を得る
ことを特徴とする溶菌成分採取方法、並びに、請求項１
の方法により得られた溶菌液をｐＨ５〜９に調整後ポリ
メラーゼ連鎖反応法に付し、該方法のもとで増幅するＤ
ＮＡに基づいて、試料中の細菌を検出することを特徴と
する細菌検査法が提供される。

この発明の対象となる試料としては、糞便等の生物試料
が代表的であるが、これ以外にも比較的大きな水不溶性
固型分と細菌とを少なくと６含有する試料が適用できる
。

この発明においては、まず上記試料の懸濁液が調製され
る。この懸濁液を調製するための水系媒体としては、溶
菌性を有さないものが適しており、例えば、その例とし
て希塩化ナトリウム水や中性リン酸緩衝液等が挙げられ
、細菌と固型分の分離分散性を向」二させるために、溶
菌しない程度の界面活性剤が含有されていてもよい。懸
濁させる試料の量は、通常、〜１００９／ｆｌ程度が適
している。

かかる懸濁液は次いで、濾過器による濾過処理に付され
る。この際、用いる濾過器は孔径約０．４５μ拘以上の
膜状フィルタを主フィルターとして有するものが用いら
れる。このうち少なくとも菌体（細胞）１個を透過しう
る孔径０．４５〜ＩＯＨのものが好ましい。０．４５４
ｓ未満では懸濁液中の菌体を通過させることが実質的に
困難であって適さない。

また菌体が凝集しているときは、後の処理を考えて大体
１００μ園未満までの孔径を有する膜状フィルタが好適
に用いられる。１００μｍを超えると懸濁液中の水不溶
性固型分が通過し易く菌体とこの固型分との分離性が著
しく低下するため好ましくない。

かかる膜状フィルターとしては、ガラス１１１濾紙、グ
ラスウール等が好適に用いられる。なお、かかる濾過器
は、この膜状フィルターのみから構成されていてもよい
が、通常、上記水不溶性固型分による目詰まりを防止す
べく、この膜状フィルターの上に繊維の不織布状充填層
及び／又は織布層を積層し、この上方から懸濁液を供給
して濾過処理を行うのが袢している。ことに、多量の試
料を扱う場合には、前記膜状フィルターの上にガラス繊
維の充填層（不織布状充填層）と合成樹脂繊維のメツシ
ュ（織布層：例えばテトロンメツシュ）とをこの順に積
層した三層構造の濾過器を用いるのが好ましい。また、
濾過操作は減圧で行ってもよく加圧で行ってもよい。

この濾過処理によって、水不溶性固型分が実質的に濾過
除去され、細菌と不溶性夾雑物とが含有された濾液が得
られる。かかる濾液は、次いで溶菌処理に付される。溶
菌処理は、孔径約０．２〜１．６μ転好ましくは０．２
〜１．２μ■の膜状フィルターに上記濾液を通過させて
該フィルターに細菌を保持させ、適宜洗浄処理等を行っ
た後、溶菌液をこのフィルターに流通させることにより
行うのが適している。ここで膜状フィルターの孔径が０
　、２個ｍ未満では、夾雑成分の濾過除去効率が低下す
るため適さず、１．６μｍを超えると細菌のフィルター
への保持効率が低下するため適さない。かかるフィルタ
ーとしては、ガラス繊＊ｍ紙が好ましい。

通常、上記フィルターへ細菌を保持させた後、溶菌液の
流通前に洗浄処理を行うのが、より精製された溶菌液が
得られる点で好ましい。ここで洗浄処理は、前述した懸
濁液Ｕ、１製時に用いた溶菌性を有さない水系媒体を流
通させることにより行われ、洗浄効率を向上させるため
に、溶菌しない程度の飛（通常０．５重量％以下）の界
面活性剤を含有したしのを用いるのが好ましい。

一方、上記で用いる溶菌液としては、溶菌用酵素（例え
ば、プロテアーゼ、コラゲナーゼ、リゾデーム等）、界
面活性剤あるいはアルカリ剤（例えば苛性ソーダ）を含
有する水系媒体を用いるのが適しており、迅速さ、簡便
さ、溶菌効率、安全性等の点で界面活性剤含有水を用い
るのが好ましい。この除用いる界面活性剤としては種々
のものが使用できるが、溶菌効率の点でアニオン界面活
性剤や双イオン性界面活性剤等のイオン性のもの及び非
イオン性界面活性剤が適している。この界面活性剤の濃
度は少なくとら保持された細菌が溶菌しうる程度の濃度
とされ、例えば、アルキル硫酸塩等のアニオン界面活性
剤を用いた場合には１〜２０重量％とするのが適してい
る。かかる溶菌液による流通処理は、この細菌保持フィ
ルターに溶菌液を！又は複数回流通させることにより行
われ、複数回の流通は、このフィルターを往復流通して
行うのが適している。ただし、流通後通常５〜ｌＧ分程
度接触保持さ什るのが好ましい。

この発明の細菌検査法において、上記のごとく調製され
る溶菌成分採取試料が用いられる。これはすなわち、上
記試料を所定のｐＨに調製した後ｒ＞ｃＲ法に付すこと
により、特定間の増幅に基づいてその閑の同定が行われ
ることとなる。このＰＯＲ法においては市販の専用機、
例えばＤＮＡ。

Ｔ　ｈｅｒ＠ａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　（バーキンエルマー
シータス社製）等公知の装置を用いることができる。こ
のＰＣＲ法を用いるにあたり、上記のごとく得られる試
料はそのｐＨが５〜９に調製される。上記同定は、ｐＨ
Ｆｌ整された試料をＰＣＲ法に付して得られる試料液を
、電気泳動法、吸光度測定法等当該分野で公知の方法を
用いて行うことができる。またこれ以外にＤＮＡプロー
ブを用いて確認する方法であってもよい。上記同定は後
述する実施例の記載が参照される。

この発明の溶菌成分採取方法によれば、水不溶性固型分
と細菌との分離が濾過器により行われ、かつ細菌の洗浄
や溶菌処理が膜状フィルターに細菌を担持した状態で行
われるため、従来のような培養や遠心分離処理等を行う
ことなく、迅速、簡便に溶菌成分を採取できることとな
る。そして、迅速、簡便ながら溶菌成分の採取効率も良
好である。

また、採取された溶菌成分を含有する試料は、所定のｐ
ｔｔに調整された後ＰＣＲ法に付すことにより、増幅さ
れるＤＮＡに基づいて上記溶菌成分が同定されることと
なる。

（ホ）実施例 実施例１ ヒト糞便０．５９をｌＯｉ＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
５）５ｘＱに懸濁して試料液を得た。

（濾過処理） 第１図に示すごとく上記試料液３をシリンジ２に吸引し
、フィルターホルダー１に取りつけた。

図中フィルターホルダー！は、テトロンメツジュロ　（
２２５ｓｅｓｈ）　（４７ｚｍ径）、グラスウール充填
層５　（０，１ｇ）　（４７ｍｍ径）、グラス７フイパ
一濾紙４（ワットマンＧＦ／Ｄ）（４７ｍｍ径）を積層
した三層からなるもの（フィルターセット）であり、グ
ラスファイバー濾紙は厚さ０．６５ｍｍ、孔径２゜７μ
朧のものである。

上記試料液をこのフィルターセットを用いてシリンジで
加圧濾過した。得られた濾液は澄明で、細胞レベルで疎
大な物質がないことが顕微鏡で確認され、菌数はｌＯＳ
個１５ｉ＋１２であった。

なお、この濾液を好気的条件下標準培地で培養したコロ
ニー数と、濾過処理しない試料液のコロニー数との比較
により、菌数の約７０％がこのフィルターセットを通過
することが判明した。

なお、フィルターセットの直径を３０ｍｍとし、糞便の
量を１９とし、さらに緩衝液量を１０１１２とする以外
同様に処理しても、上記と同様な結果が得られた。

（溶菌処理） 上記で得られた濾液を用いて溶菌処理を行った。

まず、第２図に示すごとくフィルターホルダー７に閑担
持用フィルターとして孔径０．４５μｍ、厚さ０．６５
ｘｍのグラスファイバー濾紙８（ワットマンＣＦ／Ａ又
はＣＦ／Ｃ；４７ｍｍ径）をセットしこれに試料貯留用
のガラス円筒９を接続し、かつ濾過側に逆送可能な液移
送用ポンプ１１による流路を接続した。

次いで円筒９に前記の濾液ｌＯを入れ、フィルター８を
用いてポンプＩＩで吸引濾過し、次いでフィルターを５
ＤＳＯ，１重量％を含有する０、５重量％Ｎ　ａ　Ｃｌ
−１０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２０ｍ１２で洗
浄した。この際、フィルターには閑が６０％担持される
ことを前述と同様の培養によるコロニー数の比較により
確認した。

ついで溶菌液（１Ｑｉｉ量％ＳＤＳ液）を円筒９に入れ
た。この時フィルターホルダー内が溶菌液で満たされる
ように、−度ボンプ１！で吸引し、ついで再び円筒９に
水面が現れるまで液を逆送しくこの時フィルターホルダ
ー内の空気は円筒９の方へ押し出される）、そのまま１
０分間放置した。

この流路処理後、溶菌液を回収し、２６０ｎ−の吸光度
に基づいて溶菌成分の収率（対フィルター担持１１４）
を調べたところ、約７０％であることが確認された。そ
して本実施例でこの溶菌液を得るまでの時間は合計約１
５分であった。

実施例２ バチルス　セレウス（Ｉ３　ａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅ
ｕｓ）をそれぞれｔｏ’、　ｔｏ”、　ｔｏ＠、　ｔｏ
”（個／ｇ−６ｔｏｏｌ）の割合で含有する糞便懸濁液
（０，１９／１１２）試料を４つ用意し、これらそれぞ
れについて第３図に示すごときフローチャートに従って
検査した。

まず、第４図のごとき構成のフィルターホルダー２０を
それぞれ用い、実施例１の第１図と同様にして粗大夾雑
物を除去し濾液を得た（ステップｌ）。なお、上記フィ
ルターホルダー２０はテフロンメツシュ２１　（２２５
＋ｅｅｓｈ、　４０φ）、グラスウール充填層２２　（
０，１ｇ、　４０φ）、グララフアイバー濾紙２３（ワ
ットマンＣＦ／Ｄ、孔径２．７μｍ。

４４φ）の三層積層のフィルターセットを、０リング２
４、テフロンパツキン２５　（０，５ｇｍ厚）、シリコ
ンパツキン２Ｂ（１ｍｍ厚）からなるアトバンチツク社
製ＤＰ−４０を用いた。

次に、上記各フィルターホルダー２０により得られた各
濾液を用いて溶菌処理を行った。この処理は基本的には
実施例１の第２図と同様にしてまず第５図のごとき構成
のフィルターホルダー３０にそれぞれ担持させた。なお
、上記フィルターホルダー３０は、テフロンメツシュ３
１（サポートスクリーン、孔径０．３ｍｍ程度）、グラ
スファイバ濾紙３２（ワットマンＣＦ／Ａ、孔径１．６
ｇｍ、　４７φ）、グラスファイバー濾紙３３（ワット
マンＧＦ／Ｃ，孔径１．２μ１．４４φ）の三層積層の
フィルターセットを、Ｏリング３４、テフロンパツキン
３５　（０，５ｘｔｌｆＥ）からなるもので、ザラトリ
ウス社製Ｓ　Ｍ　Ｉ　６２−５４を多少改良して用いた
。このような構成の各フィルターボルダ−３０に上記各
濾液中の菌を担持させ、これをＴＥＳ（ＩＯＩＭＮａＣ
ｌ、ｌＯｍＭＴｒｉｓ　ｌｌＣｌ、ＩＩＭＥＤＴＡ。

ｐｌ■８．０）　２０１１＋１２で洗浄した（ステップ
２）。

その後、Ｎ−アセデルムラミンディス（生化学工業製）
６０μ９ｈ（ｌの濃度で各２．５ｘ（ｌを、菌を担持さ
せた各フィルターボルダ−３０に注入し、気泡を抜いて
、５０℃で５分間放置後ポンプで吸引（−６０ｍｍｌ１
ｇ）除去し酵素処理をした。次いで０．２ＭＮａＯＨを
２．５ｙｔＱずつ各フィルターホルダー３０に注入し、
気泡を抜いて８０℃でｌＯ分間放置後ポンプで吸引（−
６０ｍｍｌ１ｇ）　して吸引びんに回収しサンプルとし
た（ステップ３）。

上記各サンプル１００μｅニツイテ、０．２ＭＩ（ＣＩ
。

０．８ＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ８，０の中和液１００
μ（を加え中和処理を行った（ステップ４）。

次に上記中和処理後の各サンプルをそれぞれ５μＱずっ
とり、これらをＰＣＲ法にそれぞれ４時間付して各サン
プル中のＤＮＡを増幅させた（ステップ５）。ここで上
記ＰＣＲ法は以下の条件で行った。すなわち、水２６，
５μＣ，ｔＯ倍緩衝液５μＱ（バーキンエルマーシータ
ス社製）、ｄＮＴＰ８μＱ　（１，２５ｉ＋Ｍ各ｄＮＴ
Ｐ）、プライマ２．５μＱ（２０μＭ）２種、サンプル
５μｇ、タックポリメラーゼ０．５μｅ（同社製）の合
計５０μＱに鉱油１００μＱを重層して、ＤＮＡ　Ｔｈ
ｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（同社製）にセットし、９４
℃１分、３７℃１分、６０℃１分、ｌサイクル５．７分
、４２サイクルで反応させた。

上記ＰＣＲ法に付して得られた各反応物をそれぞれ２０
μＱずつとり、アガロース２％ゲル（エチジウムブロマ
イド入り）で電気泳動に付しくステップ６）た後、それ
ぞれＵＶ照射したところその蛍光について第６図に示す
結果を得た（ステップ７）。

該図によれば１０４個／９・５ｔｏｏｌの割合で含有す
るサンプルについては、さらにターゲットとしているも
のとしていないものとを例えばＤＮＡプローブ法等によ
り識別することができる。

」二記結果からこの発明の細菌検査法によれば、５時間
以内に１０４ｇ７ｇ・５ｔｏｏｌまでバチルス　セレウ
ス菌を検出できることがわかる。

（へ）発明の効果 この発明の溶菌成分採取法によれば、培養や遠心分離等
の煩雑で時間を要する操作を行うことなく、迅速、簡便
に溶菌成分を試料から直接的に採取することができる。

従って、臨床判断や研究においてその有用性は極めて高
く、機械化や自動化も容易に行える点でも有利な方法で
ある。

また、非常に短時間かつ簡便な操作で糞便中の細菌約１
０’ｌ１Ｍ＃・５ｔｏｏｌを検出できる。またさらにプ
ローブ（プライマ）の作り方によって１つのサンプルで
多種の菌を電気泳動で検出できる。さらにまた採便の少
量化と前処理のＰ５貝の小型化が図れる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、各々この発明の清閑成分採取方法
を実施した過程を示す説明図、第３図はこの発明の清閑
成分採取方法から細菌検査法までの一連の手順の一例を
説明するフローチャート図、第４図は第３図のステップ
ｌで用いたフィルターホルダーの構成説明図、第５図は
第３図のステップ２で用いたフィルターホルダーの構成
説明図、第６図は第３図のステップ７で得られた電気泳
動の結果を示す泳動図である。 ３・・・・・・試料液、 ４、８．２３．３２．３３・・・・・・グラスファイバ
ー濾紙、１０・・・・・・濾液。 ス　３　［く １−１イ史！！デ饗う液 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ　＋ｃｙ′：ＴＯｉ
＋Ｏ’、ＴＯ”（（ｇ、５ｔｏｏＬ　）５ちｌ（ステ・
）ブ１） ↓ Ｆａｒｒｎ＊、ＴＥＳ　２０ｍ１＋：よ舒先升（ステ・
７ア２）↓ ＠桑、ＮａＯＨ知理（ステ１．）３） ↓ ＤＮＡ才ｌＩ＋出、尊堂０中相液τ′中細、（ステ１．
ア４）５る 第 ・桐 第１ 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水不溶性固型分と細菌を共存する糞便等の試料を水
   系媒体に懸濁させ、この懸濁液を孔径約０．４５μｍ以
   上の膜状フィルターを有する濾過器で濾過処理し、得ら
   れた細菌含有濾液を孔径約０．２〜１．６μｍの膜状フ
   ィルターに通過させてこの膜状フィルターに細菌を保持
   させた後、この膜状フィルターに溶菌液を流通させるこ
   とにより、細菌の溶菌液を得ることを特徴とする溶菌成
   分採取方法。 ２、請求項１の方法により得られた溶菌液をｐＨ５〜９
   に調整後ポリメラーゼ連鎖反応法に付し、該方法のもと
   で増幅するＤＮＡに基づいて、試料中の細菌を検出する
   ことを特徴とする細菌検査法。