CN115747042A - 一种大体积样本全自动一体化的核酸提取设备 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种大体积样本全自动一体化的核酸提取设备，主要由生物过滤膜、核酸吸附膜、样本过滤室、加热膜、温度传感器、气泵、第一电磁阀、第二电磁阀、废液阀、步进电机、废液室、液相储管、微控制器组成。本发明通过生物过滤膜，将大体积样本中需处理的生物富集在过滤膜上方，其他的杂质和液体则被去除，通过加热膜能加快生物裂解速度，加快蛋白酶K消化蛋白的速度，防止核酸溶液沉淀，加速整个核酸提取的速度，减少有机物残留，全自动无需人工干预。本发明通过微控制器实现了大体积样本全自动一体化的核酸提取，大大节省了劳动力，同时将核酸提取过程封闭在设备中降低核酸污染概率及气溶胶污染的风险，可应用于水质、空气中生物的核酸提取。

Description

一种大体积样本全自动一体化的核酸提取设备

技术领域

本发明属于生物医学设备领域，具体涉及一种大体积样本全自动一体化的核酸提取设备，用于从大体积的生物样本中提取核酸。

背景技术

自2019年全球爆发新冠疫情以来，利用核酸进行检测的分子诊断技术成为了判断病毒感染的金标准，成为了疫情防控的重要手段。而核酸的提取是进行分子诊断的第一步，将核酸从生物细胞或其他样本基质中提取出来，尽可能的减少核酸分子的损失并排除样本中的其他污染物，保证核酸分子的完整性和纯净性。目前已经开发出了多种核酸提取方法，主要包括苯酚氯仿提取法，硅胶膜提取法和磁珠提取法等。其中的硅胶膜法和磁珠法都利用了固相载体对核酸的选择性吸附作用，将核酸从生物样本中吸附出来，再将未结合的生物样本与固相载体分离，进行清洗将残留在固相载体上的生物样本清洗干净，最后将附着在固相载体上的核酸分子洗脱下来即可实现核酸的提取。这一过程涉及生物样本、裂解液、清洗液、洗脱液的添加，以及与固相的混合分离，需专业人员和专门的实验室进行复杂的操作。

为了减少人工的参与，减少对实验室环境的依赖，近年来开发了多种自动化便携式的核酸提取设备，国外的主流设备包括赛沛的GeneXpert、BioFire公司的Filmarray和罗氏的Cobas Liat等，国内的主流设备有优思达的一体化核酸检测系统EasyNAT和奥然生物的Galaxy NanoPCR检测仪等。这些设备均利用了磁珠法进行核酸分子的提取，磁珠需与生物样本进行充分的混匀使其能尽可能多的吸附样本中游离的核酸分子，但当进行大体积低含量样本的核酸提取时，磁珠难以与大体积的样本进行充分的混匀，难以将液相中游离的DNA全部吸附，因此这些设备不适用于大体积低含量样本的检测。例如在抗击新冠疫情期间，发现居民楼医院中会存在气溶胶污染，但对气溶胶污染的检测通常是利用滤膜对空气中的病毒进行富集；在水质检测中，致病菌的含量通常非常低，需要利用滤膜过滤水先对致病菌进行富集。这些案例表面在处理大体积样本时，过滤膜这种固相比磁珠具有更好的与液相充分结合的能力。而传统的基于硅胶膜法的核酸提取方法，虽然能使用大的离心柱来实现大体积样本的核酸提取，但在提取过程中需要使用到离心机、加热仪等大型仪器，并且在操作的过程中需要人工进行多种液体的添加、加热、离心和干燥等操作。因此对能够进行大体积低浓度样本全自动一体化核酸提取的设备的需要越来越迫切。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种大体积样本全自动一体化的核酸提取设备，利用气泵提供液体流经固相的驱动力，通过将合适孔径的滤膜与核酸吸附膜相结合作为固相，利用过滤膜过滤大体积生物样本中需截留的细菌、细胞、病毒等微生物，再利用核酸吸附膜提取微生物裂解后的核酸分子，从而实现从大体积生物样本中全自动提取核酸分子。

为实现上述目的，本发明提供的一种大体积样本全自动一体化的核酸提取设备，主要由生物过滤膜、核酸吸附膜、样本过滤室、加热膜、温度传感器、气泵、第一电磁阀、第二电磁阀、废液阀、步进电机、废液室、液相储管、微控制器组成，样本过滤室中叠放有生物过滤膜和核酸吸附膜，生物过滤膜放置在核酸吸附膜上方，生物过滤膜、核酸吸附膜的直径与样本过滤室内径相同；加热膜及温度传感器设置在样本过滤室的外侧，用于实现液体的加热控制和璧面残留液体挥发的加热控制；气泵、第一电磁阀、第二电磁阀构成核酸提取设备的主要动力系统——正/负压系统，气泵的出气口和进气口通过管路和第一电磁阀和第二电磁阀连接，第一电磁阀是一个四通阀包含p1进气口(与气泵出气口相连)、s1出气口(与环境相连)、s2出气口(与废液室相连)、s3出气口(与液相储管相连)，第二电磁阀是一个三通阀包含p2进气口(与气泵进气口相连)、s4出气口(与环境相连)、s5出气口(与废液室相连)；废液阀由步进电机驱动，废液阀中包含p3进液口(与废液室相连)、s6出液口(用于排废液)、s7出液口(用于排核酸洗脱液)；液相储管通过软管连接到第一电磁阀的s3出气口上；微控制器通过电线与加热膜、温度传感器、气泵、第一电磁阀、第二电磁阀、步进电机相连。所述的生物过滤膜、核酸吸附膜的直径与样本过滤室内径相同。

可选地，生物过滤膜包括纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯等聚合物、生物材料。

可选地，生物过滤膜根据处理的样本种类(细菌、病毒、细胞等)需选择不同孔径的滤膜，生物过滤膜的孔径包括0.22μm，0.45μm等。

可选地，核酸吸附膜的材料包括玻璃纤维、硅胶等硅基材料。

可选地，废液室的腔室结构包括正方形、圆柱形、锥形等。

可选地，加热膜包括硅胶加热膜、PI加热膜、PET加热膜、铝箔加热膜等，温度传感器包括热电阻传感器、热电偶传感器等。

可选地，气泵包括涡轮泵、叶片泵、活塞泵、薄膜泵等。

可选地，废液阀结构可为柱塞式、隔膜式、球阀式等。

可选地，管路的材料包括硅胶、PVC、PTFE等。

可选地，液相储管的材料包括硅胶、PTFE等。

可选地，液相储管中储存的裂解液、结合液、清洗液、洗脱液可使用商品化试剂盒中的相关试剂。

本发明的核酸提取设备所述的正/负压系统在气泵常开的情况下，能够通过控制第一电磁阀、第二电磁阀的出气口s2、s3、s5的开闭，分别能够给废液室中提供正压力驱动废液排出，给液相储管中提供正压力驱动试剂进入样本过滤室3，给废液室中提供负压力驱动样本过滤室中的液体经过生物过滤膜和核酸吸附膜。

当第一电磁阀的s2出气口、s3出气口打开时，第二电磁阀的s4出气口也需打开，维持气路通道中的压力平衡。

当第二电磁阀的s5出气口打开时，第一电磁阀的s1出气口也需打开，维持气路通道中的压力平衡。

所述的废液阀能够通过控制步进电机控制p3进液口与s6出液口相连或p3进液口与s7出液口相连。

液相储管12中预存有裂解液、结合液、清洗液、洗脱液，相邻液体间通过空气隔开。

本发明具有以下有益效果：

(1)富集待测物体：通过生物过滤膜1，将大体积样本中需处理的生物富集在过滤膜上方，其他的杂质和液体则被去除；

(2)加快核酸提取过程：在样本过滤室表面的加热膜5能加快生物裂解速度，加快蛋白酶K消化蛋白的速度，防止核酸溶液沉淀，加速整个核酸提取的速度；

(3)减少有机物残留：加热膜5能对过滤室表面、生物过滤膜1和核酸吸附膜2进行加热，使表面的有机物尽可能的挥发，降低下游核酸洗脱产物中有机杂质的含量；

(4)全自动无需人工干预：通过微控制器对各部件进行控制可以使核酸提取全流程自动完成，减少人工干预；

(5)无气溶胶污染风险：样本过滤室中大部分时间都处于负压状态下，气体不会往过滤室外部扩散，减少了气溶胶污染的风险。当系统正压时由于滤膜的阻碍，气体优先从废液阀排出。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图2为本发明中主要动力部件正/负压系统控制方式示意图。

图3为本发明中废液阀结构与控制方式示意图。

附图标记说明：

1—生物过滤膜；2—核酸吸附膜；3—样本过滤室室；4—加热膜；5—温度传感器；6—气泵；7—第一电磁阀；8—第二电磁阀；9—废液阀；10—步进电机；11—废液室；12—液相储管；13—微控制器。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

实施例1

参见图1，一种大体积样本全自动一体化的核酸提取设备，主要由生物过滤膜1、核酸吸附膜2、样本过滤室3、加热膜4、温度传感器5、气泵6、第一电磁阀7、第二电磁阀8、废液阀9、步进电机10、废液室11、液相储管12、微控制器13组成。样本过滤室3中叠放有生物过滤膜1和核酸吸附膜2，生物过滤膜1与核酸过滤膜大小相同且相互堆叠，其中核酸吸附膜2固定于生物过滤膜1下方，生物过滤膜1通过孔径能够捕获样本中的生物体，核酸吸附膜2能够在生物体裂解后吸附游离的核酸分子。样本过滤室3提供一定的体积用于存放样本、裂解液、清洗液、洗脱液等，相互堆叠的生物过滤膜1与核酸吸附膜2放置于样本过滤室3的底部，其中生物过滤膜1和核酸吸附膜2的直径与样本过滤室3的内直径相同，紧密贴合在样本过滤室3的内部。加热膜4及温度传感器5贴合设置在样本过滤室3的外侧，贴合处通过涂抹硅脂实现紧密的贴合，加热膜4用于给样本过滤室3加热，在进行生物体裂解时需加热，在洗脱核酸前需加热烘干样本过滤室3及生物过滤膜1和核酸吸附膜2，温度传感器5用于检测加热膜的温度，并为加热膜4的加热控制提供反馈，加热膜4与温度传感器5通过电线连接到微控制器13上，通过程序实现温度的精准控制。

废液室11用于存放样本过滤室3中过滤下来的废液，废液室11上方与样本过滤室3相连，废液室11下方与废液阀9相连，废液室11侧面与第一电磁阀7和第二电磁阀8相连。

废液阀9包含有进液口p3(与废液室11相连)、出液口s6(用于排废液)、出液口s7(用于排核酸洗脱液)，废液阀9具有两种工作状态：进液口p3与出液口s6相连时，废液室11中的废液会通过出液口s6排出；进液口p3与出液口s7相连时，废液室11中的洗脱液会通过出液口s7排出。废液阀9两种工作状态的切换通过步进电机10来驱动，步进电机10通过电线与微控制器13相连，通过程序实现废液阀9工作状态的切换。

气泵6、第一电磁阀7、第二电磁阀8构成了一套能够实现正/负压切换的动力系统——正/负压系统，气泵6是一个具有进气口和出气口的气泵，能够连续的工作，第一电磁阀7是一个四通阀包含进气口p1(与气泵6出气口相连)、出气口s1(与环境相连)、出气口s2(与废液室11相连)、出气口s3(与液相储管12相连)，第二电磁阀8是一个三通阀包含进气口p2(与气泵6进气口相连)、出气口s4(与环境相连)、出气口s5(与废液室11相连)。气泵6的出气口和进气口通过管路和第一电磁阀7的进气口p1和第二电磁阀8的进气口p2连接；第一电磁阀7的出气口s2与废液室11相连，出气口s1与环境相连用于平衡大气压，出气口s3与液相储管12相连用于排出管内液体；第二电磁阀8的出气口s5与废液室11相连，出气口s4与环境相连用于平衡大气压。气泵6、第一电磁阀7和第二电磁阀8通过电线与微控制器相连进行控制，第一电磁阀7存在三种工作状态：进气口p1与出气口s1相连用于平衡大气压；进气口p1与出气口s2相连用于给废液室11提供正压力；进气口p1与出气口s3相连用于给液相储管12提供正压力将液体排出。第二电磁阀8存在两种工作状态：进气口p2与出气口s4相连用于平衡大气压；进气口p2与出气口s4相连用于给废液室11提供负压力。

液相储管12中储存有裂解液、结合液、清洗液、洗脱液等用于生物裂解的试剂，这些试剂根据使用量存放有200微升、600微升不等，相邻试剂间通过空气进行阻隔防止混匀。液相储管与第一电磁阀7的出气口s3相连，能够通过微控制器13的控制排出储存的液体。

实施例2

参见图1，根据核酸提取流程各部件的控制过程为：

1、将样本直接加入样本过滤室中，关闭废液阀9，打开气泵6，使第一电磁阀7的p1口与s1口相连，第二电磁阀8中的p2口和s5口相连，给样本过滤室3中提供负压力，样本中的细胞、细菌、病毒等会被生物过滤膜1截住，而样本中的液体会通过过滤室进入废液室11中。

2、随后使第一电磁阀7的p1口与s3口相连，第二电磁阀8中的p2口和s4口相连，给液相储管12提供正压力，使裂解液推入样本过滤室3中。

3、接着关闭气泵6，打开加热膜4，利用温度传感器5给样本过滤室3稳定的提供适宜裂解的温度，加热10分钟。

4、等裂解一段时间后，关闭加热膜4，打开气泵6，使第一电磁阀7的p1口与s3口相连，第二电磁阀8中的p2口和s4口相连，给液相储管12提供正压力，将结合液推入样本过滤室中，使核酸分子吸附在核酸吸附膜2上。

5、随后将第一电磁阀7的p1口与s1口相连，第二电磁阀8中的p2口和s5口相连，给样本过滤室3中提供负压力，使多余的液体进入废液室11中。

6、接着将第一电磁阀7的p1口与s3口相连，第二电磁阀8中的p2口和s4口相连，给液相储管12提供正压力，使清洗液推入样本过滤室3中。

7、随后将第一电磁阀7的p1口与s1口相连，第二电磁阀8中的p2口和s5口相连，给样本过滤室3中提供负压力，让清洗液流过生物过滤膜1和核酸吸附膜2去除多余的杂质。

8、重复上述步骤6和步骤7一次。

9、关闭气泵6，控制步进电机10打开废液阀9，使p3口与s6口相连，使第一电磁阀7的p1口与s2口相连，第二电磁阀8中的p2口和s4口相连，打开气泵6，给废液室11提供正压力，将废液排出并打开加热膜4，加热样本过滤室3，使璧面和膜上的有机物挥发，持续2分钟。

10、随后将第一电磁阀7的p1口与s3口相连，第二电磁阀8中的p2口和s4口相连，给液相储管12提供正压力，使洗脱液推入样本过滤室3中，关闭气泵6，室温下孵育5分钟。

11、将第一电磁阀7的p1口与s1口相连，第二电磁阀8中的p2口和s5口相连，打开气泵6，给样本过滤室中提供负压力，将洗脱液抽入废液室11中。

12、关闭气泵6，控制步进电机10打开废液阀9，使p3口与s7口相连，使第一电磁阀7的p1口与s2口相连，第二电磁阀8中的p2口和s4口相连，打开气泵6，给废液室11提供正压力，即可将核酸洗脱液从s7口导出。

实施例3

参见图2，该大体积样本全自动一体化的核酸提取设备的核心动力源为一套可正/负压切换的动力系统，当不考虑液相储管12时，该系统仅需包含有一个气泵，两个电磁阀和一个三通阀。气泵分别有一个进气口和一个出气口，分别与电磁阀1的进气口I1和电磁阀2的进气口I2相连，电磁阀1的出气口O1和电磁阀2的出气口O4与环境相连，电磁阀1的出气口O2与电磁阀2的出气口O3通过一个三通阀与废液室相连。电磁阀出气口的通断皆由电压信号触发，当触发信号为低电平时，电磁阀门不工作；当触发信号为高电平时，电磁阀门工作，进气口与该出气口相连。当需要给废液室提供负压时，电磁阀1的O1为高电平，O2为低电平，I1与O1相连，平衡气泵压力；电磁阀2的O3为高电平，O4为低电平，I2与O3相连，将气泵进气口连接到废液室中。当需要给废液室提供正压时，电磁阀1的O1为低电平，O2为高电平，I1与O2相连，将气泵出气口连接到废液室中；电磁阀2的O3为低电平，O4为高电平，I2与O4相连，平衡气泵压力。

实施例4

参见图3，废液阀9为一个四通结构阀体，左侧连接柱塞，靠步进电机驱动的凸轮连接，右侧为废液口，上方连接废液室11，下方为洗脱液口。废液阀需要实现三种状态：密闭，连通废液室与废液口，连通废液室与洗脱液口。响应的对凸轮的半径进行了三种尺寸的设计，分别为r1、r2、r3，三个尺寸对应于柱塞在废液阀体内运动的路程，通过控制步进电机旋转，可以实现柱塞在废液阀内精确的运动。具体实施方式如下：步进电机的初始状态为状态1，此时柱塞将上方与废液室连通的入口封闭，可以实现正/负压系统给样本过滤室进行抽滤；控制步进电机旋转90°，可以达到状态2，该状态下废液室与废液口连通，废液室中的废液能够在正压力作用下排出；控制步进电机旋转180°，可以达到状态3，该状态下废液室与洗脱液口相连，洗脱液在正压力作用下排出。通过控制步进电机的旋转角度可以实现阀体三种状态的精确控制。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种大体积样本全自动一体化的核酸提取设备，其特征在于，由生物过滤膜(1)、核酸吸附膜(2)、样本过滤室(3)、加热膜(4)、温度传感器(5)、气泵(6)、第一电磁阀(7)、第二电磁阀(8)、废液阀(9)、步进电机(10)、废液室(11)、液相储管(12)、微控制器(13)组成，样本过滤室(3)中叠放有生物过滤膜(1)和核酸吸附膜(2)，生物过滤膜(1)放置在核酸吸附膜(2)上方，加热膜(4)及温度传感器(5)设置在样本过滤室(3)的外侧，气泵(6)、第一电磁阀(7)、第二电磁阀(8)构成核酸提取设备的主要动力系统——正/负压系统，气泵(6)的出气口和进气口通过管路和第一电磁阀(7)和第二电磁阀(8)连接，液相储管(12)通过软管与第一电磁阀(7)连接，微控制器(13)通过电线与加热膜(4)、温度传感器(5)、气泵(6)、第一电磁阀(7)、第二电磁阀(8)、步进电机(10)相连。

2.根据权利要求1所述的核酸提取设备，其特征在于，第一电磁阀(7)是一个四通阀分别为p1进气口、s1出气口、s2出气口、s3出气口，第二电磁阀(8)是一个三通阀分别为p2进气口、s4出气口、s5出气口，废液阀(9)由步进电机(10)驱动，废液阀(9)中包含p3进液口、s6出液口、s7出液口，第一电磁阀(7)的p1进气口与气泵(6)出气口相连、s1出气口与环境相连、s2出气口与废液室(11)相连、s3出气口与液相储管(12)相连，第二电磁阀(8)的p2进气口与气泵(6)进气口相连、s4出气口与环境相连、s5出气口与废液室(11)相连，液相储管(12)通过软管连接到第一电磁阀(7)的s3出气口上。

3.根据权利要求1所述的核酸提取设备，其特征在于，废液阀(9)的p3进液口与废液室(11)相连、s6出液口用于排废液、s7出液口用于排核酸洗脱液。

4.根据权利要求1所述的核酸提取设备，其特征在于，所述的生物过滤膜(1)、核酸吸附膜(2)的直径与样本过滤室(3)内径相同。

5.根据权利要求1所述的核酸提取设备，其特征在于，生物过滤膜选用纤维素、聚四氟乙烯或聚碳酸酯。

6.根据权利要求1所述的核酸提取设备，其特征在于，核酸吸附膜(2)的材料选用玻璃纤维或硅胶。

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