CN116554998A - 一种用于检测念珠菌的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测念珠菌的试剂盒 Download PDF

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柳丽萍
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Abstract

本发明提供一种用于检测念珠菌的试剂盒，包括：盒体和用于检测念珠菌的处理试剂；所述用于检测念珠菌的处理试剂被预先封装于所述盒体内，以使所述试剂盒可利用所述盒体内的压强变化推动试剂流动混合对待测样本自动进行核酸提取纯化处理以及扩增反应的体系溶液配置，而无需人工操作流程。本发明提供的试剂盒，将进行念珠菌检测所需的各项处理试剂放置入盒体的试剂腔内，通过控制盒体内的阀体运动，将各项处理试剂与待测样本按照预设顺序混合处理后送入盒体的反应腔。一方面避免了操作人员重复机械地进行试剂混合流程，能更加便捷地进行后续的扩增反应，另一方面避免人为污染引起实验结果出现假阳性或假阴性问题。

Description

一种用于检测念珠菌的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物基因技术领域，尤其涉及一种用于检测念珠菌的试剂盒。
背景技术
真菌属于真核生物，广泛存在于自然界，绝大多数对于人类有利，少数会感染人类导致严重疾病。致病真菌病分为浅部真菌病和深部真菌病(侵袭性真菌病，IFI/IFDs)，侵袭性真菌主要有假丝酵母菌、隐球菌、曲霉、毛霉、组织胞浆菌和卡氏肺孢菌等，其中以假丝酵母菌感染较常见。目前全球范围内，IFDs发生率总体呈上升趋势，成为全世界的公共卫生问题。
假丝酵母菌，俗称念珠菌，本属菌有150多种，其中有11种对人有致病性，其中以白假丝酵母菌为最常见的致病菌。在我国，念珠菌是侵袭性真菌感染最主要的病原菌，报道次数占比高达91％。在全球范围内，侵袭性念珠菌感染(invasive candidiasis，IC)也是排在首位的侵袭性真菌感染。最新统计数据显示，全球每年约有75万人被诊断为侵袭性念珠菌感染，死亡者逾5万例。成人念珠菌血症病死率为15％-40％，平均每例患者住院费用高达4万美元(2020年)。超过95％的IC由以下5种病原菌引起：白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌，其中，白色念珠菌是IC患者最常见的病原菌，占50％-70％。耳念珠菌，是日本2009年发现的一种新病原真菌物种，具有多重耐药、高致死率、易于传播以及鉴定困难等特征，被冠以“超级真菌”的称号。
另外，2022年10月25日，世界卫生组织(WHO)针对侵袭性真菌病(IFDs)首次颁布了第一份真菌重点病原体清单(FPPL)，其中白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌均在重点检测名单中。
目前真菌传统的检测方法采用如直接镜检、培养及血清学检测等，敏感性及特异性不高，检出率低，报告周期长，难以用于早期检测。全自动微生物鉴定系统能实现上百种病原真菌的准确鉴定，操作简单，相对于培养等方法快速(6个小时左右)，但存在设备耗材价格昂贵等缺点。近年来发展起来的质谱方法也面临设备昂贵问题，同时通量低，无法做到大量样本同时检测。
分子生物学检测技术逐步应用于致病菌体检测，具有敏感、特异、快速的特点，已经受到越来越多的临床实验室认可。对待测样本进行分子生物学检测时主要的步骤有核酸提取纯化、核酸扩增和核酸检测。其中，核酸提取纯化的好坏程度、核酸提取纯化的速度是完成待测样本准确检测、快速检测的关键步骤。目前核酸提取纯化的办法多种多样，有PC抽提法、高盐沉淀法、离心柱法和生物磁珠法。这些方法都需要操作人员的介入，不仅操作繁琐、而且容易产生人为污染导致假阳性，样本提取质量差影响扩增结果导致假阴性等。
发明内容
本发明提供一种用于检测念珠菌的试剂盒，以避免在对待测样本进行念珠菌检测的实验过程中人工介入核酸提取纯化流程所带来的问题。
本发明提供的用于检测念珠菌的试剂盒，包括：盒体和用于检测念珠菌的处理试剂；
所述用于检测念珠菌的处理试剂封装于所述盒体内；
所述盒体设置为：能够通过改变所述盒体内的压强以推动所述用于检测念珠菌的处理试剂流动并对待测样本进行核酸提取纯化处理。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述盒体包括：多个试剂腔、反应腔和阀体；
所述阀体包括与所述试剂腔和所述反应腔分别连通的处理腔；
所述多个试剂腔用于容置所述用于检测念珠菌的处理试剂和接收所述待测样本；
所述阀体设置为：能够改变所述处理腔内的压强，使多个所述试剂腔内的所述用于检测念珠菌的处理试剂依次输送至所述处理腔内对所述待测样本进行核酸提取纯化处理，并使所述待测样本被核酸提取纯化处理后的体系溶液输送至所述反应腔。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述用于检测念珠菌的处理试剂包括：用于检测念珠菌的引物探针组合、扩增反应液、洗涤液和超声缓冲液。
进一步，本发明所述的试剂盒，
所述用于检测念珠菌的引物探针组合包括：用于检测念珠菌的引物组和探针；
其中，用于检测念珠菌的引物组包括：引物组1、引物组2、引物组3、引物组4、引物组5、引物组6、引物组7、引物组8、引物组9、引物组10、引物组11、引物组12、引物组13、引物组14、引物组15、引物组16、引物组17、引物组18中的一种或多种；
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其中，用于检测念珠菌的探针包括：探针1、探针2、探针3、探针4、探针5、探针6、探针7、探针8、探针9、探针10、探针11、探针12、探针13、探针14、探针15、探针16、探针17、探针18中的一种或多种；
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如SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列
其中，用于检测念珠菌的引物探针组合包括：组合1、组合2、组合3、组合4、组合5、组合6、组合7、组合8、组合9、组合10、组合11、组合12、组合13、组合14、组合15、组合16、组合17、组合18中的一种或多种；
所述组合1包括：所述引物组1和所述探针1；
所述组合2包括：所述引物组2和所述探针2；
所述组合3包括：所述引物组3和所述探针3；
所述组合4包括：所述引物组4和所述探针4；
所述组合5包括：所述引物组5和所述探针5；
所述组合6包括：所述引物组6和所述探针6；
所述组合7包括：所述引物组7和所述探针7；
所述组合8包括：所述引物组8和所述探针8；
所述组合9包括：所述引物组9和所述探针9；
所述组合10包括：所述引物组10和所述探针10；
所述组合11包括：所述引物组11和所述探针11；
所述组合12包括：所述引物组12和所述探针12；
所述组合13包括：所述引物组13和所述探针13；
所述组合14包括：所述引物组14和所述探针14；
所述组合15包括：所述引物组15和所述探针15；
所述组合16包括：所述引物组16和所述探针16；
所述组合17包括：所述引物组17和所述探针17；
所述组合18包括：所述引物组18和所述探针18。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述引物探针组合和所述扩增反应液被配制为冻干球；
其中，
所述用于检测念珠菌的引物探针组合和所述扩增反应液被合成配制为一个冻干球并被容置于一个所述试剂腔；
或者，所述用于检测念珠菌的引物探针组合和所述扩增反应液被分别配制为两个冻干球并被容置于一个所述试剂腔；
或者，所述用于检测念珠菌的引物探针组合和所述扩增反应液被分别配制为两个冻干球并被分别容置于两个所述试剂腔。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述阀体包括：柱体和与所述柱体连接的流道切换机构，所述处理腔设于所述流道切换机构内，且所述流道切换机构上设有连通至所述处理腔的输液口；
所述试剂腔和所述反应腔均设有与所述输液口相适配的导通部件；
所述流道切换机构旋转使所述输液口分别与所述试剂腔或所述反应腔的导通部件对齐，以使所述试剂腔或所述反应腔分别与所述处理腔相连通。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述柱体包括：柱塞腔和设于所述柱塞腔内的柱塞；
所述柱塞腔与所述处理腔连通，所述柱塞在所述柱塞腔内沿所述柱塞腔的轴向活动，以改变所述处理腔内的压强。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述处理腔内设有生物体过滤机构。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述盒体包括：盖体、本体和底座；
所述盖体、所述本体和所述底座依次顺序连接；
所述试剂腔和所述反应腔均开设于所述本体内，所述阀体穿设于所述本体内。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述盖体包括：上盖和与所述上盖相连接的下盖；
所述上盖设有中心柱，所述下盖设有与所述中心柱相配合的中心孔，所述中心柱插入所述中心孔以构成与阀体内的柱塞腔同轴连通的柱塞孔，阀体内的柱塞穿设于所述柱塞孔和所述柱塞腔内。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述下盖上设有与所述试剂腔对应的的第一透气孔；
所述上盖设有第二透气孔；
所述上盖与所述下盖之间设有气体过滤机构。
进一步，本发明所述的试剂盒，所述下盖上设有凸台，所述上盖上设有与所述凸台相配合的环筋，所述凸台与所述环筋相配合以使所述上盖和所述下盖之间密封；
其中，所述中心柱与所述中心孔之间设有第一密封机构；
所述凸台与所述环筋之间设有第二密封机构。
本发明提供的用于检测念珠菌的试剂盒，将用于检测念珠菌所需的各项处理试剂放置入试剂腔内，通过计算机程序控制阀体运动，将各项处理试剂与待测样本按照预设顺序混合处理后，完成核酸提取纯化步骤，并且将核酸提取纯化后的体系溶液送入反应腔，避免了操作人员重复机械地进行试剂混合流程，能更加便捷地进行后续的扩增反应。
此外，本发明提供的用于检测念珠菌的试剂盒，将检测念珠菌的引物探针组合及用于扩增反应的各项试剂预先封装于试剂腔，封装后的试剂盒整体作为产品进行市场销售，使得用户在进行念珠菌检测时，省去了大量配制试剂、提纯样本的重复工作，能够大批量进行念珠菌的检测，还可以避免人为污染引起实验结果出现假阳性或假阴性问题。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1a为本发明实施例的交叉反应结果的扩增曲线示意图；
图1b为本发明实施例的交叉反应结果的熔解曲线示意图；
图2a为本发明实施例的近平滑念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图；
图2b为本发明实施例的近平滑念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图；
图2c为本发明实施例的光滑念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图；
图2d为本发明实施例的光滑念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图；
图2e为本发明实施例的白色念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图；
图2f为本发明实施例的白色念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图；
图2g为本发明实施例的热带念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图；
图2h为本发明实施例的热带念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图；
图2i为本发明实施例的克柔念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图；
图2j为本发明实施例的克柔念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图；
图2k为本发明实施例的耳念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图；
图2l为本发明实施例的耳念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图；
图3a为本发明实施例的光滑念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图；
图3b为本发明实施例的光滑念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图；
图3c为本发明实施例的克柔念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图；
图3d为本发明实施例的克柔念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图；
图3e为本发明实施例的近平滑念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图；
图3f为本发明实施例的近平滑念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图；
图3g为本发明实施例的热带念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图；
图3h为本发明实施例的热带念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图；
图3i为本发明实施例的白色念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图；
图3j为本发明实施例的白色念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图；
图3k为本发明实施例的耳念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图；
图3l为本发明实施例的耳念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图；
图4a为本发明实施例六的试剂盒的结构示意图；
图4b为本发明实施例六的试剂盒的拆分结构示意图；
图4c为本发明实施例六的试剂盒的本体的俯视结构示意图；
图4d为本发明实施例六的试剂盒的本体的立体仰视结构示意图；
图4e为本发明实施例的试剂盒的阀体的立体结构示意图；
图4f为本发明实施例六的试剂盒的阀体的内部结构示意图；
图4g为本发明实施例六的试剂盒的盖体的拆分结构示意图；
图4h为本发明实施例六的试剂盒的盖体的内部结构示意图；
图4i为本发明实施例六的试剂盒的盖体和本体的内部结构示意图；
图4j为本发明实施例六的试剂盒的本体和底座的内部结构示意图。
附图标记列表：
本体1、试剂腔11、通孔111、阀体12、柱体121、流道切换机构122、进液口123、出液口124、柱塞腔125、柱塞126、阀体腔131、阀体活动腔132、反应腔14、处理腔15、进液流道151、出液流道152、卡槽16；
盖体2、上盖21、中心柱211、第二透气孔212、环筋213、下盖22、中心孔221、第一透气孔222、凸台223、柱塞孔24；
底座3、卡扣36。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述，本领域技术人员知晓，以下具体实施方式仅为说明本发明的具体技术原理，本发明并不以此为限。
实施例一
本发明实施例一提供的用于检测念珠菌的引物组，包括：引物组1、引物组2、引物组3、引物组4、引物组5、引物组6、引物组7、引物组8、引物组9、引物组10、引物组11、引物组12、引物组13、引物组14、引物组15、引物组16、引物组17或引物组18；实际应用中，引物组也可能包括：引物组1至18中的任意多种的组合。
所述引物组1包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
所述引物组2包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
所述引物组3包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
所述引物组4包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
所述引物组5包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
所述引物组6包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
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所述引物组10包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；
所述引物组11包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列；
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所述引物组14包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列；
所述引物组15包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；
所述引物组16包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列；
所述引物组17包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列；
所述引物组18包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列。
具体地，序列名称SEQ ID NO:1至36的核苷酸序列如下表所示：
序列名称 序列
SEQ ID NO:1 5’-GTTTATGTGCAAAATAGAACGGA-3’
SEQ ID NO:2 5’-GCCAACATTACCGCGAA-3’
SEQ ID NO:3 5’-GTCCACCAATTCTTATTACACT-3’
SEQ ID NO:4 5’-AACATCTTACAAATGATGCACA-3’
SEQ ID NO:5 5’-CCTTAAATGCTCTCAAGTATCTAG-3’
SEQ ID NO:6 5’-TACAAATGATGCACAATGACTG-3’
SEQ ID NO:7 5’-ACATATTAAAATATCACTGCGGTC-3’
SEQ ID NO:8 5’-CTTTTGTAAATCTCATGGCTTG-3’
SEQ ID NO:9 5’-ATTAGTCTCCTATAACAAACCCA-3’
SEQ ID NO:10 5’-GTTCTTTTGTAAATCTCATGGCT-3’
SEQ ID NO:11 5’-ATTAAATTTACTATTCGTAGTGGTGC-3’
SEQ ID NO:12 5’-TCTTTATATTTGTACCTTGATGCGATG-3’
SEQ ID NO:13 5’-CAACAAGTCACGTCCCAG-3’
SEQ ID NO:14 5’-AGTTTCTCCGTATTGATAGCC-3’
SEQ ID NO:15 5’-GTCGGCTATCAATACGGAGA-3’
SEQ ID NO:16 5’-TTGATCTTGTTTGACGGTTG-3’
SEQ ID NO:17 5’-AGATTGAAAGAGAAACGACGAT-3’
SEQ ID NO:18 5’-CTCTATTCTGCTGGGACGTGA-3’
SEQ ID NO:19 5’-AAATAAAGCCAGACTCAACCC-3’
SEQ ID NO:20 5’-ACTTGGCGTATCTTGTTGTG-3’
SEQ ID NO:21 5’-GAAATAAAGCCAGACTCAACCCA-3’
SEQ ID NO:22 5’-TACTTGGCGTATCTTGTTGT-3’
SEQ ID NO:23 5’-CGCCAAGTAAGGAGTCAACA-3’
SEQ ID NO:24 5’-CGCTTCCTCCAATTCCAA-3’
SEQ ID NO:25 5’-CCATTGTACACAACCGTCA-3’
SEQ ID NO:26 5’-CAAATACTGTCATTAGGGCAC-3’
SEQ ID NO:27 5’-TCACAGATAACACCGAAGGC-3’
SEQ ID NO:28 5’-ATGGCAGTTGTATCTTATGGT-3’
SEQ ID NO:29 5’-TCTTTCTTGTAGACGGCTT-3’
SEQ ID NO:30 5’-ATATGCCGTTCCCGCAA-3’
SEQ ID NO:31 5’-TTGTCCACAGTTTCCGTT-3’
SEQ ID NO:32 5’-TCGCTTCACCATCGACC-3’
SEQ ID NO:33 5’-ATGCTACAACCGAAACACA-3’
SEQ ID NO:34 5’-GTCCAAGTTCAGAACGGAA-3’
SEQ ID NO:35 5’-TATACGTGGTGATATTTTACTTTAGCAAC-3’
SEQ ID NO:36 5’-ACGTAGCCCTGAAGTTCC-3’
其中，序列编号为SEQ ID NO:(2n+1)的核苷酸序列用于上引物，序列编号为SEQID NO:(2n+2)的核苷酸序列用于下引物；其中，n为整数且0≤n≤17。即上述序列编号为奇数项的核苷酸序列可用于上引物，上述序列编号为偶数项的核苷酸序列可用于下引物。
本发明实施例一的引物组可与本发明实施例二的探针构成引物探针组合，以对念珠菌进行检测，具体原理请参见本发明的实施例三的引物探针组合。
实施例二
本发明实施例二提供的用于检测念珠菌的探针，包括：探针1、探针2、探针3、探针4、探针5、探针6、探针7、探针8、探针9、探针10、探针11、探针12、探针13、探针14、探针15、探针16、探针17或探针18；实际应用中，探针也可能包括：探针1至18中的任意多种的组合。
所述探针1具有：如SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列；
所述探针2具有：如SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列；
所述探针3具有：如SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列；
所述探针4具有：如SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列；
所述探针5具有：如SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列；
所述探针6具有：如SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列；
所述探针7具有：如SEQ ID NO:43所示的核苷酸序列；
所述探针8具有：如SEQ ID NO:44所示的核苷酸序列；
所述探针9具有：如SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列；
所述探针10具有：如SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列；
所述探针11具有：如SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列；
所述探针12具有：如SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列；
所述探针13具有：如SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列；
所述探针14具有：如SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列；
所述探针15具有：如SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列；
所述探针16具有：如SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列；
所述探针17具有：如SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列；
所述探针18具有：如SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列。
具体地，序列名称SEQ ID NO:37至54的核苷酸序列如下表所示：
本发明实施例二的探针可与本发明实施例一的引物组构成引物探针组合，以对念珠菌进行检测，具体原理请参见本发明的实施例三的引物探针组合。
实施例三
本发明实施例三提供的用于检测念珠菌的引物探针组合，采用本发明实施例一的引物组和本发明实施例二的探针。
本发明实施例三的用于检测念珠菌的引物探针组合，包括：组合1、组合2、组合3、组合4、组合5、组合6、组合7、组合8、组合9、组合10、组合11、组合12、组合13、组合14、组合15、组合16、组合17和组合18中的任意一种或多种；
所述组合1包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组1和如本发明实施例二所述探针中的探针1；
所述组合2包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组2和如本发明实施例二所述探针中的探针2；
所述组合3包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组3和如本发明实施例二所述探针中的探针3；
所述组合4包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组4和如本发明实施例二所述探针中的探针4；
所述组合5包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组5和如本发明实施例二所述探针中的探针5；
所述组合6包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组6和如本发明实施例二所述探针中的探针6；
所述组合7包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组7和如本发明实施例二所述探针中的探针7；
所述组合8包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组8和如本发明实施例二所述探针中的探针8；
所述组合9包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组9和如本发明实施例二所述探针中的探针9；
所述组合10包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组10和如本发明实施例二所述探针中的探针10；
所述组合11包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组11和如本发明实施例二所述探针中的探针11；
所述组合12包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组12和如本发明实施例二所述探针中的探针12；
所述组合13包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组13和如本发明实施例二所述探针中的探针13；
所述组合14包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组14和如本发明实施例二所述探针中的探针14；
所述组合15包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组15和如本发明实施例二所述探针中的探针15；
所述组合16包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组16和如本发明实施例二所述探针中的探针16；
所述组合17包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组17和如本发明实施例二所述探针中的探针17；
所述组合18包括：如本发明实施例一所述引物组中的所述引物组18和如本发明实施例二所述探针中的探针18。
进一步，本发明实施例三所述的引物探针组合，
所述组合1、所述组合2、所述组合3用于检测白色念珠菌(Candida albicans)；
所述组合4、所述组合5、所述组合6用于检测光滑念珠菌(Candida glabrata)；
所述组合7、所述组合8、所述组合9用于检测热带念珠菌(Candida tropicalis)；
所述组合10、所述组合11、所述组合12用于检测近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)；
所述组合13、所述组合14、所述组合15用于检测克柔念珠菌(Candida krusei)；
所述组合16、所述组合17、所述组合18用于检测耳念珠菌(Candida auris)。
具体地，本发明实施例中，用于检测白色念珠菌的引物探针组合如下：
组合1的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:1、2、37所示；
或者，组合2的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:3、4、38所示；
或者，组合3的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:5、6、39所示。
具体地，本发明实施例中，用于检测光滑念珠菌的引物探针组合如下：
组合4的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:7、8、40所示；
或者，组合5的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:9、10、41所示；
或者，组合6的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:11、12、42所示。
具体地，本发明实施例中，用于检测热带念珠菌的引物探针组合如下：
组合7的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:13、14、43所示；
或者，组合8的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:15、16、44所示；
或者，组合9的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:17、18、45所示。
具体地，本发明实施例中，用于检测近平滑念珠菌的引物探针组合如下：
组合10的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:19、20、46所示；
或者，组合11的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:21、22、47所示；
或者，组合12的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:23、24、48所示。
具体地，本发明实施例中，用于检测克柔念珠菌的引物探针组合如下：
组合13的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:25、26、49所示；
或者，组合14的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:27、28、50所示；
或者，组合15的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:29、30、51所示。
具体地，本发明实施例中，用于检测耳念珠菌的引物探针组合如下：
组合16的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:31、32、52所示；
或者，组合17的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:33、34、53所示；
或者，组合18的引物对、探针，其核苷酸序列分别如：SEQ ID NO:35、36、54所示。
具体地，在本发明具体实施方式中，在Genbank(DNA序列数据库)中检索念珠菌生物的全长序列，把白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌的待检基因序列分别进行blast序列比对，比对分析获得目标基因的保守序列区段并且靶标需在非ITS区域(ITS,，Internal Transcribed Spacer，即内转录间隔区)，把每种基因的保守序列区段分别输入设计软件中，设计至少3个检测目标的引物探针。设计过程中根据如下条件进行引物探针的筛选：
(1)引物探针的Tm值(Melting Temperature)；
(2)目标对应探针的Tm值的差值；
(3)GC含量(在DNA4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率)；
(4)避免出现发夹结构及二聚体。
通过上述(1)至(4)项条件筛选出能够在同一个扩增反应体系内共同进行扩增反应的引物探针组合。即同一组内的引物探针组合的扩增反应条件相同或者相近，相近指扩增反应条件在预设差值范围内，使其条件差异对于扩增反应的影响可忽略或者满足最低检测效果。并且还需要保证备选引物探针区段分别能够全面覆盖白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌。
具体地，在本发明具体实施方式中，针对每个检测靶标设计至少三组引物探针组合，经过大量实验测定，其中的最优引物探针组合包括：
用于检测白色念珠菌的组合1；
用于检测光滑念珠菌的组合4；
用于检测热带念珠菌的组合7；
用于检测近平滑念珠菌的组合10；
用于检测克柔念珠菌的组合13；
用于检测耳念珠菌的组合16。
此外，探针的SEQ ID NO:37至54所示的核苷酸序列所包括的荧光淬灭基团为相对优选的技术方案，但对于本发明而言，探针所标记的荧光淬灭基团不局限于表格中所列的荧光淬灭基团。
此外，为做好质量控制，本发明实施例的扩增反应体系中还加入内源性内标引物探针，可以从采样、样本处理到扩增做到全方位监控，避免出现假阴性结果。
其中，所述内标引物组包括的两项引物分别具有：如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列；
所述内标探针具有：如SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列。
具体地，序列名称SEQ ID NO:55至57的核苷酸序列如下表所示：
序列名称 序列
SEQ ID NO:55 5’-TGAATCTTTCCCATTCCTTGC-3’
SEQ ID NO:56 5’-ATTTCCTCTGCTCATTCTGT-3’
SEQ ID NO:57 5'-ROX-gagctgcTCTGTCCCCACACCGGCACGAGgcagctc-Dabcal-3'
进一步，本发明实施例三中所述的引物探针组合的序列可被一些常规序列修饰方式进行替换，这种替换不需要付出创造性劳动，以下是两种常见的修饰替换方式：
(1)如SEQ ID NO:1至54中所示的任意一项核苷酸序列可被如SEQ ID NO:1至54中所示的序列名称对应相同的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸且在检测念珠菌时保持扩增产物特异性一致的核苷酸序列所替换；其中，所述多个为2个至10个；
(2)如SEQ ID NO:1至54所示的任一项核苷酸序列可被与如SEQ ID NO:1至57所示的序列名称对应相同的核苷酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性的核苷酸序列所替换。
具体地，本领域技术人员可以对于SEQ ID NO:1至36所示的引物序列进行碱基修饰，对5’端前核苷酸进行的取代、缺失、或添加一个或几个核苷酸，对3’端序列进行截断等不改变扩增产物序列或改变后的产物序列与原序列相似度大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％且特异性一致的修改。这种修改是本领域技术人员容易想到的替换技术方案，不需要付出创造性劳动，仍然在本发明的保护范围内。
具体地，本领域技术人员可以对于SEQ ID NO:26至54所示的探针序列进行碱基修饰，包括在扩增产物的位置可前后移动、荧光信号和淬灭基团改变、探针长度增加或减少、探针5‘端修饰或增加接头序列等形式。这种修改是本领域技术人员容易想到的替换技术方案，不需要付出创造性劳动，仍然在本发明的保护范围内。
具体地，本发明实施例所述的引物探针试剂，所述扩增产物特异性一致指扩增产物片段序列的一致度大于80％、85％、90％、95％、98％或99％。例如，扩增反应后的产物序列与原序列相似度大于90％。
内标引物组和内标探针的序列SEQ ID NO:55至57的修饰与此相同，因此不再赘述其具体修饰方式。
其中，在本发明的一些实施例中，可以对引物探针组合拆分组合使用，以满足不同种类的念珠菌检测。
例如，如果需要制作能够检测白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌全部六种念珠菌的试剂盒，则需要采用的引物探针组合需要包括：
组合1至3中的至少一项；
组合4至6中的至少一项；
组合7至9中的至少一项；
组合10至11中的至少一项；
组合12至14中的至少一项；
以及，组合14至16中的至少一项。
根据本发明上述具体实施方式，最优的用于检测全部六种念珠菌的引物探针组合包括：组合1、组合4、组合7、组合10、组合13和组合16。
例如，如果需要制作能够检测光滑念珠菌、热带念珠菌和耳念珠菌全部三种念珠菌的试剂盒，则需要采用的引物探针组合需要包括：
组合4至6中的至少一项；
组合7至9中的至少一项；
以及，组合14至16中的至少一项。
即，对于白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌的任意组合，根据与其对应的引物探针组合中的组合(组合1至16)进行组合，可以得到针对该菌种组合的引物探针组合。基于本发明实施例的大量实验结果，基于引物探针组合的不同拆分组合形式，一共可以形成63种采用不同引物探针组合的检测试剂。
本发明实施例三的引物探针组合的验证实验请参阅本发明实施例七，此处不再赘述。
实施例四
本发明实施例四提供的用于检测念珠菌的引物探针试剂，包括：
如本发明实施例一所述的引物组；
或者，如本发明实施例二所述的探针；
或者，如本发明实施例三所述的引物探针组合；
以及，用于检测念珠菌的引物和探针的辅料或助剂。
其中，所述辅料或助剂是指使检测念珠菌的引物探针试剂在通常工作环境条件下能够被正常使用的除引物和探针之外的常规辅料或者助剂。例如，PCR检测的Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)、镁离子、核糖核酸单体(dA/G/C/UTPs)、DNA聚合酶、UDG酶(Uracil-DNA Glycocasylase，尿嘧啶-DNA糖基化酶)等。
实施例五
本发明实施例五提供的用于检测念珠菌的试剂盒，包括：
如本发明实施例一所述的引物组；
或者，如本发明实施例二所述的探针；
或者，如本发明实施例三所述的引物探针组合；
或者，如本发明实施例四所述的引物探针试剂。
进一步，本发明实施例五的用于检测念珠菌的试剂盒，所述引物组、所述探针、所述引物探针组合或者所述引物探针试剂采用冻干体系制成。
具体地，通过冻干体系制成冻干球，可以便于试剂盒的保存和运输。关于冻干球，将在实施例六中详细介绍，此处不再赘述。
进一步，本发明实施例五的试剂盒，还包括：洗涤液和超声缓冲液。
具体地，本发明实施例五的试剂盒内容置有用于检测念珠菌的扩增反应体系试剂、洗涤液和超声缓冲液。
用于检测念珠菌的扩增反应体系试剂包括：本发明实施例三所述的引物探针组合和扩增反应液。
其中，扩增反应液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，TRIShydrochloride)、镁离子、核糖核酸单体(dA/G/C/UTPs)、DNA聚合酶和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG，Uracil-DNA Glycocasylase)等。
其中，洗涤液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和表面活性剂；其中，表面活性剂包括：聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween20)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton100))和乙基苯基聚乙二醇(NP40)等。
其中，超声缓冲液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和表面活性剂；表面活性剂包括：聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween20)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton100))和乙基苯基聚乙二醇(NP40)等。其中，可采用上述超声缓冲液对冻干球进行复溶，以节省试剂盒内的空间。
在本发明实施例中，洗涤液和超声缓冲液的组分相同。在实际应用中，洗涤液和超声缓冲液的组分也可不同。本领域技术人员不应当将洗涤液和超声缓冲液的组分相同理解为本发明的限制性解释。
具体地，扩增反应液采用：20至100mM的Tris-HCl、1至10mM的镁离子、0.05至0.2mM的dA/G/C/UTPs、1至5U的DNA聚合酶、0.05至1U的UDG酶。其中，上述扩增反应液可与0.02至0.8μM的用于检测念珠菌的引物探针组合混合构成用于检测念珠菌的扩增反应体系试剂。
具体地，洗涤液采用：10至100nM的Tris-HCl和0.05％至0.3％的表面活性剂。
具体地，超声缓冲液采用：10至100nM的Tris-HCl和0.05％至0.3％表面活性剂。
本发明实施例五的试剂盒可采用本发明实施例六的图4a至4j所示的盒体结构，在该试剂盒的试剂腔容置本发明实施例三所述的引物探针组合、扩增反应液、洗涤液和超声缓冲液。
实施例六
图4a为本发明实施例六的试剂盒的结构示意图，图4b为本发明实施例六的试剂盒的拆分结构示意图。如图4a和图4b所示，本发明实施例六的试剂盒，其盒体包括：本体1、盖体2、底座3和阀体12。盖体2、本体1和底座3依次顺序连接。其中，盖体2与本体1之间的连接，可以是焊接、粘接或其他可以密封连接的方式；在本体1内部穿设有阀体12，并且阀体12可相对本体1转动；底座3与本体1之间可以是可拆卸连接，也可以是固定连接，优选方式为可拆卸连接，以便于拆卸检查阀体12、腔体，腔体包括例如处理腔15、试剂腔11等。
图4c为本发明实施例六的试剂盒的本体的俯视结构示意图。如图4c所示，所述盒体包括：多个试剂腔11。具体的，本体1底部朝向盖体2的一侧开设有若干个试剂腔11，通过向盖体2延伸的内壁相分隔。试剂腔11封装用于检测念珠菌的处理试剂和接收待测样本。这些试剂腔11可以分别用作：待测样本试剂腔、引物探针组合的试剂腔、扩增反应液试剂腔、洗涤液试剂腔和超声缓冲液试剂腔、也可用作预留腔和废液腔，这些试剂腔用于核酸提取纯化处理流程。在将引物探针组合与扩增反应液制成一个冻干球的情况下，也可以只采用一个试剂腔11作为扩增反应体系试剂腔。具体的，盒体内的多个试剂腔用于容置各项用于检测念珠菌的处理试剂，并且用于接收待测样本。用于检测念珠菌的处理试剂包括：实施例三的用于检测念珠菌的引物探针组合，以及实施例五的扩增反应液、洗涤液和超声缓冲液。其中，引物探针组合和扩增反应液属于用于检测念珠菌的扩增反应体系试剂。此外，还需空余出一定数量的试剂腔作为核酸提取纯化处理流程所需的废液腔、预留腔、体系腔等。
图4d为本发明实施例六的试剂盒的本体的立体仰视结构示意图，如图4c和图4d所示，本体1中心的中空柱状结构为阀体腔131，其贯通本体1的底部和顶部，且试剂盒的本体1底部朝向底座3的一侧还设有阀体活动腔132。盒体包括：反应腔14，反应腔14具体设于本体1侧壁。反应腔14用于与扩增反应系统一体机相适配，将待测样本被核酸提取纯化处理后的体系溶液输送至反应腔14之后，利用扩增反应系统一体机对体系溶液进行后续的核酸扩增反应和核酸检测。
图4e为本发明实施例的试剂盒的阀体的立体结构示意图，如图4e所示，阀体12包括：柱体121和与柱体121一体成型的流道切换机构122，流道切换机构122与柱体121之间也可采用能够使流道切换机构122随柱体121共同旋转的其他固定连接方式。当阀体12穿设于本体1内部时，具体的，阀体12的柱体121设置于阀体腔131内，流道切换机构122设于阀体活动腔132内，柱体121可在阀体腔131内沿阀体腔131的周向旋转，同时流道切换机构122在阀体活动腔132内同步旋转。
参考图4c和图4d，在每个试剂腔11的底部均设有导通部件，导通部件可为开设于试剂腔11底部的通孔111，当流道切换机构122旋转时，通过导通部件将试剂腔11与流道切换机构122的内部进行导通或关闭，具体导通过程在下文进行描述。
图4f为本发明实施例六的试剂盒的阀体的内部结构示意图。如图4f所示，阀体包括：可以与试剂腔11和反应腔14分别连通的处理腔15，处理腔15具体设于流道切换机构122内。柱体121包括：柱塞腔125和柱塞126。柱塞腔125为中空贯通结构，与处理腔15相连通，柱塞126设于柱塞腔125内并且柱塞126在柱塞腔125内可以沿柱塞腔125的轴向活动。
处理腔15设有进液流道151和出液流道152。进液流道151的进液口123设于流道切换机构122的一侧，出液流道152的出液口124设于流道切换机构122的另一侧。进液口123和出液口124即构成本发明的流道切换机构122设有的连通试剂腔11与处理腔15、反应腔14与处理腔15的输液口，输液口与导通部件相适配，即其连接方式能够形成密封不漏液且可使液体顺利通过的流道，通过沿周向旋转流道切换机构122，使输液口(进液口123和出液口124)分别与试剂腔11或反应腔14的导通部件对齐导通，以使试剂腔11或反应腔14分别与处理腔15相连通；其中，分别连通指同一时刻只有一个腔室与处理腔15是导通的，其他腔室则被流道切换机构122关断，关断即指输液口不与该腔室的导通部件对齐导通，也就是流道切换机构122转动使进液流道151和出液流道152的两者之一被打开，使进液口123和出液口124两者之一与试剂腔11或反应腔14的导通部件对齐导通，从而使试剂腔11或反应腔14与处理腔15相连通。导通部件包括：用于输送液体的通孔、导管等，例如试剂腔11底部的通孔111，反应腔14的连通至处理腔15的导管等。本发明实施例中，进液口123和出液口124均朝向盖体2延伸设置，也可采用其他设置形式。
本发明中，进液口123和出液口124相对设置，进液出液是根据处理流程而定义，在实际的机械结构中，进液口123和出液口124可以相互置换使用，即进液口也可作为出液口使用。例如，对于进液口123和出液口124，使两者之一与一个试剂腔11底部的通孔111对齐，则另一者被关闭，此时柱塞126向上运动，处理腔15压强减小，则此开口为进液口，对应流道为进液流道；若此时柱塞126向下运动，处理腔15压强减增大，则此开口为出液口，对应流道为出液流道。区分进液流道和出液流道是为了后续便于进一步阐明如何利用本发明的试剂盒进行核酸提取纯化处理，并不对本发明权利要求保护的技术方案构成限制。
当试剂腔11或反应腔14与处理腔15连通后，通过改变处理腔15的压强大小，以使处理腔15内流出液体进入试剂腔11或反应腔14或者从试剂腔11向处理腔15流入液体。
例如，利用阀体12的柱塞126在柱塞腔125内向上移动，减小处理腔15的压强，使得试剂腔11内的扩增反应液或其他液体通过进液流道151输送至处理腔15，在此过程中，流道切换机构122导通进液流道151并关闭出液流道152。或者，利用阀体12的柱塞126在柱塞腔125内向下移动，增大处理腔15的压强，使得处理腔15内的液体通过出液流道152输送至其他试剂腔11或反应腔14，在此过程中，流道切换机构122导通出液流道152并关闭进液流道151。
其中，可以通过将引物探针组合、扩增反应液、洗涤液等依次输送至处理腔15中转，将复溶后的引物探针混合液、扩增反应液和样本核酸溶液从处理腔15输送至体系腔，再由体系腔通过处理腔15输送至反应腔14，为后续扩增反应做好前置准备。这个部分将在说明书稍后详细解释，此处不再赘述。
可选地，处理腔15内可以设有生物体过滤机构。生物体过滤机构可采用微滤膜或者其他能够截留住菌体，供流体通过的滤膜。
图4g为本发明实施例六的试剂盒的盖体的拆分结构示意图，图4h为本发明实施例六的试剂盒的盖体的内部结构示意图。如图4g和图4h所示，在本发明的一种实施方式中，盖体2包括：上盖21和下盖22。
上盖21和下盖22相连接；上盖21可相对下盖22打开或关闭，在一种可能的方式中，上盖21与下盖22通过铰链铰接在一起。
上盖21设有向本体1凸起的中心柱211，中心柱211设于上盖21的内壁中部，且中心柱211为中空柱体，下盖22设有与中心柱211相匹配的中心孔221，中心柱211插入中心孔221以构成与柱塞腔125同轴连通的柱塞孔24(如图4i中所示)，柱塞126穿设于柱塞孔24和柱塞腔125内，外部驱动机构可以穿过柱塞孔24与柱塞126相连接，从而提供驱动力，驱动柱塞126向上运动或向下运动。
图4i为本发明实施例六的试剂盒的盖体和本体的内部结构示意图。如图4i所示，柱塞孔24与柱塞腔125同轴连通，柱塞126穿过柱塞孔24进入到柱塞腔125内，通过外部驱动机构驱动柱塞126在柱塞腔125内上移、下降改变柱塞腔125内压强，以完成液体的交换。本申请实施例六提供的试剂盒可以与扩增反应系统一体机的操作部连接以配合使用，具体的，扩增反应系统一体机预设有计算机程序，扩增反应一体机的第一操作部穿过柱塞孔24与柱塞126连接，驱动柱塞126上移或下降，第二操作部与阀体12的流道切换机构122连接，驱动流道切换机构122在阀体活动腔132内旋转。
再次参考图4g所示，可选地，在下盖22上对应每个试剂腔11设有对应的第一透气孔222，每个试剂腔11可设置一个或多个第一透气孔222。
上盖21设有第二透气孔212。第一透气孔222与第二透气孔212之间形成气体流道，方便试剂腔11与柱塞腔125进行气体的交换，改变柱塞腔125内的压强，进而改变处理腔15的压强。
上盖21与下盖22之间通过设有气体过滤机构(图中未示出)，以对第一透气孔222和第二透气孔212之间形成的气体流道进行过滤，仅允许气流通过，不允许气溶胶通过，滤除大气环境中的气溶胶，以避免在实验过程中对试剂腔11内的液体造成污染，影响实验结果。
如图4h所示，可选地，下盖22设有朝向上盖21延伸的凸台223，凸台223设于下盖22的内壁外周，具体的，沿中心孔221和中心柱211的外周设置，上盖21设有环绕凸台223的环筋213，凸台223与环筋213相配合以使上盖21和下盖22之间密封。
如图4h所示，可选地，中心柱211与中心孔221之间设有第一密封机构231；第一密封机构231可以是中心柱211本身的结构，也可以是单独的部件。
凸台223与环筋213之间设有第二密封机构232；第二密封机构232可以是凸台223本身的结构，也可以是单独的部件。
凸台223与环筋213环绕盖体2内部空间外周，构成了试剂盒的外围第一层密封设置机构，中心柱与211中心孔221环绕在轴心周围，并且环绕在凸台223与环筋213构成的外围第一层密封设置机构之内，构成了试剂盒的内部第二层密封设置机构，第一密封机构231和第二密封机构232形成内外两层密封，保证了盖体2、本体1的内部密封性，有效防止外部污染。
此外，还可以在凸台223外围围设密封膜(图中未示出)，密封膜覆盖在第一透气孔222上，保证试剂盒在未被使用之前，试剂盒的盒体内部各种试剂的干净无污染，当试剂盒被使用时，只需打开上盖21，撕掉第一透气孔222上的密封膜即可。
图4j为本发明实施例六的试剂盒的本体和底座的内部结构示意图。如图4j所示，本体1的底部设有卡槽16，底座3上设有卡扣36，卡槽16与卡扣36相配合，使本体1和底座3之间可拆卸连接。这样设计的好处是，一方面可以保证本体1与底座3连接稳固，连接方便，另一方面可以通过拆卸底座3来检查本体1、阀体12的情况，便于更换损坏的阀体12或本体1。
如图4c所示，本体1内的多个试剂腔11可分别用作待测样本试剂腔、引物探针组合的试剂腔、扩增反应液试剂腔、洗涤液试剂腔、超声缓冲液试剂腔以及其他用途的试剂腔，以存放核酸提取纯化及扩增反应所需的各类试剂。如前，试剂盒的处理腔15主要作为液体中转腔室，例如将待测样本试剂输入处理腔15，再输出至废液腔以完成菌体和废液的分离，将洗涤液输入处理腔15再输出废液腔以完成清洗。反应腔14接收存储待测样本经过核酸提取纯化处理后的体系溶液，之后由扩增反应系统一体机对体系溶液进行扩增反应和检测分析。体系腔则作为混合溶液的腔室，进行最终溶液的混合，例如可以利用柱塞126反复升降，使溶液在体系腔进行混合，之后输送至反应腔14。体系腔可以为单独腔室，也可利用扩增反应液试剂腔作为体系腔。
进一步，本发明实施例的试剂盒，还包括：废液腔和预留腔；
废液腔和预留腔通过出液流道152与处理腔15相连通；
废液腔用于容置待测样本清洗后的废液；
预留腔用于容置菌体破碎后得到的样本核酸溶液。
其中，废液腔存储用于洗涤液清洗待测样本后的废液，也可存储待测样本初次进入处理腔15后过滤得到的废液。预留腔作为可选腔体，可预留也可不用。预留腔主要作为有特殊混合要求、需要中转的中间步骤腔室，例如超声波处理或者混合引物探针溶剂等。可采用某个空余的未被占用的试剂腔11作为废液腔或预留腔。
具体地，试剂腔11可预先放置扩增反应的所需试剂，也可根据实际情况进行调整。在本发明实施例中，引物探针试剂腔容置有引物探针组合冻干球，以扩增反应液试剂腔作为体系腔并放置扩增反应液冻干球，以洗涤液试剂腔作为清洗腔并放置洗涤液，以超声缓冲液试剂腔作为缓冲腔并放置超声缓冲液。其中，引物探针组合和扩增反应液被配制为冻干球，以便于在试剂盒内保存，在需要使用试剂盒时，可以利用预先封装于试剂盒内的复溶试剂，对冻干球进行复溶。
当使用本发明实施例的试剂盒进行核酸提取纯化时，按照如下流程进行：
步骤S1，打开试剂盒的盖体2的上盖21，将待测样本加入待测样本试剂腔，将盖体2盖合在本体1，将试剂盒放入扩增反应系统一体机内。扩增反应系统一体机是用于扩增反应的集成系统一体机，由扩增反应系统一体机对待测样本经过核酸提取纯化处理后的体系溶液进行扩增反应和检测分析。
其中，待测样本可以为：将收集到的痰液按照1～4倍比例加入4％NaOH溶液或0.1％DTT溶液至痰液样本中，剧烈震荡5min，室温静置30min左右，完全液化所得。扩增反应系统一体机预先设置扩增反应程序，并设有与阀体12和柱塞126连接的操作部，根据预设程序控制阀体12的旋转运动和柱塞126的升降运动。
步骤S2，通过旋转阀体12带动流道切换机构122旋转，使出液流道152与两孔池导通，柱塞126向下运动至极限位置，以排出柱塞腔125内的气体。其中，可以其中某个空闲试剂腔11作为两孔池，在其设置排气孔，以进行排气。
步骤S3，旋转流道切换机构122，使进液流道151与待测样本试剂腔导通，此时流道切换机构122关断了出液流道152，即进液流道151与出液流道152在同一时间只能有一个导通，另一个则关闭；柱塞126向上运动，处理腔15和柱塞腔125内压强减小，大气压通过第一透气孔222和第二透气孔212构成的气体通道，将待测样本试剂腔内的待测样本试剂输送至处理腔15和柱塞腔125内。此后各步骤中，均是进液流道151与出液流道152在同一时间只能有一个导通，另一个则关闭，并且，通过柱塞126上升下降改变压强以完成进液或者出液，为简便起见，后续步骤不再赘述。
步骤S4，旋转流道切换机构122，使出液流道152与废液腔导通，此时流道切换机构122关断了进液流道151，柱塞126向下运动，处理腔15内压强增大，将处理腔15和柱塞腔125内的待测样本试剂输送至废液腔，此时，待测样本试剂内的菌体被截留在设置于处理腔15内的生物体过滤机构，例如微滤膜，剩余废液则进入废液腔。
步骤S5，旋转流道切换机构122，使进液流道151与洗涤液试剂腔的通孔对齐导通，此时关闭出液流道152，柱塞126向上运动，将洗涤液试剂输送至处理腔15。
步骤S6，旋转流道切换机构122，使出液流道152与废液腔的通孔对齐导通，柱塞126向下运动，截留在微滤膜上的待测样本内的菌体被清洗，且洗涤液被推入废液腔。
步骤S7，重复步骤S5和S6若干次，以将菌体清洗干净。
步骤S8，旋转流道切换机构122，使进液流道151与超声缓冲液试剂腔的通孔对齐导通，柱塞126向上运动，将超声缓冲液吸入柱塞腔125和处理腔15。
步骤S9，旋转流道切换机构122，使出液流道152与废液腔的通孔对齐导通，柱塞126向下运动一定程度，一定程度是指，柱塞126可以不下降到柱塞腔125底部，以使处理腔15内充有超声缓冲液，处理腔15内可以全充满超声缓冲液，也可以不充满超声缓冲液。
步骤S10，利用扩增反应系统一体机对处理腔15进行超声震动处理，以破碎微滤膜上的菌体。
步骤S11，旋转流道切换机构122，使出液流道152与引物探针试剂腔的通孔对齐导通，柱塞126向下运动，将菌体破碎后得到的核酸溶液推出，复溶引物探针混合液冻干球，然后柱塞126上移、下降重复多次混匀，最后柱塞126上移，将复溶后的引物探针混合液和核酸溶液全部吸入处理腔15和柱塞腔125内。
步骤S12，旋转流道切换机构122，使出液流道152与体系腔的通孔对齐导通，柱塞126向下运动，将复溶后的引物探针混合液和核酸溶液推出，复溶扩增反应液冻干球，然后柱塞126上移、下降重复多次混匀，最后柱塞126上移，将复溶后的引物探针混合液、扩增反应液和核酸溶液全部吸入处理腔15和柱塞腔125内。
步骤S13，旋转流道切换机构122，使出液流道152与反应腔14的导管对齐导通，柱塞126向下运动，将步骤S12制得的体系溶液推入反应腔14内，完成待测样本的核酸提取纯化。
在步骤S13结束后，扩增反应系统一体机再对反应腔14内的待测样本进行扩增与检测的后续流程。
本发明实施例六的试剂盒可采用检测念珠菌的引物探针组合构成的试剂，并将试剂预先封装于试剂盒内，封装后的试剂盒整体作为产品进行市场销售，使得用户在进行念珠菌检测时，省去了大量配制试剂、提纯样本的重复工作，能够大批量进行一种或多种念珠菌的同时检测。
具体地，可将根据本发明实施例一所述的引物组和实施例二所述的探针、或者实施例三所述的引物探针组合制成的试剂预先封装于试剂盒的试剂腔11，或者，将本发明实施例四的引物探针试剂预先封装于试剂盒的试剂腔11。
其中，可以对引物探针组合拆分组合使用，以制备不同种类的念珠菌检测试剂盒。例如，如果是针对热带念珠菌制作试剂盒，则在试剂盒封装根据本发明实施例三中的引物探针组合的组合7至9中的任意一组制备的试剂。对于白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌的任意组合，根据与其对应的引物探针组合中的组合(组合1至16)进行组合，可以得到针对该菌种组合的引物探针组合以及对应的试剂盒。其具体原理与实施例三的白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌六种念珠菌的检测组合原理相同，此处不再赘述。根据实施例三，本发明实施例六的试剂盒可制成针对不同念珠菌组合的一共63种试剂盒产品，以满足市场对不同念珠菌的检测需求。
具体地，为了使引物探针试剂在商品化试剂盒中便于保存，封装采用两套技术方案，其中一个技术方案是将引物探针组合和扩增反应液被配制为冻干球以便于在试剂盒内保存。其中，引物探针组合和扩增反应液被合成配制为一个冻干球并被容置于一个试剂腔11，以节省试剂盒空间，使试剂盒有更多空余试剂腔11作为预留腔或废液腔等，其中合成配制为一个冻干球可进一步减少核酸提取纯化流程，例如减少扩增反应液单独的复溶步骤，减少检测时间；或者，引物探针组合和扩增反应液被分别配制为两个冻干球并被容置于一个试剂腔11，以节省试剂盒空间，使试剂盒有更多空余试剂腔11作为预留腔或废液腔等；或者，引物探针组合和扩增反应液被分别配制为两个冻干球并被分别容置于两个试剂腔11，在检测菌种组合较多，引物探针组合较多的情况下，避免交叉反应带来的误差，提升检测精度。封装的另一个技术方案是，对于试剂腔11与外界的两个通道，一个通道是设于试剂腔11底部的用于导通处理腔15的通孔，未使用状态时，可以使流道切换机构122的输液口不与该导通通孔对齐导通，从而关断试剂腔11与外部的接触；另一通道是试剂腔11的第一透气孔222，通过第一透气孔222和第二透气孔212之间的气体过滤机构关断试剂腔11与外部的接触。此外，设于第一透气孔222的密封膜以及上盖与下盖之间的双层密封机构在试剂盒未使用时，进一步起到密封作用，提升试剂腔11内各类试剂的保存时间。
此外，当待测样本来源如果为血液样本时，对血液样本的核酸提取纯化流程如上，并且可以在步骤S7之后，步骤S8之前，增加处理步骤S71，步骤S71为，旋转流道切换机构122，使进液流道151与红细胞裂解液试剂腔的通孔对齐导通，柱塞126向上运动，将红细胞裂解液吸入柱塞腔125和处理腔15，通过增加步骤71可以方便对血液样本进行后续的裂解处理。其中，将一个空闲试剂腔11作为红细胞裂解液试剂腔。
实施例七
本发明实施例六为本发明实施例一至六的验证实验，具体包括如下(一)至(八)项内容：
(一)PCR扩增体系和反应条件的确认
(1)扩增体系
利用正交试验的方法，通过大量实验测试不同引物探针浓度组合，以及扩增反应液中各组分浓度，最终确定PCR扩增反应体系如下表1所示。
表1扩增反应体系
(2)扩增条件
通过大量实验测试，对退火时间、退火温度、循环数等条件进行优化，最终确定PCR扩增条件如下表2所示。
表2扩增条件
(二)交叉反应
选择与检测目标种属相近、生存环境相同、易引起相同或相似的临床症状微生物、感染部位附近的定植菌等，包括烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌、毛霉菌、耶氏肺孢子菌、新生隐球菌、马尔尼菲蓝状菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌等作为特异性评估样本，选择106CFU/mL以上浓度进行交叉反应的验证。图1a为本发明实施例的交叉反应结果的扩增曲线示意图，图1b为本发明实施例的交叉反应结果的熔解曲线示意图，如图1a、1b所示，交叉反应的结果证明该引物、探针及引物探针组合具有较好的特异性，能够将目标与非目标微生物的核酸有效区分开。
(三)液体体系冻干
由于冻干体系具有保存稳定性好、方便运输等优势，本发明实施例采用冻干工艺，将扩增反应液试剂(PCR mix)、引物探针试剂冻干成为冻干球。冻干球使用时，利用复溶试剂将其复溶。其中，复溶试剂可以与待测样本混合在一起。复溶后加入模板进行扩增。复溶试剂也可采用实施例五的超声缓冲液作为复溶试剂。同时，配制液体体系，与冻干体系比较，二者无明显差异，说明本发明已经成功将扩增液体体系转化到了冻干体系中。其中，最低检出限浓度的冻干球和液体扩增试剂结果如下表3所示。
表3冻干体系与液体体系比较
(四)提取方法比较
由于不同的提取方法对下游检测会产生很大影响，故对提取方式进行了对比。选取了市面上三款用于真菌提取的其他商品化试剂盒，同时比对本发明实施例的试剂盒进行评估，采用超声方式对待测样本进行处理。具体如下：
以白色念珠菌为代表，取含白色念珠菌的菌悬液1mL；
对于其他商品化试剂盒的提取方式参照说明书进行操作，提取后基因组DNA暂存待用；按照常规条件配制扩增体系，以上述提取的基因组DNA为模板，在PCR扩增仪器上进行扩增；
对于本发明实施例的试剂盒，取1mL菌悬液加入到本发明实施例的试剂盒的待测样本试剂腔中，洗涤液加入洗涤液试剂腔，扩增反应液试剂腔和引物探针试剂腔分别加入扩增反应液和引物探针试剂；其中，扩增反应液和引物探针试剂采取上述(三)液体体系冻干的冻干工艺制备；将本发明实施例的试剂盒放入扩增反应系统一体机中，从而实现样本进结果出。比较结果详见下表4，结果表明采用本发明实施例的试剂盒，整体检测结果优于其他商品化试剂盒。
表4不同提取方式结果
(五)灵敏度检测
选取初始浓度为105CFU/PCR的白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌菌悬液梯度稀释为104CFU/PCR、103CFU/PCR、102CFU/PCR、101CFU/PCR、100CFU/PCR，作为灵敏度评估的模板，每个梯度重复2次。用上述(三)液体体系冻干的冻干工艺制备的引物探针试剂和扩增反应液试剂的冻干球和本发明实施例的试剂盒进行验证。
图2a为本发明实施例的近平滑念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图，图2b为本发明实施例的近平滑念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图，图2c为本发明实施例的光滑念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图，图2d为本发明实施例的光滑念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图，图2e为本发明实施例的白色念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图，图2f为本发明实施例的白色念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图，图2g为本发明实施例的热带念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图，图2h为本发明实施例的热带念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图，图2i为本发明实施例的克柔念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图，图2j为本发明实施例的克柔念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图，图2k为本发明实施例的耳念珠菌的灵敏度检测的扩增曲线示意图，图2l为本发明实施例的耳念珠菌的灵敏度检测的熔解曲线示意图，如图2a至图2l所示，采用本发明实施例的技术方案可检测100CFU/PCR的白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠。
(六)最低检出限检测
取白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌菌悬液，梯度稀释到100CFU/PCR，利用本发明实施例的试剂盒以及引物探针实际进行实验，20次重复检测。评估标准熔解曲线全部有对应的峰，检出率100％，Ct值的CV小于5％，详见下表5。
表5最低检出限
(七)临床样本检测
每种病原收集5例阳性临床血液样本或者痰液样本或者其他样本(此处对样本的形式不作限制，只要是阳性样本即可)，按照下面的方式进行检测。
将收集到的痰液，按照1～4倍比例加入4％NaOH溶液或0.1％DTT溶液，剧烈震荡5min，室温静置30min左右。完全液化后，吸取1mL液体样本，加入到封装好冻干球试剂的卡盒中，使用本发明实施例的引物探针试剂和试剂盒直接进行检测。
图3a为本发明实施例的光滑念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图，图3b为本发明实施例的光滑念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图，图3c为本发明实施例的克柔念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图，图3d为本发明实施例的克柔念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图，图3e为本发明实施例的近平滑念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图，图3f为本发明实施例的近平滑念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图，图3g为本发明实施例的热带念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图，图3h为本发明实施例的热带念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图，图3i为本发明实施例的白色念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图，图3j为本发明实施例的白色念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图，图3k为本发明实施例的耳念珠菌的临床样本检测的扩增曲线示意图，图3l为本发明实施例的耳念珠菌的临床样本检测的熔解曲线示意图，可根据PCR扩增曲线及熔解曲线判定阴阳性，具体见下表6以及图3a至3l。
表6临床样本检测结果
(八)试剂盒保存稳定性测试
将本发明实施例的引物探针试剂、扩增反应液试剂等经过冻干工艺后形成的冻干球分别置于本发明实施例的试剂盒的各个试剂腔中，常温保存。其中，配制至少六种引物探针试剂，分别对应白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌。
以10CFU/μL的白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和耳念珠菌的核酸等比例混合作为模板。将组建完毕的试剂盒按保存条件(室温)放置，分别取0天、1个月、6个月、1年、1年3个月、1年6个月、1年9个月、2年和2年3个月的卡盒进行保存期试验。保存期检测结果如表7所示。
保存期 白色念珠菌 光滑念珠菌 热带念珠菌 近平滑念珠菌 克柔念珠菌 耳念珠菌
第0天 + + + + + +
1个月 + + + + + +
6个月 + + + + + +
1年 + + + + + +
1年3个月 + + + + + +
1年6个月 + + + + + +
1年9个月 + + + + + +
2年 + + + + + +
2年3个月 + + + + + +
表7保存期试验结果
可知，卡盒按规定条件保存，在不同保存期检测均为阳性，结果表明采用该试剂盒的保存期为至少2年。
在本申请各个实施例中，各过程的序号的大小并不意味着顺序的先后，各过程的顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请的实施过程构成任何限定。
另外，本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以上所述的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本申请的具体实施方式而已，并不用于限定本申请的保护范围，凡在本申请的技术方案的基础之上，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本申请的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种用于检测念珠菌的试剂盒，其特征在于，包括：盒体和用于检测念珠菌的处理试剂；
所述用于检测念珠菌的处理试剂封装于所述盒体内；
所述盒体设置为：能够通过改变所述盒体内的压强以推动所述用于检测念珠菌的处理试剂流动并对待测样本进行核酸提取纯化处理。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述盒体包括：多个试剂腔、反应腔和阀体；
所述阀体包括与所述试剂腔和所述反应腔分别连通的处理腔；
所述多个试剂腔用于容置所述用于检测念珠菌的处理试剂和接收所述待测样本；
所述阀体设置为：能够改变所述处理腔内的压强，使多个所述试剂腔内的所述用于检测念珠菌的处理试剂依次输送至所述处理腔内对所述待测样本进行核酸提取纯化处理，并使所述待测样本被核酸提取纯化处理后的体系溶液输送至所述反应腔。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测念珠菌的处理试剂包括：用于检测念珠菌的引物探针组合、扩增反应液、洗涤液和超声缓冲液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，
所述用于检测念珠菌的引物探针组合包括：用于检测念珠菌的引物组和探针；
其中，用于检测念珠菌的引物组包括：引物组1、引物组2、引物组3、引物组4、引物组5、引物组6、引物组7、引物组8、引物组9、引物组10、引物组11、引物组12、引物组13、引物组14、引物组15、引物组16、引物组17、引物组18中的一种或多种；
所述引物组1包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
所述引物组2包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
所述引物组3包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；所述引物组4包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；所述引物组5包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；所述引物组6包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；所述引物组7包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；所述引物组8包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；所述引物组9包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；所述引物组10包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；所述引物组11包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列；所述引物组12包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列；所述引物组13包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列；所述引物组14包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列；所述引物组15包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；所述引物组16包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列；所述引物组17包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列；
所述引物组18包括的两项引物分别具有：
如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列；
其中，用于检测念珠菌的探针包括：探针1、探针2、探针3、探针4、探针5、探针6、探针7、探针8、探针9、探针10、探针11、探针12、探针13、探针14、探针15、探针16、探针17、探针18中的一种或多种；
所述探针1具有：
如SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列；
所述探针2具有：
如SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列；
所述探针3具有：
如SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列；
所述探针4具有：
如SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列；
所述探针5具有：
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所述探针6具有：
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所述探针7具有：
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所述探针8具有：
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所述探针9具有：
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所述探针10具有：
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所述探针11具有：
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所述探针12具有：
如SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列；
所述探针13具有：
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所述探针14具有：
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所述探针15具有：
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所述探针16具有：
如SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列；
所述探针17具有：
如SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列；
所述探针18具有：
如SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列
其中，用于检测念珠菌的引物探针组合包括：组合1、组合2、组合3、组合4、组合5、组合6、组合7、组合8、组合9、组合10、组合11、组合12、组合13、组合14、组合15、组合16、组合17、组合18中的一种或多种；
所述组合1包括：所述引物组1和所述探针1；
所述组合2包括：所述引物组2和所述探针2；
所述组合3包括：所述引物组3和所述探针3；
所述组合4包括：所述引物组4和所述探针4；
所述组合5包括：所述引物组5和所述探针5；
所述组合6包括：所述引物组6和所述探针6；
所述组合7包括：所述引物组7和所述探针7；
所述组合8包括：所述引物组8和所述探针8；
所述组合9包括：所述引物组9和所述探针9；
所述组合10包括：所述引物组10和所述探针10；
所述组合11包括：所述引物组11和所述探针11；
所述组合12包括：所述引物组12和所述探针12；
所述组合13包括：所述引物组13和所述探针13；
所述组合14包括：所述引物组14和所述探针14；
所述组合15包括：所述引物组15和所述探针15；
所述组合16包括：所述引物组16和所述探针16；
所述组合17包括：所述引物组17和所述探针17；
所述组合18包括：所述引物组18和所述探针18。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合和所述扩增反应液被配制为冻干球；
其中，
所述用于检测念珠菌的引物探针组合和所述扩增反应液被合成配制为一个冻干球并被容置于一个所述试剂腔；
或者，所述用于检测念珠菌的引物探针组合和所述扩增反应液被分别配制为两个冻干球并被容置于一个所述试剂腔；
或者，所述用于检测念珠菌的引物探针组合和所述扩增反应液被分别配制为两个冻干球并被分别容置于两个所述试剂腔。
6.根据权利要求2至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述阀体包括：柱体和与所述柱体连接的流道切换机构，所述处理腔设于所述流道切换机构内，且所述流道切换机构上设有连通至所述处理腔的输液口；
所述试剂腔和所述反应腔均设有与所述输液口相适配的导通部件；
所述流道切换机构旋转使所述输液口分别与所述试剂腔或所述反应腔的导通部件对齐，以使所述试剂腔或所述反应腔分别与所述处理腔相连通。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述柱体包括：柱塞腔和设于所述柱塞腔内的柱塞；
所述柱塞腔与所述处理腔连通，所述柱塞在所述柱塞腔内沿所述柱塞腔的轴向活动，以改变所述处理腔内的压强。
8.根据权利要求2至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述处理腔内设有生物体过滤机构。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述盒体包括：盖体、本体和底座；
所述盖体、所述本体和所述底座依次顺序连接；
所述试剂腔和所述反应腔均开设于所述本体内，所述阀体穿设于所述本体内。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述盖体包括：上盖和与所述上盖相连接的下盖；
所述上盖设有中心柱，所述下盖设有与所述中心柱相配合的中心孔，所述中心柱插入所述中心孔以构成与阀体内的柱塞腔同轴连通的柱塞孔，阀体内的柱塞穿设于所述柱塞孔和所述柱塞腔内。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述下盖上设有与所述试剂腔对应的的第一透气孔；
所述上盖设有第二透气孔；
所述上盖与所述下盖之间设有气体过滤机构。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述下盖上设有凸台，所述上盖上设有与所述凸台相配合的环筋，所述凸台与所述环筋相配合以使所述上盖和所述下盖之间密封；
其中，所述中心柱与所述中心孔之间设有第一密封机构；
所述凸台与所述环筋之间设有第二密封机构。
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