CN111398008A - 一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，包括以下步骤：步骤1,筛板分隔浓缩容器内空间为部分相通，且分别向外连通的两部分，一端为上开口，一端为下开口；步骤2,自上开口向筛板一侧加入待浓缩样本，并充满下开口一侧空间；步骤3,自上开口向容器加入高吸水材料；步骤4,给予待浓缩样本自上开口一侧向下开口一侧的持续的力，直至筛板吸水材料一侧可流动液体吸收完毕；步骤5,收集排出的剩余液体；本发明的浓缩速度快，20毫升浓缩至1ml，仅需3‑5分钟，充分利用了超吸水材料的快速吸水能力至浓缩过程；过量超吸水材料可以加速吸水能力，由于超吸水材料价格低，超量造成的使用成本上涨有限。
Description
技术领域
本发明属于建筑技术领域，尤其涉及一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法。
背景技术
生物大分子在制备过程中，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。
常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩：
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
缺点：不适用于不耐热细胞外囊泡。
2、空气流动蒸发浓缩：
空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的。
缺点：此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法：
生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
缺点：浓缩物浓度受低共熔浓度和冰晶可分离程度的制约，成本高。
4、吸收法：
通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
缺点：使用超滤膜或者透析膜包裹待浓缩，浓缩速度慢，浓缩量不易控制。
5、超滤法：
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下(氮气压或真空泵压)通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最小分子量值)等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。
缺点：使用成本高，生产技术由国外公司垄断。
现有吸收浓缩法，相较于其他浓缩办法超滤材料成本低廉，一种办法是将超吸水材料直接投入待浓缩样本中；其缺点是：1)浓缩终点不易控制，2)难于浓缩至固定体积；3)超量超吸水材料投放会导致过度浓缩而损失样本，4)浓缩后吸水材料与浓缩液不易分离；5)对于含有盐的溶液浓缩速度慢；
另一种办法是，将超吸水材料包裹于超滤膜袋中；其缺点是：1)由于在无压力条件下，超滤膜水通量低，导致浓缩过程缓慢，无法充分发挥超吸水材料快速吸水的性能，通常利用超吸水材料饱和吸水浓缩需要1小时以上，2)浓缩率有限，一般只能浓缩3-4倍，3)超滤膜包裹吸水材料，导致吸水材料吸水膨胀空间受限，从而限制了浓缩能力。
针对以上问题，故，有必要对其进行改进。
发明内容
本发明是为了克服上述现有技术中的缺陷，提供一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法。
为了达到以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，包括以下步骤：
步骤1,筛板分隔浓缩容器内空间为部分相通，且分别向外连通的两部分，一端为上开口，一端为下开口；
步骤2,自上开口向筛板一侧加入待浓缩样本，并充满下开口一侧空间；
步骤3,自上开口向容器加入高吸水材料；
步骤4,给予待浓缩样本自上开口一侧向下开口一侧的持续的力，直至筛板吸水材料一侧可流动液体吸收完毕；
步骤5,收集排出的剩余液体。
作为本发明的一种优选方案，所述吸水材料相对于筛板的对侧剩余液体为浓缩后包含细胞外囊泡的液体。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤4中，给予待浓缩样本相向于吸水材料对侧空间的持续的力的加速度为40g～320g，持续时间1～3分钟。
作为本发明的一种优选方案，所述待浓缩样本包括尿液小细胞外囊泡、体外培养细胞培养上清小细胞外囊泡、大肠杆菌外膜囊泡。
作为本发明的一种优选方案，所述过滤筛板的间隔疏水筛板孔径大于2um，小于超吸水材料尺寸。
作为本发明的一种优选方案，所述浓缩容器中内超吸水材料为超吸水树脂颗粒、超吸水纤维。
作为本发明的一种优选方案，所述浓缩容器具有两个独立向外联通的且可控制开闭的上开口和下开口，上开口上可拆式装配有上盖，下开口上可拆式装配有下盖。
作为本发明的一种优选方案，所述浓缩容器包括浓缩管体、上端口和上端口连接部；上端口连接部用于连接浓缩管体和上端口，上端口的外径大于浓缩管体的外径，上端口连接部呈喇叭状结构。
作为本发明的一种优选方案，所述浓缩容器的体积为5ml～25ml。
作为本发明的一种优选方案，所述浓缩容器中的吸水材料吸水量大于可加入的液体体积。
本发明的有益效果是：
1、浓缩速度快，20毫升浓缩至1ml，仅需3-5分钟，充分利用了超吸水材料的快速吸水能力至浓缩过程；过量超吸水材料可以加速吸水能力，由于超吸水材料价格低，超量造成的使用成本上涨有限；
2、定量浓缩，浓缩终液体积可控；
3、使用方便，无需配置专用昂贵设备，可以重力或者低速离心即可。
附图说明
图1为本发明实施例的浓缩容器结构示意图；
图2为本发明实施例的浓缩容器结构分解图；
图3为本发明实施例1的浓缩纯化后尿液小细胞外囊泡操作步骤图；
图4为本发明实施例1的浓缩前尿液细胞外囊泡透射电镜形态图；
图5为本发明实施例1的浓缩后尿液细胞外囊泡透射电镜形态图；
图6为本发明实施例1的浓缩前尿液细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
图7为本发明实施例1的浓缩后尿液细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
图8为本发明实施例2的浓缩纯化后大鼠血浆小细胞外囊泡操作步骤图；
图9为本发明实施例2的浓缩前大鼠血浆小细胞外囊泡透射电镜形态图；
图10为本发明实施例2的浓缩后大鼠血浆小细胞外囊泡透射电镜形态图；
图11为本发明实施例2的浓缩前大鼠血浆小细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
图12为本发明实施例2的浓缩后大鼠血浆小细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
图13为本发明实施例3的浓缩纯化后大鼠血浆小细胞外囊泡操作步骤图；
图14为本发明实施例3的浓缩前大鼠血浆小细胞外囊泡透射电镜形态图；
图15为本发明实施例3的浓缩后大鼠血浆小细胞外囊泡透射电镜形态图；
图16为本发明实施例3的浓缩前大鼠血浆小细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
图17为本发明实施例3的浓缩后大鼠血浆小细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
图中附图标记：浓缩容器1，上开口2，下开口3，上盖4，下盖5，过滤筛板6，离心管7，填料8，浓缩管体10，上端口11，上端口连接部12。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
如图1-2所示，是本发明的一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩的浓缩容器结构示意图。
如图所示，浓缩容器1具有两个独立向外联通的且可控制开闭的上开口2和下开口3，上开口2上可拆式装配有上盖4，下开口3上可拆式装配有下盖5。
浓缩容器1包括浓缩管体10、上端口11和上端口连接部12；上端口连接部12用于连接浓缩管体10和上端口11，上端口11的外径大于浓缩管体10的外径，上端口11连接部呈喇叭状结构；方便过滤筛板6固定；
其中，过滤筛板6装配于浓缩容器1内，过滤筛板6将浓缩容器1分割为两部分；分别为Va空间和Vb空间；过滤筛板6的间隔疏水筛板孔径为2um，小于填料的尺寸。
具体的，过滤筛板6与浓缩管体10的横截面体同，可以为低蛋白吸附，疏水筛板以减低吸附。
一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，包括以下步骤：
步骤1：提供待浓缩样本；其中待浓缩样本包括尿液小细胞外囊泡、大鼠血浆小细胞外囊泡、大肠杆菌外膜囊泡；
步骤2：准备浓缩容器1，体积为V，并且封闭浓缩容器底部，在浓缩容器内装配过滤筛板6；过滤筛板6将容器内分割为两部分，分别为Va空间和Vb空间；Va空间和Vb空间的位置可调；
步骤3：控制过滤筛板位置，调整过滤筛板Vb侧空间至预定浓缩体积V1＝Vb，则另一侧Va空间体积为(V-V1)＝Va；
步骤4：将待浓缩样本加入至浓缩容器中，使待浓缩样本中杂质部分或全部保留在过滤筛板之上；待浓缩样本或者已纯化细胞外囊泡样本V3<＝Va，杂质部分或全部保留在过滤筛板表面之上时，流穿液即为提取到包含细胞外囊泡的液体；
步骤5：将浓缩容器套接于离心管7中，在驱动力作用下，通过离心管离心；液体由Va空间向Vb空间运动并将Vb空间填满，使得浓缩样本至浓缩容器底部；超出部分样本位于Va空间内；其中，浓缩容器中内填料8为高吸水材料，具体的，高吸水材料为超吸水树脂颗粒、超吸水纤维等；其中，离心管离心加速度为40g～320g，持续时间1～3分钟。
步骤6：向浓缩容器内加入填料，在驱动力作用下，通过离心管离心；液体向Vb空间运动的力始终保持，直至Va空间可流动液体消失，过滤筛板上部液体吸收完，停止驱动力；其中，离心管离心加速度为40g～320g，持续时间1～5分钟。
步骤7：打开浓缩容器底部下口，通过离心管离心，收集排出浓缩液体；b侧空间内体积内体积Vb液体即为浓缩后样本，开放b侧外通出口，排出浓缩后液体；在此过程中始终保持a侧的液体不与b侧超吸水材料有直接接触。
实施例1
如图3所示，本实施例提供的一种浓缩纯化后尿液小细胞外囊泡操作步骤图；
具体实施方式为：本实施例中的浓缩容器1的总体积10ml；
1、调整过滤筛板6至下部空间体积为1ml，自上口，加入10ml已纯化尿液细胞外囊泡样本；
2、封闭浓缩容器1的下开口3，将待浓缩样本40g离心3min,将样本至浓缩管下部；
3、向上部中加入超吸水树脂颗粒，浓缩管继续持续40g离心>5min，直至筛板上部液体吸收完；
4、打开浓缩管下口，40g离心1min收集排出浓缩液体；
图4为本发明实施例1的浓缩前尿液细胞外囊泡透射电镜形态图；
图5为本发明实施例1的浓缩后尿液细胞外囊泡透射电镜形态图；
图6为本发明实施例1的浓缩前尿液细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
图7为本发明实施例1的浓缩后尿液细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
表1纯化尿液细胞外囊泡颗粒回收
表2纯化尿液细胞外囊泡蛋白回收
实施例2
如图8所示，本实施例提供的一种浓缩纯化后大鼠血浆小细胞外囊泡操作步骤图；
具体实施方式为：本实施例中的浓缩容器1的总体积5ml；
1、调整过滤筛板6至下部空间体积为0.2ml，自上口，加入2ml纯化大鼠血浆细胞外囊泡样本
2、封闭管底出口的情况下，将待浓缩样本160g离心1min,将样本至浓缩管下部
3、向上部中加入超吸水树脂纤维织物，浓缩管继续持续160g离心>1min，直至筛板上部液体吸收完；
4、打开浓缩管下口，160g离心1min，收集排出浓缩液体；
图9为本发明实施例2的浓缩前大鼠血浆小细胞外囊泡透射电镜形态图；
图10为本发明实施例2的浓缩后大鼠血浆小细胞外囊泡透射电镜形态图；
图11为本发明实施例2的浓缩前大鼠血浆小细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
图12为本发明实施例2的浓缩后大鼠血浆小细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
表3纯化大鼠血浆小细胞外囊泡浓缩颗粒回收
表4纯化大鼠血浆小细胞外囊泡浓缩蛋白回收
实施例3
如图13所示，本实施例提供的一种浓缩纯化后大鼠血浆小细胞外囊泡操作步骤图；
具体实施方式为：本实施例中的浓缩容器1的总体积25ml；
1、调整过滤筛板6至下部空间体积为0.5ml，自上口，加入20ml纯化E.coli外膜囊泡样本；
2、封闭管底出口的情况下，将待浓缩样本320g离心1min,将样本至浓缩管下部；
3、向上部中加入超吸水树脂颗粒，浓缩管继续持续320g离心>1min，直至筛板上部液体吸收完；
4、打开浓缩管下口，320g离心1min收集排出浓缩液体。
图14为本发明实施例3的浓缩前大鼠血浆小细胞外囊泡透射电镜形态图；
图15为本发明实施例3的浓缩后大鼠血浆小细胞外囊泡透射电镜形态图；
图16为本发明实施例3的浓缩前大鼠血浆小细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
图17为本发明实施例3的浓缩后大鼠血浆小细胞外囊泡纳米颗粒追踪检测粒径分布图；
表5大肠杆菌外膜囊泡浓缩颗粒回收
表6大肠杆菌外膜囊泡蛋白回收
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现；因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
尽管本文较多地使用了图中附图标记：浓缩容器1，上开口2，下开口3，上盖4，下盖5，过滤筛板6，离心管7，填料8，浓缩管体10，上端口11，上端口连接部12等术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。
Claims (10)
1.一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1,筛板分隔浓缩容器内空间为部分相通，且分别向外连通的两部分，一端为上开口，一端为下开口；
步骤2,自上开口向筛板一侧加入待浓缩样本，并充满下开口一侧空间；
步骤3,自上开口向容器加入高吸水材料；
步骤4,给予待浓缩样本自上开口一侧向下开口一侧的持续的力，直至筛板吸水材料一侧可流动液体吸收完毕；
步骤5,收集排出的剩余液体。
2.根据权利要求1所述的一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，其特征在于：所述吸水材料相对于筛板的对侧剩余液体为浓缩后包含细胞外囊泡的液体。
3.根据权利要求1所述的一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，其特征在于：所述步骤4中，给予待浓缩样本相向于吸水材料对侧空间的持续的力的加速度为40g～320g，持续时间1～3分钟。
4.根据权利要求1所述的一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，其特征在于：所述待浓缩样本包括尿液小细胞外囊泡、动物血浆小细胞外囊泡、大肠杆菌外膜囊泡。
5.根据权利要求1所述的一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，其特征在于：所述过滤筛板的间隔疏水筛板孔径大于2um，小于超吸水材料尺寸。
6.根据权利要求1所述的一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，其特征在于：所述浓缩容器中内超吸水材料为超吸水树脂颗粒、超吸水纤维。
7.根据权利要求6所述的一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，其特征在于：所述浓缩容器具有两个独立向外联通的且可控制开闭的上开口和下开口，上开口上可拆式装配有上盖，下开口上可拆式装配有下盖。
8.根据权利要求7所述的一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，其特征在于：所述浓缩容器包括浓缩管体、上端口和上端口连接部；上端口连接部用于连接浓缩管体和上端口，上端口的外径大于浓缩管体的外径，上端口连接部呈喇叭状结构。
9.根据权利要求8所述的一种快速定量细胞外囊泡样本浓缩方法，其特征在于：所述浓缩容器的体积为5ml～25ml。
10.根据权利要求6所述的一种快速定量细胞外囊泡浓缩方法，其特征在于：所述浓缩容器中的吸水材料可吸水量大于可加入的液体体积。
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