KR20130068530A

KR20130068530A - 세포배양에서 엑소좀의 정량 방법 및 이를 이용한 엑소좀의 수득율을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR20130068530A
Application number: KR1020110135777A
Authority: KR
Inventors: 박동현; 강현주; 이묘용
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-06-26
Also published as: US20130157300A1

Abstract

일 구체예는 형광 물질을 포함한 재조합 엑소좀을 분리시 프로테아제를 이용하여 재조합 엑소좀내의 형광 물질을 효율적으로 측정하는 방법에 관한 것이고, 다른 구체예는 상기 측정 방법을 이용하여 엑소좀의 분비를 유도하는 물질을 스크리닝하는 방법에 대한 것이다. 또 다른 구체예는 이러한 수득방법을 통하여 엑소좀을 수득할 경우 수득율이 증가한다. 구체예에 따른 방법을 이용할 경우 엑소좀을 활용하는 진단 및 치료등에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

세포배양에서 엑소좀의 정량 방법 및 이를 이용한 엑소좀의 수득율을 증가시키는 방법{Methods for quantifying exosome in cell culture and method for increasing yield of exosome using thereof}

형광 물질을 함유한 재조합 엑소좀에서 방출되는 형광을 측정하는 효율을 증가시키는 방법 및 이를 이용한 엑소좀의 수득율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 대략 30 - 100 nm인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소낭들은 세포밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포 뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 엑소좀은 정상 상태 및 병적 상태, 이 2가지 모든 상태하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다.

또한, 엑소좀에는 면역학적으로 중요한 단백질인 주조직접합체(Major histocompatibility, MHC)와 열충격단백질(heat shock protein, HSP) 등을 포함하고 있다고 알려져 있다. 또한, 최근에 암세포주에 주조직 적합체 II(MHC class II)의 발현을 유도하는 유전자를 이입하여 그 세포로부터 분리한 엑소좀내에 MHC II 단백질을 함유시킨 엑소좀을 백신 조성물로 이용할 수 있다는 점이 개시된 바 있다. 다만, 세포에서 더욱 효율적으로 엑소좀을 생성하기 위하여는 엑소좀 분비에 관여하는 물질에 대한 연구가 필요하다.

그뿐 아니라, 엑소좀내에는 여러가지 microRNA가 포함되어 있으며, 이것의 존재 유무 및 존재량을 검출하여 질병을 진단하는 방법에 대하여 알려져 있다(KR 10-2010-0127768A 참조). 특히 국제 공개 WO2009-015357A에는 암유래의 시료(혈액, 타액, 눈물 등)에 존재하는 엑소좀을 검출하여, microRNA의 변화량을 측정하여, 대조군에 비하여 증가 또는 감소할 경우 특정 질환과의 관련성을 예측하고, 진단하는 방법이 개시되어 있다. 특히, 특정 질환(폐질환)을 갖는 환자로부터 얻은 엑소좀을 분석하여, 특정 microRNA와 폐 질환과의 관련성에 대하여, 구체적으로 개시하고 있다. 또한, 폐질환 외에도 엑소좀에 포함된 단백질을 이용하여 신장 질환을 진단할 수 있는 방법에 대하여도 연구되고 있는 실정이다.

그러나, 상기 엑소좀을 이용하여 정확한 진단을 하기 위하여는 질환을 갖는 사람 체내에 존재하는 정확한 엑소좀의 함량을 아는 것이 중요하다. 따라서, 회수한 엑소좀과 실제 시료 내의 엑소좀 함량의 차이점을 측정하는 것은, 엑소좀을 이용한 진단 결과의 정확도를 높이기 위하여 중요하다. 즉, 엑소좀을 분리할 때 회수율을 측정하는 것은 엑소좀을 이용한 진단시 매우 중요하다. 현재까지는 엑소좀의 정량방법으로 항체와 항원의 특이적인 면역반응을 이용한 정량방법이 이용되고 있다. 이러한 방법은 인위적으로 조작한 엑소좀과 자연적으로 존재하는 엑소좀 사이에 공통적으로 존재하는 항원에 대하여는 항체를 이용하여 정량할 수 없으며, 항체를 이용하기 때문에, 정량방법이 매우 번거롭다.

따라서, 엑소좀을 유발하는 물질의 스크리닝 방법 및 시료 내의 엑소좀의 함량을 정확하게 측정하는 방법을 개시하고자 한다.

KR 10-2010-127768A 초록 및 청구항 1항 KR 10-2004-15508A 초록 및 청구항 1항 WO09/015357A 초록

일 구체예는 형광 물질을 포함한 엑소좀과 단백질 분해 효소를 인큐베이션하여 엑소좀내의 형광 물질의 검출 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

또 다른 구체예는 엑소좀의 분비를 유도하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또 다른 구체예는 엑소좀와 단백질 분해 효소를 인큐베이션하여 엑소좀의 회수율을 증가시키는 방법을 제공한다.

일 양상은 형광 물질을 포함하는 재조합 엑소좀이 포함된 세포 배양액과 단백질 분해효소를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 세포 배양액을 필터로 여과하는 단계를 포함하는 엑소좀 내의 형광 물질의 검출 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 형광 물질의 검출 효율을 증가시키는 방법은 다음과 같다.

먼저, 형광 물질을 포함하는 재조합 엑소좀이 포함된 세포 배양액과 단백질 분해효소를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.

용어, "형광 물질"은 물리적 조건 변화, 화학적 처리에 의해 빛을 발생하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 상기 형광 물질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(Red fluorescent protein, RFP)과 같은 형광 단백질(fluorescent protein)이거나, 발광 단백질(photoprotein) 또는 루시퍼라제(luciferase) 일 수 있다. 상기 형광 물질은 재조합 엑소좀의 내부에 포함되어야 한다.

또한, 형광 물질은 단독으로 엑소좀 내부에 위치할 수 있으나, 막단백질과 결합된 융합단백질의 형태일 수 있다. 용어, "막단백질"은 세포막 지질 이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질을 의미하는 것으로, 이것은 막단백질 전체가 지질층을 관통하거나, 표층에 위치하는 모든 단백질을 포함한다. 예를 들어, 효소, 펩티드 호르몬, 국소 호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 일 수 있다. 또한, 상기 막단백질 엑소좀에 위치하는 단백질일 수 있으며, 예를 들어, EpCAM, Hsc70, MHC I, Tsg101, calnexin 또는 gp96 일 수 있다. 이러한 막단백질은 형광 물질을 엑소좀내에 효율적으로 위치시켜 준다.

용어, "단백질 분해효소"는 단백질에 직접 작용하여 펩티드 결합을 분리시키는 작용을 하는 효소를 의미한다. 이러한 종류에는 단백질을 가운데 쪽에서 자르는 엔도펩티다제와 말단에서 아미노산을 잘라내는 엑소펩티다제가 포함될 수 있다. 구체적으로 펩신, 펩티다제, 트립신, 프로테아제 K, 뉴라미니다제(Neuraminidase), PNGase, 글루코사미니다제(glucosaminidase) 또는 아세틸글루코사미다제(Acetylglucosamidase) 등이 포함될 수 있으나, 단백질을 분해할 수 있는 효소라면 한정되지 않는다.

또한, 단백질 분해 효소와 인큐베이션하기 전 또는 단백질 분해 효소와 인큐베이션을 하면서 동시에, 상기 세포 배양액과 글리코시다제(glycosidase) 및/또는 DNase를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 글리코시다제는 당을 분해하는 물질로서, 엔도글리코시다제(endoglycosidase) 및 엑소글리코시다제(exoglycosidase)일 수 있으며, 구체적으로, 엔도글리코시다제 F1(endoglycosidase F1), 엔도글리코시다제 F2(endoglycosidase F2), 엔도글리코시다제 F3(endoglycosidase F3), 글루코시다제, 갈락토시다제, 수크라아제, 말타아제, O-글리코시다제(Glycosidase), 갈락토시다제(Galactosidsae), 및 플루코시다제(flucosidase) 등이 이에 해당될 수 있다. 이러한 글리코시다제는 단백질 분해효소의 작용을 보다 효율적으로 하게 하여, 형광 측정시 백그라운드를 보다 효율적으로 제거할 수 있게 한다. 또한, 상기 DNase는 DNA를 분해하는 물질을 의미하며, DNA 분자의 양말단을 절단하는 exoDNase 또는 DNA 분자의 내부를 절단하는 endoDNase 일 수 있다.

이후, 상기 세포 배양액을 필터로 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 필터는 엑소좀 이외의 효소에 의해 분해된 기타 분해 산물을 제거하는 막으로서 100 nm 이하, 50 nm 이하 및 30 nm 이하의 기공 크기를 갖는 것일 수 있다. 상기 필터는 1 nm 내지 30 nm의 입자를 투과하여 엑소좀을 선별적으로 정제할 수 있는 것이라면 어떠한 기공 크기 및 어떠한 재질로 된 필터도 이용할 수 있다.

또한, 엑소좀 내의 형광 물질의 검출은 형광 물질의 종류에 따라 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 형광 물질이 형광 단백질(fluorescent protein)일 경우, 자외선을 조사하여 발생하는 형광광도를 형광광독계(fluorophotometer)를 사용하여 측정할 수 있다. 또는 광발생 단백질이 루시퍼라제(luciferase)일 경우, 루시페린 및 ATP를 이용하여 빛을 발생시킨 후, 루미노비터를 이용하여 광도를 측정할 수 있다.

또한, 엑소좀을 정량하기 위한 형광 측정 방법은 상대적인 비교를 위한 형광 강도(Fluorescence intensity)를 측정하는 방법 혹은 나노 채널로 샘플을 흘려보내면서 형광을 내는 엑소좀을 측정하는 방법 등이 포함될 수 있다.

상기의 일 구체예에 의한 방법으로 엑소좀 내의 형광 물질의 검출 효율을 증가시킬 수 있다. 정제되어진 형광 융합 단백질로 표지되어진 엑소좀은 높은 민감도로 측정이 가능할 수 있다. 그러나, 세포 배양액 내에 존재할 때에는 높은 백그라운드 형광수준으로 인해 검출이 불가능하다. 따라서, 세포의 엑소좀 내에 있는 형광 물질에서 분비하는 형광량을 효과적으로 측정하기 위해서는 세포배양액 내에 존재하는 불순물들을 제거하면서 엑소좀을 표지하는 형광 단백질은 유지하는 방법이 필요한데, 상기의 일 구체예에 의한 방법으로 효율적으로 세포배양액 내에 존재하는 백그라운드의 원인이 되는 단백질을 분해하여 제거할 수 있어, 세포배양액의 형광 백그라운드 수준을 효과적으로 낮출 수 있다.

또 다른 양상은 형광 물질을 포함하는 재조합 엑소좀을 분비하는 형질전환 세포와 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 형질전환 세포가 분비한 재조합 엑소좀이 포함된 세포 배양액과 단백질 분해효소를 인큐베이션하는 단계; 상기 세포 배양액을 필터로 여과하는 단계; 및 상기 필터로 여과된 엑소좀의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 엑소좀 분비를 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 엑소좀 분비를 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 형광 물질을 포함하는 재조합 엑소좀을 분비하는 형질전환 세포와 후보 물질을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

용어, "형질전환 세포"는 형광 물질을 암호화하는 벡터로 형질전환되어, 형광 물질을 함유한 엑소좀을 분비한 세포를 의미한다. 형질전환 대상이 되는 세포는 엑소좀 분비와 관련된 모든 세포일 수 있다. 이러한 구체적인 예로는 MCF7, COS7, 297T, HeLa 및 NIH3T3으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

형광 물질은 단독으로 엑소좀 내부에 위치할 수 있으나, 막단백질과 결합된 융합단백질의 형태일 수 있다. 형광 물질과 막단백질과의 융합은 형광단백질과 N- 혹은 C- 말단에서 가능하나, 형광 단백질은 반드시 엑소좀 내부에 위치하여야 하며, 형광 단백질의 융합위치는 융합되는 펩타이드 혹은 단백질의 막내 위치에 따라 결정될 수 있다.

형질 전환 방법은 당업자에게 알려진 세포내로 유전자를 도입할 수 있는 모든 방법이 이용가능하다. 구체적으로 융합 형광 단백질을 암호화하는 DNA는 플라스미드 형태 혹은 바이러스 입자 안에 포장 되어진 형태로 세포로 도입되어지거나, 바이러스 RNA 형태로 만들어져 바이러스를 이용해 도입될 수 있다.

상기 방법을 이용할 경우, 형광 물질을 포함하는 엑소좀에서 분비되는 형광을 매우 높은 민감도를 가지고 측정할 수 있으므로, 낮은 농도의 엑소좀을 분비하는 경우에도 분비량을 확인할 수 있다. 따라서, 후보 물질의 농도와 엑소좀의 분비량을 확인하기 위하여, 상기 후보 물질을 형질전환된 세포에 접촉시키는 단계는 다양한 농도 일 수 있다.

이후, 후보 물질을 형질전환된 세포에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 후보 물질에는 화학 물질, 단백질, 지질 또는 핵산 등 세포에 생화학적 반응을 유발할 수 있는 물질이라면 그 종류에는 한정되지 않는다.

이후, 추가적으로 세포 배양액과 글리코시다제와 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 글리코시다제는 당을 분해하는 물질로서, 엔도글리코시다제 F1(endoglycosidase F1), 엔도글리코시다제 F2(endoglycosidase F2), 엔도글리코시다제 F3(endoglycosidase F3), 글루코시다제, 갈락토시다제, 수크라아제, 말타아제 등의 당 분해효소가 이에 해당될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이후, 엑소좀을 분리 후 세포 배양액과 단백질 분해효소를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 고분자를 분해할 수 있는 효소는 어느 것이나 이용될 수 있으며, 구체예로는 펩티다제, 트립신, 프로테아제 K, 뉴라미니다제, PNGase 및 글루코사미니다제 등이 이용될 수 있다.

이후, 필터로 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 필터는 엑소좀 이외의 효소에 의해 분해된 기타 분해 산물을 제거하는 막으로서 100 nm 이하, 50 nm 이하 및 30 nm 이하의 기공 크기를 갖는 것일 수 있다. 상기 필터는 1 nm 내지 30 nm의 입자를 투과하여 엑소좀을 선별적으로 정제할 수 있는 것이라면 어떠한 기공 크기 및 어떠한 재질로 된 필터도 이용할 수 있다.

이후, 필터로 여과한 엑소좀의 형광을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 엑소좀 내의 형광 물질의 검출은 형광 물질의 종류에 따라 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 형광 물질이 형광 단백질(fluorescent protein)일 경우, 자외선을 조사하여 발생하는 형광광도를 형광광독계(fluorophotometer)를 사용하여 측정할 수 있다. 또는, 광발생 단백질이 루시퍼라제(luciferase)일 경우, 루시페린 및 ATP를 이용하여 빛을 발생시킨 후, 루미노비터를 이용하여 광도를 측정할 수 있다.

또 다른 양상은 엑소좀이 포함된 시료와 형광 물질이 포함된 재조합 엑소좀을 혼합하는 단계; 상기 시료와 단백질 분해효소를 인큐베이션하는 단계; 상기 시료에서 필터를 이용하여 엑소좀을 여과하는 단계; 및 시료에 첨가한 재조합 엑소좀의 양과 필터에 의해 여과된 엑소좀내의 형광을 측정하는 단계를 거친 후 얻은 재조합 엑소좀의 양의 비율로부터 엑소좀의 수득율을 결정하는 단계를 포함하는 엑소좀 수득율을 결정하는 방법을 제공한다.

상기 엑소좀 수득율을 결정하는 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 상기 방법은 엑소좀이 포함된 시료와 형광 물질이 포함된 재조합 엑소좀을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 시료는 신체로부터 얻은 혈액, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 및 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 엑소좀을 포함하는 시료라면 이에 한정되지 않는다.

이후, 시료와 단백질 분해효소를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.

이후, 상기 시료에서 필터로 엑소좀을 여과하는 단계를 포함할 수 있다.

이후, 시료에 첨가한 재조합 엑소좀의 양과 필터에 의해 여과된 엑소좀내의 형광을 측정하는 단계를 거친 후 수득된 재조합 엑소좀의 양의 비율로부터 엑소좀의 수득율을 결정하는 단계를 포함하는 필터에 의한 엑소좀 수득율을 결정하는 방법을 포함할 수 있다. 시료에 첨가한 엑소좀의 함량과, 엑소좀 수득 단계를 거친 후 얻은 엑소좀의 함량의 비를 계산하여 엑소좀 수득 방법의 수득율을 계산할 수 있다. 이렇게 얻은 수득율은 시료내 엑소좀에 포함된 microRNA 또는 엑소좀 단백질을 정량할 때 이용되어, 엑소좀을 이용한 진단시 유용하게 이용할 수 있다.

상기의 엑소좀을 이용하여 진단할 수 있는 대상에는 진단되거나, 모니터링 되거나, 또는 프로파일링되는 모든 종류의 암이 될 수 있다. 구체예로서, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 유방암, 뇌암, 결장암, 전립선암, 위장관암, 두부경부 암, 비-소세포 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식-요로암, 담낭암, 흑색종, 또는 백혈병 등과 같이 엑소좀을 이용하여 진단 가능한 모든 암을 포함한다. 또한, 신경섬유종증, 수막종 또는 슈반세포종과 같은 비-악성 종양의 검출, 진단 및 예후에도 동등하게 적용될 수 있다.

또 다른 양상으로, 엑소좀이 포함된 세포 배양액과 단백질 분해 효소를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 세포 배양액을 필터로 여과하는 단계를 포함하는 엑소좀의 수득 방법을 제공한다.

엑소좀이 포함된 세포 배양액과 단백질 분해 효소를 인큐베이션한 후 필터로 분해 산물을 제거할 경우 엑소좀 외의 다른 단백질을 용이하게 제거할 수 있으며, 이로 인해 엑소좀을 효율적으로 수득할 수 있다. 따라서, 단백질 분해 효소 및 필터를 이용하여 엑소좀을 분리하는 방법은 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 단백질 분해 효소의 활성을 증가시키기 위하여, 단백질 분해효소와 인큐베이션 전 또는 함께, 세포 배양액과 글리코시다제를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 글리코시다제로 단백질상의 당을 제거하면 단백질 분해효소의 분해 효율을 증가시킬 수 있기 때문이다.

또한, 분비된 재조합 엑소좀이 포함된 시료에서 엑소좀을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 엑소좀을 분리하는 단계는 밀도구배법, 초원심분리, 여과, 투석, 음이온 교환 방법, 겔 투과 크로마토그래피, 세포소기관 전기영동, 자성 활성 세포 분류 방법, 나노막 한외여과 농축기 방법, 및 자유 유동전기이동법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에 따른 재조합 엑소좀와 단백질 분해효소를 인큐베이션하여 재조합 엑소좀내의 형광 물질의 형광량을 검출하는 방법을 통하여, 형광량을 효율적으로 검출할 수 있으며, 효율적인 형광량의 검출을 통하여 엑소좀을 분비하게 하는 물질을 용이하게 스크리닝 할 수 있다. 아울러, 엑소좀의 수득율을 높일 수 있어, 엑소좀을 보다 효율적으로 이용할 수 있게 할 수 있다.

도 1은 단백질 분해 효소를 이용하여 엑소좀을 분리 정제하는 방법을 나타내는 것이다.
도 2는 단백질 분해 효소 및 여과를 통한 엑소좀 정제 방법의 개요에 대한 것이다.
도 3은 일 구체예의 방법을 이용한 단백질 분해효소 이용시 백그라운드 형광의 감소를 나타낸다.
도 4는 일 구체예의 방법을 이용한 GFP의 회수율을 나타낸다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 막단백질 및 형광 물질을 포함하는 벡터의 제작

pGL4.76(AY864931) 플라스미드를 주형으로 하고, 멀티 클로닝 사이트(MSC)에 CMV 프로모터를 가지고, CD63- GFP의 융합 단백질를 암호화하는 뉴클레오티드 핵산(서열번호 1 참조)을 삽입하여, CD63-GFP가 결합된 융합단백질을 포함한 엑소좀을 제조하기 위한 벡터를 제작하였다(서열번호 2 참조).

실시예 2: 재조합 엑소좀의 제조

실시예 2-1 : 막단백질 -형광 물질이 결합된 융합단백질을 암호화하는 유전자를 세포주에 도입

형질감염 하루전에 세포를 150 mm 플레이트에 고르게 접종하여 배양하였다. 플라스미드 7.5 ㎍ DNA를 7.5 ㎖의 Opti-MEM 무혈청배지(serum-free medium)(Invitrogen)에 희석시킨 후, 완전히 혼합하였다. 플러스 시약(Plus reagent)(Invitrogen)을 사용하기 전에 완전하게 섞어준 후, 희석된 DNA에 플러스 시약 75 ㎕를 추가한 후, 천천히 혼합한 후, 실온에서 5분동안 인큐베이션하였다. Lipofectamine^TM LTX를 사용하기 전에 부드럽게 섞어준 후, 상기에서 인큐베이션한 혼합액에 187.5 ㎕를 직접 추가한 후 완전히 섞어주었다. 그 후, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

형질감염을 시킬 MCF-7 세포(ATCC)를 포함한 접시에 상기에서 제조된 DNA-지질 복합체를 한 방울씩 천천히 떨어뜨렸다. 그리고, 플레이트를 천천히 흔들어 주면서 혼합하였다. 상기 DNA-지질 복합체와 세포가 혼합된 플레이트를 37 ℃, CO₂ 인큐베이터에서 12 - 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 새로운 엑소좀이 없는 배지로 교환하였다. FBS(fetal bovine serum)를 가진 배양 배지를 엑소좀이 없는 FBS(exosome-free FBS)를 포함한 신선한 배지로 교체하여 주었다. CO₂ 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 - 48시간 세포를 배양하였고, 그 후 조건배지(conditioned medium)를 수거하였다.

실시예 2-2 : 원심분리기를 통한 세포 배양액내의 재조합 엑소좀의 분리

깨끗한 조건배지를 50 ㎕ 원심분리기 튜브에 옮긴 후, 4 ℃ 300 g에서 10분간 원심분리를 하였다. 상등액을 파이펫으로 제거한 후, 나머지를 새로운 원심분리기 튜브에 옮겼다. 다시 4 ℃ 300 g에서 10분간 원심분리를 하였다. 상등액을 파이펫으로 제거한 후, 나머지를 새로운 원심분리기 튜브에 옮겼다. 다시 4 ℃ 2,000 g에서 20분간 원심분리를 하였다. 상등액을 새로운 초고속원심분리기가 가능한 폴리알로머(polyallomer) 튜브 또는 폴리카보네이트(polycarbonate) 병에 옮겼다. 다시 4 ℃ 10,000 g에서 30분간 원심분리를 하였다. 상등액을 파이펫으로 새로운 초고속원심분리기용 튜브에 옮겼다. 이것을 4 ℃ 110,000 g에서 70분간 원심분리를 하였고, 상등액을 파이펫으로 완전히 제거하였다. 펠릿을 1000 ㎕ PBS로 튜브내에서 마이크로피펫을 이용하여 재현탁시켰다. 그리고, 튜브를 PBS로 채우고 나서 4 ℃ 100,000 g에서 70분간 원심분리를 하였다. 가능한 완전하게 상등액을 제거하였다. 펠릿을 다시 PBS로 튜브내에서 재현탁시키고 4 ℃ 100,000 g에서 70분간 원심분리를 하였다. 가능한한 완전히 상등액을 제거하였다. 펠릿을 재현탁시키기 위하여, 소량의 PBS 또는 TBS를 추가하고, 재현탁하였다. 100 ㎕로 분액하여 -80 ℃에 보관한 후 필요한 경우 녹여 사용하였다.

실시예 2-3: 필터를 통한 세포 배양액내의 재조합 엑소좀의 분리

실시예 2-1에서 수거한 깨끗한 조건배지를 200 ㎕ 원심분리기 튜브에 옮긴 후, 프로테아제 K(PK)(Sigma)와 인큐베이션하였다.

그 후, 필터(cut-off 100 kd, 4000 g, 5 분)를 이용하여 조건배지 용액을 제거하였다. 필터를 통과한 용액은 버리고, 엑소좀을 함유한 필터를 통과하지 못한 농축액에 다시 PBS 200 ul 추가하고, 원심분리(4000 g, 5 분)를 하여 용액을 제거하였다. PBS 세척 단계를 4회 반복 후 남아있는 형광을 이용하여 정량하였다. 이때 정량은 조건배지에서 오는 백그라운드 수준을 제거하여 계산하였다.

실시예 3: 재조합 엑소좀에서 형광 물질의 발현 여부 확인

형광광독계(fluorophotometer))(Perkin Elmer Envision) 이용하여 형광량을 측정하였다. 빛을 조사한 후, 수득한 재조합 엑소좀에서 분비하는 엑소좀의 형광량을 측정하였다. 이때 프로테아제 K와 인큐베이션한 후 필터로 여과한 재조합 엑소좀의 경우, 프로테아제 K와 인큐베이션하지 않고 여과한 재조합 엑조솜의 경우에 비하여 백그라운드 값이 현저히 감소함을 확인하였다(도 3 참조).

실시예 4: 단백질 분해효소 및 필터를 이용한 엑소좀 수득율 측정

프로테아제 사용 여부에 따른 수득율을 측정하기 위하여, CD63-GFP 융합단백질을 포함하는 재조합 엑소좀을 이용하였다. 상기 융합 단백질을 암호화하는 벡터를 세포주에 형질전환 시킨 후, 실시예 2-2와 같은 초고속원심분리법을 이용하여 엑소좀을 수득하는 방법, 실시예 2-3과 같은 프로테아제를 사용한 후 필터를 이용한 수득 방법 및 프로테아제 사용 없이 필터를 이용하여 수득 방법으로 엑소좀을 수득하였다.

그 결과 서로 다른 조건으로 샘플에서 엑소좀을 회수하면, 다양한 엑소좀량을 보여주나, 회수율을 고려할 경우 평균값은 실제값에 유사해지며, 변동 계수인 CV(coefficient of variation) 값도 크게 줄어들었음을 확인하였다

	초고속원심분리법	여과	프로테아제와 인큐베이션 후 여과
CV 값	40 %	40 %	15 %

<110> samsung advanced institute technology <120> Methods for quantifying exosome in cell culture and method for increasing yield of exosome using thereof <130> PN094951 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding CD63-GFP <400> 1 atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60 ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120 cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180 ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240 tgtcttatga tcacgtttgc catctttctg tctcttatca tgttggtgga ggtggccgca 300 gccattgctg gctatgtgtt tagagataag gtgatgtcag agtttaataa caacttccgg 360 cagcagatgg agaattaccc gaaaaacaac cacactgctt cgatcctgga caggatgcag 420 gcagatttta agtgctgtgg ggctgctaac tacacagatt gggagaaaat cccttccatg 480 tcgaagaacc gagtccccga ctcctgctgc attaatgtta ctgtgggctg tgggattaat 540 ttcaacgaga aggcgatcca taaggagggc tgtgtggaga agattggggg ctggctgagg 600 aaaaatgtgc tggtggtagc tgcagcagcc cttggaattg cttttgtcga ggttttggga 660 attgtctttg cctgctgcct cgtgaagagt atcagaagtg gctacgaggt gatgacgcgt 720 acgcggccgc tcgagatgga gagcgacgag agcggcctgc ccgccatgga gatcgagtgc 780 cgcatcaccg gcaccctgaa cggcgtggag ttcgagctgg tgggcggcgg agagggcacc 840 cccgagcagg gccgcatgac caacaagatg aagagcacca aaggcgccct gaccttcagc 900 ccctacctgc tgagccacgt gatgggctac ggcttctacc acttcggcac ctaccccagc 960 ggctacgaga accccttcct gcacgccatc aacaacggcg gctacaccaa cacccgcatc 1020 gagaagtacg aggacggcgg cgtgctgcac gtgagcttca gctaccgcta cgaggccggc 1080 cgcgtgatcg gcgacttcaa ggtgatgggc accggcttcc ccgaggacag cgtgatcttc 1140 accgacaaga tcatccgcag caacgccacc gtggagcacc tgcaccccat gggcgataac 1200 gatctggatg gcagcttcac ccgcaccttc agcctgcgcg acggcggcta ctacagctcc 1260 gtggtggaca gccacatgca cttcaagagc gccatccacc ccagcatcct gcagaacggg 1320 ggccccatgt tcgccttccg ccgcgtggag gaggatcaca gcaacaccga gctgggcatc 1380 gtggagtacc agcacgcctt caagaccccg gatgcagatg ccggtgaaga aagagtt 1437 <210> 2 <211> 5589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL4.76_CMV_CD63-GFP sequence <400> 2 ggcctaactg gccggtacct gagctcgcta gcctcgagga tatcaagatc tgccgccgcg 60 atcgccatgg cggtggaagg aggaatgaaa tgtgtgaagt tcttgctcta cgtcctcctg 120 ctggcctttt gcgcctgtgc agtgggactg attgccgtgg gtgtcggggc acagcttgtc 180 ctgagtcaga ccataatcca gggggctacc cctggctctc tgttgccagt ggtcatcatc 240 gcagtgggtg tcttcctctt cctggtggct tttgtgggct gctgcggggc ctgcaaggag 300 aactattgtc ttatgatcac gtttgccatc tttctgtctc ttatcatgtt ggtggaggtg 360 gccgcagcca ttgctggcta tgtgtttaga gataaggtga tgtcagagtt taataacaac 420 ttccggcagc agatggagaa ttacccgaaa aacaaccaca ctgcttcgat cctggacagg 480 atgcaggcag attttaagtg ctgtggggct gctaactaca cagattggga gaaaatccct 540 tccatgtcga agaaccgagt ccccgactcc tgctgcatta atgttactgt gggctgtggg 600 attaatttca acgagaaggc gatccataag gagggctgtg tggagaagat tgggggctgg 660 ctgaggaaaa atgtgctggt ggtagctgca gcagcccttg gaattgcttt tgtcgaggtt 720 ttgggaattg tctttgcctg ctgcctcgtg aagagtatca gaagtggcta 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tacccatccc cgaagtgttg gacatcggcg agttcagcga gagcctgaca tactgcatca 2520 gtagacgcgc ccaaggcgtt actctccaag acctccccga aacagagctg cctgctgtgt 2580 tacagcctgt cgccgaagct atggatgcta ttgccgccgc cgacctcagt caaaccagcg 2640 gcttcggccc attcgggccc caaggcatcg gccagtacac aacctggcgg gatttcattt 2700 gcgccattgc tgatccccat gtctaccact ggcagaccgt gatggacgac accgtgtccg 2760 ccagcgtagc tcaagccctg gacgaactga tgctgtgggc cgaagactgt cccgaggtgc 2820 gccacctcgt ccatgccgac ttcggcagca acaacgtcct gaccgacaac ggccgcatca 2880 ccgccgtaat cgactggtcc gaagctatgt tcggggacag tcagtacgag gtggccaaca 2940 tcttcttctg gcggccctgg ctggcttgca tggagcagca gactcgctac ttcgagcgcc 3000 ggcatcccga gctggccggc agccctcgtc tgcgagccta catgctgcgc atcggcctgg 3060 atcagctcta ccagagcctc gtggacggca acttcgacga tgctgcctgg gctcaaggcc 3120 gctgcgatgc catcgtccgc agcggggccg gcaccgtcgg tcgcacacaa atcgctcgcc 3180 ggagcgcagc cgtatggacc gacggctgcg tcgaggtgct ggccgacagc ggcaaccgcc 3240 ggcccagtac acgaccgcgc gctaaggagg taggtcgagt ttaaactcta gaaccggtca 3300 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taccgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc cgtgaccggc gagtactcaa ccaagtcgtt 5040 ttgtgagtag tgtatacggc gaccaagctg ctcttgcccg gcgtctatac gggacaacac 5100 cgcgccacat agcagtactt tgaaagtgct catcatcggg aatcgttctt cggggcggaa 5160 agactcaagg atcttgccgc tattgagatc cagttcgata tagcccactc ttgcacccag 5220 ttgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttcgggg tgtgcaaaaa caggcaagca 5280 aaatgccgca aagaagggaa tgagtgcgac acgaaaatgt tggatgctca tactcgtcct 5340 ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttactagtac gtctctcaag gataagtaag 5400 taatattaag gtacgggagg tattggacag gccgcaataa aatatcttta ttttcattac 5460 atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga tagtactaac atacgctctc catcaaaaca 5520 aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtgca ggtgccagaa 5580 catttctct 5589

Claims

형광 물질을 포함하는 재조합 엑소좀이 포함된 세포 배양액과 단백질 분해효소를 인큐베이션하는 단계; 및
상기 세포 배양액을 필터로 여과하는 단계를 포함하는 엑소좀내의 형광 물질의 검출 효율을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 추가적으로 세포 배양액과 글리코시다제와 인큐베이션하는 단계를 포함하는 엑소좀내의 형광 물질의 검출 효율을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 형광 물질은 형광 단백질(fluorescent protein)이거나 또는 발광 단백질(photoprotein)인 엑소좀내의 형광 물질의 검출 효율을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 펩신, 펩티다제, 트립신, 프로테아제 K, 뉴라미니다제(Neuraminidase), PNGase, 및 글루코사미니다제(glucosaminidase)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 엑소좀내의 형광 물질의 검출 효율을 증가시키는 방법.
형광 물질을 포함하는 재조합 엑소좀을 분비하는 형질전환 세포와 후보 물질을 접촉시키는 단계;
상기 형질전환 세포가 분비한 재조합 엑소좀이 포함된 세포 배양액과 단백질 분해효소를 인큐베이션하는 단계;
상기 세포 배양액을 필터로 여과하는 단계; 및
상기 필터로 여과된 엑소좀의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 엑소좀 분비를 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 후보 물질을 형질전환된 세포에 접촉시키는 단계는 다양한 농도의 후보 물질로 접촉시키는 것인 엑소좀 분비를 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법.
제5항에 있어서, 추가적으로 세포 배양액과 글리코시다제와 인큐베이션하는 단계를 포함하는 엑소좀 분비를 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 글리코시다제는 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3, 글루코시다제, 갈락토시다제, 수크라아제, 말타아제, O-글리코시다제, 갈락토시다제 및 플루코시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 엑소좀 분비를 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 필터는 1 nm 내지 30 nm의 입자를 투과할 수 있는 것인 엑소좀 분비를 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법.
엑소좀이 포함된 시료와 형광 물질이 포함된 재조합 엑소좀을 혼합하는 단계;
상기 시료와 단백질 분해효소를 인큐베이션하는 단계;
상기 시료에서 필터를 이용하여 엑소좀을 여과하는 단계; 및
시료에 첨가한 재조합 엑소좀의 양과 필터에 의해 여과된 엑소좀내의 형광을 측정하는 단계를 거친 후 수득된 재조합 엑소좀의 양의 비율로부터 엑소좀의 수득율을 결정하는 단계를 포함하는 필터에 의한 엑소좀 수득율을 결정하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 시료는 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 및 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 엑소좀 수득율을 결정하는 방법.
엑소좀이 포합된 세포 배양액과 단백질 분해 효소를 인큐베이션하는 단계; 및
상기 세포 배양액을 필터로 여과하는 단계를 포함하는 엑소좀의 수득 방법
제12항에 있어서, 추가적으로 세포 배양액과 글리코시다제와 인큐베이션하는 단계를 포함하는 엑소좀의 수득 방법.
제12항에 있어서, 추가적으로 분비된 재조합 엑소좀이 포함된 시료에서 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 엑소좀의 수득 방법.