CN107849541A - 纯化腺病毒载体的方法 - Google Patents

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Abstract

提供从不纯的制备物中纯化腺病毒的方法。在一些实施方式中，混合模式色谱和阴离子交换色谱的组合被用于纯化腺病毒。

Description

纯化腺病毒载体的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2015年7月24日提交的美国申请第14/808,699号的优先权，其完整内容通过引用结合于此。
背景技术
用于临床应用的大规模的病毒下游处理造成与许多其它生物治疗剂不同的挑战。这些挑战部分来自病毒的尺寸和复杂性。例如，腺病毒载体含有超过2700个蛋白质亚基，质量约165MDa且直径约0.1μm。进一步复杂性归因于腺病毒颗粒酸不稳定的倾向。
发明内容
提供一种从不纯的制备物中纯化腺病毒的方法。
在一些实施方式中，该方法包括：
(a)在允许腺病毒与混合模式色谱支持物结合的条件下使包括腺病毒的不纯的制备物与混合模式色谱支持物接触，其中混合模式色谱支持物是疏水性阳离子交换色谱支持物；
(b)从混合模式色谱支持物中洗脱腺病毒，从而形成混合模式洗脱液；
(c)在允许腺病毒与阴离子交换支持物结合的条件下使混合模式洗脱液与阴离子交换色谱支持物接触；以及
(d)从阴离子交换色谱支持物中洗脱腺病毒。
在一些实施方式中，所述腺病毒是重组腺病毒。在一些实施方式中，所述腺病毒是血清型5腺病毒。
在一些实施方式中，所述不纯的制备物包括一种或多种选自蛋白质、核酸、不完整病毒颗粒、和外来病毒的污染物。在一些实施方式中，所述不纯的制备物是细胞培养收获物，并且污染物包括宿主细胞蛋白质和宿主细胞DNA。
在一些实施方式中，在步骤(a)之前，用核酸酶处理包括腺病毒的不纯的制备物。在一些实施方式中，在步骤(a)中，与混合模式色谱支持物接触的不纯的制备物是在缓冲液中被稀释的细胞培养收获物(如，以约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、或约1:5的比例)。在一些实施方式中，所述不纯的制备物在与混合模式色谱支持物接触时具有约5.5到约7.0的pH。
在一些实施方式中，所述方法还包括，在步骤(a)之后，用第一洗涤溶液洗涤混合模式色谱支持物，其中腺病毒保持与混合模式色谱支持物结合。在一些实施方式中，所述第一洗涤溶液包括至少1mM组氨酸。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述洗脱包括提高和与混合模式色谱支持物结合的腺病毒接触的溶液的pH。在一些实施方式中，在步骤(b)中，用包括至少100mM氯化钠的缓冲液从混合模式色谱支持物中洗脱所述腺病毒。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述混合模式洗脱液在与阴离子交换色谱支持物接触时具有约6.5到约8.5的pH。在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述与阴离子交换色谱支持物接触的混合模式洗脱液在缓冲液中被稀释(如，以约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、或约1:5的比例)。
在一些实施方式中，所述方法还包括，在步骤(c)之后，用第二洗涤溶液洗涤阴离子交换色谱支持物，其中腺病毒保持与阴离子交换色谱支持物结合。在一些实施方式中，所述第二洗涤溶液包括至少10mM氯化钠。在一些实施方式中，所述方法还包括，在用第二洗涤溶液洗涤之后，用第三洗涤溶液洗涤阴离子交换色谱支持物，其中腺病毒保持与阴离子交换色谱支持物结合。在一些实施方式中，所述第三洗涤溶液包括至少100mM氯化钠。
在一些实施方式中，在步骤(d)中，用包括至少0.5M氯化钠的缓冲液从阴离子交换色谱支持物中洗脱所述腺病毒。
在一些实施方式中，包括在步骤(d)中洗脱的腺病毒的纯化产物具有最初的包括腺病毒的不纯的制备物的至少50％的腺病毒活性。在一些实施方式中，在步骤(d)中洗脱的包括腺病毒的纯化产物基本上没有杂质。在一些实施方式中，在步骤(d)中洗脱的包括腺病毒的纯化产物高度浓缩了腺病毒。
附图的简要说明
图1是代表性的混合模式色谱图。用(25mM组氨酸，pH6.0)平衡5.0mL ForesightNuviaTMcPrimeTM柱。以一份收获物对三份缓冲液的比例将60mL的Turbo核酸酶处理的病毒培养物上清液与(25mM组氨酸，pH6.0)掺混，并泵送过柱。在加载之后，用24mL(25mM组氨酸，pH6.0)洗涤柱，并用(75mM Tris，525mM NaCl，pH 8.5)洗脱部分纯化的腺病毒。扫描线是260nm处的OD(蓝)，280nm处的OD(红)，和电导率(黄)。
图2.代表性的阴离子交换色谱图。用(75mM Tris，250mM NaCl，pH 8.0)平衡5.0mLForesightTMA NuviaTMQ阴离子交换柱。以一份NuviaTMcPrimeTM洗脱液对一份缓冲液的比例将混合模式洗脱液与(75mM Tris，pH 8.0)掺混，并泵送过柱。在加载之后，先后用9mL的(75mM Tris，250mM NaCl，pH 8.0)和15mL的(75mM Tris，440mM NaCl，pH 8.0)洗涤柱。使用(75mM Tris，1000mM NaCl，pH 7.5)洗脱纯化的病毒。扫描线是260nm处的OD(蓝)，280nm处的OD(红)，和电导率(黄)。
图3.中间体和最终产物的SDS-PAGE。泳道1＝分子量标记物。泳道2＝NuviaTMcPrimeTM加载。泳道3＝NuviaTMcPrimeTM流通。泳道4＝NuviaTMcPrimeTM洗脱/NuviaTMQ加载。泳道5＝NuviaTMQ流通。泳道6＝NuviaTM预洗脱。泳道7＝NuviaTMQ产物。容易地在最终产物(泳道7)中观察到五种最显著的病毒蛋白质(六邻体、五邻体、核(V)、六邻体(VI)、和核(VII))。
定义
如本文所用，术语“腺病毒”或“Ad”是指已知的七个腺病毒亚属(分类为亚属A至G)的任何腺病毒。存在约57个不同的人类腺病毒的血清型。血清型分类典型地基于红凝和对其它已知的腺病毒血清型的抗血清中和的抗性。在一些实施方式中，所述腺病毒是腺病毒血清型5(“Ad5”)。腺病毒可以是野生型病毒、修饰的病毒(如，减毒的病毒)、或重组病毒。
“混合模式色谱支持物”是指使用两种或更多的化学机制的组合，以实现在混合物中组分(如蛋白质、DNA、和病毒)的分离的固相色谱支持物。实例包括但不限于，利用阳离子交换(即，其中支持物为阴离子)、阴离子交换(即，其中支持物为阳离子)、疏水性相互作用、亲水性相互作用、氢键、π-π键、和金属亲和力的组合的色谱支持物。固相可以是多孔颗粒、无孔颗粒、膜或整体件。
“阴离子交换色谱支持物”是指使用带正电荷的离子交换支持物的固相色谱支持物，其具有与有净负表面电荷的分子的亲和力，以实现组分的分离。固相可以是多孔颗粒、无孔颗粒、膜或整体件。
“制备物”是指任何含有所要纯化的腺病毒的组合物。在一些实施方式中，所述制备物是“不纯的”制备物。如本文所用，术语“不纯的制备物”是指含有所要纯化的腺病毒和一种或多种其它组分的组合物，例如但不限于蛋白质、核酸、脂质、各种细胞培养基组分和添加剂、不完整的病毒颗粒、和外来病毒。
具体实施方式
I.绪论
令人惊讶地发现，可通过两步色谱纯化工艺来纯化腺病毒以产出有活性的、浓缩的病毒产物，其在纯度、宿主细胞蛋白质、和宿主细胞DNA水平上相当于临床等级产品。本文描述的腺病毒纯化工艺容易规模化、使用与现有的产品制造工艺兼容的程序和试剂，且足够简单、快速和高效以用于生产临床等级病毒的载体。
II.色谱固体支持物
本发明的方法使用色谱形式的组合以实现从不纯的制备物纯化腺病毒。在一些实施方式中，混合模式色谱和阴离子交换色谱的组合被用于纯化腺病毒。在一些实施方式中，疏水性阳离子交换色谱和阴离子交换色谱的组合被用于纯化腺病毒。
本发明的方法中所使用的混合模式色谱和阴离子交换色谱以结合-洗脱模式操作。“结合-洗脱模式”是指一种色谱的操作方式，其中，当将制备物应用于色谱支持物时，缓冲液条件是确定的，从而要纯化的目标分子(如，腺病毒)，和任选地不希望的污染物或杂质与色谱支持物结合。随后可通过改变条件使目标分子从支持物洗脱来实现目标分子(如，腺病毒)的分离。在一些实施方式中，污染物或杂质在目标分子洗脱之后保持结合。在一些实施方式中，污染物或杂质要么在制备物被应用于色谱支持物时流通，要么在洗脱目标分子之前结合并洗脱。
本发明的方法利用混合模式色谱以纯化腺病毒。在一些实施方式中，所述混合模式色谱支持物利用阳离子交换(即，混合模式支持物中带负电荷的部分)和疏水性相互作用，以及任选的氢键或π-π键相互作用的组合。
在一些实施方式中，混合模式配体包括至少一个酸性部分(如羧基)，且还包括至少一个疏水性部分(例如但不限于苯环或脂族烃链)。在一些实施方式中，所述支持物是疏水性和弱阳离子的。例如，在一些实施方式中，混合模式配体包括与至少一个疏水性部分如芳族疏水性环组合的羧酸末端基团。本领域技术人员可理解“强”和“弱”离子基团的定义，那些基团分别能或不能在宽pH范围内(如pH 2到pH 12)保持它们的电荷。在一些实施方式中，混合模式配体还包括作为氢键供体/受体起作用的酰胺键。
在一些实施方式中，混合模式配体是对-氨基马尿酸。对-氨基马尿酸配体如下图所示：
疏水性阳离子交换支持物上的对-氨基马尿酸配体的商业实例是NuviaTMcPrimeTM，其可从伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories，Inc.)(加利福尼亚州赫科勒斯)商业获得。NuviaTMcPrimeTM例如在伯乐实验室公司公告6418(Rev A)和伯乐实验室公司公告6242(Rev C)中被描述。
其它商业可获得的疏水性阳离子交换支持物的实例包括但不限于，Capto MMCTM(可获自GE医疗公司(GE Healthcare))。混合模式色谱支持物例如也在US7,999,085中被描述，其内容通过引用纳入本文。
本发明的方法还利用阴离子交换色谱以纯化腺病毒。阴离子交换色谱利用支持物上的带正电荷的官能团与带负电荷的分子结合。用于的阴离子交换色谱的合适的带正电荷的官能团的实例包括但不限于，仲胺、叔胺和季胺(如二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、三甲基氨基乙基、和季胺基乙基)。所述官能团可例如通过共价结合与固体支持物连接。
阴离子交换色谱支持物可以是任何弱或强阴离子交换色谱支持物。一些实施方式中，阴离子交换色谱支持物包括强离子基团。可用作强阴离子交换官能的结构基团团包括例如季胺(如，季胺基乙基)。
阴离子交换色谱支持物的商业实例包括但不限于NuviaTMQ、UNOsphereTMQ，和Q(可获自伯乐实验室公司，加利福尼亚州赫科勒斯)。阴离子交换色谱支持物例如也在US8,138,291中被描述，其内容通过引用纳入本文。
任何固体支持物可用于混合模式色谱和阴离子交换色谱。固体支持物可以是，例如多孔的或无孔的，并且可以例如是，基质、珠、颗粒、碎片或其他构造的形式，例如膜或整体件(即材料的单板、块、或粒)。当用作基质时，颗粒可以是具有平滑表面或者具有粗糙或织构化表面的球或珠。许多(并且在一些情况下所有)的孔均是通孔(through-pore)，延伸穿过颗粒以用作足够大以允许流体动力学流过或快速扩散透过这些孔的通道。
所述固体支持物可用于任何常规配置，包括填充柱和流化或扩张床柱、整料或多孔膜，并且通过任何常规方法使用，包括分批模式加载、洗涤和洗脱，以及连续或流通(flow-through)模式。在一些实施方式中，混合模式色谱支持物和阴离子交换色谱支持物被各自填充在柱中。
在一些实施方式中，所述混合模式和/或阴离子交换支持物被填充在至少5mm内径和至少25mm高度的柱中。这样的实施方式可用于，如评估腺病毒纯化中各种条件的效果。也可使用其它柱尺寸。
在一些实施方式中，所述混合模式和/或阴离子交换支持物被填充在支持制备性应用所要求的尺寸的任何柱中。根据具体应用，柱直径可以是少于1cm到多于1米的范围，且柱高度可以是少于1cm到多于30cm的范围。也可使用其它柱尺寸。
III.腺病毒和包含腺病毒的制备物
本发明的方法可用于纯化任何腺病毒，包括野生型腺病毒、重组腺病毒、和修饰的腺病毒(例如包括转基因的腺病毒)。在一些实施方式中，所述腺病毒是重组腺病毒或修饰的腺病毒。被纯化的腺病毒可以是任何血清型。在一些实施方式中，所述腺病毒是血清型5腺病毒。
构建和生产腺病毒的方法在本领域内公知。参见例如Palmer和Ng在《基因治疗方案：基因转移载体的生产和体内应用》(Gene Therapy Protocols:Production and InVivo Applications of Gene Transfer Vectors)，卷433，第55-78页(2008)中的“第一代腺病毒载体的生产方法(Methods for the Production of First GenerationAdenoviral Vectors)”；还参见Ross等的《冷泉港指南》(Cold Spring HarborProtocols)，2009；doi:10.1101/pdb.prot5011中的“腺病毒载体的构建与鉴定(Construction and Characterization of Adenovirus Vecotors)”。在一些实施方式中，用腺病毒颗粒接种细胞培养物并在收获病毒之前再培养一段时间(如，24到48小时)。从细胞培养物中收获病毒的各种方法在本领域中公知。在一些实施方式中，通过裂解细胞(如，通过机械或非机械裂解方法)从细胞培养物中收获腺病毒。在一些实施方式中，通过加入细胞渗透剂从宿主细胞释放病毒，从细胞培养物中收获腺病毒。
在本发明中可以使用任何腺病毒制备物，其包含来自天然、合成或重组来源的未纯化或部分纯化的腺病毒制备物。未纯化的腺病毒制备物可来自各种来源，包括但不限于，细菌裂解物、酵母裂解物、哺乳动物细胞裂解物、和细胞收获物(如，通过加入细胞渗透剂以从宿主细胞释放病毒)。部分纯化的制备物可来自已由至少一个过滤、层析、沉淀、或分级分离步骤或其任意组合处理的未纯化制备物。在一些实施方式中，腺病毒制备物包括哺乳动物细胞裂解物。在一些实施方式中，腺病毒制备物包括从哺乳动物宿主细胞释放的腺病毒细胞收获物。
在一些实施方式中，所述腺病毒制备物包括一种或多种选自蛋白质(如，宿主细胞蛋白质)、核酸(如，宿主细胞DNA)、不完整病毒颗粒、和外来病毒(如，逆转录病毒)的污染物。在一些实施方式中，所述不纯的制备物包括宿主细胞蛋白质和宿主细胞DNA。
在一些实施方式中，在使不纯的制备物与混合模式色谱支持物接触前，对包括腺病毒的不纯的腺病毒制备物进行处理步骤或纯化步骤。作为一个非限制性实例，在一些实施方式中，在使制备物与混合模式色谱支持物接触前，对不纯的制备物(如，细胞裂解物或细胞收获物)进行过滤或澄清步骤。过滤方法和试剂在本领域中公知；参见例如WO2011/045381和US2011/0207202。作为另一个非限制性实例，在一些实施方式中，在使制备物与混合模式色谱支持物接触前，用核酸酶对不纯的制备物(如，细胞裂解物或细胞收获物)进行处理。用于处理不纯的制备物的合适的核酸酶可商业获得，且用核酸酶处理制备物的方法在本领域中公知。例如，可在混合模式色谱纯化步骤前，将TurboNucleaseTM(精锐公司(Accelagen))加入不纯的制备物至少一个小时。在一些实施方式中，在使不纯的制备物与混合模式色谱支持物接触前，可对制备物进行组合或两个或以上的处理或纯化步骤(如，过滤或澄清步骤与核酸酶处理步骤的组合)。
在一些实施方式中，在使不纯的制备物与混合模式色谱支持物接触前，不对包括腺病毒的不纯的腺病毒制备物进行处理或纯化(如，过滤)步骤。
IV.方法
本发明的方法使用色谱形式的组合以从不纯的制备物中纯化腺病毒，这样的制备物包含宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、和/或不完整病毒颗粒。在一些实施方式中，所述方法涉及在本领域中公知的允许腺病毒与混合模式色谱支持物结合的合适的条件下使用混合模式色谱支持物，起始从不纯的制备物中大规模捕获腺病毒。然后从混合模式色谱支持物洗脱腺病毒并在阴离子交换色谱支持物上进行进一步纯化工艺。
混合模式色谱步骤
在一些实施方式中，在使包括腺病毒的不纯的制备物与混合模式色谱支持物(如，混合模式柱，如，疏水性阳离子交换色谱柱)接触前，柱内的化学环境是平衡的。在一些实施方式中，平衡混合模式支持物以建立合适的pH、电导率和/或盐浓度。完成支持物的平衡，例如，通过使含有适当试剂的平衡缓冲液流过柱。缓冲化合物可包括但不限于组氨酸、磷酸盐、Tris、MES、HEPES、BICINE、和咪唑。在一些实施方式中，所述平衡缓冲液包括组氨酸。在一些实施方式中，所述平衡缓冲液包括约1mM到约50mM(例如但不限于约25mM)的量的组氨酸。
在一些实施方式中，所述混合模式色谱支持物被平衡至约4到约7的pH。在一些实施方式中，所述混合模式色谱支持物被平衡至约5.5到约7(如，约5.5、约6、约6.5、或约7)的pH。在一些实施方式中，所述混合模式色谱支持物被平衡至约6的pH。
包括腺病毒的不纯的制备物还可在将不纯的制备物应用到色谱支持物前，被平衡为兼容色谱支持物平衡缓冲液的条件。在一些实施方式中，所述不纯的制备物通过调节pH、盐的浓度、或其它所希望的化合物来平衡。在一些实施方式中，所述不纯的制备物被平衡至约4到约7的pH。在一些实施方式中，所述不纯的制备物被平衡至约5.5到约7(如，约5.5、约6、约6.5、或约7)的pH。在一些实施方式中，所述不纯的制备物被平衡至约6的pH。
在一些实施方式中，在将不纯的制备物应用于色谱支持物前，所述不纯的制备物在缓冲液中被稀释。在一些实施方式中，所述不纯的制备物在与色谱支持物平衡缓冲液相同或兼容的缓冲液中被稀释。在一些实施方式中，所述不纯的制备物在包括组氨酸的平衡缓冲液中被稀释。在一些实施方式中，所述不纯的制备物在缓冲液(如，平衡缓冲液)中被稀释，不纯的制备物与缓冲液之比为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、或约1:5。
在色谱支持物和不纯的制备物被平衡之后，可使不纯的制备物在允许腺病毒与混合模式支持物结合的条件下与混合模式色谱支持物(如，柱)接触。在一些实施方式中，所述不纯的制备物可与柱以约50-600cm/小时、在一些实施方式中约150-300cm/小时的范围内的线性流速接触，但不受此所限。也可使用其它流速。
在腺病毒与混合模式色谱支持物结合后，在腺病毒实质上保持与支持物结合的条件下任选地用一种或多种试剂洗涤结合的腺病毒，其中一种或多种试剂的存在和量置换和/或去除了一种或多种污染物(如，宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、不完整的病毒颗粒、或外来病毒)。能够使用各种洗涤试剂。在一些实施方式中，所述试剂是组氨酸或另一种盐。也可使用其它洗涤试剂。在一些实施方式中，进行两个、三个、四个、或以上的洗涤步骤。
在一些实施方式中，洗涤试剂(如，组氨酸)以1-100mM的浓度存在。在一些实施方式中，洗涤试剂(如，组氨酸)具有约25mM的浓度。在一些实施方式中，所述洗涤缓冲液具有与平衡缓冲液的pH相同或大致相同的pH。例如，在一些实施方式中，所述洗涤缓冲液具有约5.5到约7(如，约5.5、约6、约6.5、或约7)的pH。在一些实施方式中，所述洗涤缓冲液具有约6的pH。
在任选的洗涤步骤之后，从混合模式色谱支持物洗脱腺病毒。在一些实施方式中，通过提高与结合于支持物的腺病毒接触的溶液的pH、和提高与结合于支持物的腺病毒接触的溶液的离子强度(如，使用盐梯度)的组合来洗脱腺病毒。在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液具有约6.5到约9.5(如，约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、或约9.5)的pH。在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液具有约6.5到8.5的pH。在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液具有约8.5的pH。在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液包括氯化钠或另一种中性盐(如，氯化钾、氯化铵或硫酸钠)。在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液以约100-1000mM(如，约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、或约1000mM)的浓度包括氯化钠或另一种中性盐。
混合模式色谱支持物步骤的一些示例性结合-洗涤-洗脱条件为：
结合条件：0-50mM组氨酸，pH 5.5-7，在缓冲液中
洗涤条件：1-100mM组氨酸，pH 5.5-7，在缓冲液中
洗脱条件：100-1000mM氯化钠，pH 7.5-9.5，在缓冲液中(如，Tris或磷酸盐)
从混合模式色谱支持物的洗脱得到包括部分纯化的腺病毒的混合模式洗脱液。
阴离子交换色谱步骤
在一些实施方式中，使用阴离子交换色谱的第二色谱步骤对所述包括部分纯化的腺病毒的混合模式洗脱液进行进一步纯化。在一些实施方式中，在使包括腺病毒的不纯的制备物与阴离子交换色谱支持物(如，阴离子交换柱)接触前，柱内的化学环境是平衡的。在一些实施方式中，平衡阴离子交换支持物以建立合适的pH、电导率和/或盐浓度。完成支持物的平衡，例如，通过使含有适当试剂的平衡缓冲液流过柱。缓冲化合物可包括但不限于组氨酸、磷酸盐、Tris、MES、HEPES、BICINE、和咪唑。在一些实施方式中，所述平衡缓冲液包括Tris和氯化钠或另一中性盐的组合、或Tris。在一些实施方式中，所述平衡缓冲液以约1mM到约100mM(如，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、或约100mM)的量含有Tris。在一些实施方式中，所述平衡缓冲液以约1mM到约100mM(如，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、或约100mM)的量含有Tris并以约1mM到约300mM(如，约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、或约300mM)的量包括氯化钠或另一中性盐。
在一些实施方式中，所述阴离子交换色谱支持物被平衡至约6.5到约9.5的pH。在一些实施方式中，所述阴离子交换色谱支持物被平衡至约7.5到约9.5(如，约7.5、约8、约8.5、约9、或约9.5)的pH。在一些实施方式中，所述混合模式色谱支持物被平衡至约8的pH。
包括部分纯化的腺病毒的混合模式洗脱液也可在将混合模式洗脱液应用于阴离子交换色谱支持物前被平衡至与阴离子交换色谱支持物平衡缓冲液兼容的条件。在一些实施方式中，所述混合模式洗脱液通过调节pH、盐的浓度、或其它所希望的化合物来平衡。在一些实施方式中，所述混合模式洗脱液被平衡至约6.5到约9.5的pH。在一些实施方式中，所述混合模式洗脱液被平衡至约7.5到约9.5(如，约7.5、约8、约8.5、约9、或约9.5)的pH。在一些实施方式中，所述混合模式洗脱液被平衡至约8的pH。
在一些实施方式中，在将混合模式洗脱液应用于色谱支持物前，所述混合模式洗脱液在缓冲液中被稀释。在一些实施方式中，所述混合模式洗脱液在与阴离子交换色谱支持物平衡缓冲液相同或兼容的缓冲液中被稀释。在一些实施方式中，所述混合模式洗脱液在包括Tris的平衡缓冲液中被稀释。在一些实施方式中，所述混合模式洗脱液在包括Tris和氯化钠或另一中性盐的平衡缓冲液中被稀释。在一些实施方式中，所述混合模式洗脱液在缓冲液(如，平衡缓冲液)中被稀释，混合模式洗脱液与缓冲液之比为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、或约1:5。
在色谱支持物和混合模式洗脱液被平衡后，可使混合模式洗脱液在允许腺病毒与阴离子交换柱结合的条件下与阴离子交换色谱支持物(如，柱)接触。在一些实施方式中，所述混合模式洗脱物可与柱以约50-600cm/小时、在一些实施方式中约150-300cm/小时的范围内的线性流速接触，但不受此所限。
在腺病毒与阴离子交换色谱支持物结合后，在腺病毒实质上保持与支持物结合的条件下任选地用一种或多种试剂洗涤结合的腺病毒，其中一种或多种试剂的存在和量置换和/或去除了一种或多种污染物(如，宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、不完整的病毒颗粒、或外来病毒)。能够使用各种洗涤试剂。在一些实施方式中，所述试剂是氯化钠或另一种中性盐(如，氯化钾、氯化铵或硫酸钠)。在一些实施方式中，所述洗涤溶液还以约1mM到约100mM(如，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、或约100mM)的量含有Tris。
在一些实施方式中，进行两个、三个、四个、或以上的洗涤步骤。在一些实施方式中，在进行超过一个洗涤步骤的情况中，洗涤试剂可以相同或不同。在一些实施方式中，在进行超过一个洗涤步骤的情况中，洗涤试剂可以相同但各个洗涤步骤中使用的试剂的浓度不同(如，在第一洗涤步骤中使用较低浓度的试剂而在第二洗涤步骤中使用较高浓度的试剂)。在一些实施方式中，在进行超过一个洗涤步骤的情况中，洗涤试剂可以相同但各个洗涤步骤中的洗涤溶液的pH不同(如，在第一洗涤步骤中使用较低pH的洗涤溶液而在第二洗涤步骤中使用较高pH的洗涤溶液)。在一些实施方式中，在进行超过一个洗涤步骤的情况在，各个步骤的洗涤试剂可以不同，且各个洗涤步骤的洗涤溶液的pH可以相同或不同。
在一些实施方式中，使用浓度约10-500mM的氯化钠或另一中性盐来进行阴离子交换柱上的第一洗涤步骤。在一些实施方式中，洗涤试剂(如，氯化钠)具有约250mM的浓度。在一些实施方式中，所述洗涤溶液具有与平衡缓冲液的pH相同或大致相同的pH。例如，在一些实施方式中，所述洗涤溶液具有约6.5到约9.5、约7.5到约9.5、或约8的pH。
在一些实施方式中，进行阴离子交换柱上的第二洗涤步骤，其中洗涤试剂与阴离子交换柱上的第一洗涤步骤相同，但洗涤试剂的浓度和/或洗涤溶液的pH与阴离子交换柱上的第一洗涤步骤的洗涤溶液不同。例如，在一些实施方式中，阴离子交换柱上的第二洗涤步骤的洗涤溶液包括浓度约100-600mM的氯化钠或另一中性盐。在一些实施方式中，洗涤试剂(如，氯化钠)具有约450mM的浓度。在一些实施方式中，所述洗涤溶液具有约6.5到约9.5、约7.5到约9.5、约7.5到约8.5、或约8的pH。
在任选的一个或多个洗涤步骤之后，从阴离子交换色谱支持物洗脱腺病毒。在一些实施方式中，用盐梯度洗脱腺病毒(如，0到2M盐或更高)。也可以根据需要应用其它洗脱条件，包括例如通过包含二级改性剂如尿素进行洗脱。在一些实施方式中，使用以约0.5-2M(如，约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、或2M)的浓度包括氯化钠或另一中性盐(如，氯化钾、氯化铵或硫酸钠)的洗脱缓冲液洗脱腺病毒。
阴离子交换色谱支持物步骤的一些示例性结合-洗涤-洗脱条件为：
结合条件：0-100mM Tris，pH 7-9，在缓冲液中
第一洗涤条件：10-500mM氯化钠，pH 7-9，在缓冲液中(如，Tris或磷酸盐)
第二洗涤条件：100-600mM氯化钠，pH 7-9，在缓冲液中(如，Tris或磷酸盐)
洗脱条件：0.5-2M氯化钠，pH 7-9，在缓冲液中(如，Tris或磷酸盐)
在一些实施方式中，从阴离子交换色谱支持物洗脱的腺病毒基本上不含杂质。如本文所述，“基本上不含”是指杂质为纯化的腺病毒的10％或更少，如，少于10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.001％、或0.0001％，通过百万分之一的病毒颗粒测量。各种评估腺病毒的纯度的方法在本领域中公知。例如，在一些实施方式中，洗脱的腺病毒的纯度可通过凝胶电泳(如，SDS-PAGE)分析，并且对应于病毒的结构蛋白质的条带可通过染色而被可视化(如，考马斯蓝染色或SYPRO红宝石染色)。纯化的腺病毒的纯度也可通过测定最终纯化产物中如果存在的宿主细胞蛋白质和/或宿主细胞DNA污染物的量来评估。宿主细胞蛋白质的量例如可通过免疫分析(如，ELISA)测定，且宿主细胞DNA的量例如可通过PCR(如，对管家基因或核糖体RNA基因进行定量PCR)测定。
在一些实施方式中，与开始的不纯的制备物相比，从阴离子交换色谱支持物洗脱的最终纯化产物高度浓缩腺病毒。在一些实施方式中，最终纯化产物包括浓度为至少10×1010病毒颗粒/mL(如，至少10×1010、至少20×1010、至少30×1010、至少40×1010、至少50×1010、至少60×1010、至少70×1010、或至少80×1010病毒颗粒/mL)的腺病毒。确定腺病毒浓度的方法在本领域中公知。参见例如US7,316,898。
在一些实施方式中，包括腺病毒的最终纯化产物具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或以上的开始的不纯的制备物(如，细胞裂解物或细胞收获物)的腺病毒活性。测定腺病毒活性的方法在本领域中公知。参见例如，US7,579,181。在一些实施方式中，包括腺病毒的最终纯化产物(如，从阴离子交换色谱步骤回收的洗脱液)的活性可通过比较色谱前后的感染性来确定(如，比较不纯的制备物的感染性与纯化产物的感染性)。在一些实施方式中，腺病毒活性使用血凝试验测定。血凝试验在本领域中公知。参见例如，Virocyt.com在2013年4月发布的“病毒定量技术概述(An Overview of VirusQuantification Techniques)”。
V.试剂盒
在其它方面中，本发明提供了用于本发明所述方法的试剂盒。试剂盒能够任选地包括书面说明书(例如，CD-ROM或DVD上)以及包装材料。在一些实施方式中，所述试剂盒包括(1)预填充的包括疏水性和阳离子交换部分的混合模式色谱支持物，和(2)预填充的阴离子交换支持物。在本文的方法(如，平衡、洗涤和/或洗脱溶液)的内容中所述的其它试剂也能够任选地包含在试剂盒中。
VI.实施例
提供以下实施例以说明而非限制所要求的发明。
使用混合模式和阴离子交换色谱纯化腺病毒
绪论
腺病毒载体是将遗传物质转移到哺乳动物细胞中的有效工具。它们提供几个优点，包括：可容纳多达37kb的外来遗传物质的能力；非常高的感染效率，感染多种细胞类型(分裂和非分裂)的能力；它们的基因组很少整合到宿主染色体中；目前的生产系统能够产生高病毒滴度。在基础研究和基因治疗研究应用中，这些和其它品质导致腺病毒载体相当普遍。事实上，腺病毒是实验性治疗中使用最多的基因转移载体，占所有基因治疗试验的四分之一，截至2014年，已经有近500个临床试验使用了腺病毒。
用于临床应用的大规模的病毒下游处理造成与通常遇到的许多其它生物治疗剂如蛋白质不同的挑战。这些独特的挑战部分来自病毒的大尺寸和复杂性。在腺病毒的情况下，一个完整的病毒颗粒(vp)含有超过2700个蛋白质亚基，质量约为165MDa，直径为0.1μm。颗粒的复杂性产生了数以千计的电荷变化，使得难以在带电的分离介质上建立明确的结合和洗脱条件。其尺寸防止使用纳米过滤去除诸如逆转录病毒的有利试剂。另外，腺病毒倾向于酸不稳定，这意味着低pH孵育也不能作为逆转录病毒清除的工具。由于病毒包含许多不同类型的蛋白质，因此难以使用传统的电泳方法来评估纯度和监测下游工艺开发过程中的进展。由于饲料蒸汽富含游离的病毒成分，ELISA和相关方法在下游工艺开发过程中监测产品浓度和回收的效用有限。另外，应该注意确保载体的基因有效载荷不干扰宿主细胞DNA分析。
材料和色谱方法
本研究中使用的病毒Ad5-E1+GFP是5型血清型的人腺病毒，E1a基因缺失，并用编码维多利亚绿色荧光蛋白(GFP)的DNA取代。在HyClone DMEM/高葡萄糖+2％FBS中生长的HEK-293细胞中扩增重组腺病毒。细胞培养物每个细胞接种3个细胞灶形成单位(FFU)单位。
通过将细胞渗透剂(Somatek公司)加入到培养物(每升培养基10mL)中以从宿主细胞释放病毒来完成接种后36小时的病毒收获物。然后通过0.2μm过滤去除细胞。将TurboNuclease(精锐公司)加入过滤的收获物(200μL/L)中，不少于1小时，然后进行色谱纯化病毒。
使用Foresight预填充的8×100mm(5.0mL)柱产生大规模捕获(混合模式色谱)和阴离子交换操作的数据。流速保持恒定在1.0mL/分钟。(＝12CV/小时＝120cm/小时)。
混合模式色谱：用(25mM组氨酸，pH 6.0)平衡NuviaTMcPrimeTM疏水性阳离子交换柱。以一份收获对三份缓冲液的比例将60mL的Turbo核酸酶处理的病毒培养物上清液与(25mM组氨酸，pH 6.0)掺混，并泵送过柱。在加载之后，用24mL(25mM组氨酸，pH6.0)洗涤柱，并用(75mM Tris，525mM NaCl，pH 8.5)洗脱部分纯化。
阴离子交换层析：用(75mM Tris，250mM NaCl，pH 8.0)平衡NuviaTMQ阴离子交换柱。以一份收获物对一份缓冲液的比例将混合模式洗脱液与(75mM Tris，pH 8.0)掺混，并泵送过柱。在加载之后，先后用9mL的(75mM Tris，250mM NaCl，pH 8.0)和15mL的(75mMTris，440mM NaCl，pH 8.0)洗涤柱。用(75mM Tris，1000mM NaCl，pH7.5)洗脱纯化的病毒。
病毒定量
FFU测定：将病毒样品的十倍系列稀释液一式四份地施用于在48孔组织培养板(每孔7×104个细胞)中生长的HEK-293细胞。培养物保持十天并监测病毒诱导的细胞病变影响(CPE)。然后使用Spearman&算法计算TCID50，并乘以0.69以确定荧光形成单位(FFU)值。
转基因表达：将三倍连续稀释的病毒样品一式三份地施用于在96孔组织培养板(60-90％汇合)中生长的HEK-293细胞。在病毒施用18小时后，细胞裂解，并通过荧光光谱确定相对GFP浓度。
总病毒：光谱仪评估纯化的病毒制备物(或其稀释物)。将样品与等体积的0.2％SDS混合，在260nm和280nm测定吸光度。总病毒浓度使用下式确定。
OD260×稀释因子1.1×1012颗粒
注：总病毒测定仅当AU260＝0.7±0.2和AU260/AU280＝1.3±0.1均满足时使用。
报告：选择不同的方法分析样品，以协调不同的技术。除另有说明外，病毒量以总病毒颗粒形式提供，浓度以vp/mL表示。感染复数(MOI)确定为48vp/FFU。
纯度评估
凝胶电泳：用Bio-Safe考马斯蓝染料(伯乐实验室公司)染色的Criterion Tris-HCl 4-20％梯度凝胶(伯乐实验室公司)进行SDS-PAGE分析。
宿主细胞蛋白质(HCP)：HCP水平通过HEK-293HCP ELISA试剂盒(天鹅技术公司(Cygnus Technologies))确定
宿主细胞DNA：从测试样品中提取DNA，并使用针对人18S核糖体RNA基因的63个碱基对区域的引物和探针进行定量PCR分析。读数与定量的HEK-293DNA标准曲线进行比较。在ABI Prism 7000序列检测系统上运行和分析Q-PCR反应。
结论
使用Nuvia TM cPrime TM混合模式树脂完成腺病毒的大规模捕获(图1)。该过程的这一部分实现了处理体积的10倍减少和原料污染物的显著减少(图3，泳道2至4)。
在使用(75mM Tris，525mM NaCl，pH8.5)洗脱缓冲液(图1，下图)之后，使用当前程序产生的色谱图的显著特征是双峰。第一个峰(4:29)与盐锋同时发生，而第二个峰(4:33)大概相当于pH值偏移。两者均含有显著的病毒，因此产品收集跨越两峰。单独提高pH或离子强度都不能获得满意的病毒回收的洗脱。
最终病毒纯化使用NuviaTMQ树脂(图2)完成。该过程的这一部分实现了产物体积的额外的2倍减少，同时产品纯度显著改善(图3，泳道4至7)。在该操作之后，非病毒蛋白质通过SDS-PAGE不再明显(图3，泳道7)。
每个色谱操作进行三次，结果相同。
关于去除污染蛋白质的进展可以用SDS-PAGE显示(图3)。病毒培养收获物中最显著的是细胞培养基组分如白蛋白和转铁蛋白(泳道2)。在混合模式流通(泳道3)中可以看到收获物的大部分蛋白质，在混合模式洗脱液(泳道4)中具有大量的病毒和较少丰度的污染物。在阴离子交换操作期间，病毒与树脂结合，而污染物流过(泳道5)或被预洗脱(泳道6)。容易地在最终产物(泳道7)中观察到五种最显著的病毒蛋白质(六邻体、五邻体、核(V)、六邻体(VI)、和核(VII))。
沿着下游过程的选择点评估病毒浓度和DNA水平(表1)。在收获时，病毒通过透化而不是裂解细胞来从宿主细胞释放。然后通过过滤去除细胞。结果，初始DNA和HCP水平低于腺病毒粗制大量收获物(第1行和第2行)的情况。澄清的收获物的内切核酸酶处理进一步减少了可检测的宿主DNA(第2行)。在色谱纯化病毒(第7行)后，HCP水平低，而宿主细胞DNA低于可检测限。
表1：过程中间体和最终产品的病毒和DNA浓度。
结论
两步色谱工艺产生具有与临床级产品相当的纯度的活性的浓缩病毒产物，宿主细胞蛋白(HCP)和DNA水平。预期纯化方法通常适用于重组腺病毒，尤其适用于来自血清型5病毒的构建体。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

Claims (20)

1.一种从不纯的制备物纯化腺病毒的方法，所述方法包括：
(a)在允许腺病毒与混合模式色谱支持物结合的条件下使包括腺病毒的不纯的制备物与混合模式色谱支持物接触，其中混合模式色谱支持物是疏水性阳离子交换色谱支持物；
(b)从混合模式色谱支持物中洗脱腺病毒，从而形成混合模式洗脱液；
(c)在允许腺病毒与阴离子交换支持物结合的条件下使混合模式洗脱液与阴离子交换色谱支持物接触；以及
(d)从阴离子交换色谱支持物中洗脱腺病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺病毒是重组腺病毒。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述腺病毒是血清型5腺病毒。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述不纯的制备物包括一种或多种选自蛋白质、核酸、不完整病毒颗粒、和外来病毒的污染物。
5.如权利要求4中所述的方法，其特征在于，所述不纯的制备物是细胞培养收获物，并且所述污染物包括宿主细胞蛋白质和宿主细胞DNA。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之前，用核酸酶处理包括腺病毒的不纯的制备物。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，与混合模式色谱支持物接触的不纯的制备物是在缓冲液中被稀释的细胞培养收获物。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述不纯的制备物在与混合模式色谱支持物接触时具有约5.5到约7.0的pH。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在步骤(a)之后，用第一洗涤溶液洗涤混合模式色谱支持物，其中腺病毒保持与混合模式色谱支持物结合。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一洗涤溶液包括至少1mM组氨酸。
11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述洗脱包括提高和与混合模式色谱支持物结合的腺病毒接触的溶液的pH。
12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，用包括至少100mM氯化钠的缓冲液从混合模式色谱支持物中洗脱所述腺病毒。
13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其特征在于，所述混合模式洗脱液在与阴离子交换色谱支持物接触时具有约6.5到约8.5的pH。
14.如权利要求1～13中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述与阴离子交换色谱支持物接触的混合模式洗脱液在缓冲液中被稀释。
15.如权利要求1～14中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在步骤(c)之后，用第二洗涤溶液洗涤阴离子交换色谱支持物，其中腺病毒保持与阴离子交换色谱支持物结合。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第二洗涤溶液包括至少10mM氯化钠。
17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在用第二洗涤溶液洗涤之后，用第三洗涤溶液洗涤阴离子交换色谱支持物，其中腺病毒保持与阴离子交换色谱支持物结合。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述第三洗涤溶液包括至少100mM氯化钠。
19.如权利要求1～18中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，用包括至少0.5M氯化钠的缓冲液从阴离子交换色谱支持物中洗脱所述腺病毒。
20.如权利要求1～19中任一项所述的方法，其特征在于，包括在步骤(d)中洗脱的腺病毒的纯化产物具有最初的包括腺病毒的不纯的制备物的至少50％的腺病毒活性。
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