KR101906319B1 - 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드의 정제방법 - Google Patents

재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드의 정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드(Junction Opener; JO)의 정제방법에 관한 것이다.

Description

재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드의 정제방법 {PROCESS FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT ADENOVIRUS TYPE 3 FIBER POLYPEPTIDE}
본 발명은 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드(Junction Opener; JO)의 정제방법에 관한 것이다.
데스모글레인 2 (Desmoglein 2, DSG2)는 카데린 (cadherin) 단백질 패밀리에 속하는 칼슘-결합 막횡단 당단백질이다. 상피세포에서, DSG2는 세포-세포 부착 구조의 구성성분이다. DSG2의 세포질측 테일 (tail)은 세포 부착 및 세포간 접합 (intracellular junction)의 조절자와 직접 접촉하는 일련의 단백질과 상호작용한다. DSG2는 위암, 편평세포암종, 흑색종, 전이성 전립선암 및 방광암을 포함하는 일련의 상피 악성종양에서 과발현된다.
아데노바이러스는 A부터 F까지 6종으로 분류할 수 있다. 대부분의 아데노바이러스는 콕사키-아데노바이러스 수용체 (Coxackie-Adenovirus receptor)를 통해 세포 내로 침투한다. 그러나 종 B 아데노바이러스에 해당하는 아형 (3형, 7형, 14형 등)은 DSG2를 통해 세포 내부로 침투한다고 알려져 있다. 예를 들어, 3형 아데노바이러스는 구조적인 변이를 일으켜 정십이면체 파티클 (dodecahedral particles, penton-docecahedrons(PtDds))을 이루면서 표면 노브 (knob)를 약 10 nm 거리로 가까이 근접시킨 후 DSG2에 부착된다. 상피세포에서, DSG2에 아데노바이러스가 결합하면 상피간엽이행 (ephitheial-tomesenchymal transition, EMT)을 연상시키는 현상들을 촉발하여, 세포간 접합을 일시적으로 개방시킨다. 이 개방은 세포간 접합부에 갇혀있는 수용체, 예를 들어 CD46 및 Her2/neu에 대한 접근을 향상시킨다.
3형 아데노바이러스의 노브 부위를 모사한 단백질을 인공적으로 제조하면 DSG2에 강한 부착성을 지닌 단백질을 얻을 수 있다. WO2011-156761호는 (a) 1 이상의 AdB-2/3 (DSG2 수용체를 이용하는 모든 아데노바이러스 아형 (3형, 7형, 14형 포함)으로 정의됨) 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인 모티프; (b) 상기 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인 모티프에 작동가능하게 연결되고 C-말단에 위치한 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 노브 (knob) 도메인; 및 (c) 상기 1 이상의 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인 모티프에 작동가능하게 연결되고 N-말단에 위치한 1 이상의 비-AdB-2/3-유도된 이량체화 도메인을 포함하는, 재조합 AdB-2/3 섬유 폴리펩타이드를 개시하고, 이를 JO-1(Junction Opener-1)이라 명명하였다. 나아가, WO2015/048081호 및 WO2014-052322호는 JO-1에 비해 증가된 DSG2 결합능을 갖는 돌연변이체, 예를 들어 JO-2 및 JO-4 등을 개시하고 있다.
한편, 인공적인 재조합 단백질을 생산하기 위한 일반적인 방법으로는, 대장균, 효모, 동물세포 등의 다양한 세포주 내로 재조합 단백질 발현벡터를 도입하여 형질전환하고, 형질전환 세포주를 배양하여 목적 단백질을 발현시킨 후, 세포를 파쇄하여 발현된 단백질을 분리·정제하는 방법이 있다. 여기서 단백질의 분리·정제를 위한 방법으로는 분자의 크기나 질량을 이용하는 원심분리, 겔 여과 및 투석 방법; 전하 특성을 이용하는 이온 교환 크로마토그래피, 전기영동 및 등전 초점화 (Isoelectric focusing) 방법; 용해도를 이용하는 pH 변화, 이온강도 변화 및 유전상수 감소 방법; 그리고 특이적 결합 부위를 이용하는 친화성 크로마토그래피 및 친화성 용출 방법 등이 사용되고 있다. 그러나, 재조합 단백질의 효율적인 분리·정제를 위해서는 개별 단백질의 특성을 고려하여 최적화된 기술을 개발하여 적용하여야 할 필요가 있다.
종래의 JO 단백질들은 DSG2에 대해 높은 친화도를 가지나, 정제시 생산 수율이 현저히 떨어지고 물에 대한 용해도가 낮아 응집 (aggregation)이 일어나며, 생산 균주로부터 유래한 불순물인 엔도톡신 (endotoxin)을 제거하기 어려운 심각한 문제점을 가지고 있었다.
본 발명의 목적은, 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드를 증가된 수용해도, 높은 순도, 낮은 엔도톡신 수준, 높은 생산 수율로 제공할 수 있는 정제방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 1) 태그 서열을 갖는 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드를 이를 발현하는 세포로부터 카오트로픽 시약 (chaotropic agent) 존재 하에 추출하는 단계; 2) 단계 1)의 추출물에 대해, 카오트로픽 시약 존재 하에 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 폴리펩타이드를 정제하는 단계; 3) 단계 2)에서 정제된 폴리펩타이드를 리폴딩(refolding)시키는 단계; 4) 단계 3)에서 얻은 폴리펩타이드로부터 태그 서열을 제거하는 단계; 5) 단계 4)에서 얻은 폴리펩타이드에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 폴리펩타이드를 추가적으로 정제하는 단계; 및 6) 단계 5)에서 얻은 폴리펩타이드에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 폴리펩타이드를 추가적으로 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드의 정제 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서, 'JO(Junction Opener) 단백질' 또는 'JO'는 3형 아데노바이러스 노브를 모사하여 DSG2 단백질에 부착성을 지닌 재조합 단백질을 가리킨다. 'JO 단백질' 또는 'JO'는 '재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드'와 교체해서(interchangeably) 사용될 수 있다. JO 단백질의 경우 아미노산 서열의 변형이 가능하므로, 아미노산 서열이 변형된 JO 단백질을 'JO 변이체'라 하고, 이는 예를 들어 JO-1, JO-2, JO-4 등으로 명명한다.
본 발명에서, '태그(tag)' 또는 '태그 서열(tag sequence)'은 단백질의 분리 및 정제를 위해 필요한 아미노산 서열, 예를 들어 히스티딘(His) 태그 또는 라이신(lys) 태그 등을 가리킨다. 재조합 단백질의 경우, His 태그, Lys 태그 등의 태그 서열을 비롯한 다양한 아미노산 서열을 부가적으로 포함할 수 있다. 태그 서열은 단백질 정제 칼럼과의 친화도를 지니는 특성으로 인해, 단백질의 분리 및 정제를 용이하게 하는 장점을 지니고 있다. 태그 서열을 갖는 JO 단백질은 물에 대해 현저히 낮은 용해도를 가지고, 이러한 낮은 수용성은 JO 단백질의 생산 및 활용에 지장을 초래할 수 있는데, 예를 들어, JO 단백질의 낮은 수용성으로 인해 단백질의 생산 수율이 낮고, 생산 균주에서 유래된 불순물인 엔도톡신 제거가 비효율적이며, 의료적 적용에도 제한을 초래할 수 있다.
본 발명은 낮은 엔도톡신, 고순도, 고수율의 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드를 얻는 정제방법을 제공하기 위한 것으로서, 세포 파쇄, 정제 및 농축 단계까지 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드에 최적화된 신규한 정제방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 측면은, 1) 태그 서열을 갖는 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드를 이를 발현하는 세포로부터 카오트로픽 시약(chaotropic agent) 존재 하에 추출하는 단계; 2) 단계 1)의 추출물에 대해, 카오트로픽 시약 존재 하에 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 폴리펩타이드를 정제하는 단계; 3) 단계 2)에서 정제된 폴리펩타이드를 리폴딩(refolding)시키는 단계; 4) 단계 3)에서 얻은 폴리펩타이드로부터 태그 서열을 제거하는 단계; 5) 단계 4)에서 얻은 폴리펩타이드에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 폴리펩타이드를 추가적으로 정제하는 단계; 및 6) 단계 5)에서 얻은 폴리펩타이드에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 폴리펩타이드를 추가적으로 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드의 정제 방법에 관한 것이다.
상기 단백질 추출, 친화성 크로마토그래피, 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 등의 공정은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 수행되는 방법에 의해 특별한 제한 없이 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드는 (a) 하나 이상의 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인 모티프; (b) 상기 하나 이상의 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인에 작동 가능하게 연결되고 C-말단에 위치한 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드 노브(knob) 도메인; 및 (c) 상기 하나 이상의 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드 샤프트 도메인 모티프에 작동 가능하게 연결되고 N-말단에 위치한 하나 이상의 비-아데노바이러스 3형-유래된 이량체화 도메인을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 이량체화 도메인이 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고/거나, 상기 샤프트 도메인 모티프가 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고/거나, 상기 노브 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 태그 서열이 히스티딘 태그일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 카오트로픽 시약은 우레아, 티오우레아, 리튬퍼클로레이트 및 구아니딘 하이드로클로라이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 단백질 내 비공유 결합의 절단 등을 통해 단백질을 언폴딩시키기 위해 사용될 수 있는 시약 중에서 특별한 제한 없이 통상의 기술자가 본 발명의 목적을 고려하여 선택하고 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 1)에서 카오트로픽 시약의 농도는 약 4 내지 8 M일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 카오트로픽 시약의 농도는 약 4 내지 7 M, 약 4 내지 6 M, 약 5 내지 8 M, 약 6 내지 8 M, 약 5 내지 7 M, 또는 약 6 M일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 2)에서 카오트로픽 시약의 농도는 약 1 내지 10 M일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 카오트로픽 시약의 농도는 약 2 내지 10 M, 약 4 내지 10 M, 약 1 내지 8 M, 약 1 내지 6 M, 약 2 내지 8 M, 또는 약 4 내지 6 M일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 3)에서 약 2 M 이하의 농도로 희석된 카오트로픽 시약을 이용하여 폴리펩타이드를 리폴딩 시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 카오트로픽 시약은 약 1.6 M 이하, 약 1.2 M 이하, 약 1 M 이하, 약 0.6 M 이하, 또는 약 0.2 M 이하로 희석된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 3)에서 염을 함유하지 않는 완충액에서 폴리펩타이드를 리폴딩 시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 2)에서 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 경우, pH가 7 내지 9인 완충액에서 폴리펩타이드를 리폴딩 시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 pH는 약 8일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 태그 서열을 갖는 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드는, 태그 서열과 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드 서열 사이에 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 4)에서 유비퀴틴 분해효소를 가하여 태그 서열을 제거하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 6)에서 양이온 교환 크로마토그래피를 2 회 이상 반복 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회 또는 7 회 이상 반복 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있고, 원하는 단백질 수율, 순도 및 엔도톡신 함량에 따라 수행 횟수를 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 6)에서 양이온 교환 크로마토그래피를 약 pH 7 이상에서 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이 때 pH를 증가시킴으로써 최종 정제 단백질을 순도를 추가적으로 상승시킬 수 있으며, 예를 들어 상기 양이온 교환 크로마토크래피는 약 pH 7.5 이상, 약 pH 8 이상, 약 pH 8.5 이상, 또는 약 pH 9 이상에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 6)에서 얻은 폴리펩타이드에 대해 겔 여과를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 겔 여과는 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 수행되는 겔 여과 방법에 의해 특별한 제한 없이 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 단백질의 응집을 줄이고 약 10 EU/mg 수준으로 엔도톡신 함량을 낮춘 고순도, 고수율의 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드 JO-4 단백질을 얻을 수 있는 정제공정을 확립할 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면 친화성 크로마토그래피와 이온 교환 크로마토그래피, 그리고 임의로 겔 여과 공정 등을 특정 순서 내지 조합으로 수행함으로써 JO-4 단백질의 순도 및 수율을 획기적으로 증가시키고 엔도톡신 함량을 크게 낮출 수 있으며, 이러한 공정을 활용하여 산업적으로 이용가능한 수준의 JO-4 단백질을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 재조합 JO-4 발현벡터인 pAPTH6UbJO4의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드 정제방법의 순서도이다.
(1) 단백질 추출 [단계 1)]
태그 서열을 갖는 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 카오트로픽 시약을 포함하는 용균 완충액(lysis buffer)으로 처리하고, 초음파처리, 균질화 등의 방법으로 세포를 파쇄하여 원심 분리, 미세여과 등의 방법으로 정제(clarification)할 수 있다.
상기 카오트로픽 시약으로는 우레아, 티오우레아, 리튬퍼클로레이트 및 구아니딘 하이드로클로라이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 우레아를 사용할 수 있다. 우레아와 같은 카오트로픽 시약을 사용함으로써, 불용성 또는 불완전한 수용성으로 발현된 JO-4 융합단백질을 수용성 단백질로 추출 및 분리할 수 있다. 이 때, 카오트로픽 시약의 농도는 4 내지 8 M일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
(2) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피( IMAC ) 및 양이온/음이온 교환 크로마토그래피(CEX/AEX) [단계 2), 5) 및 6)]
친화성 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 방법이 폴리펩타이드의 정제를 위해 사용될 수 있다.
친화성 크로마토그래피는, 분리하고자 하는 물질과 선택적으로 결합할 수 있는 리간드를 불용성 지지체에 결합시켜 만든 리간드-기질(ligand-matrix) 복합체를 컬럼에 채우고 여기에 시료를 통과시키면 리간드에 선택적으로 결합할 수 있는 물질은 컬럼에 남고 친화력이 없는 물질은 모두 용출되는 원리를 이용하는 것이다. 이후 리간드에 결합되어 있는 물질의 용출은 용출액의 pH 또는 이온 강도를 변화시키거나 리간드에 친화력이 강한 물질을 용출액에 첨가함으로써 수행될 수 있다. NTA (Nitrilotriacetic acid)는 다양한 금속이온을 킬레이팅(chelating)하므로, Ni을 붙이고 지지체와 연결하여 수지(resin)로 사용하고 히스티딘 태그 (histidine tag)를 이용하여 히스티딘의 이미다졸 링과 니켈 같은 2가 금속이온과 배위결합을 형성하고, 정제 후에는 고농도의 이미다졸을 넣어주어 히스티딘을 유리시켜 단백질을 용출할 수 있다 [단계 2)].
이온 교환 크로마토그래피는 전하를 띤 불용성 물질인 이온 교환 수지를 이용하여 이온 화합물들을 분리하는 방법이다. 이온 교환 수지로 충전된 컬럼에 분리하고자 하는 혼합물을 가하고 적당한 완충액으로 용출시키면 혼합물의 각 성분과 이온 교환 수지간의 상호 작용의 세기에 따라 각 물질의 이동속도에 차이가 생겨 서로 분리된다. 이온 교환 수지는 불용성인 합성수지, 아가로오스, 셀룰로스, 덱스트란 등에 양 또는 음전하를 갖고 있는 작용기를 결합시킨 것으로서, 양이온과 결합할 수 있는 양이온 교환 수지는 -SO3-, -COO- 등의 음전하를 띤 작용기를 가지며 음이온과 결합할 수 있는 음이온 교환 수지는 -N+H3, -N+R3 등의 양전하를 띤 작용기를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
일 구체예에서, 양이온 교환수지는 CM 세파로스 또는 SP 세파로스 등, 특히 SP 세파로스를 사용할 수 있고 [단계 2) 및 단계 6)], 음이온 교환 수지로는 Q 세파로스 또는 DEAE 세파로스 등, 특히 Q 세파로스를 사용할 수 있다 [단계 5)]. 양이온 교환 수지를 이용하여 단백질을 분리하면 양전하를 가장 적게 띠고 있는 단백질이 가장 먼저 용출되고 양전하를 가장 많이 띠고 있는 단백질이 가장 늦게 용출된다 [단계 2) 및 단계 6)]. 음이온 교환 수지의 경우는 이와 반대의 원리로 단백질이 정제된다 [단계 5)].
단계 2)에서 적용되는 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피는 카오트로픽 시약 존재 하에 수행된다. 이 때의 카오트로픽 시약으로는 단계 1)의 단백질 추출 공정에서 사용될 수 있는 것과 동일한 종류의 시약이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 우레아를 사용할 수 있다. 우레아 등의 카오트로픽 시약의 농도는 약 1 내지 10 M인 것이 바람직하며, 크로마토그래피를 위한 완충용액의 pH는 7 내지 9인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
단계 6)에 적용되는 양이온 교환 크로마토그래피는 예를 들어 2회 이상, 바람직하게는 2회 반복 수행할 수 있고, 또한, 바람직하게는 pH 7 이상, 보다 바람직하게는 pH 8 이상, 구체적으로 pH 8에서 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
(3) 단백질 리폴딩(refolding) [단계 3)]
본 단계에서는, 단계 1) 및 단계 2)를 거쳐 언폴딩된 수용성 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드가 리폴딩된다. 리폴딩은 카오트로픽 시약의 농도를 감소시킴으로써 수행될 수 있으며, 예를 들면 우레아 등의 카오트로픽 시약의 농도를 2 M 이하로 되도록 희석시킴으로써 상기 폴리펩타이드가 리폴딩될 수 있다. 이 때 희석배수는 우레아 등의 카오트로픽 시약 농도를 목적하는 수준으로 낮출 수 있도록 하는 것으로, 통상적으로 약 4배 이상, 바람직하게는 4 내지 10배가 될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 리폴딩 완충액은 염을 함유하지 않는 것(salt free)이 바람직하다. 단계 2)에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 경우에는, 리폴딩 완충액은 pH 7 내지 9 범위를 유지시킬 수 있는 것이 바람직하다.
(4) 태그 서열 제거 [단계 4)]
본 단계에서는, 태그 서열을 갖는 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드로부터 태그 서열을 제거한다. 일 구체예에서, 태그 서열과 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드 서열 사이에 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 이 경우, 유비퀴틴 분해효소를 가하여 태그 서열을 제거할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[ 제조예 ] 6X His-태그(tag)와 유비퀴틴을 N-말단에 갖는 JO-4 ( H6Ub JO- 4)의 생산
융합단백질인 H6JO-4는 pET29a/H6JO4를 주형으로 하여, 융합파트너와 결합되도록 PCR을 실시하였다. 절단부위를 가지는 유비퀴틴이 6X His-태그와 함께 N-말단에 위치할 수 있도록, K6Ub 유전자를 주형으로 하여 H6Ub-링커를 PCR로 증폭하고, 이를 각각 JO-4를 주형으로 PCR 증폭한 링커-JO-4에 오버랩 PCR을 함으로써 H6Ub JO-4를 제작하였다. H6Ub JO-4의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 8에, 단백질 서열이 서열번호 9에 나타나 있다. 제작된 H6Ub JO-4를 pAPT(APTech's 발현벡터, 미국특허 제7,771,970호 참조)와 깁슨 어셈블리 (Gibson assembly) 방법으로 결찰(ligation)을 진행하여 pAPTH6UbJO4 벡터를 제작하였다 (도 1).
제조된 발현벡터인 pAPTH6UbJO4을 E. coli에 형질전환시켜 얻은 재조합 대장균을 5L 2X LB 액체배지에서 37℃에서 배양하였다. 복합 배지를 이용한 배양의 경우 단백질의 정제 수율이 낮았으므로, 2X LB 액체배지를 이용하는 것이 바람직한 것으로 확인되었다. 이어서, 1 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하여 6X His-태그와 유비퀴틴을 N-말단에 갖는 JO-4를 생산하였다.
[비교예 1] 수용성 H6Ub JO-4 분리정제공정 (IMAC → CEX)
수용성 H6Ub JO-4 분리정제를 위해 2X LB 배지로 발효한 습윤 세포(wet cell)를 사용하였다. 첫 번째 정제 단계인 IMAC 정제 공정의 운용조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00001
이어서, UBP 효소로 절단된 JO-4 단백질을 SP FF 컬럼을 이용하여 아래의 운용 조건으로 CEX 정제하였다.
Figure 112017120699100-pat00002
정제 완료 후 SDS-PAGE 확인 결과, 순도는 높지 않지만 복합 배지(Complex media)로 발효한 습윤 세포를 사용하였을 때와 달리 JO-4 단백질은 컬럼에 원활하게 결합되었고, 정제된 단백질을 확인할 수 있었다. 단백질 정량 결과 최종 정제 수율은 2.2 mg/L 로 확인되었다.
[비교예 2] 수용성 H6Ub JO-4 분리정제공정 (IMAC → AEX → IMAC → CEX)
수용성 H6Ub JO-4 분리정제를 위해 2X LB 배지로 발효한 습윤 세포를 사용하였다. 첫 번째 정제 단계인 IMAC 정제 공정의 운용조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00003
첫 번째 IMAC 정제 공정에서 획득한 정제된 샘플에 UBP 효소를 처리하여 융합단백질을 JO-4 단백질로 절단시킨 후, Q FF 컬럼으로 AEX 정제를 시도하였다. 이 때 컬럼의 운용조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00004
AEX 정제공정에서 JO-4 단백질과 H6Ub 단백질이 포함된 Ft를 회수한 샘플을 이용하여 IMAC Ft 모드로 정제 하였다. 이 때 컬럼의 운영 조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00005
이어서, IMAC Ft 모드로 진행하여 획득한 JO-4 단백질이 포함된 Ft샘플의 순도를 개선하기 위하여 SP FF 컬럼 정제를 시도하였다. 이 때의 컬럼 운용조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00006
이후, SP FF 컬럼에 로딩하기 전에 결합이 원활하게 이루어질 수 있도록 하기 위하여 샘플의 pH 를 5.5로 보정하였다. 이로 인해 정제된 JO-4 단백질을 얻을 수 있었지만, 여러 단계의 정제 공정을 거치면서 많은 손실이 발생하였고 이 때의 최종 생산 수율은 0.5 mg/L 정도의 수준을 보여주었다.
[ 비교예 3] 수용성 H6Ub JO-4 분리정제공정 ( IMAC → AEX → CEX )
수용성 H6Ub JO-4의 분리정제를 위해 2X LB 배지로 발효한 습윤 세포를 사용하였다. 첫 번째 정제 단계인 IMAC 정제 공정의 운용 조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00007
IMAC 정제 공정 단계에서 획득한 분획 3,4 샘플에 UBP 효소를 처리하여 융합단백질을 H6Ub 와 JO-4 단백질로 절단하였고, NaCl로 인한 결합 저해를 없애기 위하여 A 완충액으로 5배 희석한 후 Q FF 컬럼에 주입하였다. 이 때 컬럼의 운영 조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00008
AEX 정제 공정에서 회수한 Ft 샘플에서 H6Ub 단백질을 제거하고 폴리싱(polishing)하기 위해 CEX 정제 공정을 진행하였다. 이 때의 컬럼 운용 조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00009
H6Ub 단백질은 30% B 완충액을 이용한 세척 단계에서 완전히 제거되었으며, 80% B 완충용액을 흘려 주어 JO-4 단백질을 회수하였다. 이 때 회수된 JO-4 단백질의 최종 수율은 2.5 mg/L 였으며 엔도톡신 수준은 27 EU/ml 로 확인되었다.
[ 실시예 1] 불용성 H6Ub JO-4 리폴딩 및 정제공정 ( IMAC → 리폴딩 → AEX → CEX)
상기 비교예에서 확인된 바와 같이, 수용성 단백질로 발현된 JO-4 단백질을 정제하기 위한 연구에서 최대 2.5mg/L정도의 낮은 수율(생산성)이 나타났다. 이에 단백질 생산성을 높이기 위한 방안으로, 고농도 배양을 통해 발효된 세포의 파쇄 단계부터 첫 번째 정제 공정 단계까지 우레아(요소) 완충용액을 도입함으로써 정제 수율을 향상시키는 연구를 진행하였다
세포파쇄 시 6M 우레아를 완충용액에 첨가하였고, 첫 번째 정제 공정인 IMAC 완충용액에도 6M 우레아를 첨가하여 불용성 H6Ub JO-4 융합단백질을 수용화된 단백질 형태로 회수하였다. 회수된 단백질은 우레아의 농도를 낮춰 리폴딩이 진행될 수 있는 공정을 추가하였고, 이 때 우레아의 농도를 낮추기 위해 인산나트륨(sodium phosphate) 용액을 사용하였다. 리폴딩 진행 후 UBP 효소를 처리하고, 이어서 CEX 및 AEX 정제 공정을 추가 수행함으로써 정제를 완료하였다. 본 실시예에서 각각 수행된 정제 공정들의 운용 조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00010
Figure 112017120699100-pat00011
Figure 112017120699100-pat00012
Figure 112017120699100-pat00013
Figure 112017120699100-pat00014
이 공정에서의 정제 수율은 73 mg/L로 나타났다. 즉, 정제 공정에 우레아 완충용액을 도입함으로써 기존의 정제 공정 수율 2.5 mg/L로부터 생산성을 약 30배 정도 향상시킬 수 있었다.
[ 실시예 2] IMAC 배제한 H6Ub JO-4 리폴딩 및 정제공정 1 ( CEX 1 → 리폴딩 → AEX → CEX 2)
6M 우레아를 첨가한 완충액으로 H6Ub JO-4 단백질을 언폴딩시킨 상태에서 첫 번째 CEX 정제를 진행하였고, 용출된 샘플의 리폴딩이 완료된 후 UBP 효소를 첨가하여 H6Ub를 절단시켜 JO-4 단백질을 분리하고, 이어서 추가적인 정제를 위해 AEX 및 두 번째 CEX를 진행하였다. 본 실시예에서 각각 수행된 정제 공정들의 운용 조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00015
Figure 112017120699100-pat00016
Figure 112017120699100-pat00017
Figure 112017120699100-pat00018
Figure 112017120699100-pat00019
순도를 높이기 위한 목적으로 AEX 및 CEX 공정을 진행하였음에 불구하고, 일부 불순물이 포함되어 순도가 아주 높지는 않은 것으로 확인되었다.
[ 실시예 3] IMAC 배제한 H6Ub JO-4 리폴딩 및 정제공정 2 ( CEX 1 → 리폴딩 → AEX → CEX 2)
실시예 2와 Step 5까지는 동일한 공정으로 정제를 진행하였고, AEX 정제 공정 후 단백질 순도 개선을 위해 CEX 공정에서의 완충액 pH 조건을 6.9에서 7.8로 변경하여 진행하였다. 완충액 pH가 변경된 Step 6의 CEX 운용 조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00020
정제 결과, 실시예 2의 결과에 비해 순도의 향상이 있었지만 여전히 일부 불순물이 확인되었다.
[ 실시예 4] IMAC 배제한 H6Ub JO-4 리폴딩 및 정제공정 3 ( CEX 1 → 리폴딩 → AEX → CEX 2)
6M 우레아를 첨가한 완충액으로 H6Ub JO-4 단백질을 언폴딩 시켰으며 완충액 pH 8.0 조건에서 CEX 정제를 진행하였다. 이 때, CEX 공정을 포함한 모든 완충액의 pH를 8.0으로 하여 진행하였다.
CEX 공정에서 용출된 샘플을 리폴딩 시키기 위해, 염이 없는 완충액으로 희석하여 우레아 농도를 낮췄다. 리폴딩 완료 후, UBP 효소를 첨가하여 H6Ub를 절단시켜 JO-4 단백질을 분리하였다. 본 실시예에서 각각 수행된 정제 공정들의 운용 조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00021
Figure 112017120699100-pat00022
Figure 112017120699100-pat00023
Figure 112017120699100-pat00024
Figure 112017120699100-pat00025
HCP(host cell protein), HCD(host cell DNA), 엔도톡신 및 일부 불순물 단백질을 제거하고자 하는 목적으로 AEX 공정을 거친 후, 마지막 폴리싱을 위해 pH 8.0 조건하에서 CEX 정제 공정을 진행한 결과 순도 높은 JO-4 단백질을 얻을 수 있었다 (순도 96.5%, 생산 수율 86 mg/L, 엔도톡신 60 EU/mg).
[ 실시예 5] IMAC 배제한 H6Ub JO-4 리폴딩 및 정제공정 4 ( CEX 1 → 리폴딩 → AEX → CEX 2 → CEX 3)
실시예 4의 공정으로부터 엔도톡신, 순도 및 생산 수율을 더욱 향상시키기 위하여 세 번째 CEX 공정 및 겔 여과 공정을 추가적으로 진행하였다. 본 실시예에서 각각 수행된 정제 공정들의 운용 조건은 아래와 같았다.
Figure 112017120699100-pat00026
Figure 112017120699100-pat00027
Figure 112017120699100-pat00028
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Figure 112017120699100-pat00030
Figure 112017120699100-pat00031
Figure 112017120699100-pat00032
정제 결과 엔도톡신의 수준이 매우 낮은 고순도의 JO-4 단백질을 고수율로 얻을 수 있었다 (순도 97.9%, 생산수율 103.4 mg/mL, 엔도톡신 10 EU/mg).
<110> SAMYANG BIOPHARMACEUTICALS CORPORATION AP Technologies Corp. <120> PROCESS FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT ADENOVIRUS TYPE 3 FIBER POLYPEPTIDE <130> KP1711453-SAMB <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dimerization domain 1 <400> 1 Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dimerization domain 2 <400> 2 Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shaft domain motif <400> 3 Asn Ser Ile Ala Leu Lys Asn Asn 1 5 <210> 4 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> knob domain <400> 4 Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn Cys Ile Ile Glu Tyr 1 5 10 15 Gly Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn 20 25 30 Gly Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr 35 40 45 Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu 50 55 60 Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp 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Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val 20 25 30 Ser Ala Leu Lys Glu Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Ser Asn Ser Ile Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly 50 55 60 Pro Lys Pro Glu Ala Asn Cys Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Gln Asn Pro 65 70 75 80 Asp Ser Lys Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Ile Val Asn 85 90 95 Gly Tyr Val Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr Leu Phe 100 105 110 Lys Asn Lys Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp Ala Thr 115 120 125 Gly His Ile Leu Pro Asp Ser Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu Glu Leu 130 135 140 Lys Tyr Lys Gln Thr Ala Asp Phe Ser Ala Arg Gly Phe Met Pro Ser 145 150 155 160 Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Val Leu Pro Asn Ala Gly Thr His Asn Glu 165 170 175 Asn Phe Ile Phe Gly Gln Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser Asp Gly Ala Leu 180 185 190 Phe Pro Leu Glu Val Thr Val Met Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser 195 200 205 Arg Thr Ser Tyr Val Met Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu 210 215 220 Ala Pro Glu Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe 225 230 235 240 Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp 245 <210> 7 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NON-HIS JO-4: V239D <400> 7 Gly Ser Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu 1 5 10 15 Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val 20 25 30 Ser Ala Leu Lys Glu Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Ser Asn Ser Ile Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly 50 55 60 Pro Lys Pro Glu Ala Asn Cys Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Gln Asn Pro 65 70 75 80 Asp Ser Lys Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Ile Val Asn 85 90 95 Gly Tyr Val Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr Leu Phe 100 105 110 Lys Asn Lys Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp Ala Thr 115 120 125 Gly His Ile Leu Pro Asp Ser Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu Glu Leu 130 135 140 Lys Tyr Lys Gln Thr Ala Asp Phe Ser Ala Arg Gly Phe Met Pro Ser 145 150 155 160 Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asp Leu Pro Asn Ala Gly Thr His Asn Glu 165 170 175 Asn Tyr Ile Phe Gly Gln Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser Asp Gly Ala Leu 180 185 190 Phe Pro Leu Glu Val Thr Val Met Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser 195 200 205 Arg Thr Ser Tyr Val Met Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu 210 215 220 Ala Pro Glu Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe 225 230 235 240 Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp 245 <210> 8 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H6UbJO-4 nucleotide <400> 8 atgcaccatc accatcacca ccagattttc gtcaagactt tgaccggtaa aaccataaca 60 ttggaagttg aatcttccga taccatcgac aacgttaagt cgaaaattca agacaaggaa 120 ggtatccctc cagatcaaca aagattgatc tttgccggta agcagctaga agacggtaga 180 acgctgtctg attacaacat tcagaaggag tccaccttac atcttgtgct aaggctaaga 240 ggtggcggat caaaggtaag cgctttaaag gagaaagttt cagcacttaa agaaaaggta 300 tccgctttaa aggagaaagt ttcagcactt aaagaaaaag tgtccgctct gaaagaagga 360 tccggtggcg gttctggcgg tggctccggt ggcggttcta attctattgc actgaaaaat 420 aacactttat ggacaggtcc aaaaccagaa gccaactgca taattgaata cgggaaacaa 480 aacccagata gcaaactaac tttaatcctt gtaaaaaatg gaggaattgt taatggatat 540 gtaacgctaa tgggagcctc agactacgtt aacaccttat ttaaaaacaa aaatgtctcc 600 attaatgtag aactatactt tgatgccact ggtcatatat taccagactc atcttctctt 660 aaaacagatc tagaactaaa atacaagcaa accgctgact ttagtgcaag aggttttatg 720 ccaagtacta cagcgtatcc atttgacctt cctaatgcgg gaacacataa tgaaaattat 780 atttttggtc aatgctacta caaagcaagc gatggtgccc tttttccgtt ggaagttact 840 gttatgctta ataaacgcct gccagatagt cgcacatcct atgttatgac ttttttatgg 900 tccttgaatg ctggtctagc tccagaaact actcaggcaa ccctcataac ctccccattt 960 accttttcct atattagaga agatgactaa 990 <210> 9 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H6UbJO-4 protein <400> 9 Met His His His His His His Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly 1 5 10 15 Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val 20 25 30 Lys Ser Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg 35 40 45 Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp 50 55 60 Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu 85 90 95 Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu 100 105 110 Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ile Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp 130 135 140 Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn Cys Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Gln 145 150 155 160 Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Ile 165 170 175 Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr 180 185 190 Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp 195 200 205 Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp Ser Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu 210 215 220 Glu Leu Lys Tyr Lys Gln Thr Ala Asp Phe Ser Ala Arg Gly Phe Met 225 230 235 240 Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asp Leu Pro Asn Ala Gly Thr His 245 250 255 Asn Glu Asn Tyr Ile Phe Gly Gln Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser Asp Gly 260 265 270 Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr Val Met Leu Asn Lys Arg Leu Pro 275 280 285 Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala 290 295 300 Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe 305 310 315 320 Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp 325

Claims (16)

1) 태그 서열을 부가적으로 포함하는, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드를 이를 발현하는 세포로부터 카오트로픽 시약(chaotropic agent) 존재 하에 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물에 대해, 카오트로픽 시약 존재 하에 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 폴리펩타이드를 정제하는 단계;
3) 단계 2)에서 정제된 폴리펩타이드를 리폴딩(refolding)시키는 단계;
4) 단계 3)에서 얻은 폴리펩타이드로부터 태그 서열을 제거하는 단계;
5) 단계 4)에서 얻은 폴리펩타이드에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 폴리펩타이드를 추가적으로 정제하는 단계; 및,
6) 단계 5)에서 얻은 폴리펩타이드에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 폴리펩타이드를 추가적으로 정제하는 단계:
를 포함하는, 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드의 정제 방법.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 태그 서열이 히스티딘 태그인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 카오트로픽 시약은 우레아, 티오우레아, 리튬퍼클로레이트 및 구아니딘 하이드로클로라이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 단계 1)에서 카오트로픽 시약의 농도는 4 내지 8 M인 것인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 단계 2)에서 카오트로픽 시약의 농도는 1 내지 10 M 인 것인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 단계 3)에서 2 M 이하의 농도로 희석된 카오트로픽 시약을 이용하여 폴리펩타이드를 리폴딩 시키는 것인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 단계 3)에서 염을 함유하지 않는 완충액에서 폴리펩타이드를 리폴딩 시키는 것인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 단계 2)에서 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 경우, pH가 7 내지 9인 완충액에서 폴리펩타이드를 리폴딩 시키는 것인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 태그 서열을 부가적으로 포함하는 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드는, 태그 서열과 재조합 3형 아데노바이러스 섬유 폴리펩타이드 서열 사이에 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 단계 4)에서 유비퀴틴 분해효소를 가하여 태그 서열을 제거하는 것인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 단계 6)에서 양이온 교환 크로마토그래피를 2 회 이상 반복 수행하는 것인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 단계 6)에서 양이온 교환 크로마토그래피를 pH 7 이상에서 수행하는 것인 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 단계 6)에서 얻은 폴리펩타이드에 대해 겔 여과를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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