JP2002179697A - 塩基性蛋白質からエンドトキシンを除去する方法 - Google Patents
塩基性蛋白質からエンドトキシンを除去する方法Info
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- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract
(57)【要約】
【課題】塩基性蛋白質溶液に含まれているエンドトキシ
ンを除去する方法を提供する。 【解決手段】再組合わせの微生物から得た塩基性蛋白質
を含有する溶液に界面活性剤を添加して混合し、前記溶
液を陽イオン交換樹脂にローディングした後、陽イオン
交換樹脂を界面活性剤を含有しない溶媒で洗浄し、陽イ
オン交換樹脂から所望の塩基性蛋白質を溶出させる。
ンを除去する方法を提供する。 【解決手段】再組合わせの微生物から得た塩基性蛋白質
を含有する溶液に界面活性剤を添加して混合し、前記溶
液を陽イオン交換樹脂にローディングした後、陽イオン
交換樹脂を界面活性剤を含有しない溶媒で洗浄し、陽イ
オン交換樹脂から所望の塩基性蛋白質を溶出させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、有用な蛋白質含有
溶液からエンドトキシンを除去する方法に関するもので
ある。
溶液からエンドトキシンを除去する方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】医薬的活性を有する塩基性蛋白質を大量
生産するための一つの方法として、再組合わせの微生物
発現システムを用いて生産する方法が利用される。この
ように再組合わせの微生物発現システムを用いる場合、
特に、グラム陰性菌などのバクテリアを宿主細胞に用い
る場合は、精製段階で宿主細胞の細胞壁成分であるエン
ドトキシンを十分に除去することが必須である。
生産するための一つの方法として、再組合わせの微生物
発現システムを用いて生産する方法が利用される。この
ように再組合わせの微生物発現システムを用いる場合、
特に、グラム陰性菌などのバクテリアを宿主細胞に用い
る場合は、精製段階で宿主細胞の細胞壁成分であるエン
ドトキシンを十分に除去することが必須である。
【０００３】エンドトキシンは、Ｅ.ｃｏｌｉ（大腸
菌）のような大部分のグラム陰性菌の細胞壁に存在する
糖脂質である。蛋白質にエンドトキシンが存在する場
合、極微量のエンドトキシンであっても発熱、エンドト
キシンショック、炎症を起こす恐れがある。
菌）のような大部分のグラム陰性菌の細胞壁に存在する
糖脂質である。蛋白質にエンドトキシンが存在する場
合、極微量のエンドトキシンであっても発熱、エンドト
キシンショック、炎症を起こす恐れがある。
【０００４】エンドトキシンを除去するためには、１）
イオン交換クロマトグラフィ、２）親和性（アフィニテ
ィ）クロマトグラフィ、３）ウルトラフィルトレーショ
ン（限外濾過）、４）界面活性剤を利用した相分離など
が提示されている。
イオン交換クロマトグラフィ、２）親和性（アフィニテ
ィ）クロマトグラフィ、３）ウルトラフィルトレーショ
ン（限外濾過）、４）界面活性剤を利用した相分離など
が提示されている。
【０００５】しかしながら、ＤＮＡ結合蛋白質のような
塩基性蛋白質は、陽電荷を帯びるというそれ自身の特性
があるため、陰電荷を帯びるエンドトキシンと静電気的
引力によって結合される恐れがあり、イオン交換及び親
和性クロマトグラフィによってはエンドトキシンが十分
に除去されない（Journal of immunological Methods.
132(1990) 191−195）。
塩基性蛋白質は、陽電荷を帯びるというそれ自身の特性
があるため、陰電荷を帯びるエンドトキシンと静電気的
引力によって結合される恐れがあり、イオン交換及び親
和性クロマトグラフィによってはエンドトキシンが十分
に除去されない（Journal of immunological Methods.
132(1990) 191−195）。
【０００６】また、ウルトラフィルトレーションの場
合、一般的には分子量１０Ｋカットオフの膜を使用して
これより小さい所望の分子は膜を通過させ、これより大
きな分子量を有するエンドトキシンは残留させることに
よってエンドトキシンを大部分除去することができる。
しかし、所望の物質が蛋白質などのような巨大分子であ
る場合、分子量カットオフ値が１００Ｋ以上の膜を使用
してウルトラフィルトレーションを何回も繰り返さなけ
ればならないので、蛋白質の損失が発生することがあ
り、除去効率も低下する。
合、一般的には分子量１０Ｋカットオフの膜を使用して
これより小さい所望の分子は膜を通過させ、これより大
きな分子量を有するエンドトキシンは残留させることに
よってエンドトキシンを大部分除去することができる。
しかし、所望の物質が蛋白質などのような巨大分子であ
る場合、分子量カットオフ値が１００Ｋ以上の膜を使用
してウルトラフィルトレーションを何回も繰り返さなけ
ればならないので、蛋白質の損失が発生することがあ
り、除去効率も低下する。
【０００７】界面活性剤の相転移による除去は、蛋白質
溶液に界面活性剤を添加して混合した後、遠心分離によ
って相分離を誘導してエンドトキシン含有層を除去する
ことであって、エンドトキシンの除去効率は優れている
が、除去工程で界面活性剤が残るため界面活性剤の除去
工程が追加的に必要になり、何回も繰り返して処理しな
ければならないため蛋白質精製収率が減少し、工程特性
上約３５℃以上に溶液温度を高くしなければならないた
め温度に敏感な蛋白質である場合には使用するのが難し
い。
溶液に界面活性剤を添加して混合した後、遠心分離によ
って相分離を誘導してエンドトキシン含有層を除去する
ことであって、エンドトキシンの除去効率は優れている
が、除去工程で界面活性剤が残るため界面活性剤の除去
工程が追加的に必要になり、何回も繰り返して処理しな
ければならないため蛋白質精製収率が減少し、工程特性
上約３５℃以上に溶液温度を高くしなければならないた
め温度に敏感な蛋白質である場合には使用するのが難し
い。
【０００８】米国特許５,７４７,６６３には、細胞溶解
物にトリトンＸ−１１４（洗剤Triton X114）を処理
し、陰イオン交換クロマトグラフィを使用して基質溶液
からエンドトキシンを除去する方法が記載されている
が、依然として１０〜１２ Ｉ.Ｕ／ｍｇ程度のエンドト
キシンが残留する。
物にトリトンＸ−１１４（洗剤Triton X114）を処理
し、陰イオン交換クロマトグラフィを使用して基質溶液
からエンドトキシンを除去する方法が記載されている
が、依然として１０〜１２ Ｉ.Ｕ／ｍｇ程度のエンドト
キシンが残留する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、再組合わせの微生物から塩基性蛋白質を分離精製す
る際、エンドトキシンを極微量になるまで効果的に除去
することができる方法を提供することにある。
は、再組合わせの微生物から塩基性蛋白質を分離精製す
る際、エンドトキシンを極微量になるまで効果的に除去
することができる方法を提供することにある。
【００１０】すなわち、本発明は塩基性蛋白質含有溶液
からエンドトキシンを除去する方法に関するものであ
る。
からエンドトキシンを除去する方法に関するものであ
る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）再組合
わせの微生物から得た塩基性蛋白質を含有する溶液に界
面活性剤を添加して混合し、（ｂ）前記溶液を陽イオン
交換樹脂にローディングし、（ｃ）前記陽イオン交換樹
脂を、界面活性剤を含有しない溶媒で洗浄し、（ｄ）前
記陽イオン交換樹脂から所望の塩基性蛋白質を溶出させ
ることを特徴とする。
わせの微生物から得た塩基性蛋白質を含有する溶液に界
面活性剤を添加して混合し、（ｂ）前記溶液を陽イオン
交換樹脂にローディングし、（ｃ）前記陽イオン交換樹
脂を、界面活性剤を含有しない溶媒で洗浄し、（ｄ）前
記陽イオン交換樹脂から所望の塩基性蛋白質を溶出させ
ることを特徴とする。
【００１２】本発明の方法によれば、塩基性蛋白質を医
薬的に使用できるようにエンドトキシンを十分に除去す
ることができる。
薬的に使用できるようにエンドトキシンを十分に除去す
ることができる。
【００１３】本発明の方法は、部分的又は完全に精製さ
れた塩基性ペプチド又は塩基性蛋白質に適用することが
でき、従って、必要に応じて精製過程中又は精製過程の
最後の段階に適用することができる。
れた塩基性ペプチド又は塩基性蛋白質に適用することが
でき、従って、必要に応じて精製過程中又は精製過程の
最後の段階に適用することができる。
【００１４】本発明における塩基性蛋白質は、等電点が
７.０より大きい蛋白質又はペプチドを意味する。例え
ば、ヒストン（histone）のようにＤＮＡに結合する蛋
白質、ブフォリン（buforin）やマーゲイニン（magaini
n；韓国特許登録第１０７０２４号）のように抗菌活性
を有する塩基性ペプチド、塩基性繊維芽細胞成長因子な
どが挙げられる。
７.０より大きい蛋白質又はペプチドを意味する。例え
ば、ヒストン（histone）のようにＤＮＡに結合する蛋
白質、ブフォリン（buforin）やマーゲイニン（magaini
n；韓国特許登録第１０７０２４号）のように抗菌活性
を有する塩基性ペプチド、塩基性繊維芽細胞成長因子な
どが挙げられる。
【００１５】本発明で用いられる界面活性剤は、市販さ
れているユニオンカーバイド製トリトンＸ−１１４、ト
リトンＸ−１１０又はBostick & Sullivanのツイン８
０、ツイン２０などの非イオン性界面活性剤であること
が好ましい。界面活性剤の濃度は０.０１〜１０％（ｖ
／ｖ）が好ましく、０.１〜２％（ｖ／ｖ）がさらに好
ましい。界面活性剤の濃度が低ければエンドトキシンの
除去効率が落ち、濃度が高ければ界面活性剤を除去する
ための時間が多く要求される。
れているユニオンカーバイド製トリトンＸ−１１４、ト
リトンＸ−１１０又はBostick & Sullivanのツイン８
０、ツイン２０などの非イオン性界面活性剤であること
が好ましい。界面活性剤の濃度は０.０１〜１０％（ｖ
／ｖ）が好ましく、０.１〜２％（ｖ／ｖ）がさらに好
ましい。界面活性剤の濃度が低ければエンドトキシンの
除去効率が落ち、濃度が高ければ界面活性剤を除去する
ための時間が多く要求される。
【００１６】本発明で用いられる陽イオン交換樹脂には
特に限定がなく、分離しようとする塩基性蛋白質の種類
に応じて適宜選択することができる。例えば、ストリー
ムラインＳＰ（業者名後述）、ＣＭ−セファロースＦ
Ｆ、ＳＰ−セファロースＦＦ、ポロス２０ＨＲなどを用
いることができる。
特に限定がなく、分離しようとする塩基性蛋白質の種類
に応じて適宜選択することができる。例えば、ストリー
ムラインＳＰ（業者名後述）、ＣＭ−セファロースＦ
Ｆ、ＳＰ−セファロースＦＦ、ポロス２０ＨＲなどを用
いることができる。
【００１７】必要ならば、塩基性蛋白質からエンドトキ
シンの分離を促進するために、塩基性蛋白質を含む溶液
に界面活性剤を混合した後、一定時間放置しても良い。
放置温度及び時間は、使用する界面活性剤の種類、使用
量、対象蛋白質の特性などによって変えることができ
る。また、放置温度は塩基性蛋白質溶液が凍結せず、ま
た蛋白質の活性が維持される範囲を考慮して決定する。
例えば、ヒストンの場合は０〜４０℃に放置することが
できる。
シンの分離を促進するために、塩基性蛋白質を含む溶液
に界面活性剤を混合した後、一定時間放置しても良い。
放置温度及び時間は、使用する界面活性剤の種類、使用
量、対象蛋白質の特性などによって変えることができ
る。また、放置温度は塩基性蛋白質溶液が凍結せず、ま
た蛋白質の活性が維持される範囲を考慮して決定する。
例えば、ヒストンの場合は０〜４０℃に放置することが
できる。
【００１８】陽イオン交換樹脂に蛋白質溶液をローディ
ングした後、まず界面活性剤を含有しない緩衝溶液で陽
イオン交換樹脂を洗浄することにより、陽イオン交換樹
脂から蛋白質溶液に含まれていた界面活性剤やエンドト
キシンを除去することができる。この時用いられる緩衝
溶液としては、塩基性蛋白質の溶液と同一、又は他の清
浄な溶媒とすることができる。
ングした後、まず界面活性剤を含有しない緩衝溶液で陽
イオン交換樹脂を洗浄することにより、陽イオン交換樹
脂から蛋白質溶液に含まれていた界面活性剤やエンドト
キシンを除去することができる。この時用いられる緩衝
溶液としては、塩基性蛋白質の溶液と同一、又は他の清
浄な溶媒とすることができる。
【００１９】陽イオン交換樹脂から所望の塩基性蛋白質
を溶出させるために、陽イオン交換樹脂の洗浄に用いら
れたものと異なる緩衝溶液を使用する。
を溶出させるために、陽イオン交換樹脂の洗浄に用いら
れたものと異なる緩衝溶液を使用する。
【００２０】本発明で用いられる培地組成は次の通りで
ある。
ある。
【００２１】ＲＰ培地（ｐＨ６.８）：リン酸二水素カ
リウム３ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム３ｇ／Ｌ、硫酸ア
ンモニウム４ｇ／Ｌ、トリソジウムシートレート２.３
ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０.２２ｇ／Ｌ、微量の金属
液１０ｍｌ／Ｌ、カナマイシン０.１ｇ／Ｌ 微量の金属液：クエン酸鉄（III）７.３ｇ／Ｌ、塩化コ
バルト０.５３４ｇ／Ｌ、塩化マンガン３.２ｇ／Ｌ、塩
化銅０.３０２ｇ／Ｌ、ホウ酸０.６６６ｇ／Ｌ、モルリ
ーブ酸ナトリウム０.５３４ｇ／Ｌ、酢酸亜鉛１.６８７
ｇ／Ｌ、チアミン０.５３４ｇ／Ｌ、塩化カルシウム１
１.５ｇ／Ｌ、トリソジウムシートレート２０ｇ／Ｌ ＲＳ培地：ＲＰ培地、カザミノ酸２ｇ／Ｌ
リウム３ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム３ｇ／Ｌ、硫酸ア
ンモニウム４ｇ／Ｌ、トリソジウムシートレート２.３
ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０.２２ｇ／Ｌ、微量の金属
液１０ｍｌ／Ｌ、カナマイシン０.１ｇ／Ｌ 微量の金属液：クエン酸鉄（III）７.３ｇ／Ｌ、塩化コ
バルト０.５３４ｇ／Ｌ、塩化マンガン３.２ｇ／Ｌ、塩
化銅０.３０２ｇ／Ｌ、ホウ酸０.６６６ｇ／Ｌ、モルリ
ーブ酸ナトリウム０.５３４ｇ／Ｌ、酢酸亜鉛１.６８７
ｇ／Ｌ、チアミン０.５３４ｇ／Ｌ、塩化カルシウム１
１.５ｇ／Ｌ、トリソジウムシートレート２０ｇ／Ｌ ＲＳ培地：ＲＰ培地、カザミノ酸２ｇ／Ｌ
【００２２】
【発明の実施の形態】以下、実施例を通じて本発明をさ
らに詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具
体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれ
ら実施例に限られるわけではない。
らに詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具
体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれ
ら実施例に限られるわけではない。
【００２３】（実施例）ヒストンＨ１.５を暗号化する
遺伝子を得るために、人間の胎盤組織２００ｍｇを液体
窒素に急冷させた後、乳鉢で粉砕した。１.２ｍｌの分
解（Digestion）緩衝液（150mM NaCl, 10mM Tris-HCl
(pH8.0), 25mM EDTA, 0.5% SDS, 0.1mM PMSFを添加して
５０℃において１２時間反応させた後、Short protocol
s in molecular biology(1992)によってゲノムＤＮＡを
分離した。得られたゲノムＤＮＡに下記プライマーを使
用して重合酵素連鎖反応を実施して０.７ｋｂの産物を
得た後、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩとで切断した。プラスミ
ドｐＥＴ３２ａ（Novagen）を同じ制限酵素で切断した
後、重合酵素連鎖反応産物を連結してｐＥＴ３２ａ−Ｈ
Ｈ１４を製造した。
遺伝子を得るために、人間の胎盤組織２００ｍｇを液体
窒素に急冷させた後、乳鉢で粉砕した。１.２ｍｌの分
解（Digestion）緩衝液（150mM NaCl, 10mM Tris-HCl
(pH8.0), 25mM EDTA, 0.5% SDS, 0.1mM PMSFを添加して
５０℃において１２時間反応させた後、Short protocol
s in molecular biology(1992)によってゲノムＤＮＡを
分離した。得られたゲノムＤＮＡに下記プライマーを使
用して重合酵素連鎖反応を実施して０.７ｋｂの産物を
得た後、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩとで切断した。プラスミ
ドｐＥＴ３２ａ（Novagen）を同じ制限酵素で切断した
後、重合酵素連鎖反応産物を連結してｐＥＴ３２ａ−Ｈ
Ｈ１４を製造した。
【００２４】プライマー： 5’-GGTGCCAAGGATCCATGTCGGAAACCGCTCCTGCCGA-3’ 5’-GGTGCCACTCGAGTTACTTCTTTTTGGCAGCCGC-3’ ｐＥＴ３２ａ−ＨＨ１４に対して下記プライマーで重合
酵素連鎖反応を実施した後、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで
切断し、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／６４６１１の１８頁
乃至２０頁の実施例５に記載された方法によって製造し
たｐＧＮＸ４Ｆ４Ｍを同じ制限酵素で切断した後、二つ
のＤＮＡを連結してｐＧＮＸ４−ＨＨ１４を製造した。
酵素連鎖反応を実施した後、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで
切断し、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／６４６１１の１８頁
乃至２０頁の実施例５に記載された方法によって製造し
たｐＧＮＸ４Ｆ４Ｍを同じ制限酵素で切断した後、二つ
のＤＮＡを連結してｐＧＮＸ４−ＨＨ１４を製造した。
【００２５】プライマー： 5’-GGGCATATGATGTCGGAAACCGCTCCTGCCGA-3’ 5’-GGGGGATCCTTACTTCTTTTTGGCAGCCGC-3’ このプラスミドをＥ.ｃｏｌｉ ＴＧｌに形質転換させて
陽性コロニーを得た後、ＲＳ培地接種して３０℃におい
て１２時間前培養した。前培養液をＲＳ培地１.５Ｌが
含まれている５Ｌ発酵槽（韓国発酵器で製造）に接種し
て３０℃、１０００ｒｐｍ、１.０ｖｖｍでＡｂｓ
660（６６０ｎｍにおける吸光度(absorbance)）が６０
になるまで培養した後、ラクトーズを３０ｇ／Ｌに添加
し、培養温度を３７℃まで上げて１２時間培養した。
陽性コロニーを得た後、ＲＳ培地接種して３０℃におい
て１２時間前培養した。前培養液をＲＳ培地１.５Ｌが
含まれている５Ｌ発酵槽（韓国発酵器で製造）に接種し
て３０℃、１０００ｒｐｍ、１.０ｖｖｍでＡｂｓ
660（６６０ｎｍにおける吸光度(absorbance)）が６０
になるまで培養した後、ラクトーズを３０ｇ／Ｌに添加
し、培養温度を３７℃まで上げて１２時間培養した。
【００２６】次に、培養液１０Ｌを５０００xＧの速度
で２０分間遠心分離して細胞ペレットを回収した後、
０.１Ｍ塩化ナトリウムが含まれた５０ｍM リン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ８.０）を添加して１０Ｌになるよう
に懸濁させた。この懸濁液をマイクロフルダイザー（mi
crofluidizer, Microfluidics社）を利用して１０００
ｂａｒ、４００ｍＬ／ｍｉｎの速度で３回通過させて細
胞を破砕した。１０Ｌ破砕溶液のＡｂｓ660が５０とな
るように、０.１Ｍ塩化ナトリウムが含まれたリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ８.０）で約２.５倍希薄した。スト
リームラインＳＰ（Streamline SP, Amersham Pharmaci
a Biotech）９００ｍｌをコラム（１００×６００ｍ
ｍ）に充填し、溶液Ａ（２００ｍＭ塩化ナトリウム＋５
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.０））２.５Ｌで
平衡化させた後、破砕液をローディングして２５０ｍＬ
／分の速度で溶液ＡをＵＶ値が０になるまで約３Ｌを流
してコラム内の不純物を除去した。緩衝液を溶液Ｂ（５
００ｍＭ塩化ナトリウム＋５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ８.０））に変えてＵＶ値が０に落ちるまで約
２Ｌを流した。溶液Ｃ（９００ｍＭ塩化ナトリウム＋５
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.０））２Ｌを流
し、溶出させて１次精製された蛋白質溶液を得た後、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥをして２２、４４９Ｄａの大きさのＨ
１.５蛋白質帯を確認した。
で２０分間遠心分離して細胞ペレットを回収した後、
０.１Ｍ塩化ナトリウムが含まれた５０ｍM リン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ８.０）を添加して１０Ｌになるよう
に懸濁させた。この懸濁液をマイクロフルダイザー（mi
crofluidizer, Microfluidics社）を利用して１０００
ｂａｒ、４００ｍＬ／ｍｉｎの速度で３回通過させて細
胞を破砕した。１０Ｌ破砕溶液のＡｂｓ660が５０とな
るように、０.１Ｍ塩化ナトリウムが含まれたリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ８.０）で約２.５倍希薄した。スト
リームラインＳＰ（Streamline SP, Amersham Pharmaci
a Biotech）９００ｍｌをコラム（１００×６００ｍ
ｍ）に充填し、溶液Ａ（２００ｍＭ塩化ナトリウム＋５
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.０））２.５Ｌで
平衡化させた後、破砕液をローディングして２５０ｍＬ
／分の速度で溶液ＡをＵＶ値が０になるまで約３Ｌを流
してコラム内の不純物を除去した。緩衝液を溶液Ｂ（５
００ｍＭ塩化ナトリウム＋５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ８.０））に変えてＵＶ値が０に落ちるまで約
２Ｌを流した。溶液Ｃ（９００ｍＭ塩化ナトリウム＋５
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.０））２Ｌを流
し、溶出させて１次精製された蛋白質溶液を得た後、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥをして２２、４４９Ｄａの大きさのＨ
１.５蛋白質帯を確認した。
【００２７】溶出液をウルトラフィルトレーション（カ
ットオフ１０Ｋ、Millipore）して５００ｍＬまで濃縮
した後、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.８）５０ｍＭ
の２Ｌを加え、再び５００ｍＬまで濃縮しながら塩を部
分除去した（一次精製濃縮液）。
ットオフ１０Ｋ、Millipore）して５００ｍＬまで濃縮
した後、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.８）５０ｍＭ
の２Ｌを加え、再び５００ｍＬまで濃縮しながら塩を部
分除去した（一次精製濃縮液）。
【００２８】ＸＫ５０コラム（５０×３００ｍｍ、Amer
sham Pharmacia Biotech）にヒドロキシアパタイトタイ
プＩ（Hydroxyapatite, Bio-Rad）３００ｍＬを充填
し、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.８）２００ｍＭの
０.５Ｌで平衡化させた。ここに１次精製された濃縮液
５００ｍＬをローディングした後、リン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６.８）２００ｍＭの約０.５Ｌを５０ｍＬ／分
速度で流しながらコラム内の不純物を除去した。溶出液
のＵＶ値が０に落ちるとリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６.８）４００ｍＭの約０.５Ｌをコラムに同じ速度で流
しながら結合されている不純物を溶出させた。リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ６.８）６００ｍＭの０.５Ｌを流し
てヒストンＨ１.５を含有する分画物を集めて２次精製
された溶液５００ｍｌを得た。この溶液をウルトラフィ
ルトレーション（カットオフ１０Ｋ、Millipore）して
１００ｍＬまで濃縮した後、５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ８.０）０.５Ｌを加えて再び１００ｍＬまで
濃縮し、塩を部分除去した。
sham Pharmacia Biotech）にヒドロキシアパタイトタイ
プＩ（Hydroxyapatite, Bio-Rad）３００ｍＬを充填
し、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.８）２００ｍＭの
０.５Ｌで平衡化させた。ここに１次精製された濃縮液
５００ｍＬをローディングした後、リン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６.８）２００ｍＭの約０.５Ｌを５０ｍＬ／分
速度で流しながらコラム内の不純物を除去した。溶出液
のＵＶ値が０に落ちるとリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６.８）４００ｍＭの約０.５Ｌをコラムに同じ速度で流
しながら結合されている不純物を溶出させた。リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ６.８）６００ｍＭの０.５Ｌを流し
てヒストンＨ１.５を含有する分画物を集めて２次精製
された溶液５００ｍｌを得た。この溶液をウルトラフィ
ルトレーション（カットオフ１０Ｋ、Millipore）して
１００ｍＬまで濃縮した後、５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ８.０）０.５Ｌを加えて再び１００ｍＬまで
濃縮し、塩を部分除去した。
【００２９】ＸＫ５０コラム（５０×３００ｍｍ、Amer
sham Pharmacia Biotech）にポロス２０ＨＳ（Poros 20
HS, Perseptive Biosystems）２００ｍｌを充填し、溶
液A０.５Ｌで平衡化させた。２次精製された溶液１００
ｍＬをローディングして、溶液A０.５Ｌを５０ｍＬ／分
の速度でＵＶ値が０になるまで流しながらコラム内不純
物を除去した。溶液B ０.５Ｌを再び流してコラムに結
合されている不純物を溶出させた後、溶液Bと溶液D
（１０００ｍＭ塩化ナトリウム＋５０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８.０））各２.５Ｌを線状勾配（liner
gradient）して５０ｍｌ／分の速度で溶出させながら５
０ｍｌずつ分画した。各分画物はＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５
／５コラム（Amersham Pharmacia Biotech）で溶液Bと
溶液Dとに分析し、純度が９５％以上である分画物だけ
を集めて３次精製された溶液を得た。ウルトラフィルト
レーション（カットオフ１０Ｋ、Millipore）して１０
０ｍＬまで濃縮した後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８.０）５００ｍＬを加えて再び２００ｍＬまで
濃縮及び部分脱塩を実施して、この濃縮液を３次精製液
と称した。
sham Pharmacia Biotech）にポロス２０ＨＳ（Poros 20
HS, Perseptive Biosystems）２００ｍｌを充填し、溶
液A０.５Ｌで平衡化させた。２次精製された溶液１００
ｍＬをローディングして、溶液A０.５Ｌを５０ｍＬ／分
の速度でＵＶ値が０になるまで流しながらコラム内不純
物を除去した。溶液B ０.５Ｌを再び流してコラムに結
合されている不純物を溶出させた後、溶液Bと溶液D
（１０００ｍＭ塩化ナトリウム＋５０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８.０））各２.５Ｌを線状勾配（liner
gradient）して５０ｍｌ／分の速度で溶出させながら５
０ｍｌずつ分画した。各分画物はＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ ５
／５コラム（Amersham Pharmacia Biotech）で溶液Bと
溶液Dとに分析し、純度が９５％以上である分画物だけ
を集めて３次精製された溶液を得た。ウルトラフィルト
レーション（カットオフ１０Ｋ、Millipore）して１０
０ｍＬまで濃縮した後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８.０）５００ｍＬを加えて再び２００ｍＬまで
濃縮及び部分脱塩を実施して、この濃縮液を３次精製液
と称した。
【００３０】３次精製液に残存するエンドトキシンを極
微量まで除去するための方法は次の通りである。
微量まで除去するための方法は次の通りである。
【００３１】３次精製液２０ｍＬ（５０ｍｇ蛋白質）に
５０％のトリトンＸ−１１４を０.２ｍＬ（０.５％ｖ／
ｖ）加えて３０分間１０℃において攪拌した。ＳＰ−セ
ファロースＦＦ（SP-Sepharose FF, Amersham Pharmaci
a Biotech）５０ｍｌをＸＫ２６コラム（２６×２００
ｍｍ、 Amersham Pharmacia Biotech）に充填し、溶液E
（２００ｍＭ塩化ナトリウム＋５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ８.０）＋０.５％トリトンＸ−１１４）１
００ｍＬで平衡化させた。トリトン処理をした３次精製
液を５ｍＬ／分の速度でローディングした後、溶液E１
００ｍｌをコラム内に流した。溶液A（２００ｍＭ塩化
ナトリウム＋５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.
０））５００ｍｌを流してコラム内のトリトンＸ−１１
４を除去した後、溶液C（９００ｍＭ塩化ナトリウム＋
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.０））１００
ｍｌを流してヒストンＨ１.５溶液１００ｍｌを得た。
この溶出液を透析膜（カットオフ１０Ｋ、Spectrum）に
入れ、蒸溜水に対して透析して塩を除去した。塩が除去
された溶液１００ｍＬを凍結乾燥して精製されたヒスト
ン粉末を得た。ヒストン粉末の純度は９５％であり、精
製収率は３５％であった。
５０％のトリトンＸ−１１４を０.２ｍＬ（０.５％ｖ／
ｖ）加えて３０分間１０℃において攪拌した。ＳＰ−セ
ファロースＦＦ（SP-Sepharose FF, Amersham Pharmaci
a Biotech）５０ｍｌをＸＫ２６コラム（２６×２００
ｍｍ、 Amersham Pharmacia Biotech）に充填し、溶液E
（２００ｍＭ塩化ナトリウム＋５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ８.０）＋０.５％トリトンＸ−１１４）１
００ｍＬで平衡化させた。トリトン処理をした３次精製
液を５ｍＬ／分の速度でローディングした後、溶液E１
００ｍｌをコラム内に流した。溶液A（２００ｍＭ塩化
ナトリウム＋５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.
０））５００ｍｌを流してコラム内のトリトンＸ−１１
４を除去した後、溶液C（９００ｍＭ塩化ナトリウム＋
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.０））１００
ｍｌを流してヒストンＨ１.５溶液１００ｍｌを得た。
この溶出液を透析膜（カットオフ１０Ｋ、Spectrum）に
入れ、蒸溜水に対して透析して塩を除去した。塩が除去
された溶液１００ｍＬを凍結乾燥して精製されたヒスト
ン粉末を得た。ヒストン粉末の純度は９５％であり、精
製収率は３５％であった。
【００３２】エンドトキシンの量は、製造社（Endosafe
社）の指示によってカブトガニ（horseshoe crab）の発
色反応（ＬＡＬ反応）によって測定した。精製されたヒ
ストンのエンドトキシン含量は０.０５ＥＵ／ｍｇヒス
トン以下であった。
社）の指示によってカブトガニ（horseshoe crab）の発
色反応（ＬＡＬ反応）によって測定した。精製されたヒ
ストンのエンドトキシン含量は０.０５ＥＵ／ｍｇヒス
トン以下であった。
【００３３】（比較例１）上記実施例で得た３次精製液
２０ｍＬを透析して塩を除去した後、凍結乾燥してエン
ドトキシン含量を測定した。その含量は７.８９ＥＵ／
ｍｇヒストンであった。
２０ｍＬを透析して塩を除去した後、凍結乾燥してエン
ドトキシン含量を測定した。その含量は７.８９ＥＵ／
ｍｇヒストンであった。
【００３４】（比較例２）上記実施例で得た３次精製液
２０ｍＬを、トリトンＸ−１１４処理しないことを除い
ては上記実施例と同一の条件でＳＰ−セファロースＦＦ
にローディングした後に溶出し、透析して脱塩し、凍結
乾燥してヒストン粉末を得た。エンドトキシン含量を測
定した結果、エンドトキシンの含量は７.４８ＥＵ／ｍ
ｇヒストンであった。
２０ｍＬを、トリトンＸ−１１４処理しないことを除い
ては上記実施例と同一の条件でＳＰ−セファロースＦＦ
にローディングした後に溶出し、透析して脱塩し、凍結
乾燥してヒストン粉末を得た。エンドトキシン含量を測
定した結果、エンドトキシンの含量は７.４８ＥＵ／ｍ
ｇヒストンであった。
【００３５】（比較例３）エンドトキシンの除去に用い
られるAff-Prep Polymyxin Support(Bio-Rad)の２５ｍ
ｌをＸＫ２６コラム（２６×２００ｍｍ、 Amersham Ph
armacia Biotech）に充填し、 １００ｍＭ塩化ナトリウ
ム＋５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）で平
衡化した後、上記実施例で得た３次精製液２０ｍｌを５
ｍｌ／分の速度でローディングした。同じ緩衝液７５ｍ
ｌで不純物を溶出させて除去し、２００ｍＭ塩化ナトリ
ウム＋５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５） ５
０ｍｌに溶出し、蛋白質溶液を集めて透析し、脱塩し、
凍結乾燥した後、エンドトキシンの含量を測定した結
果、５.３１ＥＵ／ｍｇヒストンであった。
られるAff-Prep Polymyxin Support(Bio-Rad)の２５ｍ
ｌをＸＫ２６コラム（２６×２００ｍｍ、 Amersham Ph
armacia Biotech）に充填し、 １００ｍＭ塩化ナトリウ
ム＋５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）で平
衡化した後、上記実施例で得た３次精製液２０ｍｌを５
ｍｌ／分の速度でローディングした。同じ緩衝液７５ｍ
ｌで不純物を溶出させて除去し、２００ｍＭ塩化ナトリ
ウム＋５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５） ５
０ｍｌに溶出し、蛋白質溶液を集めて透析し、脱塩し、
凍結乾燥した後、エンドトキシンの含量を測定した結
果、５.３１ＥＵ／ｍｇヒストンであった。
【００３６】（比較例４）DEAE-Sepharose FF（Amersha
m Pharmacia Biotech）５０ｍｌをＸＫ２６コラム（２
６×２００ｍｍ、 Amersham Pharmacia Biotech）に充
填し、トリス緩衝液（ｐＨ７.５）５０ｍＭで平衡化さ
せた。上記実施例で得られた３次精製液２０ｍＬをロー
ディングした後、そのまま溶出する溶液を集め、透析し
て凍結乾燥した。この時のエンドトキシン含量は７.３
３ＥＵ／ｍｇヒストンであった。
m Pharmacia Biotech）５０ｍｌをＸＫ２６コラム（２
６×２００ｍｍ、 Amersham Pharmacia Biotech）に充
填し、トリス緩衝液（ｐＨ７.５）５０ｍＭで平衡化さ
せた。上記実施例で得られた３次精製液２０ｍＬをロー
ディングした後、そのまま溶出する溶液を集め、透析し
て凍結乾燥した。この時のエンドトキシン含量は７.３
３ＥＵ／ｍｇヒストンであった。
【００３７】（比較例５）上記実施例で得た３次精製液
２０ｍＬをウルトラフィルトレーション（カットオフ１
００Ｋ、Millipore）して膜を通過する溶液を集めて透
析して塩を除去し、凍結乾燥した後に測定したエンドト
キシン含量は０.２８ＥＵ／ｍｇヒストンであった。蛋
白質のうち一部が変成したことが観察された。
２０ｍＬをウルトラフィルトレーション（カットオフ１
００Ｋ、Millipore）して膜を通過する溶液を集めて透
析して塩を除去し、凍結乾燥した後に測定したエンドト
キシン含量は０.２８ＥＵ／ｍｇヒストンであった。蛋
白質のうち一部が変成したことが観察された。
【００３８】（比較例６）上記実施例で得た３次精製液
２０ｍＬに５０％トリトンＸ−１１４を４００ｕｌ
（１.０％ｖ／ｖ）混合した後、４℃において３０分間
攪拌して均一な溶液を得て３７℃の水槽に移して１０分
間反応させた。この溶液を２５℃において１０分間２
０、０００ｇの速度で遠心分離して上層液を取り上げ、
再び同じ量のトリトンＸ−１１４を添加して前記の過程
を２回さらに繰り返した後、上層液を集めてエンドトキ
シンの含量を測定した結果、その量は０.０５ＥＵ／ｍ
ｇヒストン以下であった。この場合、１回実施する度に
約５％の蛋白質が損失された。
２０ｍＬに５０％トリトンＸ−１１４を４００ｕｌ
（１.０％ｖ／ｖ）混合した後、４℃において３０分間
攪拌して均一な溶液を得て３７℃の水槽に移して１０分
間反応させた。この溶液を２５℃において１０分間２
０、０００ｇの速度で遠心分離して上層液を取り上げ、
再び同じ量のトリトンＸ−１１４を添加して前記の過程
を２回さらに繰り返した後、上層液を集めてエンドトキ
シンの含量を測定した結果、その量は０.０５ＥＵ／ｍ
ｇヒストン以下であった。この場合、１回実施する度に
約５％の蛋白質が損失された。
【００３９】尚、上記実施例において、ｐＧＮＸ４−Ｈ
Ｈ１４を製造する際に使用したｐＧＮＸ４Ｆ４Ｍは、Ｐ
ＣＴ公開公報ＷＯ９９／６４６１１の１８頁乃至２０頁
の実施例５に記載されている以下の方法により製造され
た。
Ｈ１４を製造する際に使用したｐＧＮＸ４Ｆ４Ｍは、Ｐ
ＣＴ公開公報ＷＯ９９／６４６１１の１８頁乃至２０頁
の実施例５に記載されている以下の方法により製造され
た。
【００４０】Ｅ．ｃｏｌｉ内で外来遺伝子を発現させる
ため、２種類の発現ベクターｐＧＮＸ２及びｐＴ７Ｋ
２．１をＴ７Φ１０プロモーター、高コピー数の複製起
点（ｐＵＣファミリーのｃｏｌＥＩ）及びカナマイシン
耐性遺伝子を利用して構築した。ｐＧＮＸ２を構築する
ため、商業的に入手できるｐＵＣ１９（アンピシリン耐
性遺伝子：ＡｍｐR）内のｂｌａ遺伝子をカナマイシン
耐性遺伝子（ＫａｎR）で置換した。
ため、２種類の発現ベクターｐＧＮＸ２及びｐＴ７Ｋ
２．１をＴ７Φ１０プロモーター、高コピー数の複製起
点（ｐＵＣファミリーのｃｏｌＥＩ）及びカナマイシン
耐性遺伝子を利用して構築した。ｐＧＮＸ２を構築する
ため、商業的に入手できるｐＵＣ１９（アンピシリン耐
性遺伝子：ＡｍｐR）内のｂｌａ遺伝子をカナマイシン
耐性遺伝子（ＫａｎR）で置換した。
【００４１】次に、ｐＵＣ１９をＳｓｐＩ及びＤｒａＩ
で消化して１７４８ｂｐを有する１７８ｂｐ ＤＮＡフ
ラグメントを分離し、そしてＫａｎR遺伝子を鋳型とし
てＥ．ｃｏｌｉのＴｎ５並びにプライマー＃３９及び＃
４０を利用するＰＣＲにより増幅させた。このＰＣＲ生
成物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノ
ウフラグメントによりフィル・インし、そしてＳｓｐＩ
及びＤｒａＩで消化したｐＵＣ１９にクローンニングし
てｐＵＣＫ２を得た。
で消化して１７４８ｂｐを有する１７８ｂｐ ＤＮＡフ
ラグメントを分離し、そしてＫａｎR遺伝子を鋳型とし
てＥ．ｃｏｌｉのＴｎ５並びにプライマー＃３９及び＃
４０を利用するＰＣＲにより増幅させた。このＰＣＲ生
成物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノ
ウフラグメントによりフィル・インし、そしてＳｓｐＩ
及びＤｒａＩで消化したｐＵＣ１９にクローンニングし
てｐＵＣＫ２を得た。
【００４２】このベクターをＮｄｅＩで消化し、そして
クレノウフラグメントでフィル・インした後、それを再
ライゲーションしてｐＵＣＫ２ΔＮｄｅｌを構築した。
最終プラスミドｐＧＮＸ２はＢａｍＨＩで消化し、クレ
ノウフラグメントによりフィル・インし、次いでＡｓｅ
Ｉで消化したＴ７Φ１０プロモーター及びｐＴ７−７由
来のＲＢＳを含むフラグメント(USB, USA)を、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩにより消化し、クレノウフラグメントによりフィ
ル・インし、次いでＡｓｅＩで消化したｐＵＣＫ２ΔＮ
ｄｅｌベクターにクローンニングすることにより構築し
た。Ｔ７Φ１０プロモーター及びカナマイシン耐性遺伝
子（ＫａｎR）はｐＧＮＸ２の中で同じ方向を向いてい
る。
クレノウフラグメントでフィル・インした後、それを再
ライゲーションしてｐＵＣＫ２ΔＮｄｅｌを構築した。
最終プラスミドｐＧＮＸ２はＢａｍＨＩで消化し、クレ
ノウフラグメントによりフィル・インし、次いでＡｓｅ
Ｉで消化したＴ７Φ１０プロモーター及びｐＴ７−７由
来のＲＢＳを含むフラグメント(USB, USA)を、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩにより消化し、クレノウフラグメントによりフィ
ル・インし、次いでＡｓｅＩで消化したｐＵＣＫ２ΔＮ
ｄｅｌベクターにクローンニングすることにより構築し
た。Ｔ７Φ１０プロモーター及びカナマイシン耐性遺伝
子（ＫａｎR）はｐＧＮＸ２の中で同じ方向を向いてい
る。
【００４３】プラスミドｐＴ７Ｋ２．１を構築するた
め、ｂｌａ遺伝子をｐＴ７−７からＳｓｐＩ及びＢｇｌ
Ｉによる消化により除き、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラ
−ゼで処理して平滑末端にした。ＫａｎR遺伝子はｐＧ
ＮＸ２と同じように調製し、そして２本のＤＮＡフラグ
メントをライゲーションしてｐＴ７Ｋ２を構築した。最
終プラスミドｐＴ７Ｋ２．１はＡｓｅＩ部位をこのベク
ターから除くことにより構築した。
め、ｂｌａ遺伝子をｐＴ７−７からＳｓｐＩ及びＢｇｌ
Ｉによる消化により除き、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラ
−ゼで処理して平滑末端にした。ＫａｎR遺伝子はｐＧ
ＮＸ２と同じように調製し、そして２本のＤＮＡフラグ
メントをライゲーションしてｐＴ７Ｋ２を構築した。最
終プラスミドｐＴ７Ｋ２．１はＡｓｅＩ部位をこのベク
ターから除くことにより構築した。
【００４４】ｐＧＮＸ２で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ
ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）は、Korean Collection of Ty
pe Cultures (KCTC), Korea Research Institute of Bi
oscience and Biotechnology, Yusong-gu Eun-dong, Ta
ejon, 韓国に１９９８年５月２９日に寄託してあり、そ
してＫＣＴＣ０４８６ＢＰの番号が付与されている。
ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）は、Korean Collection of Ty
pe Cultures (KCTC), Korea Research Institute of Bi
oscience and Biotechnology, Yusong-gu Eun-dong, Ta
ejon, 韓国に１９９８年５月２９日に寄託してあり、そ
してＫＣＴＣ０４８６ＢＰの番号が付与されている。
【００４５】ｐＧＮＸ３を構築するため、ｐＧＮＸ２Ｆ
４ＭをＢｓｐＨＩで部分消化し、そして単一のＢｓｐＨ
Ｉ部位に切れ目を有するこのフラグメントを分離し、そ
してＢａｍＨＩで更に消化した。Ｔ７及びｒｒｎＢＴ１
Ｔ２ターミネーターを含むフラグメントを調製するた
め、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで消化したｐＥＴ１１ａ
由来の１３２ｂｐのフラグメント並びにＢａｍＨＩ及び
ＥｃｏＲＶで消化したｐｔｒｃ９９ａ由来の４８８ｂｐ
のフラグメントをライゲーションさせた。これらの融合
フラグメントをＢａｍＨＩ及びＢｓｐＨＩで切断し、そ
して上述の調製したベクターにクローニングしてｐＧＮ
Ｘ３Ｆ４Ｍを構築した。
４ＭをＢｓｐＨＩで部分消化し、そして単一のＢｓｐＨ
Ｉ部位に切れ目を有するこのフラグメントを分離し、そ
してＢａｍＨＩで更に消化した。Ｔ７及びｒｒｎＢＴ１
Ｔ２ターミネーターを含むフラグメントを調製するた
め、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで消化したｐＥＴ１１ａ
由来の１３２ｂｐのフラグメント並びにＢａｍＨＩ及び
ＥｃｏＲＶで消化したｐｔｒｃ９９ａ由来の４８８ｂｐ
のフラグメントをライゲーションさせた。これらの融合
フラグメントをＢａｍＨＩ及びＢｓｐＨＩで切断し、そ
して上述の調製したベクターにクローニングしてｐＧＮ
Ｘ３Ｆ４Ｍを構築した。
【００４６】ｐＧＮＸ４を調整するため、３０５２ｂｐ
フラグメントをＸｂａＩ及びＡｌｗＮＩで消化したｐＥ
ＴＡＣｃから、そしてＸｂａＩ及びＡｌｗＮＩで消化し
たｐＧＮＸ３Ｆ４Ｍから２４０５ｂｐのフラグメントを
単離し、ｐＧＮＸ４Ｆ４Ｍを得た。
フラグメントをＸｂａＩ及びＡｌｗＮＩで消化したｐＥ
ＴＡＣｃから、そしてＸｂａＩ及びＡｌｗＮＩで消化し
たｐＧＮＸ３Ｆ４Ｍから２４０５ｂｐのフラグメントを
単離し、ｐＧＮＸ４Ｆ４Ｍを得た。
【００４７】
【発明の効果】本発明によって再組合わせの微生物によ
って生産される塩基性蛋白質からその他の汚染物質、特
にエンドトキシンを検出されない水準まで除去すること
ができ、エンドトキシンが除去された高純度の塩基性蛋
白質はエンドトキシンによる副作用のない医薬品として
使用することができる。
って生産される塩基性蛋白質からその他の汚染物質、特
にエンドトキシンを検出されない水準まで除去すること
ができ、エンドトキシンが除去された高純度の塩基性蛋
白質はエンドトキシンによる副作用のない医薬品として
使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/579 Ｇ０１Ｎ 33/579 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 パク ヒュンボク 大韓民国 テージュン市 ユーソンク ソ ンカンドン 103 ソンカンマウルアパー ト 205−1504 (72)発明者 ソ ジンオン 大韓民国 テージョン市 ユンク ユヘン ドン 10 ヒュンダイアパート 115− 1902 (72)発明者 キン ジンヒュン 大韓民国 テージョン市 ユーソンク ジ ョンミンドン 462−４ チュンクナレア パート 150−304 (72)発明者 ホン ソンス 大韓民国 テージョン市 ユーソンク ジ ョンミンドン 462−２ チュンクナレア パート 109−404 (72)発明者 リ ヒュンス 大韓民国 ソウル市 ソチョク バンプド ン 550−18 ジェウーハウス 101 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA06 4B064 AG01 AG13 CA19 CE02 CE06 CE07 CE11 CE12 DA01 4D017 AA09 BA03 CA17 DA01 DB10 EA01 EB01 4H045 AA10 AA50 CA46 EA20 FA74 GA01 GA10 GA15 GA22 GA23 GA24 GA26
Claims (5)
- 【請求項１】 （ａ）再組合わせの微生物から得た塩基
性蛋白質を含有する溶液に界面活性剤を添加して混合
し、（ｂ）前記溶液を陽イオン交換樹脂にローディング
し、（ｃ）前記陽イオン交換樹脂を、界面活性剤を含有
しない溶媒で洗浄し、（ｄ）前記陽イオン交換樹脂から
所望の塩基性蛋白質を溶出させることを特徴とする塩基
性蛋白質からエンドトキシンを除去する方法。 - 【請求項２】 前記蛋白質がＤＮＡ結合蛋白質、塩基性
抗菌ペプチド、及び塩基性繊維芽細胞成長因子からなる
群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の塩
基性蛋白質からエンドトキシンを除去する方法。 - 【請求項３】 前記蛋白質がヒストンであることを特徴
とする請求項１に記載の塩基性蛋白質からエンドトキシ
ンを除去する方法。 - 【請求項４】 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤
であることを特徴とする請求項１に記載の塩基性蛋白質
からエンドトキシンを除去する方法。 - 【請求項５】 前記界面活性剤の濃度が０.０１〜１０
％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項１に記載の
塩基性蛋白質からエンドトキシンを除去する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020000052914A KR100356738B1 (ko) | 2000-09-07 | 2000-09-07 | 염기성 단백질로부터 엔도톡신을 제거하는 방법 |
| KR2000-52914 | 2000-09-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002179697A true JP2002179697A (ja) | 2002-06-26 |
Family
ID=19687822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001271682A Pending JP2002179697A (ja) | 2000-09-07 | 2001-09-07 | 塩基性蛋白質からエンドトキシンを除去する方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6713611B2 (ja) |
| JP (1) | JP2002179697A (ja) |
| KR (1) | KR100356738B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010533201A (ja) * | 2007-07-10 | 2010-10-21 | グランビア ニュートリショナルズ | タンパク質からエンドトキシンを除去するための方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102005002969A1 (de) | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Profos Ag | Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin |
| EP2409994A3 (en) | 2007-02-28 | 2012-08-15 | Lipoxen Technologies Limited | Reduction of endotoxin in polysialic acids |
| AU2014201943B2 (en) * | 2007-07-10 | 2016-07-28 | Glanbia Nutritionals | Method for removing endotoxin from proteins |
| CN114452444B (zh) * | 2022-01-27 | 2022-10-21 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 低内毒素胶原蛋白的制备方法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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