PT2115010E - Redução de endotoxinas em ácidos polisiálicos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

REDUÇÃO DE ENDOTOXINAS EM ÁCIDOS POLISIÁLICOS A presente invenção relaciona com a redução de endotoxinas em ácido polysialic (PSA) e seus conjugados por incubação com base forte, seguido por recuperação de PSA, geralmente por adsorção e eluição a partir de uma coluna de permuta aniónica. 0 PSA purificada com o conteúdo de endotoxina reduzida pode ser usada para derivatise sistemas de entrega de drogas, as moléculas biológicas, incluindo proteínas e péptidos drogas, o que melhora a farmacocinética ea farmacodinâmica de drogas.

Os ácidos que ocorrem naturalmente são Polysialic polímeros ramificados de ácido siálico produzida por determinadas estirpes bacterianas em mamíferos e em determinadas células [Roth et. ai., 1993]. Eles podem ser produzidos em vários graus de polimerização a partir de n = cerca de 80 ou mais resíduos de ácido siálico para baixo para n = 2 por hidrólise ácida limitada ou por digestão com neuraminidases, ou por fraccionamento das formas naturais, bactérias derivadas do polímero. A composição dos diferentes ácidos polysialic também varia de tal modo que há formas homopoliméricos ou seja, o ácido alfa-2 ,8-linked polysialic compreendendo o polissacárido capsular de E. coli Kl e os meningococos grupo-B, que é também encontrada no formulário embrionário da molécula de adesão celular neuronal (N-CAM). Formas Heteropolymeric também existir -tais como a alternada alfa-2, 8 alfa-2, 9 ácido polysialic de E. coli estirpe K92 e polissacáridos do grupo C de N. meningitidis. ácido siálico também pode ser encontrada em copolímeros alternados com outros monómeros que não o ácido siálico, tais como grupo W135 ou Y grupo de N. meningitidis. ácidos Polysialic têm importantes funções biológicas, incluindo a evasão dos sistemas imunes e complemento por bactérias patogênicas e regulação da adesividade glial de neurônios imaturos durante o desenvolvimento fetal (em que o polímero tem uma função anti-aderente) [Muhlenhoff et. ai., 1998], apesar de não existirem receptores conhecidos para ácidos polysialic em mamíferos. 0 ácido alfa-2 ,8-linked polysialic de E. coli estirpe Kl é também conhecido como 'colominic ácido (CA) e é utilizada (em vários comprimentos) para exemplificar a presente invenção. 0 alfa-2, 8 forma encadeada de ácido polysialic, entre polissacáridos bacterianos, é não-imunogénico (eliciar nem respostas de células T ou anticorpo em sujeitos mamíferos, mesmo quando conjugado com proteínas transportadoras imunogénicas) , que pode reflectir o seu estatuto de um mamífero ( bem como um bacteriana) de polímero. Formas mais curtas do polímero (até n = 4) encontram-se na superfície celular gangliósidos, que estão amplamente distribuídas no organismo, e acredita-se eficazmente impor e manter a tolerância imunológica ao ácido polysialic. Nos últimos anos, as propriedades biológicas dos ácidos polysialic, particularmente aqueles da alfa-2, 8 ácido homopolimérica ligada polysialic, têm sido exploradas para modificar as propriedades farmacocinéticas do Gregoriadis proteína e de baixo custo moléculas de droga peso molecular [, 2006; Jain et. alr 2003.; US-A-584 6, 951 ; WO-A-0187922 ]. Derivatização ácido Polysialic dá origem a melhorias dramáticas em circulação meia-vida para um número de proteínas terapêuticas, incluindo catalase e asparaginase, e também permite que tais proteínas para ser usado em face da pré-existentes anticorpos criados como uma consequência (e às vezes inevitável) indesejável de exposição antes de a proteína terapêutica. Em muitos aspectos, as propriedades modificadas de proteínas polysialylated são comparáveis às proteínas derivatizado com polietileno glicol (PEG) . Por exemplo, em cada caso, as meias-vidas são aumentados, e as proteínas e péptidos são mais estáveis à digestão proteolítica, mas a retenção de actividade biológica parece ser maior do que com a PSA com PEG [Hreczuk-Hirst et al., 2002]. Além disso, existem questões sobre a utilização de PEG com agentes terapêuticos que têm de ser administrados cronicamente, uma vez que o PEG é apenas muito lentamente biodegradável [Beranova et. al. r 2000] e formas de alto peso molecular tendem a se acumular nos tecidos [Bendele et. al, 1998;. Convers et. al.r 1997]. Proteínas peguiladas foram encontrados para gerar anticorpos anti PEG que pode também influenciar o tempo de residência do conjugado na circulação sanguínea [Cheng et. al., 1999]. Apesar da história estabelecida de PEG como um administrada parentericamente polímero conjugado a terapêutica, uma melhor compreensão da sua imunotoxicologia farmacologia, e metabolismo será necessária [Hunter e Moghimi, 2002]. Da mesma forma, existem preocupações sobre a utilidade de PEG em agentes terapêuticos que podem exigir doses elevadas, uma vez que a acumulação de PEG pode conduzir a toxicidade. O alfa-2, 8 ácido ligada polysialic, por conseguinte, oferece uma alternativa atractiva para PEG, sendo um polímero imunologicamente invisível biodegradável que é, naturalmente, parte do corpo humano, e que se degrada, através neuraminidases de tecidos, ao ácido siálico, um sacárido não-tóxico. No entanto, o PSA em bruto é contaminado com altos níveis de endotoxina o que limita a sua utilidade terapêutica.

Nosso grupo descreveu, em anteriores trabalhos científicos e patentes concedidas, purificação e fracionamento de PSA e sua utilidade na melhoria das propriedades farmacocinéticas de proteínas terapêuticas [Gregoriadis, 2006, Jain et. al, 2004. ; US-A-05.846, 951 ; WO-A-0187922 ] . Agora, descrevemos preparação de PSAs purificada com o conteúdo de endotoxina menor que pode ser usado para produzir PSA-derivatizado proteínas, e outros agentes terapêuticos. Estes materiais e métodos novos são particularmente adequados para a produção de PSA-derivatizado agentes terapêuticos destinados a utilização em seres humanos e animais, em que o produto químico e definição molecular de entidades fármaco é de grande importância devido à ética médica e os requisitos de segurança do regulador autoridades, como o FDA e EMEA.

Endotoxina (que é um lipopolissacarídeo) foi definido pela primeira vez por Richard Pfeiffer em 1892 como uma substância tóxica estável calor libertado mediante ruptura de envelopes microbianos. A resposta inflamatória nos resultados hospedeiras infectadas na produção de toxicidade, o que parece ser optimamente adaptado para a depuração de a maioria das infecções locais. No entanto, uma resposta inflamatória levando ao choque séptico e morte também pode ocorrer quando há uma distribuição sistémica de infecções graves.

Este lipopolissacarídeo (LPS) é utilizado na maior parte dos passos que ocorrem durante a apresentação de endotoxina para as células mielóides do sistema imunológico ea produção de citoquinas inflamatórias. O componente mais potente do LPS é lípido A e tornou-se sinónimo de endotoxina. Mediadores inflamatórios a partir de bactérias como a peptidoglicano, a porção diacylglycerylcysteine de lipoproteinas de bactérias, ou bacterianas assinaturas de ácidos nucleicos, são também referido como endotoxina. Recentemente, tem sido descoberto que Toll-like receptor (TLR4) é o lipido A transdutor de sinal inflamatória. Além disso, os transdutores de sinal para diferentes mediadores inflamatórios foram identificados. A estrutura de endotoxina é importante desde que a sua elucidação facilita a compreensão de como ele pode ser removido. LPS é constituído por três partes: o lipido, proximal hidrofóbico Uma região, que âncoras LPS ao folheto exterior do MO, os distais, hidrofílicos O-antigénio repete, que se estendem para o meio aquoso, eo núcleo de interligação oligossacárido. 0 O-antigénio e açúcares essenciais Embora não seja essencial para a sobrevivência, proporcionar resistência bacteriana contra vários agentes antimicrobianos, incluindo detergentes e do complexo de ataque à membrana de complemento sérico. Células do tipo selvagem que produzem O-antigénio devido à sua colónia brilhante são conhecidos como 'lisa' e aqueles que não têm O-antigénio são conhecidos como 'áspera'. As moléculas que contêm o polissacárido O-antigénio são geralmente referidos como LPS e as moléculas que faltam 0-antigénio, como no Neisseria, são denominados lipooligosaccharide ou LOS. Como Lipido A é essencial para a sobrevivência e é também um potente mediador inflamatório, é agora um alvo para o desenvolvimento de antibióticos e agentes anti-inflamatórios.

Muitos mediadores inflamatórios, em adição ao LPS, pode ser considerado como endotoxinas, incluindo peptidoglicano, a porção glycerylcysteine diacilo de lipoproteinas bacterianas, bacterianas assinaturas de ácidos nucleicos e endotoxinas inactivos (produzido por estirpes mutantes de endotoxina).

Uma estrutura de lipido modificado tem sido utilizado para desenvolver antagonistas de endotoxina novos e adjuvantes imunitários [Cristo et a. /, 1995]. Determinação dos detalhes bioquímicos da estrutura lipídica e uma função de ajuda a entender seu papel na patogênese bacteriana e intervir com novos tratamentos para a infecção [Bispo 2005]. Métodos têm sido desenvolvidos para reduzir o teor de endotoxina de fluidos. WO87/07531 , Por exemplo, descreve a remoção de endotoxinas de endotoxina contendo fluidos, tais como sangue, utilizando-se polimixina B imobilizada num suporte de fase sólida. EUA B2 6.942.802 descreve métodos para a remoção de endotoxina bacteriana a partir de uma solução de proteína para recuperar a proteína. Nesta patente, metal imobilizado cromatografia de afinidade é usado. EUA B2 6.713.611 refere-se a um método de remoção de uma endotoxina a partir de uma solução contendo proteínas básicas. 0 método compreende a adição de um agente tensioactivo para a solução e carregar a solução resultante sobre uma coluna de permuta catiónica com recuperação subsequente da proteína básica a partir da coluna. EUA 6.617.443 descreve um método para a remoção de endotoxinas a partir de um material de que os ácidos nucleicos são para ser recuperado. As endotoxinas são removidos por pré-incubação dos ácidos nucleicos em uma solução de detergente isenta de sal e cromatografia de troca aniónica subsequente sobre um permutador de aniões tentáculo. EUA 5.169.535 descreve um método para a remoção de endotoxinas a partir de uma solução contendo proteína e endotoxina, em que o pH da solução é ajustado a pH 9 ou inferior (o ponto isoeléctrico da proteína) ea solução é passada através de uma coluna empacotada com uma granular reticulada quitosana. A endotoxina é absorvida ea proteína atravessa. EUA 5.917.022 descrevem um processo para a remoção de endotoxinas a partir de um produto biológico, tais como proteínas para uso terapêutico, fracções de plasma de sangue, e as soluções de albumina. Este método compreende de endotoxina presente no produto de ligação disse biológico a uma matriz reticulada hidrofílica composta por copolímero de alilo dextrano e N, N-metileno-bisacrilamida, ao qual a endotoxina liga-se com algum grau de especificidade. Este processo está na classe de afinidade método cromatográfico. EUA 7.109.322 descrevem um processo para reduzir ou remover endotoxinas a partir de composições que contêm substâncias activas terapêuticas, ácidos nucleicos, geralmente extraídos de fontes naturais por engenharia genética e / ou da biotecnologia. Para esse efeito, as composições a ser recuperados a partir de caldo de fermentação, por exemplo, são tratadas com materiais cromatográficos. As fracções de fontes naturais, tais como E. coli caldo de fermentação obtido são centrifugadas, lisadas usando 200 mM de NaOH, 1% de sulfato de sódio dodecilo , filtrada, em seguida, passado através de uma coluna de permuta aniónica em que o ácido nucleico preferencialmente (em comparação com endotoxina) absorve. 0 ácido nucleico é eluida com um tampão de eluição e recuperado. Num outro exemplo, uma afinidade de metal absorvente para a endotoxina é utilizado antes da coluna de permuta aniónica. EUA B2 6.699.386 invenção proporciona um absorvente que tem uma elevada capacidade para absorver selectivamente endotoxina e um método de adsorção de endotoxina de uma solução de proteína. 0 adsorvente é composto de uma substância básica ligado a um material de base por meio de um agente de ligação cruzada. EUA 6.774.102 invenção descreve material de sangue tratamento tendo a capacidade de remover selectivamente substâncias indutoras da endotoxina e citoquinas a partir de sangue ou plasma por adsorção extracorporal para o tratamento de choque séptico terapêutico. Eles também fornecido métodos e dispositivos que utilizaram um adsorvente com um oligopéptido polidispersa da invenção imobilizada num suporte sólido estado suporte para a remoção de endotoxinas a partir do sangue do sujeito humano ou animal. Métodos também têm sido descritos para a remoção de endotoxinas a partir de amostras de polissacáridos. EUA 5.589.591 revela um processo para a produção de uma composição de polissacárido substancialmente endotoxinfree usando uma técnica de separação de tamanho, de preferência de ultrafiltração. O método é adequado para a remoção de endotoxinas de manana, goma arábica e arabinogalactano recuperado a partir de fontes de plantas. EUA 5.039.610 descreve um processo para a remoção de endotoxinas de bactérias Gram-negativas polissacarídeos tais como o fosfato poliribosilribitol. Polissacarideo contendo pó derivado de bactérias Gram-negativas caldo de fermentação de bactérias é solubilizado para fornecer um ião divalente contador para endotoxina. 0 álcool é adicionado incrementalmente para induzir a precipitação de lipopolissacarideo eo material resultante é misturada com uma resina não-iónico, um detergente e um agente quelante. W098/32873 revela um processo para a separação de endotoxinas de polissacáridos bacterianos cápsula, por exemplo um polissacarideo capsular a partir de N. meningitidis, serogrupo C (exemplo 2), que é um ácido polysialic (polímero de ácido N-acetylnuraminic). Os principais passos deste processo são a mistura da amostra com uma solução de detergente, a precipitação alcoólica, e filtração.

No entanto, até à data, continua a ser um desafio para reduzir o teor de endotoxina de uma amostra de ácido polysialic para um nível aceitável para uso em produtos farmacêuticos. Polissacárido a partir de caldos de fermentação tem um teor aniónico e um peso molecular muito semelhante à endotoxina. 0 composto natural é também um lipopolissacárido. Por estas razões maioria das técnicas de purificação resultar em alguma copurification de PSA e endotoxina. A presente invenção ultrapassa estes problemas.

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, fornecemos um processo para reduzir o teor de endotoxina de uma amostra contendo ácido polysialic e endotoxina compreendendo os passos sequenciais: • (I) adição à amostra uma base tendo um pKa de pelo menos 12 para formar uma solução de base tendo um pH de pelo menos 12, incubando a solução por um tempo a uma temperatura, e então • (li) ácido recuperando polysialic tendo reduzido teor de endotoxina a partir da solução.

Em uma forma de realização a recuperação de PSA a partir da solução inclui as etapas: • (Iii) passando a solução de base tratada com através de uma coluna de permuta aniónica em que o ácido polysialic é absorvido na resina de permuta iónica; • (Iv) lavagem da coluna com um tampão de lavagem, em que o ácido polysialic permanece absorvido na resina de troca iónica, e • (V) eluindo o ácido polysialic a partir da coluna utilizando um tampão de eluição para fornecer uma solução de produto de ácido polysialic tendo o conteúdo de endotoxina reduzida. Acredita-se que pelo menos uma parte do produto de endotoxina de base tratada com passa através da coluna de permuta iónica no volume vazio.

Numa outra concretização o passo de recuperação (ii) envolve um passo de tratamento sal de remoção de, ou seja, com base em cromatografia de exclusão de tamanho em que materiais de alto peso molecular, tais como polissacáridos são recuperados livre de sais. A invenção é de particular utilidade para o tratamento de caldos de fermentação microbiana. 0 ácido polysialic e solução de endotoxina contendo o qual é submetido ao tratamento base do processo da invenção é de preferência caldo de fermentação, geralmente o sobrenadante após a centrifugação, ou o produto de etapas de tratamento preliminares para a remoção de contaminantes indesejados, tais como nutrientes, lipidos, proteínas e ácido nucleico. A amostra pode, no entanto, conter proteína que não é desejado no produto final como é de esperar que este irá ser degradada pela base e os produtos de degradação removido facilmente durante os passos de recuperação de PSA.

Este processo resulta em amostras de PSA que reduziram o conteúdo de endotoxina, e que são adequados para utilização na preparação de produtos farmacêuticos. Surpreendentemente, para o perito na arte, a utilização da base forte não resulta em degradação (de peso molecular) ou desacetilação do PSA. A pessoa qualificada teria evitado o contacto de PSA com uma base forte tal como NaOH, onde desacetilação é para ser evitada, ver, por exemplo Moe et al . . Nós mostramos, no entanto, que a incubação com base, seguido por recuperação de PSA por exemplo por eluição em uma coluna de permuta aniónica é um método particularmente eficaz para reduzir o conteúdo de endotoxina de PSA, enquanto que não conduza à modificação química (desacetilação, por exemplo) , nem a redução de peso molecular.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, proporciona-se uma amostra de material com PSA conteúdo de endotoxina reduzida obtenível pelo processo acima. 0 conteúdo de endotoxina deve ser reduzida para um nível farmaceuticamente aceitável. De preferência, o conteúdo de endotoxina da amostra, após o processo da invenção, é inferior a 25EU/mg de material de PSA. Por conseguinte, um terceiro aspecto da invenção fornece uma amostra de PSA compreendendo um conteúdo de endotoxina de 25EU/mg de material PSA, ou menos, medido utilizando o teste LAL. De preferência, o conteúdo de endotoxina está na gama de 0,05-25 UE / mg de material de PSA. A presente invenção proporciona amostras de PSA em si e PSA-conjugado (molécula biológica, por exemplo, ou fármaco conjugado sistema de entrega) (a seguir referido como material de PSA) que têm um conteúdo de endotoxina baixa. 0 processo da presente invenção é realizada sob condições que proporcionem rendimentos úteis de PSA. É possível para evitar a contaminação do PSA com ligandos de afinidade, tais como polimixina B, ou policatiões tais como poli-D-lisina, que são normalmente utilizados em adsorventes de afinidade concebidas para remover a endotoxina, quer por omitindo o uso de tais materiais completamente ou utilizá-los sob condições em que nenhuma degradação da matriz ocorra (sob as quais a remoção de endotoxinas podem não ser optimizados). Este 'purificado' PSA pode ser utilizado para derivatise agentes terapêuticos, tais como proteínas, e usado no corpo humano, sem o risco de toxicidade endotoxina. 0 nível de endotoxina é medida utilizando o teste LAL, tal como descrito na Farmacopeia Europeia 5,0, Apêndice XIVC.

No passo (i) do processo, a amostra é adicionada a uma base tendo um pKa de pelo menos 12. Sem se ser limitado pela teoria, pensa-se que cliva a base ligações éster, ligações provavelmente no endotoxina, tornando-o inactivo, e / ou permitindo a remoção dos produtos da reacção. Para ter utilidade no processo da presente invenção, por conseguinte, a base deve ser suficientemente forte para reagir e hidrolisar a endotoxina. É surpreendente que a concentração de endotoxinas reduzida sem substancialmente destruir o ácido polysialic, por exemplo, por desacetilação os grupos N-acetilo ou clivagem das cadeias de ácido polysialic.

Preferencialmente, a base tem um pKa de pelo menos 13, mais preferivelmente pelo menos 14. A base de preferência forma uma solução de base tendo um pH de pelo menos 13, mais preferivelmente pelo menos 14. A amostra é incubada tipicamente na base num tampão adequado, por exemplo tampão de HEPES, ou água.

As bases adequadas para utilização na presente invenção são de NaOH, KOH, Ca (OH) 2 e LiOH. Particularmente preferida é NaOH. NaOH a uma concentração de 2N é adequado.

Passo (i) é realizado durante um tempo que varia tipicamente desde 5 minutos até 24 horas, de preferência de 30 minutos a 6 horas. A temperatura é tipicamente no intervalo de 0 0 C ou 60 0 C e é, de preferência 2 0 C a 40 0 C. Temperaturas mais elevadas e / ou mais vezes pode conduzir à degradação indesejável de PSA em si.

Em uma forma de realização da invenção, a incubação no passo (i) é realizada durante 2 horas a 20 0 C com agitação constante. O passo (i) pode ser imediatamente seguido por um passo adicional em que a amostra é neutralizada. Neutralização pode ser realizada, por exemplo, com HCI, para atingir um pH da solução final de cerca de 7,4.

Um método adequado fazendo uso de cromatografia de troca iónica em que os passos (iv) e (V) pode ser baseada é descrito no nosso Pedido de Patente anteriormente, W02006/016161 . Este método pode ser adaptado para uso na presente invenção, em que não é necessário separar o PSA, nesta fase, em fracções de peso médio molecular diferente. Neste método de arte anterior, o ácido polysialic é separado em fracções de peso médio molecular diferente. Solução aquosa de PSA é contactado com resina de permuta aniónica numa coluna através do qual o PSA é adsorvido. 0 PSA é então submetido a eluição selectiva pelos tampões de eluição aquosas, eo PSA é recuperado a partir de fracções eluidas. A eluição selectiva envolve lavagem da resina na coluna com pelo menos um tampão de eluição. Se mais do que um tampão de eluição é usado, cada um pode ter força iónica diferente e / ou pH, em que os buffers de segunda e subsequentes têm maior força iónica e / ou pH do que os buffers de o passo imediatamente anterior. 0 processo de fraccionamento de permuta iónica usando conduz a uma redução pequena no conteúdo de endotoxina.

Em formas de realização preferidas do processo da presente invenção, a amostra é passado através de uma coluna de permuta aniónica, após ter sido tratado com a base. A amostra pode precisar de ser preparado antes do carregamento para a coluna, por exemplo, ele pode precisar de ser diluído. Pelo menos algumas das endotoxinas irá passar através da coluna e é preferido que o tampão de carregamento é seleccionada de tal modo que a PSA total é adsorvido e pelo menos alguns endotoxina não consegue ser adsorvida. Exemplos de tampões de carregamento estão descritos abaixo.

Passo (iv) do método é um passo de lavagem, em que um tampão de eluição iónica baixa concentração é lavado através da coluna. Por exemplo, tais um passo de lavagem inicial pode ser realizada com um tampão com uma concentração de sal de 100 mM ou menos. Tipicamente, o tampão de lavagem compreende trietanolamina e tem um pH cerca de 7,4. Esta etapa inicial pode lavar a baixas contaminantes de peso molecular. O passo de lavagem pode envolver um volume de pelo menos 1, de preferência pelo menos 1,5 volumes de coluna, com base no volume da coluna de resina de permuta iónica. Durante este passo, substancialmente todo o ácido polysialic permanece na resina de troca iónica. Mais do que um passo de lavagem pode ser realizada. 0 tampão de lavagem segundo pode ser idêntico ao primeiro, ou, alternativamente, compreender um álcool e / ou um surfactante. Os exemplos adequados de agentes tensioactivos não iónicos são tais como PEG, Tween 20 e 80 e Triton. Os passos de lavagem pode remover endotoxinas mais longe da coluna. É de notar que uma coluna de resina de permuta aniónica pode ter um diâmetro da secção transversal que é maior do que a altura ou podem, como em uma coluna convencional, têm uma altura que é maior do que o diâmetro da secção transversal. O volume pode estar na gama de 1 ml a 5000. A altura da coluna pode estar na gama de 1 centímetro de 5000 cm. A área da secção transversal pode estar na gama de 1 a centímetro 5000 centímetros 2‘ A secção transversal pode ser de qualquer forma, mas é de preferência redonda.

Após o passo de lavagem da resina de permuta aniónica, o PSA é eluída utilizando tampão de eluição. 0 tampão de eluição usado no passo (v) tem geralmente uma resistência relativamente mais elevada do que iónica do tampão de lavagem, a fim de remover o PSA a partir da coluna. Tipicamente, o tampão de eluição compreende de NaCl a uma concentração de pelo menos 0,4 M.

Verificou-se que é preferível para a etapa de eluição da forma de realização preferida para utilizar pelo menos 1,0, preferivelmente pelo menos 1,25 e mais preferivelmente pelo menos 1,5 volumes de coluna do tampão de eluição respectivo. De preferência, não mais de 3 volumes de coluna de tampão de eluição são usados. A taxa de fluxo para uma matriz de 75ml é, de preferência 7ml/minute. A forma de realização preferida do processo pode compreender mais do que um, por exemplo, pelo menos, 5, por exemplo até 20 ou, geralmente na gama de 6 a 12, os passos sequenciais de eluição com tampões de eluição, sucessivamente, o aumento da força iónica. A força iónica no primeiro desses passos essenciais está geralmente na gama de 1 mM de 1M. Desta maneira, o ácido polysialic eluida pode ser fraccionado em amostras com peso médio molecular diferente.

De preferência, a força iónica de um tampão de eluição é variado através da variação do nível de um sal de um ácido mineral forte e uma base mineral forte, de preferência cloreto de sódio.

Após o passo (v) , foi realizada, ea solução do produto obtido, os passos (i) e (iii) a (v) pode ser repetida. De preferência, os passos (iii) - (V) são repetidos. 0 PSA pode ser ainda tratada. Os passos subsequentes podem incluir ainda mais purificação e / ou passos de concentração. No que diz respeito às etapas adicionais, estes geralmente envolvem passos em que o polissacárido é isolado a partir de qualquer sal, por exemplo, usando membranas, por exemplo membranas de ultrafiltração. Tais passos podem também permitir que a concentração do PSAs para formar soluções mais concentradas. Tais soluções podem ser sujeitos a passos adicionais de tratamento de membrana, por exemplo sucessivos passos de filtração de ultrafiltração ou outros. 0 tampão de eluição de permuta aniónica pode conter um ácido ou uma base volátil e, neste caso, os passos adicionais podem envolver volatilização da base volátil a partir das fracções eluidas. Embora seja possível recuperar o PSA a partir de soluções aquosas por meio de técnicas de precipitação, por exemplo envolvendo solventes non para a PSA, é preferível que não tais solventes são utilizados, uma vez que este pode fazer o isolamento final, a partir dos respectivos solventes mais difíceis. Por conseguinte, a etapa final de recuperação de preferência envolve a evaporação da água e, de preferência, quaisquer restantes componentes do tampão voláteis remanescente dos passos de eluição. Num caso preferido em que trietanolamina está presente, tanto o catião trietanolamina e anião acetato são voláteis e pode ser facilmente removido sob vácuo. 0 PSA pode ser finalmente isolado a partir da solução por secagem, de preferência sob pressão reduzida. Isto é de preferência realizada por liofilização.

Precipitação, de preferência utilizando um solvente não, pode ser realizada como um passo preliminar para fraccionamento para remover uma porção da população e polidispersão diminuição das fracções de peso molecular mais elevados. De preferência, precipitação com etanol diferencial é usado. 0 processo pode compreender um passo adicional, quer antes do passo (i) , entre os passos (i) e (ii) ou após o passo (ii) . Isto pode envolver a cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC), cromatografia de afinidade, tais como metal imobilizado cromatografia de afinidade (IMAC) ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

Uma coluna de HIC é um adequado para que a endotoxina é adsorvido mas aos quais PSA não adsorvem, tal como fenilo FF. 0 tampão de carregamento é tipicamente sulfato de amónio, etc de cloreto de sódio em água desionizada ou água desionizada ajustada a pH 7,4. HIC é realizada de preferência antes do passo (i) . De facto, crê-se que esta é a primeira divulgação da utilização de HIC para a remoção de endotoxina de uma amostra de PSA. É surpreendente que HIC pode ser usado para remover endotoxinas sem co-remoção de ácido polysialic tais como recuperado a partir de caldo de fermentação, ou seja, sob a forma de um lipopolissacárido, ou vice-versa, por exemplo onde o material de PSA é conjugado a torná-lo mais hidrofóbico do que endotoxina. Por selecção adequada de endotoxina coluna e as condições irá adsorver à coluna enquanto o material passa através de PSA ou ou vice-versa r quer para a coluna de vácuo (com tampão de carga) ou por eluição com tampão de eluição adequado. De acordo com um aspecto adicional da invenção, portanto, proporcionar um novo processo para a redução do teor de endotoxina de uma amostra contendo ácido polysialic e endotoxina compreendendo fazer passar a amostra através de uma coluna de interacção hidrofóbica em que adsorve endotoxina, em que a PSA passa através da coluna e é recolhidos para fornecer uma solução de produto de ácido polysialic tendo conteúdo de endotoxina reduzida. De acordo com um aspecto ainda adicional da invenção é proporcionado um processo novo para a redução do teor de endotoxina de uma amostra contendo ácido polysialic e endotoxina compreendendo fazer passar a amostra através de uma coluna de interacção hidrofóbica para o qual o material de PSA adsorve, em que a endotoxina passa através da coluna e material de PSA é adsorvida e, em seguida o material de PSA é eluida e recolhido para proporcionar uma solução de produto de ácido polysialic tendo o conteúdo de endotoxina reduzida. A utilização de uma coluna de fenilo é preferido, como este se liga à endotoxina, permitindo simultaneamente que o PSA para passar através da coluna. Na primeira forma de realização, após a passagem do volume de vazios, contendo endotoxina, a coluna pode ser lavado com um tampão de lavagem e fracções de lavagem recolhidos, o que pode também compreender PSA. A segunda forma de realização é de particular utilidade para a purificação de conjugados de PSA com proteínas, tais como proteínas relativamente hidrofóbicos.

Meios de filtração de afinidade pode ser usado no processo da presente invenção geralmente após o passo (ii) . Matrizes de afinidade são selecionados que endotoxina armadilha especificamente. As condições são seleccionados de tal modo que a PSA não é adsorvido quando a solução é carregada. Pode ser frequentemente preferível evitar a utilização de endotoxina específico de cromatografia de afinidade, para evitar a contaminação por produtos de degradação da matriz. De preferência, onde qualquer etapa do processo, tais está incluído, as condições são seleccionados para evitar a degradação tal. Embora tais condições podem ser escolhidos à custa de optimizar a remoção de endotoxinas, quando combinada com os passos essenciais do processo da invenção em um processo em várias etapas do nivel de endotoxina pode ser reduzido para níveis aceitáveis

Em uma forma de realização da presente invenção, a afinidade matriz compreendendo um agente imobilizada-endotoxina de ligação é usado para purificar a amostra de PSA. Um agente adequado é um gel de polimixina B, em ™ Detoxi-Gel em particular. 0 Detoxi-Gel Gel ™ a endotoxina Removendo utiliza imobilizada polimixina B para ligar e remover pirogénios partir da solução. As polimixinas constituem uma família de antibióticos que contêm um ciclopéptido catiónico com uma cadeia de ácido gordo. A polimixina B neutraliza a actividade biológica das endotoxinas pela ligação ao lípido A porção de lipopolissacárido bacteriano. Estudos realizados por Kluger et al.r (1985) indicam que a imobilizada polimixina B inactiva algumas mas não todas as endotoxinas. A imobilizada polimixina B gel é uma matriz de afinidade estável, que resiste a lixiviação do ligando para a preparação valioso. Fazendo uso de um suporte de afinidade permite fácil limpeza de buffers, meios de cultura de células, as soluções contendo macromoléculas tais como proteínas, e os componentes farmacologicamente importantes. Detoxi-Gel Gel ™ a endotoxina Removendo também tem sido usada para remover a endotoxina a partir do ácido nucleico (DNA) amostras (Wicks et. Ai., 1995).

Tipicamente, antes de uma polimixina B gel é usado, ele deve primeiro ser desgaseifiçado. Os géis podem ser regenerada por lavagem, tipicamente com um detergente, por exemplo desoxicolato de sódio, seguido de lavagem para remover o detergente. Um agente adequado para lavar o gel é isenta de pirogénios água. Uma vez produzido, o gel é aplicado à coluna e tampão isento de pirogénio, ou água, são adicionados. 0 tempo de incubação da coluna é tipicamente uma hora. Uma vez que a amostra foi recolhida, é tipicamente liofilizada para evitar a contaminação bacteriana.

Um Cellufine ” coluna é outro tipo de coluna de cromatografia de afinidade, que podem ser utilizados para reduzir o teor de endotoxina da amostra de PSA. Tal é tipicamente uma coluna equilibrada com 2-8, por exemplo 5 volumes de coluna de tampão de endotoxina livre, por exemplo tampão de HEPES (pH 7,4). HEPES pode também ser utilizado como o tampão de carga. Cellufine é um material particularmente adequado para usar como agente ligante que tem inespecifica baixo de PSA.

Outros comercialmente disponíveis endotoxina selectivos colunas de cromatografia de afinidade são as colunas EndoTrap. Um EndoTrap Red coluna ™ pode também ser usado para reduzir o teor de endotoxina da amostra de PSA. Tal é tipicamente uma coluna equilibrada com 5-10, por exemplo 5 volumes de coluna de tampão de endotoxina livre, por exemplo com a regeneração do buffer Red ” e tampão HEPES 20 mM (pH 7,4) ou com água desionizada (pH 7,4) . HEPES ou água desionizada (pH 7,4) pode também ser utilizado como o tampão de carga.

Um Azul EndoTrap ” coluna pode ser usado para reduzir o teor de endotoxina da amostra de PSA. Tal é tipicamente uma coluna equilibrada com 5-10, para volumes exemplo 5 de coluna de água desionizada (pH 7,4), suplementado com 50-100 um de Ca +2'

No processo de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a amostra pode ser submetido a meios de purificação adicionais. Por exemplo, a amostra pode ser submetido a um ou mais passos preliminares de incubação com um agente tensioactivo, um agente quelante, uma base, num solvente orgânico, um oxidante ou uma peroxidase, antes do passo (i), entre os passos (i) e ( ii) ou após o passo (ii).

De preferência, o surfactante é um surfactante aniónico, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS). Alternativamente, o surfactante pode ser de 0,5% de Triton X 114 ou 1% de Triton X 100 ou 114. Surfactantes catiónicos Alternativamente, por exemplo, compostos bactericidally-eficazes activos de superfície tais como cetiltrimetilamónio, brometo podem ser utilizados. Um tempo de incubação adequado é de 1 hora. As temperaturas na gama 0-50 ° C são adequados, embora 35-37 ° C é preferido.

Sempre que um agente tensioactivo não iónico é usado, a solução é carregada numa coluna de permuta aniónica para a remoção de agentes tensioactivos não iónicos. Aqui, o tampão 20 mM de TEA pode ser usado.

Em uma forma de realização da presente invenção, a amostra é incubada com PSA 1% de SDS / NaOH 2N em tampão HEPES durante 1 hora e, em seguida a solução é carregada numa coluna para remover o sal e agente tensioactivo aniónico, por exemplo, uma coluna de GPC, e fraccionado com um tampão adequado, tipicamente tampão HEPES. Um PD10, coluna Sephadex 25 pode ser utilizado.

Alternativamente, outros agentes tensioactivos não iónicos possuindo pontos de turvação diferentes para Triton, tal como Tween 2 0 e Tween 80, também pode ser usado para reduzir o teor de endotoxina da amostra de PSA. A amostra é incubada PSA em 0,1% de Tween 80 por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, a solução é carregada numa coluna de permuta aniónica com um tampão adequado ou água desionizada (pH 7,4) para a remoção de agentes tensioactivos. A coluna é lavada extensivamente com água e tampão (pH 7,4) para remover surfactante.

Em formas de realização o processo inclui uma etapa de oxidação. Este passo destina-se a oxidar a unidade final de ácido polysialic a torná-lo reactivo, por exemplo, com proteínas ou péptidos. Pode simultaneamente conduzir a uma redução no conteúdo de endotoxina e, portanto, ser um passo útil para atingir o objectivo geral de redução de endotoxinas. Oxidantes adequados são periodato de sódio, superóxido, hipoclorito e peroxidase. O processo da invenção pode compreender a utilização de uma extracção de fase, a precipitação de diafiltração e / ou a utilização de calor seco antes do passo (i) ou após o passo (ii). Quando o calor seco é utilizado, tipicamente a amostra de PSA é aquecida num frasco até uma temperatura na gama de 100-200 ° C, mais preferivelmente cerca de 150 ° C durante 1-6 horas, tipicamente cerca de 4 horas. Estas condições não desativar ou degradar PSA.

Diafiltração podem ser utilizados após a incubação da amostra de PSA com um surfactante, ou alternativamente, usado independentemente do tratamento com surfactante. O filtro deve ser suficientemente pequena para reter pelo menos maior peso molecular, PSA, permitindo simultaneamente que a endotoxina para passar através. Um aparelho de ultrafiltração típico com um ponto de corte de 5kDa para as proteínas globulares tem poros suficientemente grande para permitir a passagem de endotoxina (-10.000 Da), mantendo PSAs de ~ 20.000 e acima. Um passo de diafiltração é de preferência utilizado após o tratamento com base, por exemplo, como parte do passo de recuperação (ii). O processo da presente invenção proporciona PSA com o conteúdo de endotoxina reduzida para níveis farmaceuticamente aceitáveis, para uso humano ou veterinário. Idealmente, o conteúdo de endotoxina do PSA do produto é inferior a 25EU/mg PSA. De preferência, o conteúdo de endotoxina do PSA está na gama de 0,05-25 UE / mg. A presente invenção pode ser de utilidade para a produção de conjugados de PSA com o conteúdo de endotoxina baixa. Em um conjugado de PSA de preferência porção do conjugado é de preferência uma molécula biológica, mais preferencialmente uma proteína. Os conjugados de proteína de PSA podem ser produzidos por uma variedade de métodos, em particular, ver os nossos pedidos de patente anteriores WO-A-0187922 e W092/22331 . O processo de acordo com o primeiro aspecto da invenção é geralmente inadequado para conjugados de PSA-biológicas da molécula desde a base tipicamente danifica a porção biológica, isto é, qualquer conjugação não é levada a cabo antes do passo (i) . Num quarto aspecto da invenção é proporcionado um processo compreendendo os passos sequenciais: • (V) PSA conjugado - mistura endotoxina é contactado com um agente tensioactivo não iónico por um tempo predeterminado a uma temperatura pré-determinado; • (Vi) A amostra tratada com agente tensioactivo é passado através de uma coluna de permuta aniónica em que o conjugado de PSA é adsorvido sobre a coluna; • (Vii) o conjugado de PSA é eluida da coluna utilizando um tampão de eluição para produzir uma solução de conjugado PSA tendo o conteúdo de endotoxina reduzida.

Exemplos de agente tensioactivo não iónico a ser utilizados neste aspecto são para os compostos de PEG exemplo, monooleato de sorbitano Tween 20/80 ou um membro da série

Triton. Mais uma vez, sem querer estar limitado pela teoria, acredita-se que o surfactante reduz os níveis de endotoxina por perturbar a formação de micelas endotoxina, ou por dissolução de endotoxina. O produto do quarto aspecto ou primeiro da invenção pode ser uma composição farmacêutica, em cujo caso, o teor de endotoxina deve ser suficientemente baixa para evitar efeitos secundários tóxicos quando a composição é administrada a um ser humano ou animal. A composição pode ser uma composição farmacêutica humana ou veterinária.

Tipicamente, as amostras de PSA, antes de purificação, isto é, o material de partida para o passo (i) do primeiro aspecto eo passo (v) do quarto aspecto tem um conteúdo de endotoxina na gama 1000-200, 000 UE / mg. A fim de ser farmaceuticamente aceitável, o conteúdo de endotoxina final da amostra deve ser não mais do que 25 UE / mg. 0 conteúdo de endotoxina admissível é dependente do uso pretendido do PSA. Se o PSA é para ser usado para derivatise uma proteína a ser utilizada como um medicamento, o conteúdo de endotoxina admissível varia com a dose de proteína a ser utilizada como um medicamento - doses mais elevadas requerem tipicamente a remoção mais rigorosa da endotoxina.

Para a PSA-proteína conjugados utilizados em composições farmacêuticas com uma dose (veterinário) humano de 10-500mg, o conteúdo de endotoxina não deve ser mais do que 0,5 UE / mg, e é de preferência na gama de 0,05-0,5 UE / mg. Para a PSA-proteína conjugados com uma dose humana de l-10mg, o conteúdo de endotoxina não deve ser mais do que 5 UE / mg, e é de preferência na gama de 0,5-5 UE / mg. Para a PSA-proteína conjugados com uma dose humana de até 1000pg, o conteúdo de endotoxina não deve ser mais do que 25 UE / mg, e está preferencialmente na gama de 5 a 25 UE / mg.

Na amostra invenção contendo endotoxina e PSA é convenientemente um caldo de fermentação. O caldo de fermentação pode ser produzida de forma recombinante ou ser de ocorrência natural PSA-produzindo caldo microbiana, um produto da hidrólise do mesmo ou de um derivado fractionalised de qualquer um destes. Os micróbios podem ser coli Kl, Neisseria meningitidis, ou liquefaciens Moraxella. Tipicamente, o processo de acordo com o primeiro aspecto da invenção compreende um passo preliminar em que os micróbios são fermentados para produzir um caldo de fermentação. O PSA pode ser um poli (2,8-linked ácido siálico), poli (2,9-linked ácido siálico) ou um alternada 2,8 - 2,9-ligadas de PSA. De preferência, o PSA é colominic ácido (CA) ou um derivado, oxidados reduzida, aminada e / ou hidrazida do mesmo. 0 PSA tipicamente tem pelo menos 2, de preferência pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 10, por exemplo, pelo menos, 50 unidades de sacáridos. Tipicamente, PSAs de maior utilidade tem um peso molecular médio de até lOOkDa. O PSA pode ser derivada de qualquer fonte, de preferência uma fonte natural, tais como uma fonte bacteriana, por exemplo, E. coll Kl ou K92, o grupo B meningococos, ou mesmo de leite de vaca ou de N-CAM. O polímero de ácido siálico pode ser um polímero heteropolymeric tal como o grupo 135 ou V grupo de N. meningitidis, ou podem ser sintetizados por exemplo, enzimaticamente. O PSA pode ser um copolímero de bloco, tais como um conjugado de um poli homo (ácido siálico) com um bloco de um outro polímero de ocorrência natural ou um polímero sintético. O PSA pode estar na forma de um sal ou o ácido livre. Pode estar numa forma hidrolisada, de tal modo que o peso molecular foi reduzida a seguir à recuperação a partir de uma fonte bacteriana. O PSA no material de partida para um processo da invenção pode ser material tendo uma ampla gama de pesos moleculares, tais como tendo uma polidispersão de mais de 1,3, por exemplo, tanto quanto 2 ou mais. De preferência, a polidispersidade de peso molecular é inferior a 1,2, mais preferivelmente inferior a 1,1, por exemplo tão baixo como 1,01. A derivatização de proteínas e sistemas de entrega de drogas com o PSA purificada pode resultar em meia vida aumentada, uma melhor estabilidade, imunogenicidade reduzida, e / ou controlo de solubilidade e, portanto, biodisponibilidade e propriedades farmacocinéticas, ou pode aumentar a solubilidade ou agentes activos de viscosidade de soluções contendo o derivatizado ativo.

De preferência, o PSA do produto final dos aspectos do processo do invento e dos novos produtos têm 2-1000 unidades de ácido siálico, por exemplo 10-500, mais preferencialmente de 10 a 50 unidades de ácido siálico. De preferência, a polidispersidade do PSA será menor do que 2, de preferência inferior a 1,2, e idealmente na gama de 1,01-1,10.

Os métodos de purificação utilizados na presente invenção vantajosamente reduzir a polidispersividade do PSA, além de reduzir o teor de endotoxina. O conteúdo de endotoxina de uma amostra de PSA é reduzida pelo processo da invenção, pelo menos, 5-vezes, de preferência, pelo menos, 10 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100, 200, 500 vezes e em algumas concretizações até 1000, 10.000, 100.000 ou mesmo 1 milhão de vezes. De preferência, o tratamento com uma base e de recuperação reduz o teor de endotoxina pelo menos 5 vezes. A redução global por etapas preliminares amd múltiplos passos PSA-de recuperação pode levar a uma redução de pelo menos 10 5 vezes. Em geral, a combinação de passos de recuperação é seleccionada de tal modo que a endotoxina redução é maximizada enquanto a recuperação de PSA é maximizada através da utilização de passos que são complementares a um outro em termos de remoção fracção endotoxina. O "Ensaio para a endotoxina" (teste LAL) secção dos Exemplos descreve como o conteúdo de endotoxina pode ser medido.

Exemplos

Ensaio de referência para endotoxinas

Para realizar o ensaio para a endotoxina, O Endosafe - PTS (Sistema de teste portátil) a partir de Charles River

Laboratories foi usado. Isto é baseado no ensaio (Limulus Amoebocyte Lysate) LAL.

Operação do Instrumento

Toda a informação necessária foi inserido no leitor. Uma vez que todas as informações do teste tinha sido inscrito, o leitor exibida "adicione a amostra; pressione enter". As amostras foram preparadas de PSA, a menos que especificado de outra forma a 1 mq / ml em tampão de 20 mM de TEA, a pH 7,4. 25 uL de amostra foi pipetado para todos os quatro reservatórios de amostra e tecla enter foi pressionada sobre o leitor. A bomba extraiu aliquotas de amostra para o canal de teste e os resultados foram produzidos em 15-20 minutos. Quando o teste foi terminado o instrumento apresentado a medição de endotoxina e os critérios de aceitação de ensaio sobre a tela. O instrumento deu as seguintes especificações: Amostra UE / mL, amostra de CV%, aumento UE / mL, pico CV% e recuperação de pico%.

Exemplo 1 - redução de endotoxinas utilizando hidróxido de sódio 6 mg / ml de solução de ácido colominic contaminados com endotoxina (31 kDa não oxidado) foi preparado em 0,5 M de tampão Hepes NaOH e foi incubada à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, 0,5 ml de solução foi carregada numa coluna de exclusão de tamanho cromatografia dessalinização e A fracção recolhida foi descartada. A coluna foi então lavada com 2,5 ml de tampão HEPES ea fracção foi recolhida seguido por recolha de uma outra fracção de 2 ml com tampão HEPES. As fracções de eluição recolhidos foram então analisadas por colominic teor de ácido por ensaio de resorcinol. As fracções contendo ácido colominic foram então analisadas em conjunto e foram analisadas para o conteúdo de endotoxina. As amostras foram testadas para o grau de desacetilação do PSA.

Houve uma redução de 53 vezes no teor de endotoxina utilizando NaOH e não havia nenhum grau de desacetilação detectável. Também não é qualquer quebra de CA observada no PAGE utilizando NaOH e SDS.

Exemplo 2 - Redução de endotoxina por troca iônica após o base A amostra colhida diretamente do E. fermentador coli Kl (lmg/ml) em tampão de TEA 2 0 mM (pH 7,4) foi medida e verificou-se ser mais do que 10 5 UE / mg. Em seguida, NaOH foi adicionado à solução de PSA para fazer normalidade final de NaOH 2N em PSA solução de amostra e depois foi incubada durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. O pH da solução foi gravada. O HiTrap qff coluna (1 mL) foi lavada com 10 água desionizada volume de coluna (pH 7,4) e, em seguida, coluna foi equilibrada com 10 volumes de coluna de 2 0 mM de TEA. A condutividade da solução da amostra foi medida e foi diluída de forma adequada com 2 0 mM de tampão de TEA para coincidir com a condutividade da solução tampão. A solução de amostra foi então carregado no qff (1 ml da coluna) a uma taxa de lml/mim eo volume vazio (- 1/3 do volume da coluna) foi recolhido separadamente. Frations lml foram coletados. A coluna foi então lavada com 20 mM de TEA e fracções de lavagem de 1 ml cada foram recolhidos. A amostra foi então eluída com 1 M de NaCl em 20 mM de TEA e as fracções foram recolhidas. Ensaio resorcinol das amostras de eluição foi realizada para calcular a quantidade de colominic ácido presente nas amostras eo conteúdo de endotoxina das amostras de eluição reunidas contendo colominic ácido foi determinada. O nível de endotoxina do produto foi encontrada para ser reduzida para 1407EU/mg, ou seja, mais de-71 vezes. A recuperação de PSA foi de 91%. 0 tratamento com uma base e recuperação por permuta aniónica foi repetido tendo acima do produto e uma maior redução no conteúdo de endotoxina foi visto, até menos de 300, ou seja, uma redução de 5 vezes mais.

Exemplo 3 - Redução de endotoxina por base / permuta aniónica seguida por tensioactivo não iónico e de permuta aniónica

Colominic produto solução de ácido de um caldo de fermentação diferente foi tratada por base pelo processo do Exemplo 2 e em seguida tratado com Triton X 114, como abaixo, de permuta aniónica seguida. 1% de Triton X solução 114 foi preparada e foi adicionada à solução de PSA em quantidade apropriada para fazer a concentração final de 0,5% de Triton X 114. A solução torna-se turva, à temperatura ambiente (25 ° C) . Para tornar a solução límpida, foi mantida em gelo durante 10-15 minutos. Novamente, a solução foi mantida à temperatura ambiente durante 20 minutos para torná-lo turvo. A solução turva foi centrifugado e duas camadas foram separadas: camada superior contendo PSA e camada inferior de Triton X 114 endotoxina que contém. A camada superior foi mantido para carregar sobre a coluna de qff. A coluna HiTrap qff foi preparado, carregado, lavou-se e eluiu-se como no Exemplo 4.

Neste caso, o nível de endotoxina foi reduzido de cerca de 10 5 a cerca de 4,4 x 10 3 UE / mg no primeiro passo base de tratamento e após 8,2 x 10 2 UE / mg após o passo de surfactante segundo e de permuta aniónica.

Referências

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Beranova, M., Wasserbauer, R., Vancurova, D., Stifter, M., Ocenaskova, J., Mora, M., Biomateriais, 11 (2000) 521-524

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Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a redução do teor de endotoxina de uma amostra contendo ácido polisiálico e endotoxina compreendendo os passos sequenciais: (i) adição à amostra de uma base tendo um pKa de pelo menos 12 para formar uma solução de base tendo um pH de pelo menos 12, incubando a solução por um tempo a uma temperatura; e (ii) recuperação do ácido polisiálico tendo um conteúdo reduzido de endotoxina.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a base tem um pKa de pelo menos 13.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o pH da referida solução de base é pelo menos 13.
4. 4. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a base é NaOH, KOH, Ca(OH)2 ou LiOH.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a base é 2N NaOH.
6. 6. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que os ditos intervalos de tempo variam desde 5 minutos até 24 horas e em que a referida temperatura está na qama de 0 a 60°C.
7. 7. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o passo (ii) inclui os seguintes subpassos sequenciais: (iii) fazer passar a amostra através de uma coluna de troca aniónica em que o ácido polisiálico é adsorvido na resina de troca iónica; 1 (iv) lavagem da coluna com um tampão de lavagem, através do qual o ácido polisiálico permanece adsorvido na resina de troca iónica; e (v) eluição do ácido polisiálico a partir da coluna utilizando um tampão de eluição para fornecer uma solução de produto de ácido polisiálico tendo conteúdo reduzido de endotoxina.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a amostra, após o passo (i), é neutralizada antes do passo (ii) .
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, em que no passo (iv), a coluna é lavada num primeiro passo com um primeiro tampão de lavagem de baixa força iónica para eluir a endotoxina a partir da coluna e em que o tampão de eluição usado no passo (v) tem relativamente mais elevada força iónica.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o dito tampão de lavagem e/ou o dito tampão de eluição contêm uma base volátil.
11. 11. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 10, em que no passo (iv) a coluna é lavada mais de uma vez.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11, que compreende a lavagem da coluna com um segundo tampão de lavagem, que compreende NaCl a uma concentração de pelo menos 0,2 M. 2
13. 13. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 12, os em que passos (i) e (iii) a (v) são repetidos com a solução de produto.
14. 14. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, compreendendo pelo menos um passo no qual o nível de endotoxina do ácido polisiálico é reduzido por purificação realizada quer antes do passo (i), entre os passos (i) e (ii) ou após o passo (ii) selecionado a partir da cromatografia de troca iónica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão de tamanho e combinações das mesmas.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a cromatografia de interação hidrofóbica é realizada antes do passo (i).
16. 16. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a amostra de ácido polisiálico quer antes do passo (i) , entre os passos (i) e (ii) ou após o passo (ii), é incubado com um tensioactivo, um agente quelante, um solvente orgânico, um oxidante ou uma peroxidase.
17. 17. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, compreendendo um passo preliminar em que E. coli são fermentados para produzir um caldo de fermentação contendo o ácido polisiálico e endotoxina, opcionalmente compreendendo os passos intermediários de remoção de proteínas, lípidos, ácido nucleico e/ou nutrientes, para formar a referida amostra. 3
18. 18. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o conteúdo de endotoxina do ácido polisiálico na solução do produto não é mais do que 25 UE/mg de ácido polisiálico medido pelo teste LAL.
19. 19. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a amostra contém o conjugado do ácido polisiálico-proteina e endotoxina.
20. 20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o conteúdo reduzido de endotoxina não é mais do que 5 UE/mg.
21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que o conteúdo reduzido de endotoxina não é mais do que 0,5 UE/mg.
22. 22. Processo para a preparação de um conjugado de molécula biológica de ácido polisiálico, compreendendo a redução do teor de endotoxina de uma amostra contendo ácido polisiálico de acordo com o processo de qualquer reivindicação anterior e combinando o ácido polisiálico obtido com a molécula biológica.
23. 23. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que a molécula biológica é uma proteína. 4