CN103361283B - 微生物发酵法生产多聚n-乙酰神经氨酸及其提纯方法 - Google Patents

微生物发酵法生产多聚n-乙酰神经氨酸及其提纯方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种使用大肠杆菌CGMCC NO.5585发酵生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法及多聚N-乙酰神经氨酸提纯方法，获得一种高纯度、不含内毒素的多聚N-乙酰神经氨酸，满足在食品、化妆品、药物生产的要求。本发明的发酵原料使用了便宜的葡萄糖代替较贵的山梨醇，依然可以在发酵阶段获得5～6g/L的产量，特别适合于于工业化发酵生产PSA；最后，本发明通过后续的提出步骤，可以获得聚合度至少可以达到70000Da以上，纯度至少为＞95％(HPLC)，产率为4～4.5g/L的高纯PSA。

Description

微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸及其提纯方法
技术领域
本发明涉及一种使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸及其提纯方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸(PSA)已有很多研究和尝试。利用大肠杆菌天然菌种即可以完成。PSA本身有药品缓释剂，免疫佐剂，药物前体等多种用途。而且进一步水解可以得到单体N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，后者是重要的食品和药品原料。发酵法生产PSA目前已有文献报道如郭良栋等(产多聚唾液酸的菌种筛选及产酸条件，1998)等，但是经过中试实验多种指标并不能达到要求，其最高的发酵水平仅为1.2g/L左右，而且发酵来源为山梨醇，成本较昂贵，还必须去除内毒素。因此，限制了多聚N-乙酰神经氨酸(PSA)在治疗方面的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法及更为简洁与经济的多聚N-乙酰神经氨酸提纯方法，获得一种高纯度、不含内毒素的多聚N-乙酰神经氨酸，满足在食品、化妆品、药物生产的要求。
技术方案
本发明提供了一种高产多聚N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌，保藏号为CGMCC NO.5585。即本发明涉及的高产多聚N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC NO.5585，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院；保藏日期：2011年12月13日，分类命名及拉丁学名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
本发明还提供了一种使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在种子罐的基础培养基中接种大肠杆菌，发酵培养获得种子培养液；
2)将种子培养液接种于含上述基础培养基的发酵罐中，37℃温度下进行发酵培养，并流加碳源，控制溶氧为20％，控制pH＝7；
3)发酵后期，降低转速为75rpm/min，不控制溶氧，通气比例0.2，至发酵结束。
优选地，本发明所述的大肠杆菌的保藏号为CGMCC NO.5585。
优选地，本发明所述的基础培养基的碳源为葡萄糖。
优选地，本发明所述的基础培养基葡萄糖含量为10～35g/L。
优选地，本发明所述的使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法的步骤2)中流加的碳源为葡萄糖。
优选地，本发明所述的使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法的的步骤2)中流加葡萄糖的方法为：在接种种子培养液发酵4小时后，流加50％葡萄糖，0.5ml/min持续4小时后调为1ml/min持续4小时，再转换成0.5ml/min持续4小时。
同时补液氨以控制pH＝7。发酵16小时后，葡萄糖改为0.2ml/min补料，5MNaOH控制pH＝7。
本发明还提供了一种提纯多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以大肠杆菌的发酵液为原料，采用0.1微米微滤膜过滤发酵液；
2)微滤后的上清液使用70000Dalton超滤膜超滤，弃去滤液，保留超滤后的浓缩液；
3)将超滤浓缩液加入等体积乙醇和1.5％v/v聚合氯化铝，离心除沉淀，保留上清，然后加入氯化钙使终浓度达到30mM后，加热到65，保持30min。离心除沉淀，收集上清；
4)加入二倍体积的95％乙醇，静置降温至8℃以下，维持1小时后，离心收集PSA沉淀；
5)溶解PSA沉淀，调节pH＝2。温度控制在20℃以下，使用反相色谱层析精制。
优选地，本发明所述的提纯多聚N-乙酰神经氨酸的方法中，所述步骤5)的反相色谱层析精制的步骤如下：采用30μm聚苯乙烯型反相色谱柱，流动相用0.005M硫酸配制pH＝2的水。将溶解于水的PSA上柱洗脱。上样量为装柱量的1/4体积。连续记录流出液pH和210nm紫外吸收。收集紫外吸收峰且pH＜2的组分。流动相精确量取体积，加入等摩尔数的Ca(OH)2除去硫酸根。过滤或离心去除CaSO4沉淀，上清真空冷冻干燥得成品PSA。
由上可以看出，本发明至少有以下技术效果：
1.本发明的多聚N-乙酰神经氨酸的发酵产率可以达到5～6g/L，高于现有技术的平均水平，特别适合于于工业化发酵生产PSA；
2.本发明的发酵原料使用便宜的葡萄糖代替较贵的山梨醇，可以进一步降低生产成本；
3.本发明的发酵产生的PSA聚合度较高，至少可以达到70000Da以上，并使用超滤膜可以将浓缩液体积降为原体积的1/20，大大降低了后期处理的液量和难度；
4.本发明在传统步骤中的沉淀PSA步骤前，还使用了单独去除蛋白的方法，可以除去大分子蛋白和脂类等杂质，降低色谱层析的难度；
5.采用反相液相色谱，相比目前报道的离子交换色谱法，降低了色谱处理的复杂性，提高了色谱效率；
6.减少缓冲盐的使用，可以省去透析步骤；
7.本发明的提纯方法，省去了去除内毒素步骤，但获得内毒素的含量仍在水平以下，更适合于在食品和药物中应用；
8.本发明的提纯方法，可以获得纯度至少为＞95％(HPLC)，产率为4～4.5g/L的高纯PSA。
附图说明
图1为通过本方法得到的多聚N-乙酰神经氨酸的产品图；
图2为多聚N-乙酰神经氨酸的反相层析色谱图，其中图示A为有颜色的杂质，图示B为纯化的多聚N-乙酰神经氨酸；
图3为多聚N-乙酰神经氨酸的高效液相谱图。
高产多聚N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌保藏信息：
分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；
保藏号：CGMCC NO.5585；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院；
保藏日期：2011年12月13日。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本发明发明人意外地获得了一种高产多聚N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌，保藏号为CGMCC NO.5585。该大肠杆菌可以利用葡萄糖作为碳源，因此，本发明可以使用葡萄糖代替较贵的山梨醇；其次，该大肠杆菌CGMCC NO.5585发酵获得多聚N-乙酰神经氨酸(PSA)聚合度更高，至少可以达到70000Da以上，这是以往发现的菌株所不能达到的，因此，本发明在后期处理方面更加容易，获得的聚合物的质量也更佳；最后，本发明的大肠杆菌CGMCC NO.5585发酵产量很高，纯度也更好，而且内毒素的含量更低，更适于食品和医药领域中的应用。
其次，本发明实施例对大肠杆菌CGMCC NO.5585的发酵方法进行创造性的调整，发现在保持发酵液中的残糖量低于5mg/L时，菌株的生长更好，发酵产量和质量也更佳，因此，本发明在大肠杆菌CGMCC NO.5585的培养中需要控制葡萄糖的流加速率，以达到最佳发酵的目的。
最后，由于大肠杆菌CGMCC NO.5585发酵产物多聚N-乙酰神经氨酸的聚合度较高，因此，本发明实施例对上述大肠杆菌发酵的多聚N-乙酰神经氨酸的纯化过程中，可以使用70000Dalton以上的超滤膜超滤，这样可以在满足多聚N-乙酰神经氨酸的聚合度的要求的前提下，去除大量的小分子杂质，甚至部分蛋白，进一步提高多聚N-乙酰神经氨酸的纯度和质量。
此外，通过选择反相色谱层析的方法精制，降低了色谱处理压力，提高了色谱效率，可以获得纯度至少为＞95％(HPLC)，产率为4～4.5g/L的高纯PSA。
下面以具体的实施方式对本发明进行具体说明：
实施例1微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸
发酵菌种为中国科学院微生物研究所工业微生物研究室诱变筛选的大肠杆菌CGMCC NO.5585。种子罐采用5升发酵。所用的基础培养基为葡萄糖25g/L，硫酸铵5g/L，酪蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾20g/L，硫酸镁0.4g/L，混合均匀后，通蒸汽灭菌。至121℃后，维持罐压0.09MPa，灭菌30分钟。灭菌过程需用200rpm连续搅拌。待冷却后，接种9升菌体培养液。37℃培养12小时获得种子培养液。
发酵罐采用200升发酵。基础培养基为葡萄糖25g/L，硫酸铵5g/L，酪蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾20g/L，硫酸镁0.4g/L。接种上述种子培养液，37℃温度下进行发酵培养。发酵4小时后流加50％葡萄糖，0.5ml/min持续4小时后调为1ml/min持续4小时，再转换成0.5ml/min持续4小时。同时补液氨以控制pH＝7。发酵16小时后，葡萄糖改为0.2ml/min补料，5MNaOH控制pH＝7。全程溶氧控制为20％，转速由溶氧控制。发酵36小时后，停止发酵，调低转速为75rpm/min，不控制溶氧，通气比例0.2。维持6小时后发酵结束。
发酵结束后，测定发酵收获期的PSA产率，使用间苯二酚法测得发酵收获期的PSA产率平均为5～6g/L。
实施例2多聚N-乙酰神经氨酸的分离纯化
使用实施例1获得的发酵液。按下述步骤进行多聚N-乙酰神经氨酸的分离纯化：
1.菌液分离
采用0.1微米陶瓷膜切向微滤法分开菌体(微滤装置)与发酵清液。滤过液体积为原体积的7/8。再用原体积3/8的水洗涤菌体，微滤菌体洗涤液，与前述滤过液合并。
2.去除小分子杂质
由第2步分离的上清液，使用滤膜为70000Dalton超滤器超滤，浓缩大分子。滤过的废液舍弃。此步骤可浓缩上述上清液至少20倍体积以上。用浓缩液2倍体积的清水洗涤浓缩液并超滤，重复3次。废弃滤除液，保留浓缩液。
3.去除蛋白
去除蛋白分两次。第一次将超滤浓缩液加入等体积乙醇和1.5％v/v聚合氯化铝，离心除沉淀，保留上清。第二次加入氯化钙使终浓度达到30mM后，加热到65℃，30min。离心除沉淀，收集上清。
4.乙醇沉淀PSA
加入二倍体积的95％乙醇，静置降温至8度以下，维持1小时后，离心收集PSA沉淀。PSA沉淀可以用70％乙醇洗涤2次。然后减压蒸馏，除去乙醇。并溶解于3倍质量(湿重)的水中，调节pH＝2。温度控制在20℃以下。
5.反相色谱层析精制
采用30μm聚苯乙烯型反相色谱柱，流动相用0.005M硫酸配制pH＝2的水。将溶解于水的PSA上柱洗脱，流速为3ml/min。连续记录流出液pH和210nm紫外吸收。收集紫外吸收峰且pH＜2的组分。流动相精确量取体积，加入等摩尔数的Ca(OH)2除去硫酸根。过滤或离心去除CaSO4沉淀，上清真空冷冻干燥得成品PSA。反相色谱层析的结果可以参见色谱图2，其中，图示A为杂质，图示B为PSA峰。
对反相层析色谱纯化的PSA进行HPLC检测，检测条件为色谱柱phenomenex的Synergi Hydro色谱柱(150mm×4.6mm，4μm)；流动相条件为5％甲醇-65％甲醇，pH＝2进行梯度洗脱30min，流速为0.5ml/min；上样量为10μl。柱温：40度。结果可以参见附图2，由图计算可以得到本发明实施例的PSA纯度＞95％(HPLC)。
因此，本发明精制获得的PSA平均产率为4～4.5g/L，纯度＞95％(HPLC)，具体产品可以参见图3，可以看出本发明的多聚N-乙酰神经氨酸产品为白色晶体，质地蓬松；而现有技术中的多聚N-乙酰神经氨酸产品一般带有颜色，并为无定型的粉末。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种生产多聚N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌，其特征在于，保藏号为CGMCC No.5585。
2.一种使用微生物发酵法生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在种子罐的基础培养基中接种大肠杆菌，发酵培养获得种子培养液，其中，所述的大肠杆菌的保藏号为CGMCC No.5585；
2)将种子培养液接种于含上述基础培养基的发酵罐中，37℃温度下进行发酵培养，并流加碳源，控制溶氧为20％，控制pH＝7；
3)发酵后期，降低转速为75r/min，不控制溶氧，通气比例0.2，至发酵结束。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的基础培养基的碳源为葡萄糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖含量为10～35g/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中流加的碳源为葡萄糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中流加葡萄糖的方法为：在接种种子培养液发酵4小时后，流加50％葡萄糖，0.5ml/min持续4小时后调为1ml/min持续4小时，再转换成0.5ml/min持续4小时；同时补液氨以控制pH＝7,发酵16小时后，葡萄糖改为0.2ml/min补料，5M NaOH控制pH＝7。
7.一种提纯多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以大肠杆菌CGMCC No.5585的发酵液为原料，采用0.1微米微滤膜过滤发酵液；
2)微滤后的上清液使用70000Dalton超滤膜超滤，弃去滤液，保留超滤后的浓缩液；
3)将超滤浓缩液加入等体积乙醇和1.5％v/v聚合氯化铝，离心除沉淀，保留上清，然后加入氯化钙使终浓度达到30mM后，加热到65℃，30min,离心除沉淀，收集上清；
4)加入二倍体积的95％乙醇，静置降温至8℃以下，维持1小时后，离心收集多聚N-乙酰神经氨酸沉淀；
5)溶解多聚N-乙酰神经氨酸沉淀，调节pH＝2,温度控制在20℃以下，使用反相色谱层析精制。
8.根据权利要求7所述的提纯多聚N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述步骤5)的反相色谱层析精制的步骤如下：采用30μm聚苯乙烯型反相色谱柱，流动相用0.005M硫酸配制pH＝2的水,将溶解于水的多聚N-乙酰神经氨酸上柱洗脱,连续记录流出液pH和210nm紫外吸收,收集紫外吸收峰且pH<2的组分,流动相精确量取体积，加入等摩尔数的Ca(OH)2除去硫酸根,过滤或离心去除CaSO4沉淀，上清真空冷冻干燥得成品多聚N-乙酰神经氨酸。
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