CN108588152B - 聚唾液酸发酵培养基、聚唾液酸的生产方法和聚唾液酸制品 - Google Patents

聚唾液酸发酵培养基、聚唾液酸的生产方法和聚唾液酸制品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了聚唾液酸发酵培养基、聚唾液酸的生产方法和聚唾液酸制品，涉及聚唾液酸生产技术领域。本发明公开的聚唾液酸发酵培养基其包括有基础培养基和添加剂，添加剂包括以下成分中的任意一种或多种的组合：B族维生素、微量元素组合以及CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，B族维生素包括：VB1、VB5、VBH和VB12，微量元素组合包括：FeSO4、KIO3、MnCl2、CoCl2、CrCl3、ZnSO4、Na2MoO4以及H3BO3。采用该聚唾液酸发酵培养基进行发酵生产聚唾液酸，可以提高聚唾液酸含量，进而降低发酵成本，扩展N‑乙酰神经氨酸的应用。

Description

聚唾液酸发酵培养基、聚唾液酸的生产方法和聚唾液酸制品
技术领域
本发明涉及聚唾液酸生产技术领域，具体而言，涉及一种聚唾液酸发酵培养基、聚唾液酸的生产方法和聚唾液酸制品。
背景技术
2017年5月31日国家卫计委审核并批准了乳木果油等10种新食品原料的使用，其中包含N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。Neu5Ac是细胞信息传递的第一接触位点，且其分子结构具有多样性，因此Neu5Ac参与细胞识别、信号转导、肿瘤发生、受精等多个生理过程。此外，Neu5Ac能调节IgG的抗炎活性，增强婴儿免疫力，影响神经细胞的完整性、渗透性及活性，促进婴儿大脑的发育。所以N-乙酰神经氨酸的生产引起了较多的关注和研究。
目前N-乙酰神经氨酸的生产方法包括：天然产物提取、化学合成、生物酶催转化、基因工程菌直接发酵及聚唾液酸发酵水解法。绝大多数天然产物中Neu5Ac含量低，而且组份非常复杂，从中提取Neu5Ac伴随着复杂的过程，回收率低，很难满足大规模生产的要求。化学合成法由于繁琐的基团保护、去保护等操作，以及手性异构副产物的存在，该方法亦无法应用于工业生产。生物酶催转化及基因工程菌涉及转基因问题亦难以通过食品相关法律批准，更无法应用于婴幼儿健康领域。聚唾液酸发酵水解法由于其属于天然产物，消费者比较容易认可，且已经通过中国官方认可，具有较高的产业化价值。
聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)以α-2，8和(或)α-2，9键连接的同聚物，是少数细菌的荚膜多糖的主要组分。1957年，Barry和Goebel首先在E.coli K235中发现聚唾液酸，后来人们相继在其它菌株中发现聚唾液酸。
但是，目前聚唾液酸的发酵水平较低，普遍在5～6g/L左右，导致发酵成本较高，进而限制了N-乙酰神经氨酸的应用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚唾液酸发酵培养基，其可用于接种产聚唾液酸细菌以发酵生产聚唾液酸，提高聚唾液酸产量。
本发明的另一目的在于提供一种聚唾液酸的生产方法。
本发明的另一目的在于提供一种聚唾液酸制品。
本发明是这样实现的：
一种聚唾液酸发酵培养基，其适用于接种产聚唾液酸细菌以发酵生产聚唾液酸，其包括基础培养基和添加剂；
上述添加剂包括以下成分中的任意一种或多种的组合：用于在发酵前添加至上述基础培养基中的B族维生素、用于在发酵前添加至上述基础培养基中的微量元素组合以及用于在发酵过程中添加至上述基础培养基中的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)；
上述B族维生素包括：VB1(硫胺素)、VB5(泛酸钙)、VBH(生物素)和VB12(氯钴胺)；
上述微量元素组合包括：FeSO4、KIO3、MnCl2、CoCl2、CrCl3、ZnSO4、Na2MoO4以及H3BO3。
需要说明的是，本发明提供的培养基的基础培养基和添加剂二者可以是以分开独立地的形成存在，二者也可以是以混合形成存在。
若二者以分开独立地的形成存在，使用时，在接种前，将添加剂中的B族维生素或微量元素组合添加至基础培养基中即可，或者将B族维生素和微量元素组合在接种前添加至基础培养基，或者发酵过程中将CTAB添加至基础培养基中。
B族维生素是微生物菌体生长重要的生长因子，作为酶的辅助因子以多种方式参与细菌的代谢过程，发明人发现，在培养基中添加由VB1、VB5、VBH和VB12组成的B族维生素组合，可以提高聚唾液酸的产量。
微量元素组合的添加使用，可以补充产聚唾液酸细菌例如大肠杆菌生长所需要微量离子和酶合成所需要的辅酶离子，使菌体的生长活性得到延续。发明人发现，在培养基中添加由FeSO4、KIO3、MnCl2、CoCl2、CrCl3、ZnSO4、Na2MoO4以及H3BO3组成的微量元素组合可以提高聚唾液酸的产量。
在发酵的过程中添加CTAB可以促进主要成分是PSA的细胞荚膜脱落，还可以增加细胞膜透性，提高反应效率，进而提高聚唾液酸的产量。因为CTAB对细胞具有一定毒性和副作用，故选择在发酵中期细胞具有较强活力可以耐受CTAB时开始添加。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在基础培养基中，VB1的浓度为0.4-0.6mg/L、VB5的浓度为3-3.4mg/L、VBH的浓度为0.005-0.007mg/L以及VB12的浓度为0.13-0.17mg/L。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述基础培养基中，FeSO4的浓度为1-3mg/L、KIO3的浓度为0.04-0.08mg/L、MnCl2的浓度为0.7-0.9mg/L、CoCl2的浓度为0.1-0.3mg/L、CrCl3的浓度为0.07-0.09mg/L、ZnSO4的浓度为0.08-0.1mg/L、Na2MoO4的浓度为0.02-0.04mg/L以及H3BO3的浓度为1.5-2mg/L。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，CTAB的浓度为180-220mg/L。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述基础培养基含有以下成分中的一种或多种的组合：葡萄糖、玉米浆干粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化铵以及丙酮酸钠。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在基础培养基中，葡萄糖的浓度为18-22g/L、玉米浆干粉的浓度为2.8-3.2g/L、磷酸氢二钾的浓度为4.8-5.2g/L、硫酸镁的浓度为0.3-0.72g/L、氯化铵的浓度为5-7g/L、丙酮酸钠的浓度为5.5-6.5g/L。
一种聚唾液酸的生产方法，其包括：将产聚唾液酸细菌接种至上述的培养基的基础培养基中进行发酵。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，发酵的条件包括：温度36-38℃和DO高于30％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵过程中，培养基的pH维持6.2-6.6。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵过程中，用氢氧化钠加入培养基中以调节培养基的pH。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵第8-30h往上述基础培养基中加入上述CTAB。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，产聚唾液酸细菌的接种量为2％-4％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，产聚唾液酸细菌为具有产聚唾液酸能力的大肠杆菌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述产聚唾液酸细菌的保藏编号为CCTCCNO:M 2018103。
相较于其他类型的产聚唾液酸细菌，使用保藏编号为CCTCCNO:M 2018103产聚唾液酸细菌进行发酵，可以提高聚唾液酸的含量。
该产聚唾液酸于2018年3月6日已提交至湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号CCTCC NO:M 2018103；分类学命名：Escherichia coli CASOV-8。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在培养基中加入有泡沫抑制剂以抑制泡沫产生。
本发明提供的聚唾液酸的生产方法通过使用上述的培养基进行发酵，可以明显提高发酵产物中聚唾液酸的含量。
一种聚唾液酸制品，其由上述的生产方法所制得。
本发明提供的聚唾液酸制品中具有较高含量的聚唾液酸。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的聚唾液酸发酵培养基其包括有基础培养基和添加剂，添加剂包括以下成分中的任意一种或多种的组合：B族维生素、微量元素组合以及CTAB，B族维生素包括：VB1、VB5、VBH和VB12，微量元素组合包括：FeSO4、KIO3、MnCl2、CoCl2、CrCl3、ZnSO4、Na2MoO4以及H3BO3。采用该聚唾液酸发酵培养基进行发酵生产聚唾液酸，可以提高聚唾液酸含量，进而降低发酵成本，扩展N-乙酰神经氨酸的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的聚唾液酸发酵曲线结果图；
图2为本发明实施例2中的聚唾液酸发酵曲线结果图；
图3为本发明实施例3中的聚唾液酸发酵曲线结果图；
图4为本发明实施例4中的聚唾液酸发酵曲线结果图；
图5为本发明对比例1中的聚唾液酸发酵曲线结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的聚唾液酸的生产方法包括如下步骤：
1菌种活化
取冻存的产聚唾液酸(保藏编号CCTCC NO:M 2018103)的菌种划线接种至固体LB培养基上，37℃培养。
所使用的产聚唾液酸于2018年3月6日已提交至湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号CCTCC NO:M 2018103；分类学命名：Escherichia coli CASOV-8。
2一级种子的培养：
待长出单菌落后，挑取单菌落，接种到含50mL液体LB种子培养基的三角瓶中，200rpm，37℃培养过夜，得到一级种子液。
3二级种子的培养：
将一级种子液按1％的接种量接到含50mL液体种子培养基的三角瓶中，200rpm，37℃培养6h，得到二级种子液。
液体LB培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0。
固体LB培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。
4发酵罐发酵：
发酵罐(5L的规格)装有液体聚唾液酸发酵培养基3L，将二级种子液100mL接种至发酵罐中培养；
本实施例中，液体聚唾液酸发酵培养基的成分包括如下：葡萄糖20g/L、玉米浆干粉3g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化铵6g/L、丙酮酸钠6g/L、B族维生素溶液1mL/L以及微量元素溶液1mL/L。
其中，B族维生素溶液含有：VB1 0.5g/L、VB5 3.2g/L、VBH 0.006g/L以及VB120.15g/L。
微量元素溶液含有：FeSO4的浓度为2g/L、KIO3的浓度为0.06g/L，MnCl2的浓度为0.8g/L、CoCl2的浓度为0.2g/L、CrCl3的浓度为0.08g/L、ZnSO4的浓度为0.09g/L、Na2MoO4的浓度为0.03g/L以及H3BO3的浓度为1.75g/L。
此外，在发酵过程第8h小时(接种时记为第0h)中在添加CTAB至液体聚唾液酸发酵培养基中，终浓度为200mg/L。
此外，本实施例中，液体聚唾液酸发酵培养基中还加入有1mL泡敌以抑制泡沫产生。
发酵条件：
控制初始通气量1vvm，初始转速200rpm；接种后根据调整转速及通气维持DO高于30％、发酵温度37℃；
发酵过程用10％的氢氧化钠维持pH6.4培养基中碳源耗完后，以2.5g/(L*h)的速率进行补充葡萄糖。
发酵培养72h放罐。培养期间，于不同时间点(发酵第12h、24h、36h、48h、60h、72h)，取发酵产物，检测其OD600和聚唾液酸含量，结果如图1所示。
聚唾液酸含量的检测方法如下：
发酵液离心去除菌体，清液稀释一定倍数，各取2mL稀释后清液及0.1M稀盐酸混合，密闭混匀于85℃水浴3h，反应结束后冷却，HPLC检测。
高效液相色谱(HPLC)检测法：岛津Lc-15c；检测柱Bio-Rad AMINEX HPX 87HOrganic Analysis Column(300×7.8mm)；柱温60℃；流动相5mmol硫酸，流速是0.6ml/min；检测波长210nm。
实施例2
本实施例提供的聚唾液酸的生产方法与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中，不添加CTAB。
培养期间，于不同时间点，取发酵产物，检测其OD600和聚唾液酸含量，结果如图2所示。
实施例3
本实施例提供的聚唾液酸的生产方法与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中，不添加B族维生素。
培养期间，于不同时间点，取发酵产物，检测其OD600和聚唾液酸含量，结果如图3所示。
实施例4
本实施例提供的聚唾液酸的生产方法与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中，不添加微量元素组合。
培养期间，于不同时间点，取发酵产物，检测其OD600和聚唾液酸含量，结果如图4所示。
对比例1
本对比例提供的聚唾液酸的生产方法与实施例1基本相同，不同的是，本对比例中，不添加B族维生素、微量元素组合和CTAB。
培养期间，于不同时间点，取发酵产物，检测其OD600和聚唾液酸含量，结果如图5所示。
从图1-图5的结果看出，发酵结束时，实施例1-4的聚唾液酸的含量分别是：15.32g/L、12.15g/L、11.24g/L以及9.52g/L，均高于对比例1的聚唾液酸的含量6.56g/L。由此说明，本发明提供的聚唾液酸的生产方法通过在基础培养基中添加B族维生素、微量元素组合和CTAB中的任意一种成分或多种成分的组合均可以实现提高聚唾液酸产量的效果，有利于降低发酵成本，扩展N-乙酰神经氨酸的应用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种聚唾液酸发酵培养基，其适用于接种产聚唾液酸细菌以发酵生产聚唾液酸，其特征在于，其包括基础培养基和添加剂；
所述添加剂包括以下成分：用于在发酵前添加至所述基础培养基中的B族维生素、用于在发酵前添加至所述基础培养基中的微量元素组合以及用于在发酵过程中添加至所述基础培养基中的CTAB；
所述B族维生素包括：VB1、VB5、VBH和VB12；
所述微量元素组合包括：FeSO4、KIO3、MnCl2、CoCl2、CrCl3、ZnSO4、Na2MoO4以及H3BO3；
添加所述添加剂后，在所述发酵培养基中，VB1的浓度为0.4-0.6 mg/L、VB5的浓度为3-3.4 mg/L、VBH的浓度为0.005-0.007 mg/L、VB12的浓度为0.13-0.17 mg/L；
添加所述添加剂后，在所述发酵培养基中，FeSO4的浓度为1-3mg/L、KIO3的浓度为0.04-0.08mg/L、MnCl2的浓度为0.7-0.9mg/L、CoCl2的浓度为0.1-0.3mg/L、CrCl3的浓度为0.07-0.09mg/L、ZnSO4的浓度为0.08-0.1 mg/L、Na2MoO4的浓度为0.02-0.04 mg/L以及H3BO3的浓度为1.5-2 mg/L；
添加所述CTAB后，在所述发酵培养基中，CTAB的浓度为180-220 mg/L；
所述产聚唾液酸细菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2018103。
2.根据权利要求1所述的聚唾液酸发酵培养基，其特征在于，所述基础培养基含有以下成分中的一种或多种的组合：葡萄糖、玉米浆干粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化铵以及丙酮酸钠。
3.一种聚唾液酸的生产方法，其特征在于，其包括：将产聚唾液酸细菌接种至权利要求1-2中任一项所述的聚唾液酸发酵培养基的基础培养基中进行发酵；所述产聚唾液酸细菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2018103；在发酵第8-30h往所述基础培养基中加入所述CTAB。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，发酵的条件包括：温度36-38℃、DO高于30%以及培养基的pH为6.2-6.6。
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