CN104561134B - 一种微生物发酵法生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物发酵法生产1,3‑丙二醇的方法,包括如下内容:菌种经种子活化、种子培养得到种子培养液,种子培养液在发酵培养基中,以甘油为发酵底物,进行厌氧或微氧发酵,发酵期间通过补料方式维持发酵底物浓度,发酵结束后,分离回收1,3‑丙二醇产品。该方法可以强化菌体消耗能量、产生还原力的菌体生成途径,有效的促进菌体生长,并增强菌体细胞膜的通透性,提高菌体对甘油的利用率,在1,3‑丙二醇的合成领域有着广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体地说涉及一种微生物发酵法生产1,3-丙二醇的方法。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PDO),分子式为HOCH2-CH2-CH2OH,是众多聚合物的基础原料,目前为国际上公认的石化新产品之一,可用于化妆品、液体清洁剂、防冻液、服装、室内装饰材料、工程聚合物等诸多领域。
1,3-丙二醇的合成方法分为两大类:化学法和微生物发酵法。其中化学法包括丙烯醛水合加氢法和环氧乙烷羰基化法,丙烯醛水合加氢法的产品成本略高,而环氧乙烷羰基化法的设备投资大、技术难度高,微生物发酵法因其具有条件温和、原料价廉易得、成本低等特点,是一种具有广阔发展前景的1,3-丙二醇生产路线。
微生物发酵法是指以甘油或葡萄糖为底物进行发酵生产1,3-丙二醇的生产工艺。从自然界中筛选出来的能以甘油为碳源、利用自身代谢途径生产1,3-丙二醇的野生型菌株主要集中在肠杆菌科、梭菌属和乳杆菌属,目前研究较多的三种菌为克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬菌(Citrobacter freundii)以及丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)。
甘油在微生物体内有三条代谢途径。其中之一为消耗能量、产生还原力的菌体生成途径;另外两个途径为氧化途径和还原途径。
氧化途径主要步骤为:(1)甘油在甘油脱氢酶(GDH)催化下,生成二羟丙酮(DHA),同时生成还原性辅酶Ⅰ(NADH2)。(2)二羟丙酮(DHA)在二羟丙酮激酶(DhaK)作用下,生成磷酸二羟丙酮(DHAP)。此步反应需要消耗能量三磷酸腺苷(ATP)。(3)磷酸二羟丙酮(DHAP)进入糖酵解途径生成丙酮酸。然后,丙酮酸代谢生成乙酰辅酶A,进入三羧酸循环再生成其他小分子物质。
还原途径主要步骤为:(1)甘油在甘油脱水酶(GDHt)作用下生成3-羟基丙醛(3-HPA),此甘油脱水酶(GDHt)需要以维生素B12为辅酶。(2)3-羟基丙醛(3-HPA)在1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)作用下生成1,3-丙二醇。此过程需要消耗还原性辅酶Ⅰ(NADH2)。
1,3-丙二醇生产菌株代谢甘油后,发酵液中除1,3-丙二醇外,还会有其他代谢副产物,如乙酸、乙醇、2,3-丁二醇、乳酸等,这些副产物不但会对发酵菌体的生长代谢产生影响,还会在后期的产物分离纯化过程中带来诸多问题。因此,减少发酵体系过程中副产物的含量,将有助于提高微生物发酵法生产1,3-丙二醇的产率。
CN1696298A公开了一种外源添加反丁烯二酸促进微生物合成1,3-丙二醇的方法,该方法通过在发酵培养基中添加反丁烯二酸作为外源电子受体,来加速菌体对甘油的利用,但通过其实施例可以看到该方法发酵液中的副产物含量也明显增多。CN1446919A公开了外源添加还原剂促进菌体合成1,3-丙二醇的方法,其通过在发酵培养基或在厌氧发酵过程中添加适量的还原剂,增强菌体中还原当量的积累,促进底物甘油沿还原途径代谢来提高1,3-丙二醇的合成浓度和转化率,但大量外源还原剂的加入无助于菌体生物量的增加,并且会促进副反应进而导致大量副产物的生成。CN101230362A公开了一种改变细胞膜通透性有效生产1,3-丙二醇的方法,该方法通过添加非离子表面活性剂改变细胞膜通透性,减少氧及营养物质进入细胞的传递阻力,并促使代谢产物分泌至胞外,降低代谢产物在细胞内的积累,提高发酵终产物1,3-丙二醇的浓度,但是非离子表面活性剂对菌体具有一定的毒害作用。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种微生物发酵法生产1,3-丙二醇的方法,该方法可以强化菌体消耗能量、产生还原力的菌体生成途径,有效的促进菌体生长,并增强菌体细胞膜的通透性,提高菌体对甘油的利用率。
本发明的微生物发酵法生产1,3-丙二醇的方法,包括如下内容:菌种经种子活化、种子培养得到种子培养液,种子培养液在发酵培养基中,以甘油为发酵底物,进行厌氧或微氧发酵,发酵期间通过补料方式维持发酵底物浓度,发酵结束后,分离回收1,3-丙二醇产品;其中在配制发酵培养基过程和/或发酵过程中加入钙类助剂;优选在配制发酵培养基过程和发酵过程分别加入一定质量的钙类助剂;所述的钙类助剂,选自果糖酸钙、半乳糖酸钙、葡萄糖酸钙、蔗糖酸钙或乳糖酸钙中的一种或几种。
本发明方法中,发酵体系中钙类助剂的浓度为1~100g/L。
本发明方法中,所述菌种为克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬菌(Citrobacter freundii)或丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)。
本发明方法中,菌种活化、菌种培养和发酵过程均为本领域技术人员熟知的,其中将每一阶段的培养液按照规定的接种量逐级接种至下一阶段。
本发明方法中,菌种活化、菌种培养和发酵过程各阶段的培养温度均为30~40℃,搅拌转速为200~500rpm;其中菌种活化阶段培养时间为8~12小时,种子培养时间为8~12小时。
本发明方法中,所述的厌氧发酵条件为:氮气通入量为2~4vvm,微氧发酵条件为:空气通入量为0.25~0.5vvm,优选微氧发酵;发酵体系的pH控制在6~8之间,发酵培养时间36~72h。
本发明方法中,通过补料方式维持发酵液中的甘油浓度在10~80g/L,优选为分批补料发酵方式。
本发明方法中,发酵过程中优选使用流加甘油作为补料方式,其中所述的流加甘油是体积浓度为70%~90%的甘油水溶液。
本发明方法中,钙类助剂优选在发酵过程中与流加甘油混合引入。
本发明方法中,所述的种子活化培养基(LB培养基)各组分含量如下:蛋白胨 7~15g/L,酵母膏 3~10g/L,NaCl 7~15g/L。
本发明方法中,所述的种子培养基各组分含量如下:酵母膏 7~15g/L,麦芽糖 1~5g/L,蛋白胨 3~10g/L,NaCl 3~10g/L。
本发明方法中,所述的发酵培养基各组分含量如下:酵母膏 3~10g/L,K2HPO4·3H2O 3~10g/L,KH2PO4 1~5g/L,NH4Cl 1~5g/L,NaCl 0.1~2g/L,MgSO4·7H2O 0.1~2g/L,FeCl3·6H2O 5~100mg/L,CoCl2·6H2O 5~100mg/L,维生素B12 5~100mg/L,甘油 10~80g/L。
本发明方法中,种子培养基和发酵培养基体积比为1:10~1:50。
本发明方法中,发酵培养基中含有C、P、K、Na、Mg等微生物生长所必需的营养物质,也可根据需要补充微生物营养物质。
本发明的有益效果在于:
1、本发明方法中钙类助剂的引入,能够强化菌体消耗能量、产生还原力的菌体生成途径,有效的促进菌体生长,使生物催化活性单位大量增加,同时产生的还原当量还可为菌体甘油代谢的还原途径提供必需的还原力。
2、钙类助剂中所含的钙离子还可作用于菌体细胞膜,通过增强菌体细胞膜的通透性,来降低菌体对甘油和1,3-丙二醇的选择性透过作用,以此来增强菌体对甘油的利用率,使菌种保持在较高的发酵水平。
3、本发明不增加额外设备,仅需少量附加投入即可达到进一步缩短发酵周期、提高菌体对甘油的利用率、提高1,3-丙二醇生产强度的多效果耦合作用。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明的方案和效果,其中实施例及比较例均采用批式流加发酵方式。
实施例1
(1)菌种:克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)由抚顺石油化工研究院筛选,保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),编号为0798。
(2)培养基
种子活化培养基(LB培养基):蛋白胨 10.0g/L,酵母膏 5.0g/L,NaCl 10.0g/L,pH7.0。
种子培养基:酵母膏 5.0g/L,麦芽糖 3.0g/L,蛋白胨 5.0g/L,NaCl 5.0g/L,pH7.0。
发酵培养基:酵母膏 5.0g/L,K2HPO4﹒3H2O 10.0g/L,KH2PO4 2.0g/L,NH4Cl 1.0g/L,NaCl 0.5g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeCl3·6H2O 30mg/L,CoCl2﹒6H2O 5mg/L,维生素B125mg/L,甘油 50g/L,pH为7.0。
流加甘油:质量百分比为90%的甘油水溶液。
(3)发酵过程
步骤1:菌种活化
由保藏菌种的甘油管中挑取一环接入LB培养基活化12h后,再挑取一环菌苔接入固体LB平板,37℃培养12h后置4℃冰箱保藏。
步骤2:种子培养
种子培养在250mL三角瓶中进行,装液量为125mL,从步骤1的LB固体平板上挑取一单菌落于预先灭菌的装有125mL种子培养基的250mL三角瓶中,37℃,140rpm,培养10h,使菌体浓度OD600达到2~4左右。
步骤3:在15L发酵罐中微氧发酵合成1,3-丙二醇
向培养基中加入葡萄糖酸钙(葡萄糖酸钙在培养基中的浓度为5g/L),并将葡萄糖酸钙按照与甘油质量比1:10的比例添加到流加甘油中,灭菌后将种子液接入15L发酵罐,装液量7L,微氧发酵(0.25vvm空气),37℃,300rpm,培养时间48h,自12h起以30g/h的速率流加甘油溶液。每隔4h取一次样,取样体积4mL,测定的项目有菌体浓度、底物甘油浓度、1,3-丙二醇的合成浓度及其他主要副产物的浓度。
(4)发酵结果见表1。
实施例2
单独配制质量百分比20%的果糖酸钙水混悬液,在发酵第12h起以1.5g/h的速率向培养基中流加果糖酸钙水混悬液,发酵培养基及流加甘油中均不添加钙类助剂,其他条件同实施例1。
实验结果见表1。
实施例3
将葡萄糖酸钙按照与甘油质量比为1:100的比例添加到流加甘油中,发酵培养基中不添加钙类助剂,其他条件同实施例1。
实验结果见表1。
实施例4
将葡萄糖酸钙和果糖酸钙按照1:1的质量比混合,混合后按照与甘油质量比1:1配制培养基,发酵过程中不添加钙类助剂,其他条件同实施例1。
实验结果见表1。
比较例1
在培养基和发酵过程中均不添加钙类助剂,发酵过程中用使用40%的NaOH溶液对发酵体系的pH进行调控,其他条件同实施例1。
实验结果见表1。
表1 使用不同钙类助剂的发酵结果。
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 比较例1 | |
1,3-丙二醇浓度,g/L | 95.620 | 84.536 | 88.849 | 90.589 | 69.545 |
转化率,mol/mol | 0.628 | 0.555 | 0.583 | 0.595 | 0.457 |
产率,g/h·L | 1.992 | 1.761 | 1.851 | 1.887 | 1.449 |
菌体浓度,OD<sub>650</sub> | 6.0 | 5.3 | 5.5 | 5.7 | 4.3 |
表1中的结果表明,在添加钙类助剂后,发酵液中的1,3-丙二醇浓度相对于比较例提高了21.56%~37.49%,菌体浓度提高了23.26%~39.53%,相应的摩尔转化率及产率也有较大的提高。
Claims (5)
1.一种微生物发酵法生产1,3-丙二醇的方法,其特征在于包括如下内容:采用克雷伯氏肺炎杆菌、弗氏柠檬菌或丁酸梭状芽孢杆菌中的一种作为菌种,经种子活化、种子培养得到种子培养液,菌种活化的培养温度为30~40℃,搅拌转速为200~500rpm,培养时间为8~12小时;菌种培养的培养温度为30~40℃,搅拌转速为200~500rpm,培养时间为8~12小时;种子培养液在发酵培养基中,以甘油为发酵底物,进行厌氧或微氧发酵,发酵培养的培养温度为30~40℃,搅拌转速为200~500rpm,发酵培养时间36~72h;所述的厌氧发酵条件为:氮气通入量为2~4vvm;微氧发酵条件为:空气通入量为0.25~0.5vvm;发酵期间通过补料方式维持发酵底物浓度,发酵结束后,分离回收1,3-丙二醇产品;其中在配制发酵培养基过程和/或发酵过程中加入钙类助剂;所述的钙类助剂,选自果糖酸钙和/或葡萄糖酸钙,发酵体系中钙类助剂的浓度为1~100g/L;
其中,种子活化培养基各组分含量如下:蛋白胨 7~15g/L,酵母膏 3~10g/L,NaCl 7~15g/L;
种子培养基各组分含量如下:酵母膏 7~15g/L,麦芽糖 1~5g/L,蛋白胨 3~10g/L,NaCl 3~10g/L;
发酵培养基各组分含量如下:酵母膏 3~10g/L,K2HPO4·3H2O 3~10g/L,KH2PO4 1~5g/L,NH4Cl 1~5g/L,NaCl 0.1~2g/L,MgSO4·7H2O 0.1~2g/L,FeCl3·6H2O 5~100mg/L,CoCl2·6H2O 5~100mg/L,维生素B12 5~100mg/L,甘油 10~80g/L。
2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:在配制发酵培养基过程和发酵过程分别加入钙类助剂。
3.按照权利要求1或2所述的方法,其特征在于:通过补料方式维持发酵液中的甘油浓度在10~80g/L。
4.按照权利要求1或2所述的方法,其特征在于:发酵过程中使用流加甘油作为补料方式,其中流加甘油是体积浓度为70%~90%的甘油水溶液。
5.按照权利要求1或2所述的方法,其特征在于:钙类助剂在发酵过程中与流加甘油混合引入。
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