CN101307335A

CN101307335A - 微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法

Info

Publication number: CN101307335A
Application number: CNA2007100114144A
Authority: CN
Inventors: 金平; 王领民; 王崇辉; 佟明友; 黎元生
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2007-05-18
Filing date: 2007-05-18
Publication date: 2008-11-19
Anticipated expiration: 2027-05-18
Also published as: CN101307335B

Abstract

本发明提供了一种甘油厌氧发酵生产1，3－丙二醇的改进方法。通过在发酵过程中加入碱性钙盐实现pH值在线调控，改善了甘油在还原与氧化两个支路之间的代谢，从而有利于菌体的生长和产物的生产。本发明的方法不仅能够提高发酵液中1，3－丙二醇的浓度，还能提高甘油的摩尔转化率。而本发明提供的超滤和纳滤脱盐方法，操作简单，产品损失率低，效果理想。

Description

微生物发酵生产1，3-丙二醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种利用单一微生物将可发酵的甘油碳源生物转化为1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇(1，3-propanediol，简称1，3-PDO)是重要的化工和医药中间体原料，是一种在生产聚酯纤维中和在制造聚亚胺酯及环状化合物中具有潜在应用价值的单体。

目前工业上主要采取化学合成法来进行1，3-丙二醇的生产。已经知道有很多种化学途径能够生产1，3-丙二醇，但化学法副产物多，产品分离提纯较困难，生产成本相应较高。相比之下，生物转化法生产1，3-丙二醇以其利用再生资源、对环境污染小等特点越来越受到重视。

目前生产1，3-丙二醇的微生物法大致可分为三类：一是用肠道细菌将甘油歧化为1，3-丙二醇(USP5254467和EP0373230A1)；二是以葡萄糖为底物用基因工程菌生产1，3-丙二醇(PCT/US 96/-6705、USP5599689、WO 96/35796、WO9821340及WO 9821339)；三是将生产甘油和1，3-丙二醇的两株菌混合培养(USP5599689)。这些方法各有优缺点：第一种方法的转化率和产物浓度均较高，但是甘油价格偏高，影响1，3-丙二醇的生产成本；第二种方法可以降低原料成本，但基因工程菌的生产能力及其稳定性还不太理想；第三种方法有助于减少两步发酵的时间，但由于两种菌的生长条件不尽相同，如产甘油菌通常在好氧条件下生长，而产1，3-丙二醇菌通常在厌氧条件下生长，因此很难取得较为理想的效果。

就目前情况来看，甘油转化1，3-丙二醇的技术最为成熟，效果也最好。比较理想的方法是利用甘油做底物，以克雷伯氏菌(Klebsieblla penumoniae)、非氏柠檬酸菌(Citrobacter freandii)或丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)等厌氧或兼性厌氧菌为发酵菌种(这些菌种已经解决了底物和产物高浓度耐受能力差的问题)。发酵菌种利用甘油进行厌氧或兼性厌氧代谢生产1，3-丙二醇都是通过氧化和还原两个支路进行的，两个支路间通过生物体的能荷(由ATP提供)与氢荷(由NADH₂提供)维持代谢通量分布。

其氧化途径的主要步骤为：(1)甘油经甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase，GDH)催化生成2-羟基丙酮(DHA)，该酶为厌氧酶，以NAD⁺为辅酶，受到体系的氢荷水平的影响；(2)DHA在ATP及2-羟基丙酮激酶(Dihydroxyacetonekinase)的作用下，生成磷酸二羟丙酮(DHAP)；(3)DHAP进一步代谢生产丙酮酸。丙酮酸是代谢过程中很重要的中间产物，它进一步代谢为各种小分子产物，如乙酸、乳酸、乙醇、甲醇等，同时产生菌体生长和生产所必需的NADH₂和ATP，这些小分子副产物再进行厌氧发酵。

随着发酵的进行，有机酸等副产物的累积极大地影响了菌体生长与生产的能力。尤其是乙酸和乳酸等有机酸副产物，不仅使得发酵液pH值降低，而且它们在体系的存在严重抑制了氧化途径的代谢过程，不利于甘油歧化过程两个支路之间的平衡与协调。一般解决办法是及时分离产出有机酸或将其转化为有机酸盐的形式加以转化回收。由于PDO发酵生产中在线除去有机酸存在较大难度，因此发酵过程中采取加入氢氧化钾或氢氧化钠中和发酵副产物以促使发酵进行的方法，而在发酵结束后，通常采用电渗析法分离有机酸盐完成发酵液的脱盐。在CN1763210A中通过加入3-5M的氢氧化钠溶液来中和发酵过程生成的有机酸，发酵液通过常规方法脱盐。徐友海等在《不同甘油原料发酵生产1，3-丙二醇的研究中》(精细与专用化学品Vol 14No.5P14-17)中用5M的氢氧化钠溶液调控pH值。《膜科学与技术》Vol 25 No.4P21-29通过加入氢氧化钾实现对发酵体系的pH值控制，并通过电渗析进行脱盐。

上述各种方法虽然都能实现对发酵过程pH值的控制，但不能很好地提高发酵效率。各种文献资料表明，利用碱性钙盐对发酵过程中体系的PH进行控制，进行有效代谢还未有报道。

发明内容

针对单一菌体利用甘油厌氧发酵转化率低的问题，本发明提供一种甘油发酵合成1，3-丙二醇的改进方法，不仅可以有效地控制发酵过程的pH值，而且可以高效降低体系的乙酸和乳酸副产物的累积，加强氧化代谢支路中丙酮酸以后的代谢过程，使丙酮酸的后续代谢流主要向着TCA循环进行，从而在提供给甘油还原支路中形成1，3-丙二醇时所需NADH的同时，削弱菌体在厌氧情况下乙酸和乳酸副产物代谢支路的抑制作用，改善菌体代谢过程，增加菌体生长与生产的相互耦合性，提高发酵效率。

本发明的方法包括：制备用于培养克雷伯氏杆菌的发酵培养基，并往上述培养基中接入克雷伯氏杆菌种子培养液，进行厌氧发酵以合成1，3-丙二醇，发酵结束后，发酵液经脱盐、浓缩和精馏，将1，3-丙二醇分离、提纯，制备产品。本发明在厌氧发酵过程中加入碱性钙盐对体系进行在线pH值控制。所述的碱性钙盐选自氧化钙、氢氧化钙、碳酸氢钙或碳酸钙构成的一组物质中的一种或几种。

本发明方法利用碱性钙盐对发酵体系进行pH值在线控制，实现了1，3-丙二醇发酵过程中底物与产物间理想的通量分布，进而实现高效的1，3-丙二醇发酵。这种方法的益处在于大大简化了微生物发酵生产1，3-丙二醇的工艺过程，突破了甘油生物法生产1，3-丙二醇甘油转化率低的瓶颈，提高了底物转化率，缩短了发酵时间，从而降低了生产成本，为微生物利用甘油发酵法生产1，3-丙二醇的工业化奠定了基础。

具体实施方式：

本发明提供的技术方案的具体实施方式可按如下步骤进行：

(1)培养基制备：基本培养基中必须含有菌体生长所需的营养成分，碳源为甘油，氮源为酵母膏或铵盐，另外还含有钠、钾、铵、镁、钙等阳离子和磷酸根、硫酸根、氯离子等阴离子，以及锌、铁、镍、铜、钴、硼和钼等微量元素。培养基在121℃、0.1MPa下灭菌20分钟使用。

(2)种子培养：在摇瓶中进行，温度为32℃～42℃，转速为100～200转/分钟，培养时间为15～30小时，氮气通入量为0.1～1升/分钟。

(3)发酵培养：在发酵罐中进行，接种量10v％～15v％，转速为100～300转/分钟，温度控制在32℃～42℃，pH控制在5.0～9.0之间。发酵罐保持厌氧条件，氮气通入量为1vvm～6vvm，在发酵过程中通过加入碱性钙盐来对发酵体系进行在线pH值控制。所述的碱性钙盐选自氧化钙、氢氧化钙、碳酸氢钙和碳酸钙构成的一组物质中的一种或几种。通常为了方便调控的目的，碱性钙盐以水溶液的形式加入，碱性钙盐溶液的浓度一般为10g/L～100g/L。

发酵方式可以是间歇发酵或批式流加发酵。不同发酵方式下甘油的初始浓度为20g/L～80g/L，发酵过程中控制甘油浓度在10g/L～60g/L。间歇或批式流加的发酵时间48h～72h，发酵液中1，3-丙二醇的最终浓度可达到20g/L～73g/L，底物的摩尔转化率可达到50％～60％。

(4)发酵结束后，发酵液通过脱盐、蒸馏和真空精馏等步骤将1，3-丙二醇分离、提纯，制备产品。

步骤(4)所述的发酵液可以采用常规的方法进行脱盐，如采用溶剂萃取法。本发明提供了一种更为有效的脱盐方法：采取超滤和纳滤操作进行处理，即分别使用1万～5万截留分子量的超滤膜和100～500截留分子量的纳滤膜，对发酵液进行过滤处理，经脱盐后的处理液电导率低于2000μs/cm，满足后续提取操作的要求。

与常规的脱盐方法相比较，本发明提供的超滤和纳滤脱盐法，将除菌过滤、除蛋白和脱盐操作合并为一步进行，既简化了操作，降低了操作成本，还能更有效地脱除发酵液中的盐分，提高产品回收率，减少产品损失。

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步的阐述。本发明比较例和实施例中均采用批式流加发酵方式。

实施例1

(1)本发明实施例中所用的菌种为克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，菌种在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)保藏，菌种保藏号：0798。

(2)培养基分种子培养基和发酵培养基两种：

种子培养基：(1L)

K₂HPO₄：34g KH₂PO₄：13g

(NH₄)₂SO₄：6g MgSO₄·7H₂O：0.2g

CaCl₂·H₂O：0.02g CaCO₃：2.0g

Yeast extract：1.0g Glycerol：60g

Fe²⁺solution：2.0mL Trace element solution I：1.0mL

其中Fe²⁺solution(1L)：FeSO₄5g/L HCl(37％)4.0mL

Trace element solution I(1L)组成

MgSO₄·4H₂O：100mg ZnCl₂：70mg

Na₂MoO₄·2H₂O：35mg H₂BO₃：60mg

CoCl₂·6H₂O：200mg CuSO₄·5H₂O：29.28mg

NiCl2·6H₂O：25mg 37％HCl：0.9mL

发酵培养基组成(1L)

NH₄Cl：5.35g KCl：0.75g

NaH₂PO₄·H₂O：1.38g Na₂SO₄：0.28g

MgCl₂·6H₂O：0.26g CaCl₂·H₂O：0.0029g

柠檬酸：0.2g 酵母膏：1.0g

泡敌(稀)：0.1mL 甘油：40.0g

Trace element solution II：5mL

其中Trace element solution II(1L)组成：

FeCl₃·6H₂O：5.0mg Na₂MoO₄·2H₂O：0.005mg

ZnCl₂·6H₂O：0.68mg MnCl₂·4H₂O：0.17mg

H₃BO₃：0.06mg CoCl₂·6H₂O：0.47mg

CuCl₂·2H₂O：0.17mg 37％HCl：1.0mL

种子与发酵培养基在灭菌前均要把pH调节为7.0。

(3)发酵过程分种子培养和发酵培养两步。

种子培养在500mL的带有挡板的三角摇瓶中进行，装液量为200mL，瓶口用橡皮塞密封，并在瓶塞上带有两个进出气口，进气口由导管通入底部，通入氮气流量为0.1～1升/分钟，摇床转速为150转/分钟，培养温度为37℃，培养时间为20小时。

发酵培养在全自动发酵罐中进行，发酵体积为6L，温度和转速恒定在37℃和150转/分钟，氮气通气量为3vvm，用50g/L的氧化钙溶液调节pH值，在线控制pH值为7.0，起始甘油浓度为20g/L，完全厌氧发酵过程中甘油浓度维持在～40g/L。发酵时间40～60小时。

(4)具体的发酵实验结果如下：发酵时间为40小时，1，3-丙二醇的浓度为72.4g/L，甘油摩尔转化率为55.7％。

实施例2-12

分别为利用不同碱性钙盐在不同浓度下实施体系pH值在线控制所进行的发酵实验。

比较例1

其它条件同实施例1，发酵过程中用5mol/L的氢氧化钠溶液实施体系pH值在线控制。

比较例1和实施例1-12所得的实验结果列于表1。由表1可见，在发酵过程中利用碱性钙盐对发酵系统实施在线pH控制，与利用氢氧化钠调控系统pH值的对照实验结果相比，不仅能提高最终发酵液中1，3-丙二醇浓度，还能使甘油的摩尔转化率提高2.4到7.8个百分点。

比较例2

其它条件同实施例1，发酵过程中利用碱性钙盐对发酵系统实施在线pH控制，只是发酵结束后产品处理过程要经过除菌过滤、除蛋白、溶剂萃取除盐等步骤，其中除菌过滤利用絮凝剂让菌体絮凝然后通过滤纸过滤除菌，使用酸化煮沸过滤的方法对蛋白进行去除，在对过滤液浓缩之后添加乙醇进行萃取除盐。除盐后得到的处理液电导率情况如表2。

实施例13-15

分别为利用碱性钙盐调控发酵体系pH值情况下，发酵液直接进行超滤纳滤除盐，超滤使用截留分子量为3万的有机膜，纳滤使用截留分子量300的卷桶式膜，即可同时实现除菌除蛋白和脱盐的效果，得到的处理液电导率情况见表2。

由表2结果可以看出，使用碱性钙盐调节发酵过程体系的pH值，对得到的发酵液进行处理时，其中关键的除盐步骤采用传统的方法分离时效果不尽人意，而使用本发明提供的超滤和纳滤过程效果理想，并大大简化了操作步骤。得出的结论：常规方法步骤繁琐，除盐效果不够理想，而本发明推荐的超滤、纳滤法操作简单，产品损失率低、效果理想。

通过上述实验证明，本发明提出利用一定浓度碱性钙盐在线控制体系pH值来促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，在保证菌体高产的同时，大幅提高了菌体生产产物的效率，降低了生产成本。

表1 利用碱性钙盐对发酵体系实施在线pH控制实验结果

	比较例1	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
	比较例1	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	pH调控策略	5mol/L氢氧化钠	50g/L氧化钙	10g/L氧化钙	100g/L氧化钙	50g/L氢氧化钙	10g/L氢氧化钙	100g/L氢氧化钙
1，3-丙二醇浓度，g/L	60.2	72.4	67.1	68.4	68.2	64.6	67.7	pH调控策略	5mol/L氢氧化钠	50g/L氧化钙	10g/L氧化钙	100g/L氧化钙	50g/L氢氧化钙	10g/L氢氧化钙	100g/L氢氧化钙
1，3-丙二醇浓度，g/L	60.2	72.4	67.1	68.4	68.2	64.6	67.7	甘油转化率，mol％	47.9	55.7	50.3	51.2	52.5	52.3	51.9

表1-续利用碱性钙盐对发酵体系实施在线pH控制实验结果

	实施例7	实施例8	实施例9	实施例10	实施例11	实施例12
	实施例7	实施例8	实施例9	实施例10	实施例11	实施例12	pH调控策略	50g/L碳酸氢钙	10g/L碳酸氢钙	100g/L碳酸氢钙	50g/L碳酸钙	10g/L碳酸钙	100g/L碳酸钙
1，3-丙二醇浓度，g/L	70.2	64.5	65.1	69.4	68.2	68.6	pH调控策略	50g/L碳酸氢钙	10g/L碳酸氢钙	100g/L碳酸氢钙	50g/L碳酸钙	10g/L碳酸钙	100g/L碳酸钙
1，3-丙二醇浓度，g/L	70.2	64.5	65.1	69.4	68.2	68.6	甘油转化率，mol％	54.9	52.1	52.3	52.2	50.5	51.3

表2 发酵液脱盐结果

	比较例2	实施例13	实施例14	实施例15
	比较例2	实施例13	实施例14	实施例15	pH调控策略	50g/L氧化钙	50g/L碳酸氢钙	50g/L碳酸氢钙	50g/L碳酸钙
处理液电导率μs/cm	3200	1800	1920	1910	pH调控策略	50g/L氧化钙	50g/L碳酸氢钙	50g/L碳酸氢钙	50g/L碳酸钙
处理液电导率μs/cm	3200	1800	1920	1910	产品损失率	3.0％	0.5％	0.6％	0.4％

Claims

1、一种微生物发酵生产1，3-丙二醇的方法，包括：制备用于培养克雷伯氏杆菌的发酵培养基，往上述培养基中接入克雷伯氏杆菌种子培养液，以甘油为底物进行厌氧发酵以合成1，3-丙二醇，发酵液经脱盐、蒸馏和真空精馏，制得1，3-丙二醇产品，其特征在于，在发酵过程中加入碱性钙盐对体系进行在线pH值控制。

2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱性钙盐选自氧化钙、氢氧化钙、碳酸氢钙和碳酸钙中的一种或几种。

3、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱性钙盐以水溶液的形式加入，溶液的浓度为10～100g/L。

4、按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的发酵采取间歇式或批式流加发酵方式。

5、按照权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的脱盐是通过对发酵液进行超滤和纳滤处理实现的。

6、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的超滤使用1万～5万截留分子量的超滤膜进行，所述的纳滤使用100～500截留分子量的纳滤膜进行。