CN105237352A - 分离发酵液成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从发酵液分离1,4-丁二醇(1,4-BDO)的方法，其包括：从包含细胞的固体部分分离富含1,4-BDO的液体部分，从所述的液体部分除去水，从所述的液体部分除去盐，和纯化1,4-BDO。生产1,4-BDO的方法包括将产生1,4-BDO的微生物在发酵罐中培养足够时间以生产1,4-BDO。产生1,4-BDO的微生物包括具有1,4-BDO途径的微生物，该1,4-BDO途径具有一个或多个编码1,4-BDO途径酶的外源基因和/或一个或多个基因破坏。生产1,4-BDO的方法进一步包括分离1,4-BDO。

Description

分离发酵液成分的方法
本申请是申请日为2010年06月03日、申请号为201080034314.3、名称为“分离发酵液成分的方法”的发明申请的分案。
本申请要求享有2009年6月4日提交的美国临时申请第61/184,292号的优先权，其全部内容以引用方式并入本发明。
发明背景
本发明主要涉及发酵液成分的分离以及，更具体地涉及具有高于水的沸点的与水可混溶化合物与其它发酵液成分的分离。
从环境和减少成本的角度考虑，存在设计能够分离且可选地再循环发酵成分的工艺方案的动机，所述的发酵成分包括细胞团块、残余培养基和培养基盐、残余基质(例如蔗糖和/或葡萄糖)、以及水。人们也试图为了循环细胞团块以改善发酵的生产率作出努力。在回收残余培养基和培养基盐以重新用于发酵的领域上就作比较少的努力。就此而言，大多数努力都着重于减少初始培养基的成本而非下游回收。所得“低成本”培养基对于细胞生长和产品生产而言通常并非最佳。通过开发有效回收培养基成分的方法，更优化的培养基配方可在初始原料成本的较少限制下使用。
大规模且有用纯度的化合物分离是工艺化学中复杂的难题。仅在规模上的差异即导致在实验台规模中开发的分离工艺变得不切实际或甚至在中试或商业规模中变得不可行。从复杂混合物中分离化合物取决于很多因素，包括：化合物在室温下是固体还是液体、化合物的沸点、密度、极性、存不存在pH敏感官能团、相对于水在有机溶剂中的溶解度。这些因素也适用于混合物中的所有其它成分，目标化合物将从中被分离。影响化合物(尤其是有机化合物)的分离的另一性质是其如何在两种不混溶相之间分配，例如在水与有机溶剂之间。强极性化合物在水中的溶解度通常高于在萃取过程中使用的常用有机溶剂。一些化合物由于具有两亲性特性而尤其难以通过萃取方法从水中分离。两亲分子是同时具有极性部分和亲脂性部分的化合物。这些化合物可因产生难以处理的乳液而使通过萃取來分离变得复杂。
另外，当一种化合物从发酵制备时，水量可明显地高于目标化合物的量，从而需要从复杂的混合物中分离次要成分。分离与水相比在更高温度沸腾的化合物进一步增加了分离的复杂性和成本，因为该化合物不能从发酵液直接蒸馏，例如乙醇发酵工艺中的情形。在这点上，目标化合物与水的相互作用可导致两种物质在不同于两种纯的成分的沸点下以共沸物形式进行共蒸馏。共沸物的形成不易预测。试图从水中分离目标化合物时可能会减少目标化合物的回收率。当化合物具有极性官能团时，另一关注的问题是其如何与在水相中存在的其它化合物(例如，包括任何盐和金属离子)相互作用。
存在于目标化合物中的官能团的性质可能使盐的分离变复杂。例如，化合物的一个或多个官能团可能与阳离子或阴离子相互作用或螯合。阳离子或阴离子的螯合作用是以尺寸依赖性的方式发生，并且也取决于官能团在目标化合物上的位置。螯合作用及其它相互作用可使得一些盐即使在不存在水的情况下也可溶于液体化合物中，而其它盐可在不存在水的情况下不可溶，尽管存在具有能够与盐相互作用的官能团的化合物。这些作用对盐的溶解度是难以预测的。进一步增加化合物与盐相互作用的复杂性是任何共溶剂的性质。例如，在分离水可混溶性目标化合物期间，与水之间的氢键和其它相互作用可破坏盐与目标化合物的相互作用。因此，在一些情况下，在一定量水存在下，盐能更易于与化合物分离。然而，能够平衡盐过饱和从而使盐通过结晶分离的水量(例如，在维持水破坏目标化合物与任何盐的螯合作用和其它相互作用的能力时)是难以预测的。
开发分离方法中的又一难题是生物合成副产物(例如有机酸、过量基质等等)的潜在反应活性。在加热条件下，过量基质可能会降解并导致产物具有不期望的颜色。此外，一些副产物可与目标产物发生反应，令到分离产率显著降低。这些副产物可包括那些在发酵期间形成的副产物以及在其分离工艺本身的步骤中所形成的副产物，例如在蒸馏、水份蒸发等等期间升温时由于降解过程而形成的副产物。
因此，需要开发可从微生物发酵液分离沸点高于水的水可混溶性化合物的方法，同时考虑循环其他发酵成分的环境和成本效益。本发明可满足这需要也提供相关的优点。
发明内容
在某些方面，本发明所公开的实施方式涉及从发酵液分离1,4-丁二醇(1,4-BDO)的方法，其包括：从包含细胞的固体部分分离富含1,4-BDO的液体部分，从所述的液体部分去除水，从所述的液体部分去除盐，和纯化1,4-BDO。
在其它方面，本发明所公开的实施方式涉及从发酵液分离1,4-BDO的方法，其包括：通过圆盘堆叠式离心去除一部分固体以取得液体部分，通过超滤从液体部分去除另一部分固体，通过蒸发结晶从液体部分去除一部分盐，通过离子交换从液体部分去除另一部分盐，和蒸馏1,4-BDO。
在其它方面，本发明所公开的实施方式涉及从发酵液分离1,4-BDO的方法，其包括：通过圆盘堆叠式离心除去一部分固体以取得液体部分，通过超滤从液体部分去除另一部分固体，通过纳滤从液体部分去除一部分盐，通过离子交换从液体部分去除另一部分盐，蒸发一部分水，和蒸馏1,4-BDO。
在其它方面，本发明所公开的实施方式涉及生产1,4-BDO的方法，其包括将产生1,4-BDO的微生物在发酵罐中培养足够时间以生产1,4-BDO。产生1,4-BDO的微生物包括具有1,4-BDO途径的微生物，该1,4-BDO途径具有一个或多个编码1,4-BDO途径酶的外源基因和/或一个或多个基因破坏。所述的方法进一步包括根据所述的分离方法分离1,4-BDO。
附图说明
图1显示从发酵液中纯化1,4-BDO的方法的步骤的方框图。
图2显示圆盘堆叠式离心机的剖视图。
图3显示沉降式离心机的剖视图。
图4显示强制循环结晶器的示意图。
图5显示在有效体积中具有水平热交换器和挡板的强制循环结晶器的示意图。
图6显示导流管和挡板结晶器的示意图。
图7显示诱导循环结晶器的示意图。
图8显示密闭型奥斯陆结晶器的示意图。
图9显示开放型奥斯陆结晶器的示意图。
图10显示降膜蒸发器的部分剖视图。
图11显示强制循环蒸发器的部分剖视图。
图12显示板式蒸发器的部分剖视图。
图13显示循环蒸发器的示意图。
图14显示流化床蒸发器的示意图。
图15显示用于生产和分离1,4-BDO的完整流程的示意图。
图16显示用于生产和分离1,4-BDO的另一种完整流程的示意图。
发明详述
经发酵生产商用化学品是替代使用不可再生矿物燃料为原料的传统生产的有效方式。由于能够使用可再生原料(例如循环的生物质等等)，与基于矿物燃料的生产相比该方法可显示出更具经济和环境的合理性。从发酵产生的产物可用于许多应用中。在具体实施方式中，本发明提供生产1,4-BDO的方法。1,4-丁二醇(BDO)是一种聚合物中间体和工业溶剂。在下游，丁二醇可进一步转化；例如，通过氧化转化成γ-丁内酯，其可进一步转化成吡咯烷酮和N-甲基-吡咯烷酮，或者其可以经氢解而转化成四氢呋喃。这些化合物具有广泛的用途如作为聚合物中间体、溶剂、和添加剂。
本发明部分地涉及从发酵液分离沸点高于水的水可混溶性化合物，同时可选地可循环发酵液的其它成分的方法。该方法分离出可包括微生物有机体的细胞团块，而该微生物有机体已经用基因插入、基因破坏或者插入与破坏的结合被改造，以从合适的原料有效地产生化合物。
无细胞培养液、或液体部分可通过进一步处理去除盐。这可在从发酵液去除一些或基本上所有水之前或之后通过多种方法完成。如上所述，盐通常不能回收以循环于发酵过程中。通常，任何回收的盐包括期望的生物合成产物的盐形式，例如乳酸盐、柠檬酸盐或其它羧酸盐产物或含胺产物的铵盐等等，而不是培养基盐等等。，本发明所述的方法可以回收培养基盐并且可选地返回至发酵中循环。该分离方法也包括除水，其可将水重新引入发酵系统中。在最终纯化中，若为固体的話，发酵产生的化合物可在除去细胞、盐和水后从剩余的液体部分蒸馏、或重结晶。在液体的情况下，可通过如分馏去完成最终纯化。
在一些实施方式中，本发明涉及从发酵液分离沸点高于水的水可混溶性目标化合物的方法。该方法包括：(1)从包含细胞的固体部分分离富含化合物的液体部分；(2)从该液体部分去除水；(3)从该液体部分去除盐；和(4)通过蒸馏或重结晶纯化目标化合物。上述步骤(2)和(3)可依次或同时进行。
通过发酵得到的沸点高于水的目标化合物的沸点可比水高10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、150℃、200℃和300℃和更高(包括之间的所有值)。沸点高于水的目标化合物可包括，例如1,4-BDO、1,3-BDO、2,3-BDO、1,3-PDO、1,2-PDO(甲基乙基乙二醇)、1,2-乙二醇(乙二醇)；γ-丁内酯(GBL)、1,5-戊二醇、1,6-己二醇。另外，目标化合物包括可与水混溶的那些化合物。在一些实施方式中，这种水可混溶性化合物可能难以经受常规萃取方法。此外，目标化合物包括那些中性化合物。本发明所指的中性化合物是不具有能够携带电荷的官能团(例如胺、羧酸、磺酸、硼酸等等)的化合物。最后，如下文进一步所述，目标化合物可足够小以便可透过纳滤膜。示例性化合物的种类包含醇、二醇、三醇(例如甘油)、四醇和多元醇等等。
在一个具体实施方式中，目标化合物是1,4-BDO。1,4-BDO具有大约230℃的沸点，并且可与水完全混溶。另外，还未鉴定可从水中经济地萃取1,4-BDO的溶剂。作为中性分子，不能通过结晶来分离盐的形式。1,4-BDO的分子量足够低，如下文实施例III中所述，可以通过纳滤膜。另外，如下文实施例VI中所述，各种发酵培养基盐在纯1,4-BDO中的溶解度相对较低。
在一些实施方式中，本发明提供从发酵液分离1,4-丁二醇(1,4-BDO)的方法，其包括：(1)从包含细胞的固体部分分离富含1,4-BDO的液体部分；(2)从液体部分去除水；(3)液体部分去除盐，和(4)纯化1,4-BDO。
所属领域技术人员应认识到，考虑到本发明关于示例性化合物1,4-BDO所公开的教导的指导，其它沸点高于水的水可混溶性目标化合物可使用相同方法进行分离。例如，本发明公开的方法可以很容易地修改成能够分离1,3-丁二醇。因此，尽管许多实施例通过1,4-BDO进行举例说明，但应理解，该方法很容易适用于其它沸点高于水的水可混溶性目标化合物。
在一些实施方式中，本发明涉及从发酵液分离1,4-丁二醇(1,4-BDO)的方法。该方法包括从包含括细胞的固体部分分离富含1,4-BDO的液体部分。在从液体部分分离盐之前或之后，从液体部分蒸发水。在一些实施方式中，如下文进一步所述，在去除水后从已结晶的盐分离1,4-BDO。盐在1,4-BDO中具有低的溶解度，因此所分离的1,4-BDO大约98％不含盐。在一些实施方式中，如下文进一步所述，在去除水之前通过特殊的过滤方法和/或离子交换、或色谱方法分离盐。
本发明所用的“分离”是指包括纯化步骤以获得基本上纯的目标化合物的方法。在具体实施方式中，目标化合物包含1,4-BDO。基本上纯的化合物包含在一些实施方式中至少98％不含盐、在其它实施例中至少99％不含盐、和在其它实施例中至少99.5％不含盐的化合物。基本上纯的化合物不含盐外也不含其它杂质的化合物，从而目标化合物在一些实施方式中至少98％纯、在其它实施方式中至少99％纯、和在其它实施方式中至少99.5％纯。
本发明所用的术语“液体部分”是指在从发酵液去除固体物质获得的离心分离液或上清液。除去的固体物质包括一些、基本上所有、或所有的固体物质。例如，在离心分离中，液体部分是从固体分离的离心分离液或上清液。液体部分也是通过膜过滤后获得的渗透液或上清液的部分。液体部分也是在应用一种或多种过滤方法后获得的滤液或上清液的部分。
本发明所用的术语“固体部分”是指发酵液的一部分,其含有不溶性物质的发酵液。这种不溶性物质包含，例如，细胞、细胞碎片、沉淀的蛋白质和细粒等等。细粒是指细小的，通常无定型的固体。细粒也可在结晶期间或从发酵液除水期间产生。细粒可由目标化合物组成，該目标化合物可被溶解并重结晶出来。细粒可包括因过小而不能在膜过滤中截留的固体部分。
本发明所用的术语“盐”，可与培养基盐和发酵培养基盐互换使用，其是指在发酵液中使用的溶解的离子化合物。发酵液中的盐可包含，例如氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、硫酸镁、硫酸铵、和缓冲液，例如钠和/或钾和/或铵盐的磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、和硼酸盐。
本发明所用的术语“基本上所有”在用于指去除水或盐时是指去除至少95％的水或盐。“基本上所有”也可包含去除至少96％、97％、98％、99％、或99.9％，或之间的任何值。
本发明所用的术语“基因破坏”或其语法同义词意思是使所编码的基因产物失活的遗传改变。该遗传改变可以是，例如整个基因的缺失、转录或翻译所需的调控序列的缺失、导致基因产物截短的基因的一部分缺失，或者使所编码基因产物失活的各种突变策略中的任何一种。一种特别有用的基因破坏方法是基因完全缺失，因为其减少或消除了在本发明非自然发生的微生物中遗传回复变异的发生。
本发明所用的术语“微生物”意思是具有显微粒径的原核或真核细胞或有机体。该术语意欲包含所有种类的细菌和真核有机体，例如酵母和真菌。该术语也包含可经培养用于产生生物化学物质的任何物种的细胞培养物。
本发明所用的术语“产生1,4-BDO的微生物”意思是改造成能生物合成有效量的1,4-BDO的微生物。经改造的有机体可包括基因插入，其包括质粒插入和/或染色体插入。经改造的有机体也可包括基因破坏以通过期望的途径进一步优化碳通量來生产1,4-BDO。产生1,4-BDO的有机体可包括插入与缺失的组合。
如本发明所用的“外源”意思是将参照分子或参照活性引入宿主微生物有机体中。例如，可通过将编码核酸引入宿主遗传物质中来引入分子，比如通过整合至宿主染色体中或作为非染色体遗传物质，例如质粒。因此，当用于提及编码核酸的表达时，该术语是指以可表达形式将编码核酸引入微生物有机体中。当用于提及生物合成活性时，该术语是指引入宿主参照有机体中的活性。来源例如可以是同源或异源的编码核酸，其在引入宿主微生物有机体中后可表达参照活性。因此，术语“内源”是指在宿主中存在的参照分子或活性。同样，当用于提及编码核酸的表达时，该术语是指包含在微生物有机体中的编码核酸的表达。术语“异源”是指来源于除参照物种外的来源的分子或活性，而“同源”是指来源于宿主微生物有机体的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源表达可使用异源或同源编码核酸中的任一种或两种。
在一些实施方式中，本发明提供一种从发酵液纯化目标化合物的方法。适用化合物包含具有高于水的沸点和低的盐溶解度的化合物。目标化合物也包含可与水混溶的化合物。示例性目标化合物是1,4-BDO。该方法包括从包含细胞团块的固体部分分离含有目标产物的液体部分。该目标产物可以是沸点高于水的任何化合物。细胞团块包含用于生产目标化合物的的微生物有机体。固体部分也包含细胞碎片、细粒、蛋白质、和来自发酵的其它不溶性物质。
分离方法也包括从液体部分去除盐和水。去除的顺序并不重要。在一些实施方式中，可部分地去除盐，随后去除基本上所有的水，和然后除去剩余的盐。在其它实施方式中，可部分地去除水，随后去除基本上所有的盐，和然后除去剩余的水。在其它实施方式中，可部分地去除水，随后从发酵液分离固体部分。在其它实施方式中，最终去除基本上所有的水可作为纯化步骤的一部分，例如通过蒸馏进行。如下文实施例VI中所公开的，纯的1,4-BDO不会使典型发酵培养基盐明显溶解。因此，1,4-BDO可通过从液体部分蒸发水来与盐分离。如下文实施例V中所示，当1,4-BDO的浓度为大约30％重量时，盐开始结晶析出。在一些实施方式中，通过去除水來结晶或沉淀盐已分离1,4-BDO后，1,4-BDO是至少98％不含盐。从实施例VI可发现，密切相关的同系物乙二醇和丙二醇也明显使发酵盐溶解。因此，即使去除基本上所有的水之后，也可使用其它方法来去除盐。
最后当已除去盐和水时，剩余液体或固体可进行最终纯化。当目标产物是液体时，纯化可通过蒸馏例如包括分馏或多次蒸馏完成。当目标产物是固体时，纯化可通过重结晶完成。
产生和分离目标化合物和循环各种发酵液成分的总体过程概括在图1的方框流程图中。步骤100是使用碳原料例如蔗糖发酵，来生产目标化合物。步骤110是从发酵液分离细胞以取得液体部分，其中步骤115是任选的循环细胞。步骤110已经在实施例I和II中举例说明，其中细胞和固体通过离心和超滤从发酵液分离。在步骤120中，从液体部分分离盐，其中步骤125是任选的循环盐。步骤120已经在实施例III-V中举例说明，其描述纳滤(实施例III)和离子交换(实施例IV)，其中水仍存在于液体部分中。实施例V显示在蒸发水期间通过结晶来分离盐。步骤130是通过蒸发去除水，其中步骤135是任选的循环水。步骤130通过实施例V进行举例说明，其显示蒸发水，以利于通过沉淀来分离盐。如下文进一步所述，步骤120与130的顺序可互换。最后目标化合物在步骤140中进行最终纯化。
在一些实施方式中，从发酵液分离目标化合物(包括1,4-BDO)的方法包括从包含细胞的固体部分分离富含目标化合物的液体部分。在分离富含目标化合物的液体部分时，可处理任意量的发酵液，包含1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，包括到发酵液的全部体积，以及之间的所有值，并且进一步包含少于发酵液总体积1％的体积。所属领域技术人员应该认识到，如下文所详述，发酵液的处理量可取决于发酵方法的类型，例如分批发酵、加料分批发酵、或连续发酵。包括细胞和其他固体副产物和来自发酵液的杂质的固体分离可通过离心、过滤、或者这些方法的组合完成。
在一些实施方式中，离心可用于提供包含目标化合物(如1,4-BDO)的液体部分，其基本上不含包含固体,如细胞团块。依据离心机的构造和尺寸，运行速度可在500至12,000rpm之间变化，其可产生高达重力15,000倍的离心力。用于从发酵液去除细胞和固体的许多离心机构造在本领域中是已知的。例如如图2中所示的圆盘堆叠式离心机200就是其构造之一。
在圆盘堆叠式离心机中的分离发生于转筒210的内部。供料通过固定入口管道220从顶部引入转筒中，以及在分配器230中加速，随后进入圆盘堆叠240中。分配器设计成加速供料液体。
液体-固体或液体-液体-固体的分离发生在各圆盘之间。在两相系统中，如具有不混溶的油相和水相，油相经过圆盘堆叠移动到中心，并可通过管道250排出和喷雾至收集框中。与油相分离的水和固体移动至外周，水通过顶部圆盘260中的通道引入配流室中，在此借助内置配流圆盘270将水抽出转子。
固体在外周收集，在此可通过离心机旋风将其间断地排出。固体的排出可通过液压系统完成，其中预设合适的间隔迫使滑动型转筒底部280落下从而打开位于转筒外周的固体端口。
圆盘堆叠式离心机通常以连续过程使固相与一种或两种液相彼此分离。通过离心力促使密度较大的固体向外移动，而密度较小的液相形成内部同心层。通过插入特殊圆盘(圆盘堆叠)可增加分离效率。可手动地、间断地、或连续地去除固体。根据某些实施方式，细胞团块可再次引入发酵中。在典型的圆盘堆叠式离心机装置中，液相在转筒顶部的出口区中溢出进入单独室中。
在圆盘堆叠式离心机运行期间，供料从转筒轴引入，加速(通常通过径向叶片组)，并使其流经紧密间隔的圆锥形盘。盘间距通常为0.5至3mm，目的是减小从流体分离沉降颗粒所需的距离。盘间角通常介于40与50度之间以利于固体沿圆盘表面向下传送并进入固体容纳空间。
分离机制是基于固体在离心力影响下沿着圆盘下侧的沉降，并且沿圆盘向下滑动至固体容纳空间。同时，澄清的流体沿圆盘间的通道向上移动并通过向心泵离开离心机。沉降的固体通过喷嘴连续排出或通过转筒外周的端口间断地排出。
圆盘堆叠式离心机可在发酵液中细胞的浓度和粒径较低的情况下使用。当所包括细胞和其它固体物质低至大约0.2％至大约3％发酵液重量时，可使用圆盘堆叠式离心机。也可在细胞和其它固体物质小于大约0.2％重量，例如0.01％重量、0.05％重量、和0.1％重量(包括其间的所有值)时使用圆盘堆叠式离心机。也可在细胞和其它固体物质超过3％重量(例如4％重量、5％重量、6％重量、7％重量、8％重量、9％重量、10％重量、和15％重量(包括其间的所有值)时使用圆盘堆叠式离心机。当细胞团块及其它固体之和超过大约3％至大约15％重量时，可使用其它离心机构造，例如沉降式离心机。
具有大约0.5微米至大约500微米之间范围的，而又柔软的、可塑的和没有磨损的细胞及其它固体颗粒通常非常适合于盘式离心。对于小于大约0.5微米的颗粒物质来说，超滤是有用的。同样，大于大约500微米时，沉降型离心机可能是有用的。可经培养以产生目标化合物(包括1,4-BDO)的典型的原核细胞的尺寸可在大约0.5微米至大约10微米之间范围，使圆盘堆叠式离心成为一种非常适合的方法。
在分批发酵后、或在加料分批发酵或连续发酵期间，细胞和不溶性固体可通过圆盘堆叠式离心机从发酵液去除。圆盘堆叠式离心机的输出物是澄清的(无细胞)离心分离液和含有大约5％至大约50％固体的下溢流。来自圆盘堆叠式离心机的下溢固体流可含有大量可回收的目标产物。从固体回收额外的目标化合物的一种方式包括进一步的离心步骤。除提升目标化合物的回收率外，多次离心还能进一步浓缩细胞和固体。浓缩的细胞可循环返回至发酵中。当使用有价值的经改造的有机体时，细胞循环尤其有用。
在一些实施方式中，可使用沉降式离心机来分离出细胞和固体。对于具有下限接近大约10微米粒径的固体，沉降式离心机通常可实现良好性能，尽管小颗粒可根据其沉降速度进行处理，如下文进一步所述。当培养细胞是较大尺寸范围的典型的原核有机体时，可使用此离心机构造。所属领域技术人员应认识到，真核细胞通常远大于原核细胞，其中真核细胞的平均尺寸在大约10微米至大约100微米之间或更大。尽管圆盘堆叠式离心机在此尺寸范围中可良好运行，但沉降式离心机是有用的，因为其能够处理较大量的固体。因此，当细胞团块及其它固体占超过大约3％至大约50％重量的物质时，可使用沉降式离心机。此浓度应用于上述圆盘堆叠式离心机的下溢，使沉降式离心成为一种进一步浓缩细胞团块并回收额外产物的非常适合的方法。
沉降式离心机或固体转筒离心机基于沉降原理运行。示例性装置描述在美国专利号4,228,949和4,240,578中，它们的全文引用作为参考。如图3所示，在这一装置300中，机器的中心部分是转鼓310，其包括一独立的旋转螺杆320。发酵液或含固体的供料(例如，来自圆盘堆叠式离心机的下溢)通过入口管道330供给至位于螺杆第一部分中心的混合室340中。发酵液然后通过混合室中的端口向外到达转鼓的外壁。通过螺杆将脱水发酵液传送至机器外。离心分离液350、或上清液通过离心管道从槽内表面轻轻倒出。可根据待处理物质的特性来调节转鼓中的水位。
转鼓和螺杆以高达大约3,600rpm的速度彼此独立地旋转，其取决于机器的类型和尺寸。所用的脱水原理在本领域中作为“并流”或“逆流”方法是已知的。并流方法容许极低的差速。差速是转鼓速度与螺杆速度之间的差。低的差速意味着在离心机中的保留时间较长，这会导致污泥较干且磨损相当小。逆流原理可能更适合于易于脱水的供料和期望较高容量时。
固体可在固体转筒离心机中分离，前提是固体在供料的液相部分中的沉降速度足够高。影响沉降速度的因素包括，例如粒径、形状、细胞/固体与发酵液液相间的密度差、和粘度。转筒的几何形状，尤其是长度与直径之间的关系，应可适用于具体条件。在一些实施方式中，在大约2:1至大约3:1之间的长度直径比范围内可获得良好结果。
运行时，分离发生在配置有螺杆传送带的水平圆锥形柱状转筒中。发酵液通过固定入口管道供给至转筒中，并通过入口分配器加速。离心力提供将固体沉降于转筒壁上的方式。在转筒的相同方向差速旋转的传送带将固体传送至圆锥形末端。然后使固体上升脱离液相并离心脱水，随后将其排入收集通道。剩余液相然后通过转筒的圆柱形末端中的开口流入外壳中。
如上所述，可通过多次离心来分离细胞和固体以增加目标化合物的分离产率。多次离心可包括，例如离心两次、三次、四次、和五次。中间的下溢流可用水稀释以进一步增加液体产物的回收率。也可使用离心构造的任意组合来实施多次离心，例如上述的圆盘堆叠式离心与沉降式离心的组合。不能通过离心分离的其它固体可通过过滤方法(例如超滤)除去。
超滤是使用高达大约145psi(10bar)的压力通过膜的选择性分离方法。有用的构造包括使用螺旋缠绕、空心纤维、或平板纸(盒)超滤组件的错流过滤。这些组件由具有截留分子量小于大约200,000道尔顿的聚合物或陶瓷膜组成，例如，如下实施例I所用的Hydranautics5KPES膜。陶瓷超滤膜是有用的因为其具有长达或超过10年的长使用寿命。陶瓷膜具有比聚合物膜昂贵很多的缺点。超滤可浓缩分子量超过大约1,000道尔顿的悬浮固体和溶解物。超滤包括通过具有正常截留分子量(MWCO)从大约1,000道尔顿至大约200,000道尔顿(孔径为大约0.005微米至0.1微米)的膜进行过滤。术语截留分子量用于定义通过膜保留大约90％蛋白质的大小。使用超滤时，渗透液将含有低分子量的有机溶解物(例如1,4-BDO)、培养基盐和水。截留的固体可包括，例如残余细胞碎片、DNA和蛋白质。
除在离心的下游使用超滤外，超滤也可用于微滤的下游。微滤是可替代离心來分离细胞的方式。当微滤用于分离大约0.05-10微米范围的胶体和悬浮颗粒时,通常包括低压错流膜过程。微滤包括通过具有从大约0.05微米至大约5.0微米孔径的膜进行过滤。聚合物、陶瓷、或钢制微滤膜可用于分离细胞。陶瓷或钢制微滤膜具有长的运行寿命，包括长达或高于10年。微滤可用于澄清发酵液。与超滤不同，微滤通常并不截留残余的细胞碎片、DNA和蛋白质。然而，使用具有逐渐降低孔径的一系列过滤步骤来避免过滤膜阻塞是有用的。这有助于优化过滤膜的再使用。在一些实施方式中，可使用单一的超滤步骤来除去细胞团块(代替离心或微滤)和残余细胞碎片、DNA蛋白质等。陶瓷超滤组件由于其能够承受用于此运行模式中的频繁清洗循环，所以可用于此应用中。
在一些实施方式中，称作纳滤的进一步过滤方法,其可用于分离出某些盐。例如，此工艺步骤可回收某些培养基盐而不用事先蒸发水。纳滤可分离盐、脱色、和提供脱盐。在纳滤中，渗透液通常包含单价离子和低分子量的有机化合物，以1,4-BDO为代表。纳滤包括通过具有标称截留分子量(MWCO)为大约100道尔顿至大约2,000道尔顿的膜(孔径为大约0.0005微米至0.005微米)进行过滤。用于纳滤的一种方法是使用螺旋缠绕组件的错流过滤。有多种纳滤膜可供选择，例如如下文实施例III中所用复合纳滤膜GEDK的薄膜。纳滤中的质量转移机制是扩散。纳滤膜容许某些离子性溶解物(例如钠和氯化物)、主要为单价离子、以及水部分地扩散。大的离子类(包括二价和多价离子)、和更复杂分子基本上得以保留。
由于单价离子部分地通过纳滤膜与水一起扩散，在膜两侧溶液间的渗透压差并不大，并且这通常导致纳滤中的操作压力略低于(例如)反渗透。
纳滤不仅去除一部分无机盐，而且还可去除有机酸盐。在分离过程中除去有机酸副产物是重要的，因为所述的酸在与目标产物的不期望副反应中可能起催化作用或作为反应物。在涉及分离1,4-BDO的具体实施例中，例如，有机酸的去除尤其有用，因为这可防止在任何下游蒸发或蒸馏步骤中升温期间诸如羟基的酯化等反应。这些酯副产物通常具有高于BDO的沸点，从而导致蒸馏中的重物流发生产率损失。
纳滤也可将葡萄糖或蔗糖基质与目标产物分离，防止在蒸发和蒸馏期间发生降解反应。这些降解反应可使目标化合物着色。与从蒸发结晶回收盐流相比，该富含盐和基质的纳滤保留物可能更适于循环至发酵中。例如，使用过滤方法代替包括应用加热的方法可产生较少的降解产物。这种降解产物可能对发酵有机体具有毒性。
纳滤和离子交换都可去除形成颜色的化合物和UV吸收性化合物。这可能对一些目标化合物有用。例如，颜色的去除在聚合物级1,4-BDO的生产中是有用的。
多重过滤膜可连串地使用，其中保留的固体的大小逐渐变细。这可有助于减少膜阻塞并且有助于回收发酵液的各种成分用于循环。例如，一系列过滤可使用微滤、随后超滤、随后纳滤。因此，微滤有助于回收细胞团块，超滤可去除较大成分，例如细胞碎片、DNA和蛋白质，和纳滤有助于回收盐。
所属领域技术人员应认识到，在本发明所提供的教导和指导下，任意的各种过滤类型均可整合至各种发酵生物反应器构造中。在一些实施方式中，在生物反应器外过滤进行。在此模式中，任何量的发酵液可从生物反应器移除并单独地过滤。过滤可通过使用真空方法、或使用正压来帮助进行。在一些实施方式中，细胞过滤可通过生物反应器内部的过滤组件的方式完成。这种构造包括发现于膜细胞-循环生物反应器(MCRBs)的构造。Chang等的美国专利号6,596,521已经描述了两段式细胞-循环连续反应器。
在一些实施方式中，可通过如Yang等(Biotechnol.Bioprocess.Eng.，7:357-361(2002))描述的声学细胞沉降器来分离并循环细胞至发酵混合物中。声学细胞沉降使用超音波来浓缩发酵液中的细胞悬浮液。此方法使细胞易于返回生物反应器，并且避免有时使得过滤型细胞循环系统变得复杂的膜阻塞的问题。
对于在水蒸发之前的盐分离来说，其它方法可单独使用、或与上述示例性过滤方法相组合。所述的其它方法包括，例如离子交换。例如，Gong等(Desalination191:1-3，193-199(2006))已经描述了通过电透析离子交换膜对1,3-丙二醇发酵液脱盐的传输性质的影响。
离子交换组件可采用树脂珠和膜的形式。通常，树脂浇注成多孔珠粒形式。树脂可以是具有带电位点形式的活性基团的交联聚合物。在这些位点处，带相反电荷的离子会被吸引，但可能被其它离子替代，这取决于其相对浓度和对位点的亲和力。例如，离子交换剂可为阳离子型或阴离子型。决定
特定的离子交换树脂的效率的因素包括特定离子的倾向性，和可用活性位点的数量。为了使活性位点最多，通常使用较大表面积。因此，小颗粒是有用的,因其表面积较大。
例如，树脂聚合物可包括大约0.5至大约15％的交联度。温度和pH也影响离子交换的效率。例如，pH可影响可供交换的离子数，以及温度影响此过程的动力学。在一些实施方式中，通过离子交换除去盐包括除去有机酸和有机酸盐。阴离子形式的有机酸可结合至阴离子交换活性位点。在一些实施方式中，结合有机酸的pH是低于该酸的pKa。例如，乳酸的pKa是大约3.1。去除有机酸盐的有效方法是阳离子交换后进行阴离子交换。阳离子树脂首先除去有机酸抗衡离子(钙、钠、铵等等)，降低溶液的pH。然后阴离子树脂结合游离酸。
离子交换的有用方面是可再生树脂的设备。可冲洗树脂以使其不含交换的离子并与期望离子的溶液接触以替换它们。对于再生来说，相同的树脂珠可反复使用，并且分离的离子可在废物流出物中浓缩。对于许多过滤方法来说，如实施例IV中所举例说明，可实施连续离子交换。因此，可使供料经过任何数量的阴离子型和阳离子型交换器、或混合床交换器，并且以任何顺序经过。
在一些实施方式中，通过使用蒸发除水来促进盐回收。在一些实施方式中，在水除去之前已除去盐。在这两种情况下，蒸馏的水可作为补充水循环至发酵中，将该工艺的总体水需求量降至最低。在未除去盐的情况下，其在富含1,4-BDO的液相中的溶解度足够低，从而其可在除水后结晶。在一些实施方式中，盐在1,4-BDO中具有足够低的溶解度，从而所分离的1,4-BDO中大约98％不含盐。
蒸发结晶器可用于生成沉淀的盐，所述的盐可通过离心、过滤或其它机械方式去除。在分离1,4-BDO的情形中，蒸发结晶器用于从发酵液去除水，使至所产生的液相在除去足够的水下导致发酵培养基盐过饱和，随后在剩余液相或母液中结晶。如下的实施例V中所述，在1,4-BDO浓度为大约30％重量时盐开始结晶。
母液是指结晶中的主溶剂。母液通常是具有溶解各种溶解物的不同能力的溶剂的组合。例如在从发酵液纯化1,4-BDO的情形中，该母液包括在从发酵液去除细胞及其它固体后获得的液体部分。在从发酵液分离目标化合物的情形中，主要溶解物包括发酵培养基盐和有机酸。
结晶中的过饱和是指其中溶解物在主溶剂中的浓度高于在特定温度和压力条件下通常可能的浓度的状况。发酵液的主溶剂是水，其中包括相对较少量的1,4-BDO，例如，和溶解的盐与其它培养基。
示例性的蒸发结晶器是如图5和6中所示的强制循环(FC)结晶器。FC结晶器已经描述于(例如)美国专利号3,976,430中，它的全文引用作为参考。FC结晶器可蒸发水，从而导致盐在富含化合物(例如1,4-BDO)的液体部分中的过饱和度增加，因此引发盐结晶。该FC结晶器对获得高的蒸发速率是有用的。该FC结晶器由四个基本组件组成：具有圆锥形底部部分的结晶器容器、循环泵、热交换器、和处理结晶器中产生的蒸气的真空设备。来自结晶器容器的浆液通过热交换器循环并再次返回结晶器容器，其中通过将盐沉积于浆液中存在的晶体上来减少过饱和度。将蒸发的水引入真空系统，其在此被冷凝，并且根据需要循环至发酵液中。尽管在一些实施方式中使用低真空，但也可在大约大气压下使用FC结晶器。在一些实施方式中，FC结晶器使用绝热蒸发冷却来产生盐过饱和。在这种实施方式中，FC结晶器无需配置热交换器。
在一些实施方式中，如图6中所示，FC结晶器可进一步配置内部挡板，以处理液相溢流并减少可抑制晶体生长的细粒。也可借助任选的析出段淘洗柱对FC结晶器中产生的盐进行尺寸选择。FC结晶器的此部分位于结晶器容器的圆锥形部分的底部。尺寸选择通过以下完成：提供沿该段向上流动的发酵流，从而仅允许具有特定沉降速率的颗粒逆着此流而移动。沉降速度与晶体的尺寸和形状以及流体的粘度有关。在其它实施方式中，FC结晶器也可配置一个内部洗涤器以减少产物损失。这可能有助于回收挥发性产物。
如图7所示，湍流或导流管和挡板DTB结晶器提供两种排放流，一种是包括晶体的浆液，和另一种是具有少量细粒的液相。DTB结晶器的构造可促进晶体生长，并且可产生平均尺寸大于用FC结晶器获得的晶体的晶体。在一些实施方式中，DTB结晶器是在真空下、或在略高于大气压下运行。在一些实施方式中，DTB结晶器使用真空进行冷却。
在一些实施方式中，DTB结晶器是在低的过饱和状态下运行。所属领域技术人员应认识到，使用此方案可获得大的晶体。该系统可可选地设置成可溶解细粒从而进一步增加晶体尺寸。当DTB结晶器用于发酵培养基盐的回收时，就不需优先考虑晶体尺寸。
DTB结晶器在结晶的领域已得到广泛研究，并且可精确地进行模拟。其生长区和澄清的液相区的显著不同有利于定义动力学参数，以及因此可容易地计算出生长和成核速率。这些特征使得DTB结晶器适于进行数学描述，并且因此受到良好的操作控制。如同FC结晶器，DTB结晶器是混合悬浮混合产品排除(MSMPR)设计的一个实例。
DTB结晶器包括用作沉降区的挡板区，其位于有效体积的外周。此区用来进一步处理液相和细粒。在一些实施方式中，不存在挡板区，如细粒的进一步处理不太重要的情形。这种构造在本领域中称作导流管结晶器。DTB结晶器可配置有搅拌器，其通常位于装置底部邻近供料溶液入口处。如同FC结晶器，DTB结晶器可选地配置有淘洗柱。在一些实施方式中，可使用任选的外部加热环来增加蒸发速率。
如图8中所示，又一结晶器构造是诱导循环结晶器。此构造提供用于有效体积的额外搅拌方式。该装置在导流管的使用方面与DTB结晶器相似。与DTB装置不同，其没有内部搅拌器。相反，容器的圆锥形部分中的诱导器从循环泵引入热溶液。对于其它结晶装置的构造来说，诱导循环结晶器可选地配置有淘洗柱。挡板也可可选地用于这种结晶器中。
在其它实施方式中，结晶器可为奥斯陆-型结晶器，如图9和10中所示。这种结晶器也称作“生长-”、“流化床-”、或“克里斯塔尔-”型结晶器。奥斯陆结晶器容许晶体在流化床中生长，其不经机械循环。在奥斯陆单元中的晶体会生长至与在流化床中的保留时间成正比的尺寸。结果为奥斯陆结晶器可生长出比大部分其它结晶器类型更大的晶体。可从结晶器的流化床除去浆液并传送至(例如)离心部分。包括1,4-BDO的澄清液相可从结晶器的澄清区吹扫出来。
分类结晶室是单元中的下部分。上部分是液-气分离区，在此通过除水产生过饱和度。稍微过饱和的液相经中心管道向下流，并且通过与晶体的流化床接触来减轻过饱和度。循环液相在该室的顶部中被收集之前，循环液相随着通过分类床向上移动而逐渐去过饱和。剩余的液体通过循环管道离开，并在添加新鲜供料后，其通过提供热补充的热交换器。然后其循环至上部。
在一些实施方式中，奥斯陆型结晶器也可可选地配置如上所述的有挡板、淘洗柱、和洗涤器。由于正生长的晶体不与任何搅拌器接触，需要除去的细粒的量通常较低。奥斯陆型结晶器容许在晶体除去期间有长的生产周期。
奥斯陆-型结晶器可用于如在发酵培养基盐中所发现的多种化学物质的分离-结晶。在一个实施方式中，如图9中所示，奥斯陆型结晶单元是“密闭”型。在其它实施方式中，如图10中所示，奥斯陆型结晶器是“开放”型，。当例如需要较大沉降区时，后者构造是有用的。
许多上述蒸发结晶装置可控制晶体生长。在细胞除去后从液体部分回收发酵培养基盐时，确切的晶体形态、尺寸等等通常不重要。实际上，在纯化任何目标化合物(包括1,4-BDO)中，回收无定型培养基盐已经足够。因此，在一些实施方式中，可使用不控制晶体本身生长的其它蒸发方法。
在通过纳滤和/或离子交换除盐时，在蒸发之前可使用反渗透(RO)膜过滤除去一部分水。水渗透过RO膜而1,4-BDO得以保留。在一些实施方式中，RO膜可浓缩产物(例如1,4-BDO)至大约20％。所属领域技术人员应认识到，产物1,4-BDO的渗透压增加至一点，就再无法使用RO膜进一步浓缩。然而，使用RO膜是有效的低能量输入方法，其用于在更大的能量密度的水蒸发工艺之前浓缩目标产物。因此，使用RO膜尤其有用于大规模上。
在一些实施方式中，在除水之前去除基本上所有的盐。在其它实施方式中，在去除一部分水之后去除基本上所有的盐。所除去的水的比例可以是包括5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％，以及之间所有值的任意量。在一些实施方式中，在去除基本上所有的水之后去除盐。基本上所有的水包括95％、96％、97％、98％、99％、99.9％，以及之间所有的值，和包括所有的水。
有许多类型和构造的蒸发器可用于除水。设计蒸发系统的一个考虑是将能量需求降至最低。例如多效或机械蒸气再压缩等蒸发构造可降低能量消耗。在一些实施方式中，除水通过使用包括单效或多效的蒸发器系统进行蒸发来完成。在一些实施方式中，双效或三效蒸发器系统可用于分离水与目标产物(例如1,4-BDO)。任何数量的多效蒸发器系统都可用来除水。这些装置也可应用于沸点高于水的任何发酵产物中。三效蒸发器、或其它蒸发装置构造可包括专用效，其是用于回收盐的蒸发结晶器，例如三效构造的最终效。
蒸发器是沸腾液体产生蒸气的热交换器，其也是低压蒸汽产生器。此蒸汽可用于在称作另一“效”的另一蒸发器中來进一步加热。因此，例如，两个蒸发器可连接起来，以便一者的蒸气线与另一者的蒸汽室连接，从而提供两效或双效蒸发器。例如，此构造可延续至第三蒸发器以建立三效蒸发器。
因此蒸发器可根据效的数量进行分类。在单效蒸发器中，蒸汽提供用于气化的能量，并且将蒸气产物冷凝并从系统中除去。在双效蒸发器中，离开第一效的蒸气产物用于提供第二气化单元的能量。级联效可延续任何阶段。多效蒸发器与单效蒸发器相比可更有效地去除大量溶剂。
在多效布置中，使用离开一个效的蒸气产物的潜在热量来加热下一效。效从通过蒸汽加热的效(效I)开始编号。第一效在最高压力下运行。使用来自效I的蒸气来加热效II，其因此在较低压力下运行。此继续经过每一额外的效，而压力在该序列下降低，并且热蒸气将从一个效行进至下一效。
在一些实施方式中，蒸发器中的所有效可具有物理性相似的大小、构造、和传热面积。除非热损失明显，否则它们也可具有相同的能力。蒸发器管系(串联的效)可以多种不同方式接收供料。顺向供料排列遵循模式I、II和III。这些使用单一供料泵。在此构造中，将供料升温至如效I中所用的最高运行温度。最低运行温度是在最后的效中，其中产物的浓度也是最高的。因此，此构造可用于热敏性产物或用以减少副反应。
在其它实施方式中，可使用逆向供料排列-III、II、I。在此构造中，多个泵用于对抗系统中压力的下降，然而，由于供料被逐渐加热，故其与顺向供料构造相比更有效。这种排列也减小了系统中的粘度差，并且因此可用于粘性发酵液。在一些实施方式中，可使用混合的供料排列，供料进入系统中部，或者或效II、III和I。最终的蒸发在最高温度下实施。此外，所需要的泵少于逆向供料排列。在其它实施方式中，使用平行供料系统将供料分割开并将各部分供给至每一效。此构造常用于预期产物是浆液的结晶蒸发器中。
有许多种蒸发器设计。设计的任何组合可用作如上所述的效。一种蒸发器设计是降膜蒸发器。此装置包括垂直管-壳式热交换器，其具有横向或同心排列的离心分离器，如图11中所示。
将待蒸发的液体均匀分配于管道的内表面上。液体向下流动形成薄膜，由于通过蒸汽加热而从此处发生蒸发。蒸汽冷凝并沿管道外表面向下流动。将大量的管道并排构建在一起。管道在每一末端固定至管板上，并且管束最终被保护套包封。
通过保护套引入蒸汽。管道之间的空间形成加热部分。管道内侧称为沸腾部分。它们共同形成加热体。浓缩的液体和蒸气在底部离开加热体，大部分浓缩液从这里排出。剩余部分与蒸气一起沿切向进入随后的分离器中。通常借助于来自加热体的大部分离心分离液的同一泵来排出分离的离心分离液，并且蒸气从顶部离开分离器。加热蒸汽冷凝于管道外表面上，加热蒸汽被收集成冷凝物于加热部分的底部，从这里将其排出。
降膜蒸发器可在加热介质与沸腾液体之间的温差极低的情况下运行，并且其也具有极短的产物接触时间，通常每程仅数秒钟。这些特征使降膜蒸发器尤其适用于热敏性产物。降膜蒸发器在较小温差下运行有利于其用于多效构造或者与机械蒸气压缩系统一起使用。
加热体管道中加热表面的足够润湿帮助避免能阻塞管道的干斑和水垢。在一些实施方式中，通过延伸或划分蒸发器效可增加润湿率。降膜蒸发器可高度响应例如能量供应、真空、供料速率、和浓度等参数的变化。在一些实施方式中，单效、双效、三效、或其它多效降膜蒸发器构造可使用已通过如上所述的纳滤方法过滤的发酵液供料。在水蒸发之前，降低盐可进一步帮助防止加热体管道中的水垢。
在一些实施方式中，降膜蒸发器是短程蒸发器。运行时，液体部分通过分配系统均匀分配于加热体的加热管道上。液体部分以类似于常规降膜蒸发器的方式在内壁上向下流动呈薄膜形式。在加热体管道中形成的蒸气在冷凝管的外壁上冷凝成馏出物，并且然后向下流动。水馏出物和浓缩液体部分分别从蒸发器的下部排出。
另一蒸发器构造是强制循环蒸发器。在此设计中，如图12中所示，闪蒸器或分离器设置于加热体和循环泵上方。运行时，液体部分借助循环泵循环经过加热体。液体在高于正常沸腾压力的高压下在加热体内使过热。进入分离器后，压力迅速减小从而使液体闪蒸或迅速沸腾。该流速通过循环泵控制，其和温度可用于控制除水过程。此构造可用于避免加热体管道阻塞。
在一些实施方式中，可如上所述使用多个强制循环蒸发器效。例如，在从发酵液的液体部分分离水的过程中，除使用单效强制循环蒸发器外，也可使用双效、三效和多效强制循环蒸发器。在一些实施方式中，一个或多个强制循环蒸发器可与一个或多个降膜蒸发器结合使用。
在其它实施方式中，蒸发器可以是板式蒸发器，如图13中所示。此蒸发器使用板式热交换器和一个或多个分离器。板框式构造使用具有交替通道的板来携带加热介质和发酵液的液体部分。运行时，液相和加热介质逆流经过其各自的通道。定义的板距和形状可产生湍流，从而有效地进行传热。液体部分传热至通道可使水沸腾。因此形成的蒸气促使残余液体成为升膜进入板组的蒸气管道中。残余液体和蒸气在离心分离器的下游被分离。宽的进气管道和向上移动可帮助在热交换器的横截面上进行良好地分配。板式蒸发器可与纳滤膜预过滤一起有效地运行以避免阻塞。因此，对于水垢须考虑与降膜蒸发器相似的因素。
在一些实施方式中，多效板式蒸发可以使用与上文针对降膜和强制循环蒸发器所述的非常相同的方式。当用于多效构造中时，所属领域技术人员应认识到在向板式蒸发器引入液体部分之前使用强制循环蒸发器和/或纳滤步骤的益处。因此，分离流程可包括，例如纳滤，随后通过一个或多个强制循环蒸发器的多效蒸发构造，随后一个或多个板式和/或降膜蒸发器。在其它实施方式中，任何上述的蒸发结晶器也可与多效构造结合使用。
在一些实施方式中，循环蒸发器可用于从液体部分除水，如图14中所示。循环蒸发器使用具有短的管道长度的垂直加热体，其中横向分离器排列于热交换器顶部。运行时，液体部分从加热体底部供应并上升至顶部。在加热体的管道中加热期间，水开始沸腾以释放蒸气。液体被向上移动的蒸气夹带运输至加热体顶部。当进入分离器时液体与蒸气分离。液体通过循环管道流回进蒸发器中以继续循环。加热体加热组件与分离器室之间的温差越大，导致水从液体部分蒸发的程度越大。当液体部分充分富含1,4-BDO时，盐开始从液体部分沉淀。
在一些实施方式中，循环蒸发器的分离器可分成多个分离室，每一分离室均配置有单独的液体循环系统。这可减小从液体部分除水所需的加热表面。
流化床蒸发器是可用于从液体部分除水的又一构造。如图15中所示，此系统配置有垂直流化床热交换器。在热交换器的管道侧是固体颗粒，例如玻璃或陶瓷珠，或钢丝颗粒。
流化床蒸发器以与强制循环蒸发器相似的方式运行。液体的向上移动可夹带固体颗粒，提供冲刷或清洗作用。固体颗粒与液体部分一起被转移通过加热体管道。在加热体头部，固体颗粒从液体分离并循环至加热体入口室中。过热流体在分离器中闪蒸至沸腾温度來通过蒸发去除水。加热体管道中固体的冲刷作用使得延长运行时间，并且进一步防止管道阻塞。在常规强制循环蒸发器系统造成固体阻塞限制下这是有用的。
升膜蒸发器是用于从发酵液收集的液体部分除水的另一类蒸发器。这种系统构造具有在垂直管壳式热交换器(加热体)上顶置式蒸气分离器。运行时，加热体底部的液体部分上升至顶部进入蒸气分离器中。外部加热使液体部分中的水在加热体管道的内壁中沸腾。蒸汽的向上移动使液体部分被携带至加热体顶部。在通过管道上升期间进一步形成蒸气。在进入分离器后蒸气与液相分离。当与粘性液体一起使用和/或当预期具有大量阻塞固体时，升膜蒸发器尤其有用。
逆流-涓流蒸发器是可用于从发酵液的液体部分除水的另一蒸发器。此装置具有管壳式热交换器(加热体)，其中加热体的下部比升膜蒸发器的下部大。如同升膜蒸发器，在加热体顶部设置分离器。在此蒸发器中，分离器进一步配置液体分配系统。
运行时，如同降膜蒸发器在蒸发器顶部提供液体。液体分配于蒸发器管道上，但蒸气相对于液体逆向流动至顶部。在一些实施方式中，该方法也可包括例如惰性气体流以增强夹带。此气体可从加热体的下部引入。
搅拌蒸发器是可用于从发酵液的液体部分除水的另一类蒸发器。此装置包括配置有搅拌器的外部加热套式容器。运行时，将液体部分可选地分批置于该容器中。在不断的搅拌下,通过沸腾使水蒸发至期望浓度。此装置可通过使用可选的浸没加热线圈以增加加热表面，来增加其蒸发速率。当发酵液粘性较高时，这类蒸发器尤其有用。
最后，螺旋管式蒸发器是可用于从发酵液的液体部分除水的另一类蒸发器。此设计包括配置有螺旋加热管的热交换器和底置式离心分离器。运行时，液体部分自顶部至底部与蒸气平行流动变成沸腾膜。膨胀的蒸气对液体膜产生剪切、或推动作用。流动途径的曲率引起二次流，其干扰沿管道轴的移动。此湍流促进传热并且对于粘性液体尤其有用。加热管道的螺旋构造相对于非螺旋有效地提供较大的加热表面积高度比。此装置提供较大的蒸发比率从而容许单程运行。
如上所述，以双效、三效和多效构造方式使用上述任何类型的多个蒸发器可增加蒸发效率。提高运行效率的其它方法包括，例如热力和机械蒸气再压缩。在一些实施方式中，可使用多效构造、热力再压缩、和机械再压缩的任何组合来增加蒸发效率。
热力蒸气再压缩包括将来自沸腾室(或分离器)的蒸气再压缩至较高压力。对应于加热室压力的饱和蒸汽温度更高，蒸气从而可再用于加热。这由蒸汽喷射式蒸气再压缩机完成，其以蒸汽喷射式泵的原理运行。简单地说，蒸汽喷射原理使用蒸汽的能量来产生真空并处理制程气体。蒸汽在压力作用下进入喷嘴中并产生高速射流。这种喷射作用产生真空，其吸引和夹带气体。在大气压力下，排出蒸汽与气体的混合物。一定量蒸汽(称为动力蒸汽)是用来操作热力再压缩机。动力蒸汽被转移至下一效或冷凝器中。过量蒸气的能量接近于所用动力蒸汽的能量。
在配置有热力蒸气再压缩机的多效蒸发器中，第一加热体中的加热介质是来自一个相关效的产物蒸气，其使用蒸汽喷射器压缩至较高温度水平。任何后一效的加热介质是前一加热体中所产生的蒸气。来自最终效的蒸气与引入的产物冷凝，可选地如有必要补充冷却水。所有回收的水很易地循环至发酵液。
机械再压缩机利用离开一个蒸发器的所有蒸气。将蒸气再压缩至蒸发器的相应加热蒸汽温度的压力。运行原理与热泵相似。可选地使用蒸气冷凝物的能量来预热发酵液中液体部分的其它部分。通过使用高压风机或涡轮压缩机来提供机械再压缩。这些风机以高速运行，并且当蒸气压缩比是大约1:12至大约1:2的适用于较大流速。合理的速度可介于大约3,000至大约18,000rpm之间。在一些实施方式中，尤其当使用高压时，可使用多级压缩机。
在配置有机械蒸气再压缩机的蒸发器中，第一效中的加热介质是在相同效中产生的蒸气，其利用高压风机压缩至较高温度。来自高热部分的任何过量的蒸气可选地被冷凝或可用于后浓缩器中。
如上所述，有许多可能的蒸发类型，其可按各种能量效构造排列，包括：多效、热力蒸气再压缩、机械蒸气再压缩、或其组合。最佳构造取决于许多因素，包括，例如培养基盐是否在蒸发之前去除还是在蒸发期间通过结晶去除。对于在蒸发之前去除盐的情形，低成本构造是有用的。示例性的构造包括降膜三效蒸发器系统或机械蒸气再压缩系统。由于盐的沉淀可能使热交换器表面阻塞，所以盐在蒸发期间结晶的情形比较复杂。用于此情形的示例性构造包括三重效，其中，例如前两个效是降膜蒸发器(在开始结晶之前)和最后一个步骤是强制循环蒸发结晶器。
具体地，1,4-BDO的纯化可在两个蒸馏柱系列中进行，尽管可使用更多蒸馏柱。第一个柱用于从1,4-BDO分离水和其它轻成分，而第二个柱用于从任何残余重成分蒸馏1,4-BDO。蒸馏柱可在真空下运行以降低所需温度，和减少不期望的反应、产物降解和颜色形成。把横越柱中的压力下降減至最低以维持底部再沸器中的低温。通过使用例如降膜再沸器，将再沸器中的保留时间降至最低也可以防止不期望的反应、产物降解和颜色形成。
所属领域技术人员应认识到，所列举的离心、过滤、离子交换、蒸发结晶器、蒸发器和蒸馏装置的各种构造可用于纯化目标化合物，包括1,4-BDO。一种示例性构造包括，如图16的流程图所示，例如圆盘堆叠式离心、超滤、蒸发结晶、离子交换和蒸馏。因此，在一些实施例中，本发明提供从发酵液分离1,4-BDO的方法，其包括：通过圆盘堆叠式离心去除一部分固体以取得液体部分，通过超滤从该液体部分去除另一部分固体，通过蒸发结晶从该液体部分去除一部分盐，通过离子交换从该液体部分去除另一部分盐，以及蒸馏1,4-BDO。
如图16中所示，首先通过圆盘堆叠式离心去除细胞和固体。该细胞可任选地循环返回至发酵中。超滤法去除细胞碎片、DNA和沉淀的蛋白质。蒸发结晶去除一部分培养基盐和水，其任何一种都可任选地循环返回至发酵中。蒸发结晶后，使剩余液相通过离子交换柱以去除其它盐。如上所述，离子交换后可在蒸发器系统中蒸发一部分水。蒸馏轻馏分，随后蒸馏1,4-BDO以提供基本上纯的1,4-BDO。
另一示例性构造包括圆盘堆叠式离心、超滤、纳滤、离子交换、蒸发和蒸馏，如图17中所示。因此，在一些实施方式中，本发明提供从发酵液分离1,4-BDO的方法，其包括：通过圆盘堆叠式离心去除一部分固体以取得液体部分，通过超滤从该液体部分去除另一部分固体，通过纳滤从该液体部分去除一部分盐，通过离子交换从该液体部分去除另一部分盐，蒸发一部分水，和蒸馏1,4-BDO。
如图17中所示，首先通过圆盘堆叠式离心去除细胞和固体。该细胞可任选地循环返回至发酵中。超滤法去除细胞碎片、DNA和沉淀的蛋白质。纳滤去除一部分培养基盐，培养基盐可任选地循环返回至发酵中。纳滤后，使渗透液通过离子交换柱以去除其它盐。如上所述，离子交换后可在蒸发器系统中蒸发一部分水。蒸馏轻馏分，随后蒸馏1,4-BDO以提供基本上纯的1,4-BDO。
目标化合物可以是能够在微生物中经生物合成制造的产物的任何化合物。本发明所公开的方法可用于沸点高于水的目标化合物。具体地，目标化合物的沸点可介于大约120℃与400℃之间。其它性质包括高水溶性或高水混溶性和不能使盐明显溶解(在使用蒸发结晶时)、和分子量低于大约100-150道尔顿(适用于纳滤)的中性化合物。
本发明描述的方法和原理可用于从发酵液分离目标化合物，其中目标化合物具有上述的一般性质。这一方法包括从包含细胞团块的固体部分分离富含目标化合物的液体部分，随后去除水和盐，然后纯化。
在一些实施方式中，本发明也提供循环发酵液成分的方法。发酵液可包含1,4-BDO或沸点高于水的任何目标化合物、能够产生1,4-BDO或目标化合物的细胞、培养基盐和水。该方法包括从包含细胞的固体部分分离富含1,4-BDO或目标化合物的液体部分。然后使该细胞循环至发酵液中。水可在从液体部分分离盐之前或之后去除。使来自液体部分的蒸发水循环至发酵液中。可通过从液体部分除水使盐结晶，或者通过纳滤和/或离子交换，去除来自液体部分的盐并循环至发酵液中。然后使从纳滤分离的盐循环至发酵液中。该方法提供1,4-BDO或其它目标化合物，其可进一步通过例如蒸馏纯化。
在一些实施方式中，产生目标化合物例如1,4-BDO的方法包括在发酵罐中培养产生化合物的微生物足够时间以产生目标化合物。该生物包含具有化合物途径的微生物，该化合物途径包含一个或多个编码化合物途径酶的外源基因和/或一个或多个基因破坏。生产化合物的方法也包括通过一种包括以下步骤的方法分离化合物：从包含细胞的固体部分分离富含目标化合物的液体部分，从该液体部分除水，从该液体部分去除盐，和纯化目标化合物。该目标化合物具有高于水的沸点。
在一具体实施方式中，生产1,4-BDO的方法包括在发酵罐中培养产生1,4-BDO的微生物足够时间以生产1,4-BDO。该生物包含具有1,4-BDO途径的微生物，该1,4-BDO途径包含一个或多个编码化合物途径酶的外源基因和/或一个或多个基因破坏。生产1,4-BDO的方法也包括通过包括以下步骤的方法分离化合物：从包含细胞的固体部分分离富含目标化合物的液体部分，从该液体部分除水，从该液体部分去除盐，和纯化目标化合物。
在目标产物是1,4-BDO的具体实施方式中，从培养能够通过一组1,4-BDO途径酶产生1,4-BDO的微生物有机体开始生产。示例性的微生物有机体包括,不限于在U.S.2009/0075351和U.S.2009/0047719描述中的微生物，它们的全文引用作为参考。
可提供整合一种或多种编码1,4-BDO途径酶的外源核酸的有机体。该有机体包括，例如被改造成具有完整的1,4-BDO生物合成途径的非天然存在的微生物有机体。该途径可包含由内源和外源核酸编码的酶。微生物宿主中通常不存在的酶可通过(例如)包含一个或多个外源核酸来增加功能性以使途径完整。一种这样的1,4-BDO途径包括编码以下的酶：4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶。
另一途径可包含一种或多种编码以下的外源核酸：4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰基-CoA水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰基-CoA氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酰基-CoA转胺酶、或4-羟基丁酰基-CoA脱氢酶。这一途径可进一步包含4-羟基丁酰基-CoA还原酶(醇形)、4-羟基丁酰基-CoA还原酶、或1,4-丁二醇脱氢酶。
又一途径可包含一种或多种编码以下的外源核酸：4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰基-CoA水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰基-CoA还原酶(醇形)、4-氨基丁酰基-CoA还原酶、4-氨基-1-丁醇脱氢酶、4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)或4-氨基-1-丁醇转胺酶。这一途径可进一步包含1,4-丁二醇脱氢酶。
另一途径可包含一种或多种编码以下的外源核酸：4-氨基丁酸激酶、4-氨基丁醛脱氢酶(磷酸化)、4-氨基-1-丁醇脱氢酶、4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基-1-丁醇转胺酶、[(4-氨基丁酰基)氧基]膦酸氧化还原酶(脱氨基)、[(4-氨基丁酰基)氧基]膦酸转胺酶、4-羟基丁酰基-磷酸脱氢酶、或4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)。这一途径可进一步包含1,4-丁二醇脱氢酶。
另一途径可包含一种或多种编码以下的外源核酸：α-酮戊二酸5-激酶、2,5-二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)、2,5-二氧代戊酸还原酶、α-酮戊二酸CoA转移酶、α-酮戊二酰基-CoA水解酶、α-酮戊二酰基-CoA连接酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶(醇形)、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶、或5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。这一途径可进一步包含4-羟基丁酰基-CoA还原酶(醇形)、4-羟基丁酰基还原酶、或1,4-丁二醇脱氢酶。
另一途径可包含一种或多种编码以下的外源核酸：谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-CoA水解酶、谷氨酰基-CoA连接酶、谷氨酸5-激酶、谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)、谷氨酰基-CoA还原酶、谷氨酸-5-半醛还原酶、谷氨酰基-CoA还原酶(醇形)、2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)、2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶、或5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。这一途径可进一步包含4-羟基丁酰基-CoA还原酶(醇形)、4-羟基丁酰基-CoA还原酶、或1,4-丁二醇脱氢酶。
另一途径可包含一种或多种编码以下的外源核酸：3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰基-CoA脱水酶、乙烯基乙酰基-CoAΔ-异构酶、或4-羟基丁酰基-CoA脱水酶。这一途径可进一步包含4-羟基丁酰基-CoA还原酶(醇形)、4-羟基丁酰基-CoA还原酶、或1,4-丁二醇脱氢酶。
另一途径可包含一种或多种编码以下的外源核酸：高丝氨酸脱氨酶、高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶、高丝氨酸-CoA连接酶、高丝氨酸-CoA脱氨酶、4-羟基-2-丁烯酰基-CoA转移酶、4-羟基-2-丁烯酰基-CoA水解酶、4-羟基-2-丁烯酰基-CoA连接酶、4-羟基-2-丁烯酸还原酶、4-羟基丁酰基-CoA转移酶、4-羟基丁酰基CoA水解酶、4-羟基丁酰基-CoA连接酶、或4-羟基-2-丁烯酰基-CoA还原酶。这一途径可进一步包含4-羟基丁酰基-CoA还原酶(醇形)、4-羟基丁酰基-CoA还原酶、或1,4-丁二醇脱氢酶。
另一途径可包含一种或多种编码以下的外源核酸：琥珀酰-CoA还原酶(醇形)、4-羟基丁酰基-CoA水解酶、4-羟基丁酰基-CoA连接酶、或4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)。这一途径可进一步包含琥珀酰-CoA还原酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰基-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸-4-羟基丁酰转移酶、4-羟基丁酰基-CoA还原酶、4-羟基丁酰基-CoA还原酶(醇形)、或1,4-丁二醇脱氢酶。
另一途径可包含一种或多种编码以下的外源核酸：谷氨酸脱氢酶、4-氨基丁酸氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酸转氨酶、谷氨酸脱羧酶、4-羟基丁酰基-CoA水解酶、4-羟基丁酰基-CoA连接酶、或4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)。这一途径可进一步包含α-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰基-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸-4-羟基丁酰转移酶、4-羟基丁酰基-CoA还原酶、4-羟基丁酰基-CoA还原酶(醇形)、或1,4-丁二醇脱氢酶。
除基因插入外或代替基因插入，有机体可包括基因破坏以引导碳通量向合成1,4-BDO的方向进行。这种有机体包括例如具有一组代谢修饰的非天然存在的微生物，该代谢修饰使1,4-丁二醇的产生与生长偶联。在一些实施方式中，1,4-丁二醇产生不与生长偶联。该代谢修饰组可包括一个或多个基因破坏、或其直系同源基因。在一些实施方式中破坏可包括完全的基因缺失。破坏也可包括通过除去启动子序列等进行修饰。对于1,4-BDO的生产来说，一组代谢修饰可包括例如adhE和ldhA的破坏。其它破坏可包括基因mdh。其它破坏可包括一种或多种选自包括mqo、aspA、sfcA、maeB、pntAB和gdhA的基因组的基因。其它破坏可包括一种或多种选自包括pykA、pykF、dhaKLM、deoC、edd、yiaE、ycdW、prpC和gsk的基因组的基因。其它破坏可包括pflAB的破坏。示例性的一组破坏可包括一种或多种选自包括adhE、ldhA、pflAB、mdh和aspA的基因组的基因，包括基因adhE、ldhA、pflAB、mdh和aspA中每一种的破坏。
其它示例性的组破坏包括adher、nadh6；adher、ppck；adher、sucd4；adher、atps4r；adher、fum；adher、mdh；adher、pfli、ppck；adher、pfli、sucd4；adher、ackr、nadh6；adher、nadh6、pfli；adher、aspt、mdh；adher、nadh6、ppck；adher、ppck、thd2；adher、atps4r、ppck；adher、mdh、thd2；adher、fum、pfli；adher、ppck、sucd4；adher、glcpts、ppck；adher、gludy、mdh；adher、gludy、ppck；adher、fum、ppck；adher、mdh、ppck；adher、fum、gludy；adher、fum、hex1；adher、hex1、pfli；adher、hex1、thd2；adher、frd2、ldh_d、mdh；adher、frd2、ldh_d、me2；adher、mdh、pgl、thd2；adher、g6pdhy、mdh、thd2；adher、pfli、ppck、thd2；adher、ackr、akgd、atps4r；adher、glcpts、pfli、ppck；adher、ackr、atps4r、sucoas；adher、gludy、pfli、ppck；adher、me2、pfli、sucd4；adher、gludy、pfli、sucd4；adher、atps4r、ldh_d、sucd4；adher、fum、hex1、pfli；adher、mdh、nadh6、thd2；adher、atps4r、mdh、nadh6；adher、atps4r、fum、nadh6；adher、aspt、mdh、nadh6；adher、aspt、mdh、thd2；adher、atps4r、glcpts、sucd4；adher、atps4r、gludy、mdh；adher、atps4r、mdh、ppck；adher、atps4r、fum、ppck；adher、aspt、glcpts、mdh；adher、aspt、gludy、mdh；adher、me2、sucd4、thd2；adher、fum、ppck、thd2；adher、mdh、ppck、thd2；adher、gludy、mdh、thd2；adher、hex1、pfli、thd2；adher、atps4r、g6pdhy、mdh；adher、atps4r、mdh、pgl；adher、ackr、frd2、ldh_d；adher、ackr、ldh_d、sucd4；adher、atps4r、fum、gludy；adher、atps4r、fum、hex1；adher、atps4r、mdh、thd2；adher、atps4r、frd2、ldh_d；adher、atps4r、mdh、pgdh；adher、glcpts、ppck、thd2；adher、gludy、ppck、thd2；adher、fum、hex1、thd2；adher、atps4r、me2、thd2；adher、fum、me2、thd2；adher、glcpts、gludy、ppck；adher、me2、pgl、thd2；adher、g6pdhy、me2、thd2；adher、atps4r、frd2、ldh_d、me2；adher、atps4r、frd2、ldh_d、mdh；adher、aspt、ldh_d、mdh、pfli；adher、atps4r、glcpts、nadh6、pfli；adher、atps4r、mdh、nadh6、pgl；adher、atps4r、g6pdhy、mdh、nadh6；adher、ackr、fum、gludy、ldh_d；adher、ackr、gludy、ldh_d、sucd4；adher、atps4r、g6pdhy、mdh、thd2；adher、atps4r、mdh、pgl、thd2；adher、aspt、g6pdhy、mdh、pyk；adher、aspt、mdh、pgl、pyk；adher、aspt、ldh_d、mdh、sucoas；adher、aspt、fum、ldh_d、mdh；adher、aspt、ldh_d、mals、mdh；adher、aspt、icl、ldh_d、mdh；adher、frd2、gludy、ldh_d、ppck；adher、frd2、ldh_d、ppck、thd2；adher、ackr、atps4r、ldh_d、sucd4；adher、ackr、acs、ppc、ppck；adher、gludy、ldh_d、ppc、ppck；adher、ldh_d、ppc、ppck、thd2；adher、aspt、atps4r、glcpts、mdh；adher、g6pdhy、mdh、nadh6、thd2；adher、mdh、nadh6、pgl、thd2；adher、atps4r、g6pdhy、glcpts、mdh；adher、atps4r、glcpts、mdh、pgl；和adher、ackr、ldh_d、mdh、sucd4。前述的基因与这些基因所催化的反应一起以敲除候选者包括在下表1a中。
表1a.E.coli.中基因敲除候选者
表1a中代谢产物的缩写显示在下表1b中。
表1b.对应于表1a中所用的缩写的代谢产物名称
代谢产物的缩写 代谢产物的名称
10fthf 10-甲酰四氢叶酸酯
1pyr5c 1-吡咯烷-5-甲酸酯
2ddg6p 2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸-6-磷酸酯
2dmmq8 2-去甲基甲基萘醌8
2dmmql8 2-去甲基甲基萘醇8
2pg D-甘油酸2-磷酸
3pg 3-磷酸-D-甘油酯
6pgc 6-磷酸-D-葡萄糖酯
6pgl 6-磷酸-D-葡萄糖酸-1,5-内酯
ac 醋酸酯
acald 乙醛
accoa 乙酰-CoA
actp 乙酰磷酸酯
adp ADP
akg 2-酮戊二酸
amp AMP
asn-L L-天冬酰胺
asp-L L-天冬氨酸盐
atp ATP
cbp 氨甲酰磷酸酯
co2 CO2
coa 辅酶A
dhap 二羟丙酮磷酸酯
e4p D-赤藓糖4-磷酸酯
etoh 乙醇
f6p D-果糖6-磷酸酯
fad 氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸
fadh2 还原型黄素腺嘌呤二核苷酸
fdp D-果糖-1,6-二磷酸酯
for 甲酸酯
fum 延胡索酸盐
g3p 甘油醛-3-磷酸酯
g6p D-葡萄糖-6-磷酸酯
glc-D D-葡萄糖
glu5p L-谷氨酸-5-磷酸酯
glu5sa L-谷氨酸-5-半醛
glu-L L-谷氨酸酯
glx 乙醛酸
gly 甘氨酸
h H+
h2o H2O
icit 异柠檬酸
lac-D D-乳酸
mal-L L-苹果酸
methf 5,10-次甲基四氢叶酸
mlthf 5,10-亚甲基四氢叶酸
mql8 甲基萘醇8
mqn8 甲基萘醌8
nad 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
nadh 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
nadp 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯
nadph 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯
nh4 铵
oaa 草酰乙酸
pep 磷酸烯醇丙酮酸
pi 磷酸酯
ppi 二磷酸酯
pro-L L-脯氨酸
pyr 丙酮酸
q8 泛醌-8
q8h2 泛醇-8
ru5p-D D-核酮糖-5-磷酸酯
s7p 景天庚酮糖-7-磷酸酯
so4 硫酸盐
succ 琥珀酸酯
succoa 琥珀酰-CoA
thf 5,6,7,8-四氢叶酸
xu5p-D D-木酮糖-5-磷酸酯
整合上述基因破坏的任意组合的任何非天然存在的微生物也可包含至少一种外源核酸的基因插入。任何上述的基因插入途径可与基因破坏整合。例如，包括基因adhE、ldhA、pflAB、mdh和aspA破坏的途径也可包括插入4-羟基丁酸脱氢酶、CoA非依赖性琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、谷氨酸:琥珀半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶、CoA-非依赖性醛脱氢酶、CoA-依赖性醛脱氢酶或醇脱氢酶。下表2概括了经改造的用于生产1,4-BDO的示例性有机体，其整合了基因破坏与因插入的组合。注意到基因插入可以染色体插入或提供质粒的形式。
表2.用于产生1，4-BDO的破坏-插入组合设计
*δ标记(Δ)表示基因缺失
表2中概括的菌株如下：菌株1：E.coliMG1655的单缺失衍生物，其中缺失内源性基因ldhA；质粒表达E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd、P.gingivalisCat2、C.acetobutylicumAdhE2。菌株2：宿主菌株AB3，产生琥珀酸酯的菌株，E.coliMG1655的衍生物，其中缺失内源性adhEldhApflB，质粒表达E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd、P.gingivalisCat2、C.acetobutylicumAdhE2。
菌株3：宿主菌株ECKh-138，其中缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源性lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA；质粒表达E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd、P.gingivalisCat2、C.acetobutylicumAdhE2；菌株提供lpdA的改进以增加丙酮酸脱氢酶通量。菌株4：宿主菌株ECKh-138，缺失内源性adhE、ldhA、pflB和lpdA，并且染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA；质粒表达E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd、C.acetobutylicumbuk1、C.acetobutylicumptb、C.acetobutylicumAdhE2。
菌株5：宿主菌株ECKh-401，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源性lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA；质粒表达E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd、P.gingivalisCat2、C.acetobutylicumAdhE2；菌株缺失mdh和arcA以引导通量通过氧化性TCA循环。菌株6：宿主菌株ECKh-401，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源mdh和arcA；质粒表达M.bovissucA、E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd、P.gingivalisCat2、C.acetobutylicumAdhE2。
菌株7：宿主菌株ECKh-422，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换；质粒表达E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd、P.gingivalisCat2、C.acetobutylicumAdhE2；菌株在柠檬酸盐合成酶中具有突变以改良厌氧活性。菌株8：菌株ECKh-422，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换；质粒表达M.bovissucA、E.colisucCD、P.gingivalissucCD、P.gingivalis4hbd、P.gingivalisCat2、C.acetobutylicumAdhE2。菌株9：宿主菌株ECKh-422，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换；质粒表达M.bovissucA、E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd、P.gingivalisCat2、C.beijerinckiiAld。
菌株10：宿主菌株ECKh-426，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换。在fimD基因座处染色体插入E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd；质粒表达P.gingivalisCat2、C.beijerinckiiAld；菌株在fimD基因座处具有整合至菌株ECKh-422中的上游途径的琥珀酸酯分支。菌株11：宿主菌株ECKh-432，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换，在fimD基因座处染色体插入E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbd；质粒表达P.gingivalisCat2、C.beijerinckiiAld；菌株具有整合至ECKh-422中的琥珀酸酯和α-酮戊二酸上游途径分支。菌株12：宿主菌株ECKh-432，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换。在fimD基因座处染色体插入E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbd；质粒表达C.acetobutylicumbuk1、C.acetobutylicumptb、C.beijerinckiiAld。
菌株13：宿主菌株ECKh-439，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换，缺失内源性ackA，在fimD基因座处染色体插入E.colisucD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbd；质粒表达P.gingivalisCat2、C.beijerinckiiAld；菌株在ECKh-432菌株中具有醋酸酯激酶缺失。菌株14：宿主菌株ECKh-453，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换，缺失内源性ackA，缺失内源性ppc并且在ppc基因座处插入Haemophilusinfluenzappck，在fimD基因座处染色体插入E.colisucCD、P.gingivalissucCD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbd；质粒表达P.gingivalisCat2、C.beijerinckiiAld；菌株具有醋酸酯激酶缺失和在ECKh-432菌株中进行PPC/PEPCK替换。
菌株15：宿主菌株ECKh-456，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换，在fimD基因座处染色体插入E.colisucD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbd，使用fnr结合位点、pflB-p6启动子和pflB的RBS替换lpdA启动子；质粒表达P.gingivalisCat2、C.beijerinckiiAld；菌株使用菌株ECKh-432中的厌氧启动子替换lpdA启动子。菌株16：宿主菌株ECKh-455，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换，在fimD基因座处染色体插入E.colisucD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbdI，使用fnr结合位点、pflB-p6启动子和pflB的RBS替换pdhR和aceEF启动子；质粒表达P.gingivalisCat2、C.beijerinckiiAld；菌株使用菌株ECKh-432中的厌氧启动子替换pdhR和aceEF启动子。
菌株17：宿主菌株ECKh-459，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换。在fimD基因座处染色体插入E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbd；在fimD基因座处染色体插入C.acetobutylicumbuk1、C.acetobutylicumptb；质粒表达C.beijerinckiiAld；菌株已将BK/PTB整合进菌株ECKh-432中。菌株18：宿主菌株ECKh-459，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换，在fimD基因座处染色体插入E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbd；在fimD基因座处染色体插入C.acetobutylicumbuk1、C.acetobutylicumptb；质粒表达C.beijerinckiiAld、G.thermoglucosidasiusadh1。
菌株19：宿主菌株ECKh-463，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换。在fimD基因座处染色体插入E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbd；在rrnC基因座处插入非PTS蔗糖操纵子基因蔗糖通透酶(cscB)、D-果糖激酶(cscK)、蔗糖水解酶(cscA)、和LacI-相关性蔗糖特异性抑制子(cscR)；质粒表达P.gingivalisCat2、C.beijerinckiiAld。菌株具有插入菌株ECKh-432中的非PTS蔗糖基因。
菌株20：宿主菌株ECKh-463，缺失内源性adhE、ldhA、pflB，缺失内源lpdA并且在lpdA基因座处染色体插入具有Glu354Lys突变的KlebsiellapneumoniaelpdA，缺失内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体对gltA进行染色体替换。在fimD基因座处染色体插入E.colisucCD、P.gingivalissucD、P.gingivalis4hbd，在fimD基因座处染色体插入M.bovissucA、C.kluyveri4hbd；在rrnC基因座处插入非PTS蔗糖操纵子；质粒表达C.acetobutylicumbuk1、C.acetobutylicumptb、C.beijerinckiiAld。
经改造的菌株通过磷酸转移酶(PTS)系统利用蔗糖产生大量丙酮酸酯副产物。因此，使用非PTS蔗糖系统可用来降低丙酮酸酯的形成，因为引入蔗糖不会伴随将磷酸稀醇丙酮酸(PEP)转化成丙酮酸酯。这将增加PEP池和通过PPC或PEPCK的草酰乙酸通量。
可将非PTS蔗糖操纵子插入至rrnC区域中。为了产生PCR产物，其包含非PTS蔗糖基因被同源区域与rrnC区域所包夹，两个寡核苷酸用来PCR扩增来自MachlTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)的csc基因。此菌株是W菌株的派生物，该菌株是已知能够使蔗糖分解代谢的E.coli菌株(Orencio-Trejoetal.,BiotechnologyBiofuels1:8(2008))。序列衍生自E.coliW菌株KO11(保藏号AY314757)(Shuklaetal.,Biotechnol.Lett.26:689-693(2004))，并且包括编码蔗糖通透酶(cscB)、D-果糖激酶(cscK)、蔗糖水解酶(cscA)、和LacI相关性蔗糖特异性抑制子(cscR)的基因。cscR的前53个氨基酸通过引物的配置来有效除去。纯化后，PCR产物电穿孔导入MG1655电感受态细胞，其已经用pRedET(tet)转化并且根据制造商说明书制备(www.genebridges.com/gb/pdf/K001％20Q％20E％20BAC％20Modification％20Kit-version2.6-2007-screen.pdf)。设计PCR产物以使其基因组整合至染色体的rrnC区域中。其有效地缺失rrlC(23SrRNA)上游的191个核苷酸、所有rrlCrRNA基因和rrlC下游的3个核苷酸，并用蔗糖操纵子将其替换。通过P1转导将整个rrnC::crcAKB区域转移至BDO宿主菌株ECKh-432中(Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual，第三版，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001))，从而得到ECKh-463(ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::K.p.lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163LfimD::E.colisucCD，P.gingivalissucD，P.gingivalis4hbdfimD::M.bovissucA，C.kluyveri4hbdrrnC::cscAKB)。重组体通过在蔗糖上生长来选择，并通过诊断型PCR来证实。
在培养产生-化合物或产生-1,4-BDO的有机体之前，原料供料如蔗糖糖浆和培养基成分在加入生产生物反应器中之前可通过例如加热灭菌来处理，以除去任何生物污染物。根据一些实施方式，原料可包括例如用于发酵BDO的蔗糖或葡萄糖。在一些实施方式中，原料可包括合成气。用于支持微生物生长的其它培养基成分包括例如盐、氮源、缓冲液、痕量金属和用于控制pH的盐基。示例性培养基包的主要成分，以g/L发酵液表示，显示在下表3中。
表3
碳源类型可有很大变化，并且可包括葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、淀粉、菊糖、甘油、植物油(例如大豆油)、烃、醇(例如甲醇和乙醇)、有机酸(例如醋酸)、合成气、以及CO、CO2、H2的类似组合。术语“葡萄糖”包括葡萄糖糖浆，即包括葡萄糖寡聚物的葡萄糖组合物。植物和植物来源的生物质可以是低成本原料来源。这些原料可包括例如玉米、大豆、棉花、亚麻子、油菜籽、甘蔗和棕榈油。生物质可经酶或化学物质介导的水解释放基质，其进一步通过生物催化处理以产生目标化学产物。这些基质包括碳水化合物、以及芳族化合物和其它产物的混合物，其共同源自生物质的纤维素、半纤维、和木素部分。从生物质产生的碳水化合物是富含的5和6碳糖的混合物，包括例如蔗糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和果糖。
碳源可以固体、液体或气体的形式加到培养物中。碳源可以可控的方式添加，以避免因过量加料而对细胞产生应力。在这一点上，如下文进一步所述，分批加料和连续培养是有用的培养模式。
氮源的类型可有很大变化，并且可包括尿素、氢氧化铵、铵盐(例如硫酸铵、磷酸铵、氯化铵和硝酸铵)、其它硝酸盐、氨基酸(例如谷氨酸和赖氨酸)、酵母萃取物、酵母自溶产物、酵母含氮碱、蛋白质水解物(包括但不限于蛋白胨、酪蛋白水解物例如胰蛋白胨和酪蛋白氨基酸)、大豆粕、Hy-Soy、胰蛋白酶大豆肉汤、棉籽粕、麦芽浸膏、玉米浆和糖蜜。
培养物的pH可通过添加酸或碱来控制。因为pH在培养期间可能下降，所以如果需要可添加碱。合适的碱的例子包括NaOH和NH4OH。
用于生产目标化合物(例如1,4-BDO)的示例性细胞生长程序包括分批发酵、使用分批分离的分批加料发酵、使用连续分离的分批加料发酵以及使用连续分离的连续发酵。所有这些方法在本领域中均已众所周知。有赖于有机体的设计，发酵可在需氧或厌氧条件下实施。在一些实施方式中，培养温度保持在大约30和大约45℃之间，包括31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、和44℃。
在分批发酵中，发酵罐(或生物反应器)填充了已制备的培养基用以支持生长。适当地调节微生物发酵的温度和pH，并且添加任何额外补充物。将产生1,4-BDO的有机体的接种物添加至发酵罐中。在分批发酵中，发酵通常进行一段固定的时间和然后从发酵中分离产物。此过程可分批重复进行。
在分批加料发酵中，向发酵生物反应器连续或定期添加新鲜培养基。固定体积的分批加料发酵是分批加料发酵的其中一类，其供给碳源是不会稀释培养物。也可通过以浓缩液或气体形式供给生长碳源来维持培养物体积接近恒定。另一类体积固定的分批加料培养中，有时称为循环分批加料培养，定期取出一部分培养物并用作另一分批加料过程的起点。一旦发酵达到某一阶段，除去培养物并用无菌水或包括碳供料基质的培养基将生物质稀释至初始体积。稀释降低了生物质的浓度并且导致具体生长速率的增加。随后，随着供料继续，生长速率将随着生物质增加而逐渐降低，当再次达到容器中可承受的最大值时，可再次稀释培养物。可替代地，分批加料发酵可以是可变体积的。在体积可变的模式中，随着向培养物中连续添加营养物和培养基而并不除去一部分发酵液，发酵液的体积随发酵时间变化。
在连续发酵中，当分泌产物时，通常随着连续分离所消耗的培养基(其中可包括目标产物，例如1,4-BDO)而连续添加新鲜培养基。连续培养的一个特征是可获得时间独立性稳态，其能够确定微生物行为与环境条件之间的关系。此稳态通过借助于恒化器或类似的生物反应来完成。恒化器允许连续添加新鲜培养基同时连续除去培养液，以保持培养物体积恒定。通过改变向恒化器添加培养基的速率，可控制微生物的生长速率。
目标化合物(例如1,4-BDO)的连续和/或近连续生产可包括：在充足的营养物和培养基中培养产生化合物的有机体以维持和/或接近维持在指数期生长。在这种条件下的连续培养可包括例如1天、2、3、4、5、6或7天或更长。此外，连续培养可包括1周、2、3、4或5周或更多周和多达数月。可替代地，如果适用于具体的应用，可将产生目标化合物的有机体培养数小时。应理解，连续和/或近连续培养条件也可包括在这些示例性时间之间的所有时间间隔。应进一步理解，产生化合物的微生物有机体的培养时间是足够长的时间來产生預期目的足够量的产物。
在一些实施方式中，培养可在需氧条件下实施。可以控制向培养物供氧。氧可以空气、富含氧、纯氧或其任意组合的形式供应。监测氧浓度的方法是本领域中已经熟知的。氧可以某一供料速率递送，或者可根据需要来递送，通过测量培养物中溶解的含氧量并相应地出于维持溶解的含氧量恒定而供料。在其它实施方式中，培养可在基本上厌氧条件下实施。厌氧基本上是指含氧量小于液体培养基中所溶解氧的饱和量的大约1％。厌氧条件包括使液体或固体培养基维持在具有小于大约1％氧的大气的密闭室中。
发酵可在厌氧条件下实施。例如，可通过以下方式使培养物基本上无氧：首先用氮吹扫培养基并且然后密封培养物容器(例如烧瓶可使用隔膜和卷曲盖密封)。也可通过提供有限量曝气的小孔来制造微氧条件。在商业规模中，通过如需氧的情况那样使用空气或氧吹扫发酵罐，但以非常低的速率并且严格控制搅拌来获得微氧条件。
在一些实施方式中，目标化合物(包括1,4-BDO)可使用遗传修饰的E.coli在厌氧分批发酵中生产。在发酵中，将一部分原料基质用于细胞生长并且将另一部分基质转化成其它发酵副产物。培养基成分(例如盐、缓冲液、氮等)可以过量加入发酵液中以支持细胞生长。因此，发酵液是水、目标化合物、副产物、残余培养基、残余基质、和原料/培养基杂质的复杂混合物。从这种发酵液中分离和纯化目标化合物。示例性的发酵液组成显示于下表4中。
表4*
用量 成分
～100g/L 1,4-BDO
～5g/L 细胞团块
～10g/L 副产物(乙醇、醋酸、4-羟基丁酸、GBL、蛋白质)
＜10g/L 残余培养基/盐
＜1g/L 残余蔗糖/葡萄糖
＜2g/L “未发酵物”(原料/杂质)
*平衡水
可通过基于生物合成生产过程的发酵已达到以1,4-BDO重量计大约5-15％的产物浓度。
应理解，基本上不影响本发明各实施例的作用的修改也包括在本发明所提供的本发明定义内。因此，以下实施例意在阐述，但不以限制本发明。
实施例1
发酵液的离心
此实施例显示使用圆盘堆叠式离心机从发酵液去除细胞团块及其它固体。
由遗传修饰的E.coli产生的1,4-丁二醇发酵液通过离心澄清。GEA-Westfalia圆盘堆叠式离心机用于此步骤。实验室规模的CTC1Whispefuge型离心机具有1.0升的转筒容量和0.55升的固体容纳空间。转筒罩、分配器、圆盘堆叠和所有过程湿件都使用高拉伸强度的不锈钢来构造。向离心机单元的供料使用蠕动泵来控制，并且流速保持恒定在大约0.25升/分钟。通过使用调节阀对出口离心分离液流进行节流，来将维持系统中大约15psi的反压。使离心机在12,000rpm下运行并在室温环境下供料。离心可从发酵液去除细胞生物质和不溶性物质。细胞生物质和不溶性物质的浓度用浊度来表示，浊度通过在600nm的光密度(OD)测定。供料发酵液和澄清的离心分离液的浊度数据显示在表5中。供料明显浑浊并且所测量的OD为13.3。澄清的离心分离液明显比较澄清并且所测量的OD为0.18。总体来说，浊度降低大约99％，表明通过圆盘堆叠式离心机可获得优异的澄清效果。
表5.通过600nm下的光学密度(OD)测量的浊度
实施例II
发酵液的超滤
此实施例显示在实施例I中实施的通过离心除去细胞团块及其他固体后发酵液的超滤。
使用GEA实验室规模的L型过滤单元来进一步澄清实施例1中所产生的产物。L型过滤单元配置有Hydranutics5KPES平板膜。总的安装膜面积为0.144m2。通过调节入口流和反压调节阀将透膜压力维持于大约36psi。使用入口热交换器将供料温度维持于大约27℃。测量整个实验过程的渗透液流速以确定通量。表6显示了作为体积浓度因子(VCF)的函数以升/m2表示的渗透液通量。
表6.超滤通量对VCF
在实验中还抽取样本以确定渗透液质量。使用Bradford测定來测量供料和渗透液中蛋白质浓度。表7显示供料、渗透液和保留物中的蛋白质浓度。与供料相比，渗透液中的蛋白质浓度降低大约68％。
表7.使用Bradford测定來测量的蛋白质浓度
实施例III
发酵液的纳滤
此实施例显示在实施例II中实施的超滤后发酵液的纳滤。
L型GEA实验室规模的过滤单元配置有GEDK的纳滤平板膜。总的安装膜面积为0.072m2。使用此设置来过滤从实施例2获得的UF渗透液。通过调节入口流和反压调节阀将透膜压力维持于大约270psi。使用入口热交换器将供料温度维持在38℃。测量整个实验过程中的渗透液流量以确定通量。表8显示作为体积浓度因子(VCF)函数的以升/m2/h表示的通量。
表8.纳滤通量
在实验中还抽取样本以确定渗透液质量。使用LC-MS來测量有机酸，使用离子色谱(IC)來分析盐离子，和使用AnaloxG6分析仪來测量葡萄糖。表9显示葡萄糖、离子、和有机酸的截留百分比。在供料的pH下有机酸预计以其盐形式存在。纳滤渗透液也具有明显的颜色减弱，从深黄色的供料变变成极淡黄色的渗透液产物。
表9.通过纳滤获得的葡萄糖、离子和有机酸的截留百分比
葡萄糖 单价阳离子 二价阳离子 阴离子 有机酸
88.57％ 72.80％ 100.00％ 82.45％ 64.39％
实施例IV
发酵液的离子交换
此实施例显示在实施例III中实施的纳滤后发酵液的离子交换色谱纯化。
从实施例III获得的纳滤渗透液通过离子交换步骤处理以去除剩余离子并进一步澄清产物。此步骤使用了强酸型阳离子交换树脂AmberliteIR120H和弱碱型阴离子交换树脂AmberliteIRA67。各阳离子和阴离子交换柱(2ft高×1英寸直径)分别装填5.3×10-3ft3的阳离子和阴离子交换树脂。在10mL/min和40℃下，首先将纳滤渗透液供给至阳离子交换柱，和然后供给至阴离子交换柱。离子交换通过IC分析离子含量。所有剩余离子都去除到小于0.1mEq/L的浓度。所有剩余有机酸也都在此步骤中去除。产物非常澄清并且没有明显的黄色。
实施例V
合成供料的蒸发结晶
此实施例显示借助旋转蒸发器通过蒸发结晶以实验室规模去除来自合成供料的盐。
蒸发采用BuchiRotavapR-205在50℃的温浴和～100mmHg的真空下进行。合成供料物质使用包括大约92mEq/L单价阳离子、5mEq/L二价阳离子和125mEq/L阴离子的大约8％BDO水溶液来制备。从此混合物中蒸发掉水同时盐离子可从溶液中沉淀。提取小等份样本通过离子色谱分析来监测整个蒸发过程中溶液中的离子浓度。在分析前滤出沉淀的固体。表10显示了随着将BDO浓缩至大约10至95％时溶液中的离子浓度(供料样本标准化至100％)。溶液中的离子浓度增加至饱和点(大约30％BDO)。此后进一步蒸发将迫使盐结晶(沉淀)。总体来说，此蒸发结晶步骤使97.5％的盐离子从BDO溶液中沉淀。
表10.合成发酵液的蒸发沉淀
时间，h BDO wt％ ％单价阳离子 ％双价阳离子 ％阴离子
0 10.00 100.00 100.00 100.00
0.25 15.74 159.75 132.32 161.25
0.5 33.79 344.61 159.73 353.02
0.75 81.32 35.49 0.00 47.24
1.5 94.25 22.43 0.00 20.17
实施例VI
盐的溶解度
此实施例显示盐在各种小碳链二醇(包括1,4-BDO)中的溶解度曲线。
测量盐在包括不同量的1,4-丁二醇(BDO)、1,3-丙二醇(PDO)或1,2-乙二醇(单乙二醇，MEG)的不同溶液中的溶解度。将盐加入到10mL溶液中直至溶液饱和。使用离子色谱测量饱和盐的溶解度。表11显示四种不同盐在室温下(大约20℃)的盐溶解度。盐的溶解度随BDO浓度增加而显著降低，表明用蒸发结晶除去盐的可行性。表12显示盐在室温下在三种不同盐的不同浓度的1,4-BDO、PDO或MEG溶液中的溶解度。结果显示，盐溶解度从MEG至PDO至1,4-BDO逐渐降低，证实了1,4-BDO在三种化合物中最适合用于蒸发结晶。
表11.四种不同盐在包括0-100％1,4-丁二醇(1,4-BDO)的溶液中的溶解度
表12.三种不同盐在50、80或100％的1,4-丁二醇(BDO)、1,3-丙二醇(PDO)或1,2-乙二醇(MEG)中的溶解度
在本申请的全文中各公开文本均已引用在括号内。这些公开文本公开的全部内容均以引用方式并入本申请中，从而更全面地阐述本发明所涉及现有技术领域。
尽管已参照所公开的实施例对本发明进行描述，但所属领域技术人员应不难了解，上文详细说明的具体实施例和研究仅用于说明本发明。应理解，可不背离本发明的精神作出各种修改。因此，本发明的范围仅被下列权利要求书限制。

Claims (17)

1.从发酵液分离1,4-丁二醇(1,4-BDO)的方法，其包括
从包含细胞的固体部分分离富含1,4-BDO的液体部分，其中所述分离液体部分的步骤包括微滤；
从所述的液体部分去除水，其中所述除去水是通过以包含单效或多效和机械蒸气再压缩机的蒸发器系统蒸发来完成；
从所述的液体部分去除盐，其中通过纳滤和离子交换去除盐；和
纯化1,4-BDO。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微滤包括通过孔径为大约0.05微米至大约5.0微米的膜过滤。
3.根据权利要求1所述的方法，其中分离液体部分的步骤还包括超滤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述超滤包括通过孔径为大约0.005微米至大约0.1微米的膜过滤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的蒸发器系统包含双效或三效蒸发器。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的蒸发器系统包含选自以下组成的蒸发器：降膜蒸发器、短程降膜蒸发器、强制循环蒸发器、板式蒸发器、循环蒸发器、流化床蒸发器、升膜蒸发器、逆流-涓流蒸发器、搅拌蒸发器、和螺旋管式蒸发器。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的蒸发器系统包含真空。
8.根据权利要求1所述的方法，其中基本上所有的盐在去除水之前被去除。
9.根据权利要求1所述的方法，其中基本上所有的盐在去除部分水之后被去除。
10.根据权利要求1所述的方法，其中盐在基本上去除所有水之后被去除。
11.根据权利要求1所述的方法，其中纳滤包括通过具有孔径范围在大约0.0005微米至大约0.005微米之间的膜过滤。
12.根据权利要求1所述的方法，其中包含细胞的所述固体部分再循环至所述的发酵液中。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述被去除的水再循环至所述的发酵液中。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述被去除的盐再循环至所述的发酵液中。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化1,4-BDO的步骤包括蒸馏。
16.生产1,4-BDO的方法，其包括：
将产生1,4-BDO的微生物在发酵罐中培养足够时间以生产1,4-BDO，所述产生1,4-BDO的微生物包括具有1,4-BDO途径的微生物，该1,4-BDO途径具有一个或多个编码1,4-BDO途径酶的外源基因和/或一个或多个基因破坏；
根据权利要求1所述的方法分离1,4-BDO。
17.根据权利要求1所述的方法，其中通过离子交换去除盐包括依次以阳离子交换和阴离子交换去除盐。
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