JP4418793B2 - 遺伝子ノックアウト戦略を決定する方法 - Google Patents

Description

本発明は菌株遺伝子操作戦略の特定を目的とする新規な計算法に関する。

関連特許出願
本出願は、２００２年７月１０日に出願された米国特許出願番号第６０／３９５，７６３（特許文献１）、２００２年１０月９日に出願された米国特許出願番号第６０／４１７，５１１（特許文献２）、及び２００３年２月３日に出願された米国特許出願番号第６０／４４４，９３３（特許文献３）に基づくものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書にインコーポレートされる。

助成金関連
本研究は、研究助成金番号第５８８５５によるエネルギー省の支援、及びナショナル・サイエンス・ファウンデーション研究助成金番号第ＢＥＳ０１２０２７７の支援を受けた。従って、米国政府が本発明に一定の権利を有しうる。

化学物質や生化学物質の製造を最適化するための遺伝子操作された微生物菌株の体系的な開発は、バイオテクノロジーにおける何よりも重要な挑戦である（非特許文献１）。しかしながら、代謝操作及び遺伝子操作の処置をしなければ、多くの微生物の生産物収量は理論上の最大値をはるかに下回ってしまうことが多い。これは、細胞代謝が自然選択によって、特定の化学化合物の過剰生産に対してではなく、過去の選択圧に対する最大限の応答に対して備えているためであると予測される。驚くべきことではないが、代謝ネットワークの挙動は、化学物質過剰生産の標的としばしば直接競合する内細胞の目標によって支配される。

近年の注釈付き配列情報の急増は豊富な化学文献と共に、多数の微生物でゲノム規模での代謝ネットワークの再構築を可能にした（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。フラックス平衡分析（ＦＢＡ）のモデルとなった枠組み（非特許文献６）との関連で用いられたこの情報は、代謝ネットワークの統合機能の探求に広く利用されてきた（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。ＦＢＡモデルは通常、可能性のあるフラックス分配を提案するため、ネットワーク化学量論に従って、特定細胞の目標の最適化（例えば、ＡＴＰ生産（非特許文献１１、非特許文献１２）、バイオマス形成（非特許文献６、非特許文献１３）、代謝調整の最小化（非特許文献１４））をもたらす。バイオマス最大化仮説を利用した大腸菌（E. coli）代謝の化学量論モデルは、ある場合においては（ｉ）遺伝子ノックアウトの致死率の予測（非特許文献２、非特許文献１５）、（ｉｉ）嫌気状態が強まる中での副産物分泌の正しい順序の特定（非特許文献１６）、及び（ｉｉｉ）特定の条件下における細胞増殖速度の定量的な予測（非特許文献１７）に成功した。興味深いことに、最近の研究はバイオマス最大化仮説の下ではＦＢＡ予測が失敗であると思われるような場合ですら、ある場合には、代謝ネットワークが適応進化により最大増殖(即ち、バイオマス収量）に向かって進化できることを示唆している（非特許文献１８）。

ゲノム規模、従って全身レベルで単細胞生物の代謝を研究することが可能になったので、菌株遺伝子操作戦略の特定を目的とする新規な計算法の必要に対する動機が生まれた。

従って、本発明の一つの目的、特性、又は利点は、生物工学的目標を達成する手段を計算により提案する方法を提供することである。

本発明のさらなる目的、特性、又は利点は、代謝ネットワークのモデルの使用により、遺伝子欠失又は遺伝子付加の候補を決めることである。

本発明のさらなる目的、特性、又は利点は、計算により生物工学的目標を達成するための最適化された方法を提供することである。

本発明のまた別の目的、特性、又は利点は、計算により生物工学的目標を達成するための最適化された、エラーに強い方法を提供することである。

これらの及び／又は他の本発明の目的、特性、及び利点の一つ以上は、以下の開示された実施態様の詳細な説明、及び添付の請求項を検討すれば明らかになるであろう。

米国特許出願番号第６０／３９５，７６３ 米国特許出願番号第６０／４１７，５１１ 米国特許出願番号第６０／４４４，９３３ ステファノプーロス，Ｇ，アリスティドゥー，ＡＡ，ニールセン，Ｊ．1998．代謝操作：原理と方法論．サンディエゴ，アカデミックプレス． エドワーズ，ＪＳ，パールソン，ＢＯ．2000．大腸菌ＭＧ１６５５コンピュータ代謝遺伝子型：その定義、特性と性能．Proc Natl Acad Sci U S A 97(10): 5528-33． シリング，ＣＨ，パールソン，ＢＯ．2000．ゲノム規模経路分析によるヘモフィルス・インフルエンザＲＤの代謝性能の評価：J Theor Biol 203(3): 249-83． シリング，ＣＨ，カバート，ＭＷ，ファミリ，Ｉ，チャーチ，ＧＭ，エドワーズ，ＪＳ，パールソン，ＢＯ．2002．ヘリコバクター ピロリ２６６９５のゲノム規模代謝モデル．J Bacteriol 184(16): 4582-93． フォースター，Ｊ，ファミリ，Ｉ，フー，ＰＣ，パールソン，Ｂ，ニールセン，Ｊ．2003．酵母代謝ネットワークのゲノム規模再構築．Genome Research 13(2): 244-253． バルマー，Ａ，パールソン，ＢＯ．1993．大腸菌の代謝性能：ＩＩ．最適増殖パターン．J. Theor. Biol. 165: 503-522． バーガード，ＡＰ，マラナス，ＣＤ．2001．仮説の代謝目的関数を推測及び試験するための最適化に基づくフレームワーク．Biotechnol Bioeng 82(6): 670-7． バーガード，ＡＰ．バイドヤラマン，Ｓ，マラナス，ＣＤ．2001．異なる増殖必要条件及び取り込み環境下における大腸菌代謝の最小反応セット．Biotechnol Prog 17: 791-797． パパン，ＪＡ，プライス，ＮＤ，ウィバック，ＳＪ，フェル，ＤＡ，パールソン，Ｂ．2003．ポストゲノム時代における代謝経路．Trends Biochem Sci, accepted． プライス，ＮＤ，パパン，ＪＡ，シリング，ＣＨ，パールソン，Ｂ．2003．コンピュータによるゲノム規模の微生物モデル：制約に基づくアプローチ．Trends Biotechnol, accepted． マジェウスキー，ＲＡ，ドマック，ＭＭ．1990．大腸菌における酢酸オーバーフローの制約が単純な最適化ビュー．Biotechnol Bioeng 35: 732-738． ラマクリシュナ，Ｒ，エドワーズ，ＪＳ，マカロック，Ａ，パールソン，ＢＯ．2001．微生物エネルギー代謝のフラックス平衡分析：系統的化学量論制約．Am J Physiol Regul Integer Comp Physiol 280(3): R695-704． バルマー，Ａ，パールソン，ＢＯ．1994．代謝フラックス平衡：基本概念、科学的及び実践的使用．Bio/Technology 12: 994-998． セグレ，Ｄ，チャーチ，ＧＭ．2002．天然の及び撹乱された代謝ネットワークにおける最適性分析．Proc Natl Acad Sci U S A 99(23): 15112-7． バダリナラヤナ，Ｖ，エステップ，ＰＷ，３世，シェンジャー，Ｊ，タヴァゾーイ，Ｓ，ラム，Ｆ，チャーチ，ＧＭ．2001．サブジェニック分解能アレイ．Nat Biotechnol 19(11): 1060-5． バルマー，Ａ，ボーシュ，ＢＷ，パールソン，ＢＯ．1993．異なる酸素添加率における大腸菌グルコース異化反応の化学両論的解釈．Appl Environ Microbiol 59(8): 2465-73． エドワーズ，ＪＳ，イバラ，ＲＵ，パールソン，ＢＯ．2001．大腸菌代謝性能のコンピュータ予測は実験データに一致する．Nat Biotechnol 19(2): 125-30． イバラ，ＲＵ，エドワーズ，ＪＳ，パールソン，ＢＯ．2002．大腸菌Ｋ−１２はコンピュータで予測した最適増殖を達成するために順応性進化する．Nature 420(6912): 186-9．

発明の概要
化学物質や生化学物質の製造を最適化するための遺伝子操作された微生物株の体系的な開発は、バイオテクノロジーにおける何よりも重要な挑戦である。代謝のゲノム規模モデルの出現は、過剰生産につながる遺伝子操作を提案する計算法の開発の礎を築いた。本発明は、大腸菌中で化学物質又は生化学物質の過剰生産をもたらす遺伝子欠失戦略を提案する計算枠組みについて述べる。これは、増殖資源（即ち、炭素、酸化還元電位、及びエネルギー）に向かう排出が、化学量論により所望の産物の製造を伴うことを確実にすることにより達成される。具体的には、この計算枠組みは、前提の細胞目標（例えば、バイオマス形成）を外部から課せられた化合物生産目標と最大限に結び付ける遺伝子欠失の複数の組合せを同定する。この入れ子構造（nested structure) は二段階最適化の問題を発生させ、それは双対理論 (duality theory) から発想を得たトランスフォーメーションに基づいて解決される。バイオマス形成と化合物生産を結合させることによるこの枠組みのこの手順は、過剰生産する突然変異体を間接的に進化させる増殖選択／適応システムを提案するものである。

本発明の一つの実施態様は、遺伝子欠失と遺伝子付加の候補を決定する方法に向けられる。この方法は、生物と関連する代謝ネットワークのモデルを使用する。このモデルには、代謝物の関係を定める幾つかの代謝反応が含まれる。この方法には、該生物を選択するため生物工学的目標を選択する工程が含まれる。次に、細胞目標を少なくとも一つ選択する。この細胞目標を生物工学的目標と結び付ける最適化問題が形成される。最後に、この最適化問題を解いて、少なくとも一つの候補を得る。

単細胞生物の代謝をゲノム規模で、従って全身レベルで研究できることから、菌株操作戦略の特定を狙う新規な計算法の必要性に対する動機が生まれる。本発明は、大腸菌中で特定の化合物の過剰生産をもたらす遺伝子欠失戦略を提案するための、ＯｐｔＫｎｏｃｋと称する計算枠組みを含む。これは、所望の化学物質の生産が代謝ネットワークの連結性を「形作る」ことによる増殖の必須副産物となることを確実にすることにより達成される。言い換えれば、ＯｐｔＫｎｏｃｋは化合物生産から細胞増殖を切り離すことができる代謝反応を特定し、その後除去する。計算手順は、パールソンと共同研究者ら（エドワードとパールソン，2000）のコンピュータ内大腸菌モデルで概説されているような大腸菌代謝ネットワーク全体を同時に考慮することにより直接的なだけでなく直観的でないノックアウト戦略をも特定するように設計する。このネットワークの複雑さと内蔵された余剰性（例えば、大腸菌モデルには７２０の反応が含まれる）には、遺伝子ノックアウト戦略候補の組合せの膨大さに対抗する体系的で有効な検索アプローチが必要である。

細胞の増殖目標と外部から与えた化合物生産目標とを最大限に結び付ける複数の遺伝子欠失の組合せを特定するために、図１に示す入れ子型最適化枠組みを開発する。競合する二つの最適な戦略（即ち、細胞目標と化合物生産）を含むこの多層最適化構造は、二階層最適化問題と呼ばれる（バード，1998）。線形計画（ＬＰ）二重理論を利用するあざやかな解決法を伴う問題公式の詳細は、方法のセクションで述べる。ＯｐｔＫｎｏｃｋ手法は、細胞目標として使用された固定量の取り込まれたグルコースに対するバイオマス収量の最大化を伴う大腸菌中のコハク酸、乳酸、及び1，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）の生産に適用される。得られた結果は、細胞目標として代謝調節の最小化（ＭＯＭＡ）（セグレら，2002）を用いた場合との対比も行う。ＯｐｔＫｎｏｃｋ枠組みに基づくと、最も有望な遺伝子ノックアウト戦略と、大腸菌中でのコハク酸、乳酸、及びＰＤＯの生産との関連における化合物生産対バイオマス生産の、該遺伝子ノックアウト戦略に対応する許容可能な包絡線 (envelope) を特定することが可能である。

本発明の好ましい実施態様は、増殖資源（即ち、炭素、酸化還元電位、及びエネルギー）として必要な代謝物／化合物に向けての排出が、化学量論により所望の化学物質の生産を伴わねばならないということを確実にすることにより、大腸菌中で化合物生産をもたらすことができるであろう遺伝子欠失戦略を提案する、ＯｐｔＫｎｏｃｋと称する計算枠組みについて述べる。従って、所望の生産物の生産は、細胞増殖の必須の副産物となる。とりわけＯｐｔＫｎｏｃｋは、どの反応が代謝ネットワークから除去されるべきかを正確に指摘するが、これは特定された機能と結びつく遺伝子（単数又は複数）を欠失させることにより実現できる。この手順は、大腸菌Ｋ−１２におけるコハク酸、乳酸、及びＰＤＯの生産に基づいて実証した。得られた結果は、文献で公開されている菌株との良好な一致を示す。提案する遺伝子欠失の一部は、それらが所望のものと競合する反応経路を完全に取り除くので極めて直接的ではあるが、他の多くの遺伝子欠失は大腸菌の代謝ネットワークに内蔵された複雑性と余剰性を反映して、最初は極めて非直観的である。コハク酸の場合、ＯｐｔＫｎｏｃｋは、問題への直接入力としてではなく、細胞目標と化合物生産目標との間の競合の結果として、嫌気的発酵とホスホトランスフェラーゼによるグルコース取り込み機構の除去を正確に提案した。乳酸の研究では、ある種のノックアウト戦略において乳酸生産とバイオマス生産を切り離すためにグルコキナーゼに基づくグルコース取り込み機構が示された。ＰＤＯの場合は、エントナー−ドウドロフ経路が実質的にはエネルギー的には効果が低いという事実にも関わらず、ＥＭＰ解糖よりも優れているという結果を示す。加えて、これまで一般的なｔｐｉノックアウトはＰＤＯの最大収量の減少を明らかに示し、一方１５の反応の複雑なネットワークはＰＰＰ経路からＴＣＡサイクルへフラックスを「漏出させる」こと、従ってバイオマス形成からＰＤＯ生産を切り離すことが理論的に可能であることが分かった。得られた結果は、細胞目標の選択に関してエラーに極めて強いことことも分かった。

本発明は、増殖速度の最大化、ＡＴＰ生産の最大化、代謝調整の最小化、養分取り込みの最小化、酸化還元生産（redox production）の最小化、ユークリッド・ノルムの最小化を含むがこれらに限定しない、任意の数の細胞目標、及び、これら及びその他の細胞目標の組合せを意図する。

提案する遺伝子欠失戦略は、慎重に解釈しなければならないことに注意することが重要である。例えば、多くの場合、分岐した経路の一方の分岐における遺伝子欠失は、もう一方の分岐での顕著な高レベル調節と同等である。さらに、遺伝子欠失の前と後でのフラックスの変化を調べることにより、どの遺伝子を高レベル調節若しくは低レベル調節する必要があるのかについての洞察が得られる。最後に、対応する相手の遺伝子に移動させることを目標とする、一連の特定された反応のマッピングの問題は、必ずしも一意に特定できるわけではない。従って、アイソザイムや多機能性酵素の原因となる最も経済的な遺伝子群を慎重に特定する必要がある。

ＯｐｔＫｎｏｃｋ枠組みでは、基質（即ち、グルコース）取り込みフラックスは１０ミリモル／ｇＤＷ・時であると仮定するのが好ましい。従って、化合物生産及びバイオマス形成の報告値は全て、この仮定の取り込みシナリオに基づくものであり、推定した取り込みシナリオに基づくものではない。従って、提案した欠失突然変異体が実質的により低い取り込み効率を伴う可能性が極めて高い。しかしながら、ＯｐｔＫｎｏｃｋは本来、増殖と化合物生産を結合させた変異体を提案するものであるので、人は取り込み効率が改善され従って所望の化合物生産特性の増強された突然変異体を開発することに成功するであろう成長選択システムを思い描くことができるであろう。

フラックス割り当てを行う内部最適化問題の、純然たる化学量論的表示の範囲内での何らかの調節情報又は動力学的情報が欠如している場合、化合物過剰生産の唯一の機構としていずれかの遺伝子欠失を特定するためにＯｐｔＫｎｏｃｋが使用される。明らかに、このモデルにおける如何なる調節情報や動力学的情報の欠如も、ある場合には非現実的なフラックス分配を提案するかもしれない単純化を生ずる。調節情報を組み込むことは、より適切にフラックス割り当てを解決することにより提案される遺伝子欠失の質を向上させるだけでなく、菌株改良の機構として遺伝子欠失に加えて調節修正の提案をも可能にする。若し入手可能ならば、代替的モデル化法（例えば、サイバネティック（コンパラら，１９８４、ラムクリシュナら，１９９６、バーナーとラムクリシュナ，１９９９）、代謝制御分析（カクサーとバーンズ，１９７３、ハインリッヒとラポポート，１９７４、ハチマニカティスら，１９９８））の使用を、遺伝子欠失代謝ネットワークの代謝フラックス分配をより正確に推定するために、ＯｐｔＫｎｏｃｋ枠組み内に組み込むことができる。それにもかかわらず、このような調節情報若しくは動力学的情報なしでさえも、ＯｐｔＫｎｏｃｋは菌株改良のための有用な示唆を与え、より重要なことに体系的枠組みを確立する。本発明は当然に、代謝及び調節のモデル化枠組みにおける将来の改良を意図する。

方法
代謝物の集合

及びグルコース基質により燃料補給される代謝反応の集合

を含む、定常状態の代謝ネットワークのための反応フラックス集合体として定量化された細胞目標の最大化は、次のように数式で表される。

上式中、Ｓ_ijは反応ｊにおける代謝物ｉの化学量論係数であり、ｖ_jは反応ｊのフラックスを表し、ｖ_glc-uptakeは基本グルコース取り込みシナリオであり、ｖ_atp-mainは増殖と関係しないＡＴＰ維持要求であり、

はバイオマス生産の最小レベルである。ベクターｖは内部反応と輸送反応の両方を含む。前（即ち、正）方向の輸送フラックスはある特定の代謝物の取り込みに相当し、逆（即ち、負）方向のものは代謝物の分泌に相当する。ホスホトランスフェラーゼシステムとグルコキナーゼによるグルコース取り込みは、それぞれｖ_pts及びｖ_glkで表される。ネットワークからの分泌しかできない代謝物の輸送フラックスは、 M_secr-only の構成要素である。反応の完全な集合 Mは、可逆性の M_rev 反応と非可逆性の M_irrev 反応にさらに分割できることにも注意されたい。細胞目標は、バイオマス形成に必要な割合での生合成前駆体の排出であると仮定されることが多い（ナイトハルトとカーティス，1996）。このフラックスはバイオマス形成が生産されたバイオマス（ｇ）／ｇＤＷ・時、又は１／時として表されるように、１ｇＤＷ・時当たりで報告される。

遺伝子欠失、従って反応排除のモデル化には、まず、フラックス均衡分析枠組み（バーガードとマラナス，2001、バーガードら，2001）に２値の変数を組み込むことが必要である。

これらの２値変数は、反応ｊが活性である場合には１の値をとり、反応ｊが不活性であれば０の値をとる。次の制約は、変数ｙ_j が０に等しい場合にのみ反応フラックスｖ_jが０に設定されることを保証するものである。

または、ｙ_jが１に等しい場合、ｖ_jは下限ｖ_j ^minから上限ｖ_j ^maxまでの範囲にある任意の値を自由にとる。本研究では、ｖ_j ^minとｖ_j ^maxは最初の問題からくる制約を受ける全ての反応フラックスを最小化し、次いで最大化することにより特定する。

最適な遺伝子／反応ノックアウトの特定は、細胞目標の最適化が間接的に目的の化学物質若しくは生化学物質の過剰生産をもたらす（図１も参照）のであれば、（ｙ_j＝１）であり得る一連の反応を選択するという二階層最適化問題を解くことを必要とする。細胞目標としてのバイオマス形成を使用すれば、これは数学的には次の二階層混合整数最適化問題として表される。

ここで、Ｋは許容可能なノックアウトの数である。この最終的な制約は結果的に得られるネットワークが最小バイオマス収量、

を満たすことを保証する。

この二段階最適化問題の直接的な解は、フラックス空間の高次元性（即ち、７００を超える反応）や、二つが入れ子になった最適化問題の存在を考えると処理が難しい。この問題を軽減するため、我々はＬＰ二重理論から借用した効果的な解法を開発する。このＬＰ二重理論とは、個々の線形計画法問題（第一の問題）について、その最適化目標値が最初の問題の目標値と等しくなる特有の最適化問題（二重の問題）が存在することを示すものである。同様の戦略が、代謝フラックスデータから代謝の目標関数を特定／試験するために（バーガードとマラナス，2003）により採用された。ＯｐｔＫｎｏｃｋの内側の問題に関連する二重の問題（イグナチオとカバリエ，1994）を次に挙げる。

ここで、λ_i ^stoichは化学量論的な制約に関する二重変数であり、ｇｌｃはグルコース取り込み制約に関する二重変数であり、μ_jはそれに対応する第一の解におけるフラックスｖ_jに対する任意の他の制限に関する二重変数である。ＯｐｔＫｎｏｃｋの内側の問題内でそれに対応するフラックスがｙ_j＝０を強要することによりゼロに設定された場合には、二重変数μ_jは、無制限のサインを獲得することに注意されたい。パラメータμ_j ^minとμ_j ^maxは、二重問題の制約を受けるそれらの値を最小化し、その後最大化することにより決定される。

もし第一の問題と二重の問題の最適解が結び付いているなら、その目標関数値は最適性において、相互に等しくなければならない。このことは、両問題に対するそれぞれの最適解がそれらの目標値を相互に等しい値に設定し、それらの各々の制約を累積することにより特徴付け得ることを意味する。従って、前に示したＯｐｔＫｎｏｃｋに対する二階層公式化は、次の単一レベルＭＩＬＰに変換できる。

上の公式の重要な特性は、もし問題が実行可能であるなら、最適解は常に見つかるはずであるということである。本発明では、遺伝子ノックアウトの候補には、解糖、ＴＣＡ回路、ペントースリン酸回路、呼吸の全反応、及び全ての補充反応が含まれるが、これらに限定されない。これは、総和に含まれる反応数を限定することにより達成できる（即ち、次式）。

１００程度の２値変数を含む問題は、ＩＢＭのワークステーション、ＲＳ６０００−２７０上のＧＡＭＳモデル環境経由でアクセスするＣＰＬＥＸ７．０を用いて、数分から数時間のオーダーで解かれた。しかしながら、本発明は使用される如何なる特定タイプのコンピュータや環境に依存するものではないことが理解されるべきである。本発明の方法に関連する情報の入力及び出力を行うについては、如何なるタイプのものでも使用することが可能になる。さらには、本発明の方法の工程はいかなる数のタイプのソフトウェアアプリケーション、又は言語で実行することが可能であり、この点で、本発明は制限を受けない。

他の実施態様及び使用が当業者らに明らかになること、及び、本発明がこれらの特に例示する具体例に限定されないことは、理解されるはずである。

コハク酸及び乳酸の生産
バイオマスの最大化がフラックス割当ての良い記述子である場合は常に、残りのネットワークがコハク酸又は乳酸を生産するとすれば、大腸菌Ｋ−１２化学量論モデル（エドワードとパールソン，2000）から除外できる反応が、もしあるとすれば、どの反応であるのかを特定した。無機リン酸、酸素、硫酸、及びアンモニアの無制限取り込み経路と共に事前に特定した量のグルコース（１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ・時間）をこの代謝ネットワークに燃料として供給する。最適化の工程は、ホスホトランスフェラーゼ系、グルコキナーゼ、又はグルコース取り込みの両方の機構を選択若しくは選択除去することができるであろう。酢酸、二酸化炭素、エタノール、ギ酸、乳酸、及びコハク酸の分泌経路も使用可能である。グルコース取り込み速度は固定されているため、バイオマス収量及び生産物収量は、本質的にはそれぞれバイオマス生産速度及び生産物生産速度に等しいことに注意されたい。どんな場合でも、ＯｐｔＫｎｏｃｋ法は酸素取り込み反応を排除して、現在のコハク酸（ツァイクスら，1999）及び乳酸（ダッタら，1995）の発酵生産戦略と一致する嫌気的な増殖条件を指し示す。

表Ｉは、コハク酸過剰生産に対する三つの特定された遺伝子ノックアウト戦略（即ち、突然変異体Ａ、Ｂ、及びＣ）をまとめたものである。完全な大腸菌ネットワーク（即ち、野生型）、突然変異体Ｂ、及び突然変異体Ｃについての最大バイオマス収量での嫌気的フラックス分配を図２Ａ〜Ｃに例示する。突然変異体Ａの結果は、二つの反応（即ち、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、及び乳酸脱水素酵素）をネットワークから除去することが、最大バイオマス収量におけるその理論上の最大値の６３％に達するコハク酸生産をもたらすことを示唆した。このノックアウト戦略は、ストルスとドナリー（ストルスとドナリー，1997）がコハク酸を過剰生産する彼らの大腸菌株で用いたものと同じである。次に、許容されるコハク酸生産対バイオマス生産の包絡線を、野生型大腸菌ネットワークと表Ｉに挙げた３種の突然変異体について調べた。図３Ａに示すコハク酸生産限界が、バイオマス収量が最大値の８０％に達するまで突然変異体Ａがコハク酸生産とバイオマス形成の結び付きを示さないことを明らかにしたことに注意されたい。しかしながらアセトアルデヒド・デヒドロゲナーゼのさらなる欠失を有する突然変異体Ｂは、コハク酸収量とバイオマス収量の結び付きがずっと早くなるという結果になった。

競合副産物（即ち、エタノール、ギ酸、及び乳酸）の生産機構の除去ではなく、二つのＰＥＰ消費反応の不活性化に着目した突然変異体Ｃについては、直観的には分かり難い戦略が特定された。まず、ネットワークがグルコース取り込みのために専らグルコキナーゼに依存することを要求するホスホトランスフェラーゼ系を使用不可能にした。次に、ピルビン酸キナーゼを除去して、解糖によって供給されるＰＥＰの相当の量を排出できる唯一の中心的代謝反応としてＰＥＰカルボキシキナーゼを残した。最大のバイオマス収量が得られることを仮定するこの戦略は、コハク酸収量が理論上の最大値の８８％に近づくという結果を与えた。さらに、図３Ａは達成可能な全てのバイオマス収量に対して顕著なコハク酸生産を示すが、コハク酸の理論的最大収量は野生型株に対するものと同じである。

次に、乳酸生産とバイオマス生産を結び付けるためのノックアウト戦略を特定するために、ＯｐｔＫｎｏｃｋ枠組みを適用した。表Ｉは特定した三つの遺伝子ノックアウト戦略（即ち、突然変異体Ａ、Ｂ、及びＣ）を示すものであり、図２Ｄに最大バイオマス収量における突然変異体Ｃのフラックス分配を示す。突然変異体Ａでは、酢酸生産とエタノール生産を遮断することにより、最大バイオマス収量においてフラックスの向きが乳酸に変わる。この結果は、大腸菌株のａｄｈ、ｐｔａ突然変異体が乳酸の生産によりグルコース上で嫌気的に増殖できることを実証した先行研究と一致する（グプタとクラーク，1989）。突然変異体Ｂは、酢酸生産機構と共に最初の解糖反応の除去を含む代替戦略を提供する。これは、最大バイオマス収量における理論的限界の９０％の乳酸収量という結果をもたらす。図３Ｂで突然変異体Ｂに対する縦方向の赤線は、ネットワークがバイオマス形成を最大化している間に乳酸の生産を回避できることを示す。これは、ＯｐｔＫｎｏｃｋが「最悪の場合」の代替となる解を明確に説明するものではないという事実によるものである。グルコキナーゼとエタノール生産機構をさらに排除すると、突然変異体Ｃは乳酸生産とバイオマス生産の間のより強い結び付きを示したことは評価すべきである。

表Ｉ
ＯｐｔＫｎｏｃｋ により特定された様々な遺伝子ノックアウト戦略に対するバイオマス収量と化合物収量。それぞれのノックアウト戦略の反応に対応する酵素をリストに挙げる。最大バイオマス収量に対応する最大の化合物収量は１０mmol/時のグルコース投与と１gＤＷの細胞を基準にして示す。右端の縦列は、野生型（無欠失）大腸菌ネットワークからの代謝フラックスの最小再分配を仮定（ＭＯＭＡ仮説）して同じ基準に基づいた化合物収量を示すものである。１，３−プロパンジオールの事例については、グリセロール分泌は両方のノックアウト戦略で使用できなかった。

１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）の生産
最適な遺伝子ノックアウト戦略の発明に加えて、ＯｐｔＫｎｏｃｋは大腸菌でのＰＤＯ生産におけるような遺伝子欠失と共に遺伝子付加が必要な菌株を設計するために用いられた。微生物による１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）の製造法は、グリセロールを第一炭素源として利用して開発されたが（ハートレップら，2002、チューら，2002）、１，３−プロパンジオールを単一の微生物でグルコースから直接製造することは、最近かなりの注目を集めた（キャメロンら，1998、ビーブルら，1999、ツェングとビーブル，2002）。野生型大腸菌ではＰＤＯ生産に必要な経路が欠けているため、まず遺伝子付加枠組みを使用して大腸菌でグルコースからＰＤＯを生産するのに必要な付加反応を同定した。この遺伝子付加枠組みは、グリセロール・ホスファターゼによりグリセロール−３−Ｐをグリセロールへ転換し、次いでグリセロール・デヒドラターゼと１，３−プロパンジオール・オキシドレダクターゼによってグリセロールを１，３プロパンジオールに転換する工程を含む、直接３段反応経路を同定した。これらの反応はついで、大腸菌の化学量論モデルに加えられ、続いてＯｐｔＫｎｏｃｋ法が適用された。

ＯｐｔＫｎｏｃｋは、ＰＤＯ生産とバイオマス生産が結び付いた一重欠失の突然変異体も二重欠失の突然変異体も存在しないことを明らかにした。しかしながら、ＰＤＯ生産とバイオマス生産を結び付けることができる一つの三重ノックアウト戦略と、複数の四重ノックアウト戦略を同定した。これらのノックアウト戦略の二つを表Ｉに示す。この結果は、大腸菌ネットワークからある主要な機能を除去すると、結果としてグルコース上で増殖するためのＰＤＯを過剰生産する突然変異体が得られることを示唆するものであった。具体的にいうと、表Ｉは、グリセロールの分解を阻止する付加的ノックアウトと共に解糖系の二つの反応の除去が、最大のバイオマス収量におけるＰＤＯの理論的最大収量の７２％に達することができるネットワークをもたらすことを明らかにする。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）ノックアウトが、デュポン社のＰＤＯ過剰生産大腸菌株（ナカムラ，2002）で用いられたことに注意されたい。同様のＰＤＯ収量と３８％高いバイオマス収量を示すトリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）酵素の除去を含む突然変異体Ｂは、代替的戦略を明らかにした。興味深いことに、トリオースリン酸イソメラーゼ活性が欠損した酵母菌株が、ＰＤＯへの主要な前駆体であるグリセロールをその理論的最大収量の８０〜９０％で生産することが最近報告された（コンパーニョら，1996) 。

バイオマス収量を最大化する野生型大腸菌ネットワーク、突然変異体Ａネットワークと突然変異体Ｂネットワークのフラックス分配を図４に挙げる。驚くべきことではないが、グリセロールのグリセルアルデヒドへのさらなる転換が突然変異体ＡとＢの両方で妨害された。突然変異体Ａでは、二つの反応を解糖系の最上部と最下部から除去すると、その結果ペントースリン酸経路と解糖経路（トリオースリン酸イソメラーゼを除く）がほぼ完全に失活した。補償のため、エントナー−ドゥドロフ解糖経路を活性化させて、フラックスをグルコースからピルビン酸及びグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）に向ける。その後、ＧＡＰをグリセロールに転換し、グリセロールは続いてＰＤＯに転換される。解糖フラックスの減少と共に野生型大腸菌ネットワーク事例から失われたエネルギー需要が、ここでＴＣＡ回路フラックスにおける増加によって満たされる。突然変異体Ｂに対して提案されるノックアウトは、全く異なる機構によってフラックスの向きをＰＤＯ生産の方向に変える。ペントースリン酸経路の最初の反応の除去は、解糖系の第一段階を通して代謝フラックスの完全な流れをもたらす。フルクトース二リン酸アルドラーゼ接合点で、このフローは二つの代謝物、即ちＰＤＯに転換されるジヒドロキシアセトン−リン酸塩（ＤＨＡＰ）と、解糖の後半を通って続くＧＡＰに分かれる。トリオースリン酸イソメラーゼ反応を除去すると、ＤＨＡＰとＧＡＰの相互転換が妨げられる。興味深いことに、四つ目のノックアウトはバイオマス形成と化合物生産の間の結び付きを保持すると予測される。このノックアウトは、合わさってリボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）を酢酸とＧＡＰに転換する１５の反応を含む複合経路によるフラックスの「漏出」を防ぎ、それにより化合物生産から増殖を切り離す。

次に、許容できるＰＤＯ生産対バイオマス収量の包絡線を、表Ｉに挙げた二つの突然変異体について調べる。図５に例示したこの突然変異体と元の大腸菌ネットワークの生産限界は、バイオマス収量が最大化の対象となる場合には野生型大腸菌ネットワークにはＰＤＯを生産する「誘因」がないことを明らかにする。他方、ＡとＢの両方の突然変異体は、遺伝子除去後のネットワークの機能の減少の下である量のバイオマスが形成されることになれば、顕著な量のＰＤＯを生産する必要がある。突然変異体Ａは、バイオマス生産のＰＤＯ生産に対する割合を本質的に決定するｔｐｉノックアウトを回避することにより、ＰＤＯの理論的最大収量がより高くなるという特徴をもつ。上で述べた結果は、ＰＤＯに対する主要な中間体としてグリセロールを使用することを条件とする。次に、１，３−プロパンジオール生産に対するグリセロール転換経路の代替経路の利用可能性を調査した。

本出願人らは、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰＡ）を生産するためのマロニル−ＣｏＡの２段階ＮＡＤＰＨ依存性還元を含むクロロフレクサス・アウランティアクス（Chloroflexus aurantiacus）内の経路を同定した（メネンデスら，1999、ヒューグラーら，2002）。次いで、３−ＨＰＡを、この転換を行なう生物学的機能がないと仮定し、続いて１，３プロパンジオールに化学的に転換した。この経路は、その最初の段階（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ）が炭素固定反応であるので、グリセロール経路によるＰＤＯ生産に優る重要な利点を有する。従って３−ＨＰＡの理論的最大収量（１．７９ｍｍｏｌ／ｍｍｏｌグルコース）は、グリセロール転換経路（１．３４ｍｍｏｌ／ｍｍｏｌグルコース）によるＰＤＯ生産に対するよりもかなり高い。３−ＨＰＡ生産経路の付加に対するＯｐｔＫｎｏｃｋ枠組みの適用により、バイオマス形成が３−ＨＰＡ生産と結び付く前にずっと多くのノックアウトが必要であることが明らかになった。最も興味深い戦略の一つには、最適増殖におけるその理論的最大値の９１％で３−ＨＰＡを生産する９つのノックアウトが含まれる。最初の三つのノックアウトは、競合する酢酸、乳酸及びエタノールの生産機構の除去を含むので、比較的簡単なものであった。加えて、エントナー−ドゥドロフ経路（ホスホグルコン酸デヒドラターゼか２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼのいずれか）、四つの呼吸反応（即ち、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼII、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びコハク酸デヒドロゲナーゼ複合体）、及び最初の解糖段階（即ち、ホスホグルコースイソメラーゼ）が妨害される。この戦略は、最大バイオマス収量を前提として、グリセロール転換経路を利用する先に同定された突然変異体よりも６９％高い３−ＨＰＡ収量を結果的にもたらす。

代替的細胞目標：代謝調節の最小化
上に記した結果は全て、フラックス割当てを駆動する細胞目標としてバイオマス収量の最大化を呼び出すことにより得たものである。この仮説は、本質的には、代謝ネットワークが変化する環境的条件の下でバイオマス収量の最大性を維持する（最大応答）ため、調節ループを任意に変更及び／又は修正することすらできるということを想定している。最近の証拠は、複数サイクルの増殖選択の後にこれが大腸菌のＫ−１２菌株により時々達成されるということを示唆している（イバラら，2002）。このセクションでは、遺伝子欠失に対する代謝ネットワークの近視眼的な（最小の）応答を想定した対照的な仮説（即ち、代謝調節の最小化（ＭＯＭＡ）（セグレら，2002））を検討した。ＭＯＭＡ仮説は特に、代謝ネットワークが遺伝子欠失（単数又は複数）により到達できなくさせられたシステムの本来の定常状態にできるだけ近い状態に留まろうと努力すると提案する。この仮説では、遺伝子欠失事象の直後のフラックス分配をより正確に描写できることが分かっている（セグレら，2002）。図６は、二つの仮説によって予測される二つの異なる新たな定常状態をそれぞれ図で表している。この研究のため、ＭＯＭＡ目標を利用してＯｐｔＫｎｏｃｋによって同定した突然変異菌株におけるフラックス分配を予測した。乳酸及びコハク酸のシミュレーションの基本事例は嫌気的条件下における最大バイオマス形成であり、一方ＰＤＯシミュレーションの基本事例では好気的条件下における最大バイオマス形成であると仮定した。その結果を表Ｉの最終縦列に示す。全ての場合に、提案した複数遺伝子ノックアウト戦略は、最大バイオマス仮説と比べると、ＭＯＭＡ事例に対する化合物生産収量がわずかに低いだけであることを示唆している。これは、ＯｐｔＫｎｏｃｋの結果が細胞目標の選択に関して、かなりエラーに強いことを意味している。

発明の背景を明らかにするために、又は実施に関する詳細を付け加えるために本明細書で使用した刊行物やその他の資料が、参照により本明細書にその全体がインコーポレートされる。

本発明は、生物の変更、細胞目標の変更、生物工学的目標の変更、形成される最適化問題のタイプの変更、使用される解法の変更を含む、無数の変更を意図する。

これらの及び／又は他の変更、修正又は改変は、添付の請求の範囲に記載する本発明の精神と範囲から逸脱することなく、行うことができる。

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図１は、Ｏｐｔｋｎｏｃｋの二階層最適化構造を表す図である。内側の問題が特定の細胞目標の最適化（例えば、バイオマス収量の最大化、ＭＯＭＡ）に基づくフラックスの割当てを実行する。次いで、外側の問題が内側の問題の最適化に使用できる主要反応へのアクセスを制限することにより、生物工学的目標（即ち、化合物生産）を最大化する。 図２Ａは、嫌気的条件下でバイオマス収量を最大化する野生型大腸菌ネットワークのフラックス分配を表す図である。 図２Ｂは、嫌気的条件下でバイオマス収量を最大化するコハク酸突然変異体Ｂネットワークのフラックス分配を表す図である。 図２Ｃは、嫌気的条件下でバイオマス収量を最大化するコハク酸突然変異体Ｃネットワークのフラックス分配を表す図である。 図２Ｄは、嫌気的条件下でバイオマス収量を最大化する乳酸突然変異体Ｃネットワークのフラックス分配を表す図である。 図３Ａは、突然変異体Ａ（一点鎖線）、突然変異体Ｂ（点線）、突然変異体Ｃ（短いダッシュ）、及び野生型大腸菌（実線）ネットワークに対する、嫌気的条件下でのコハク酸生産限界を示す。この生産限界は各ネットワークに使用できるバイオマス収量のためのコハク酸生産をそれぞれ最大化及び最小化することにより得られる。黄色の点は、ＯｐｔＫｎｏｃｋにより特定した解（即ち、最大バイオマス収量における最大化合物生産）を表す。 図３Ｂは、突然変異体Ａ（一点鎖線）、突然変異体（点線）、突然変異体（短いダッシュ）、及び野生種大腸菌（実線）ネットワークに対する、嫌気的条件下での乳酸生産限界を示す。この生産限界は各ネットワークに使用できるバイオマス収量のための乳酸生産をそれぞれ最大化及び最小化することにより得られる。黄色の点は、ＯｐｔＫｎｏｃｋにより特定した解（即ち、最大バイオマス収量における最大化合物生産）を表す。 図４Ａは、バイオマス収量を最大化する野生型大腸菌ネットワークの好気的フラックス分配を表す図である。 図４Ｂは、バイオマス収量を最大化する突然変異体Ａネットワークの好気的フラックス分配を表す図である。突然変異体Ａについての結果は、１，３−プロパンジオール生産を担う反応が使用できることを仮定している。 図４Ｃは、バイオマス収量を最大化する突然変異体Ｂネットワークの好気的フラックス分配を表す図である。突然変異体Ｂの結果は、１，３−プロパンジオール生産を担う反応が使用できることを仮定している。 図５は、突然変異体Ａ（一点鎖線）、突然変異体Ｂ（点線）、及び野生型大腸菌ネットワーク（実線）に対する好気的条件下での１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）生産の限界を表す図である。黄色の点は、ＯｐｔＫｎｏｃｋにより特定した解（即ち、最大バイオマス収量における最大化合物生産）を表す。 図６は、多次元フラックス空間の２次元への投射を表す図である。ピンク色の領域は突然変異体ネットワークと完全なネットワークの両方により到達できる可能性のあるフラックス範囲を表し、一方青色の領域は遺伝子欠失（単数又は複数）により到達できなくされたフラックス分配に相当する。点Ａは最大バイオマス収量の解を表す。点Ｂは突然変異体ネットワークに対する代謝調節仮説の最小化を仮定した解であり、点Ｃは突然変異体ネットワークがそのバイオマス収量を最大化すると仮定した解である。

Claims (18)

1. 生物に関連する代謝ネットワークのモデルを用いて遺伝子欠失の候補を決定する方法であって、該モデルが代謝物の関連性を規定する複数の代謝反応を含むものであり、入力手段、演算手段及び出力手段を有するコンピュータにデータが入力されるとともに当該コンピュータにおいて各工程が実行され、該方法が、
   上記入力手段が該生物のための生物工学的目標を選択する工程、ここで生物工学的目標は該選択された生物工学的目標のなかに含まれる１以上の反応に関するフラックスを含み、
   上記入力手段がなくとも一つの細胞目標を選択する工程、ここで細胞目標は該選択された細胞目標のなかに含まれる１以上の反応に関するフラックスを含み、
   上記演算手段がOptKnock演算を実行することで、少なくとも一つの細胞目標の最適化と生物工学的目標の最適化とを含む２つの競合する最適化問題を結び付ける二階層最適化問題を形成する工程、
   上記演算手段が、上記細胞目標を最大化するための二重の最適化問題の値と実質的に類似する第１の最適化問題の値を決定し、そして、上記細胞目標の最大化のための得られた値において上記生物工学的目標の最大化することによって、最適化問題を解いて少なくとも一つの候補を得る工程、及び
   上記出力手段が当該少なくとも一つの候補を出力する工程を含む方法。
2. 上記生物工学的目標が化学物質の過剰生産である、請求項１に記載の方法。
3. 上記生物工学的目標が化学物質の低生産である、請求項１に記載の方法。
4. 上記細胞目標が増殖である、請求項１に記載の方法。
5. 上記細胞目標が代謝調節の最小化である、請求項１に記載の方法。
6. 該候補が遺伝子欠失の候補であり、最適化問題が反応フラックスが活性であるか不活性であるかを特定する２値を含むものである、請求項１に記載の方法。
7. 上記最適化問題が混合整数最適化（a mixed-integer optimization) 問題である、請求項１に記載の方法。
8. 上記最適化問題が少なくとも一つの化学量論的な制約を含むものである、請求項１に記載の方法。
9. 上記最適化問題が少なくとも一つの化合物取り込み制約を含むものである、請求項１に記載の方法。
10. 上記最適化問題を形成する工程が、細胞目標を反応フラックス集合体として定量化する工程を含むものである、請求項１に記載の方法。
11. 上記演算手段が、少なくとも一つの細胞目標を満たすネットワークの能力に基づき、少なくとも一つの候補を用いて代謝ネットワークの性能限界を評価する工程をさらに含むものである、請求項１に記載の方法。
12. 上記細胞目標が、増殖速度の最大化、ＡＴＰ生産の最大化、代謝調節の最小化、栄養物取り込みの最小化、酸化還元生産の最小化、ユークリッド・ノルムの最小化、及びこれらの組合せから成る群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
13. 上記生物工学的目標がグリセロールの過剰生産であり、少なくとも一つの候補がフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩ、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、デオキシリボース−リン酸アルドラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、又はそれらの組合せなどの酵素をコードする遺伝子含む遺伝子の欠失の候補である、請求項１に記載の方法。
14. 上記生物工学的目標が１，３−プロパンジオールの過剰生産であり、少なくとも一つの候補がフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、デオキシリボース−リン酸アルドラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、又はそれらの組合せなどの酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子の欠失の候補である、請求項１に記載の方法。
15. 上記生物工学的目標がコハク酸の過剰生産であり、少なくとも一つの候補がピルビン酸ギ酸リアーゼ、アセトアルデヒド・デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ＦＯＦ１−ＡＴＰアーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩ、フマラーゼ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、又はそれらの組合せなどの酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子の欠失の候補である、請求項１に記載の方法。
16. 上記生物工学的目標が乳酸の過剰生産であり、少なくとも一つの候補がホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アセトアルデヒド・デヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼ、又はそれらの組合せなどの酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子の欠失の候補である、請求項１に記載の方法。
17. 生物に関連する代謝ネットワークのモデルを用いて遺伝子欠失の候補を決定するための、入力手段、演算手段及び出力手段を有するコンピュータに基づく方法であって、該モデルが代謝物の関連性を規定する複数の代謝反応を含むものであり、該方法が、
    上記入力手段が少なくとも一つの生物工学的目標を入力する工程、ここで生物工学的目標は該生物工学的目標のなかに含まれる１以上の反応に関するフラックスを含み、
    上記入力手段が入力として少なくとも一つの細胞目標を受け取る工程、ここで細胞目標は該細胞目標のなかに含まれる１以上の反応に関するフラックスを含み、
    上記演算手段が反応フラックス集合体として細胞目標を定量化し、少なくとも一つの細胞目標の最適化と生物工学的目標の最適化とを含む２つの競合する最適化問題を結び付ける二階層最適化問題を形成する工程、
    上記演算手段が、上記細胞目標を最大化するための二重の最適化問題の値と実質的に類似する第１の最適化問題の値を決定し、そして、上記細胞目標の最大化のための得られた値において上記生物工学的目標の最大化することによって、この最適化問題を解いて少なくとも一つの候補を得る工程、及び
    上記出力手段が少なくとも一つの候補を出力する工程を含む方法。
18. 上記最適化問題を解くことで、少なくとも１つの遺伝子付加の候補を得る、請求項１に記載の方法。

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