BRPI0808988A2 - micro-organismos e métodos para a produção de 1,4-butanodiol (1,4-bdo) - Google Patents

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Abstract

MICRO-ORGANISMOS E MéTODOS PARA A PRODUçãO DE 1,4-BUTANODIOL (1,4-BDO). A invenção refere-se a um micro-organismo que não ocorre naturalmente possuindo uma via biossintética de ácido 4-hidroxibutanoico (4- HB) e 1 ,4-butanodiol (1 ,4-BDO) que tem pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando cL-cetoglutarato descarboxilase, 4-hidroxibutanoato desidrogenase, butirato cinase, fosfotransbutirilase, aldeido desidrogenase e álcool desidrogenase em que tais ácjdos nucléicos exógenos são expressos em quantidade suficiente para produzir 1 ,4-butanodiol (1 ,4-BDO). Também é fornecido um micro-organismo que não ocorre naturalmente que tem vias biossintéticas de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e 1 ,4-butanodiol (BDO), as vias incluem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica cr-cetoglutarato descarboxilase, 4-hidroxibutanoato desidrogenase, 4-hidroxibutiril- CoA:acetil-CoA transferase, aldeido desidrogenase e Icodl desidrogenase, em que referidos ácidos nucléicos são expressos em quantidades suficientes para produzir 1 ,4-butanodiol (1 ,4-BDO). Adicionalmente são fornecidos métodos para a produção de 1 ,4-BDO compreendendo o cultivo dos micro- organismos que não ocorrem naturalmente sob condições substancialmente anaeróbicas por um período suficiente de tempo para produzir 1 4-butanodiol (1 ,4-BDO). Os produtos de 1 ,4-BDO podem ser secretados dentro do meio de cultura.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MICRO- ORGANISMOS E MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE 1,4-BUTANODIOL (1,4-BDO)".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se geralmente ao projeto in silico de organismos e, mais particularmente a organismos que têm a capacidade de biossíntese de 1,4-butanodiol.
O composto ácido 4-hidroxibutanoico (4-hidroxibutanoato, 4- hidroxibutirato, 4-HB) é um ácido carboxílico de 4 carbonos que tem potenci- al industrial como um bloco de construção para vários produtos e especiali- dades químicas. Em particular, 4-HB têm o potencial de servir como um no- vo ponto de entrada na família de produtos químicos de 1,4-butanodiol que inclui solventes, resinas, precursores de polímero e especialidades químicas. 1,4-Butanodiol (BDO) é um intermediário de polímero e um solvente industri- al com um mercado global de cerca de 3 bilhões de libras/ano. BDO é atu- almente produzido a partir de precursores petroquímicos, primariamente acetileno, anidrido maleico e oxido de propileno.
Por exemplo, acetileno é reagido com 2 moléculas de formaldeí- do na reação da síntese de Reppe (Kroschwitz e Grant, Encyclopedia of Chem. Tech., John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque (1999)), seguida pela hidrogenação catalítica para formar 1,4-butanodiol. Foi estimado que 90% do acetileno produzido nos EUA é consumido para a produção de butanodiol. Alternativamente, ele pode ser formado por esterificação e hidrogenação catalítica do anidrido maleico, o qual é derivado a partir do butano. A jusante, o butanodiol pode ser ainda transformado; por exemplo, pela oxidação para □-butirolactona, a qual pode ainda ser convertida para pirrolidona e N-metil- pirrolidona, ou hidrogenólise para tetra-hidrofurano (Figura 1). Estes com- postos possuem usos variados como intermediários de polímero, solventes e aditivos e têm um mercado combinado de quase 2 bilhões de libras/ano.
É desejável desenvolver um método para a produção destes produtos químicos por meios alternativos que não somente é um substituto renovável para matérias-primas baseadas em petróleo, mas também usa processos menos intensivos de energia e capital. O Departamento de Ener- gia propôs 1,4-diácidos, e particularmente ácido succínico, como intermediá- rios-chave biologicamente produzidos para a fabricação da família de produ- tos de butanodiol (DOE Report, "Top Value-Added Chemicals from Bio- mass", 2004). Entretento, o ácido succínico é caro de se isolar e purificar e requer altas temperaturas e pressões para a redução catalítica para o buta- nodiol.
Portanto, existe uma necessidade de meios alternativos para eficazmente produzir quantidades comerciais de 1,4-butanodiol e seus pre- cursores químicos. A presente invenção satisfaz esta necessidade e também fornece vantagens relacionadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção fornece um biocatalisador microbiano que não ocorre naturalmente incluindo um organismo microbiano que tem uma via biossinté- tica do ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que tem pelo menos um ácido nucle- ico exógeno que codifica 4-hidroxibutanoato desidrogenase, succinil-CoA sintetase, semialdeído de succínico desidrogenase CoA-dependente ou a- cetoglutarato descarboxilase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades suficientes para produzir ácido 4-hidroxibutanoico monomé- rico (4-HB). Também é fornecido um biocatalisador microbiano que ocorre não-naturalmente incluindo um organismo microbiano que tem vias biossin- téticas de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO), as vias incluem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4- hidroxibutanoato desidrogenase, succinil-CoA sintetase, semialdeído succí- nico desidrogenase CoA-dependente, 4-hidroxibutirato: CoA transferase, 4- butirato quinase, fosfotransbutirilase, α-cetoglutarato descarboxilase, aldeído desidrogenase, álcool desidrogenase ou um aldeído/álcool desidrogenase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades suficientes para produzir 1,4-butanodiol (BDO). Adicionalmente é fornecido um método para a produção de 4-HB. O método inclui o cultivo de um organismo micro- biano que não ocorre naturalmente que tem uma via biossintética do ácido 4- hidroxibutanoico (4-HB) incluindo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4-hidroxibutanoato desidrogenase, succinil-CoA sintetase, se- mialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente ou α-cetoglutarato des- carboxilase sob condições substancialmente anaeróbicas por um período suficiente de tempo para produzir ácido 4-hidroxibutanoico monomérico (4- HB). Ainda é fornecido um método para a produção de BDO. O método inclui o cultivo de um biocatalisador microbiano que não ocorre naturalmente, in- cluindo um organismo microbiano que tem vias biossintéticas do ácido 4- hidroxibutanoico (4-HB) e 1,4- butanodiol (BDO), as vias incluindo pelo me- nos um ácido nucleico exógeno que codifica 4-hidroxibutanoato desidroge- nase, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase CoA- dependente, 4-hidroxibutirato: CoA transferase, 4-hidroxibutirato quinase, fosfotranshidroxibutirilase, α-cetoglutarato descarboxilase, aldeído desidro- genase, álcool desidrogenase ou um aldeído/álcool desidrogenase por um período suficiente de tempo para produzir 1,4-butanodiol (BDO). Os produtos de 4-HB e/ou BDO podem ser secretados dentro do meio de cultura. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é um diagrama esquemático mostrando um ponto de entrada de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) no produto pipeline da família de produtos químicos de 1,4-butanodiol (BDO), e comparação com as vias de síntese química a partir das matérias-primas petroquímicas. Setas pretas sólidas mostram vias de sínteses químicas; setas azuis hachuradas mostram uma via biossintética para 4-HB e etapas subsequentes de conversão para a família de produtos químicos de BDO.
A Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando vias bioquí- micas para a produção de 4-hidroxibutirato (4-HB) e de 1,4-butanodiol. As primeiras 5 etapas são endógenas a E. coli, enquanto o restante pode ser expresso heterogeneamente. Enzimas que catalisam as reações biossintéti- cas são: (1) succinil-CoA sintetase; (2) semialdeído succínico desidrogenase CoA-independente; (3) α-cetoglutarato desidrogenase; (4) glutama- to:semialdeído succinato transaminase; (5) glutamato descarboxilase; (6) semialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente; (7) 4- hidroxibutanoato desidrogenase; (8) α-cetoglutarato descarboxilase; (9) 4- hidroxibutiril CoA:acetiI-CoA transferase; (10) butirato quinase; (11) fosfo- transbutirilase; (12) aldeído desidrogenase; (13) álcool desidrogenase.
A Figura 3 é um diagrama esquemático mostrando a biossíntese de homosserina em E. coli.
A Figura 4 mostra um diagrama esquemático de uma biovia de homosserina prevista a partir de L-homosserina para 4-HB. A etapa 1 é uma liase de amônia deduzida (classe de EC 4.3.1) com um ArxnG estimado de 12 kJ / mol. A etapa 2 é uma oxidorredutase deduzida (classe de EC 1.3.1) com um ArxnG estimado de -59 kJ / mol.
A Figura 5 mostra um diagrama esquemático para a via endóge- na de E. coli para a conversão de aspartato para succinato por fumarato. Esta via exibe química similar à biovia de homosserina prevista.
A Figura 6 mostra um diagrama esquemático que ilustra os para- lelos entre (A) homosserina e (B) vias biossintéticas de succinil-CoA para - 15 BDO.
A Figura 7 é um diagrama esquemático mostranda vias bioquí- micas para acetoacetato em E. coli.
A Figura 8 é um diagrama esquemático mostrando uma via bio- química a partir de acetoacetato para BDO por meio de semialdeído succíni- co.
A Figura 9 é um diagrama esquemático mostrando um esquema de reação de D-lisina-5,6-aminomutase.
A Figura 10 é um diagrama esquemático mostrando uma via pa- ra acetoacetato a partir de acetil-CoA. As enzimas são: (1) piruvato formiato- liase, (2) piruvato desidrogenase, (3) acetil-CoA:acetoacetil-CoA transferase, (4) acetil-CoA C-acetiltransferase, (5) fosfotransacetilase, e (6) acetato qui- nase. A enzima 7 representa a via de multietapas de acetoacetato para BDO na Figura 8.
A Figura 11 mostra a produção de 4-HB em meio de glicose mí- nimo usando cepas de E. coli que hospeda plasmídeos expressando várias combinações de genes de via de 4-HB. (a) concentração de 4-HB no caldo de cultura; (b) concentração de succinato no caldo de cultura; (c) OD da cul- tura, medido a 600 nm. Agrupamentos de barras representam os pontos de tempo de 24 horas, 48 horas e 72 horas (se medido). Os códigos ao longo do eixo χ indicam a combinação de cepa/plasmídeo usada. O primeiro índice refere-se à cepa hospedeira: 1, MG1655 lacl"q; 2, MG1655 ∆gabD lacl"q; 3, MG1655 ∆gabD ∆aldA laclq. O segundo índice refere-se à combinação de plasmídeo usada: 1, pZE13-0004-0035 e pZA33-0036; 2, pZE13-0004-0035 e pZA33-0010n; 3, pZE13-0004-0008 e pZA33-0036; 4, pZE13-0004-0008 e pZA33-0010n; 5, vetores de controle pZE13 e pZA33.
A Figura 12 mostra a produção de 4-HB a partir de glicose em cepas de E. coli expressando α-cetoglutarato descarboxilase a partir de My- cobacterium tuberculosis. As cepas 1-3 contêm pZE13-0032 e pZA33-0036. A cepa 4 expressa somente os vetores vazios pZE13 e pZA33. As cepas de hospedeiro são como segue: 1 e 4, MG1655 lacl"q; 2, MG1655 ∆gabD lacl"q; 3, MG1655 ∆gabD ∆aldA laclq. As barras referem-se à concentração em 24 e 48 horas.
A Figura 13 mostra a produção de BDO a partir de 4-HB a 10 mM em cepas de E. coli recombinante. Posições numeradas correspondem às experiências com MG1655 lacl"q contendo pZA33-0024, expressando eat2 a partir de P. gingivalis e os seguintes genes expressos em pZE13: 1, ne- nhum (controle); 2, 0002; 3, 0003; 4, 0003n; 5, 0011; 6, 0013; 7, 0023; 8, 0025; 9, 0008n; 10 0035. Os números dos genes estão definidos na Tabela 6. Para cada posição, as barras referem-se às condições aeróbicas, microa- eróbicas, e anaeróbicas, respectivamente. As condições microaeróbicas fo- ram criadas pela selagem dos tubos de cultura, mas não os evacuando.
A Figura 14 mostra o espectro de massa de 4-HB e BDO produ- zido por MG1655 lac10 pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036 crescido em meio mínimo M9 suplementado uniformemente com glicose 4 g/L não- rotulada (a, c, e e g), 13C-glicose uniformemente marcada (b, d, f e h). (a) e (b), massa 116 fragmento característico de BDO derivatizado, contendo 2 átomos de carbono; (c) e (d), massa 177 fragmento característico de BDO derivatizado, contendo 1 átomo de carbono; (e) e (f), massa 117 fragmento característico de 4-HB derivatizado, contendo 2 átomos de carbono; (g) e (h), massa 233 fragmento característico de 4-HB derivatizado, contendo 4 átomos de carbono.
A Figura 15 é um diagrama de fluxo de processo esquemático de bioprocessos para a produção de γ-butirolactona. O painel (a) ilustra a fermentação de alimentação em batelada com separação de batelada e pai- nel (b) ilustra fermentação de alimentação em batelada com separação con- tínua.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Esta invenção é direcionada para o projeto e a produção de cé- lulas e organismos que têm capacidades de produção biossintética para áci- do 4-hidroxibutanoico (4-HB), γ-butirolactona e 1,4-butanodiol. Em uma mo- dalidade, a invenção utiliza modelos in silico de estequiometria do metabo- lismo de Escherichia coli que identifica projetos metabólicos para a produção biossintética do ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO). Os resultados descritos aqui indicam que as vias metabólicas podem ser plane- jadas e recombinantemente projetadas para alcançar a biossíntese de 4-HB e produtos a jusante tais como 1,4-butanodiol em Escherichia coli e outras células ou organismos. A produção biossintética de 4-HB, por exemplo, para projetos in silico, pode ser confirmada pela construção de cepas que têm o genótipo metabólico projetado. Estas células ou organismos metabolicamen- te criados também podem ser submetidos à evolução adaptativa para ainda aumentar biossíntese de 4-HB, incluindo sob condições alcançam o cresci- mento máximo teórico.
Em certas modalidades, as características de biossíntese de 4- HB das cepas projetadas as tornam geneticamente estáveis e particularmen- te úteis no bioprocesso contínuo. Foram identificadas estratégias de projeto de cepa separadas com a incorporação de capacidades diferentes não- nativas ou de reação heteróloga em E. coli levando a vias metabólicas que produzem 4-HB e 1,4-butanodiol a partir de semialdeído succínico desidro- genase CoA-independente, succinil-CoA sintetase e semialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente ou semialdeído glutamato:succínico tran- saminase. Projetos metabólicos in silico foram identificados os quais resulta- ram na biossíntese de 4-HB em ambas as espécies de E.coli e levedura de cada uma destas vias metabólicas. O intermediário de 1,4-butanodiol, γ- butirolactona, pode ser gerado em cultura através da ciclização espontânea sob condições a pH <7,5, particularmente sob condições ácidas, tais como pH abaixo de 5,5, por exemplo, pH < 7, pH <6,5, pH < 6, e particularmente em pH <5,5 ou mais baixo.
Cepas identificadas pelo componente computacional da plata- forma podem ser colocadas na produção atual através da manipulação ge- nética de qualquer uma das alterações metabólicas previstas as quais levam à produção biossintética de 4-HB, 1,4-butanodiol ou outro intermediário e/ou produtos a jusante. Em ainda uma outra modalidade, cepas exibindo a pro- dução biossintética destes compostos ainda podem ser submetidas à evolu- ção adaptativa para ainda aumentar a biossíntese do produto. Os níveis de rendimento da biossíntese do produto seguido de evolução adaptativa tam- bém pode ser prevista pelo componente computacional do sistema.
Em outras modalidades específicas, organismos microbianos foram construídos para expressar uma via biossintética de 4-HB que codifica as etapas enzimáticas a partir de succinato para 4-HB e para 4-HB-CoA. A coexpressão de succinato de coenzima A transferase, semialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente, 4-hidroxibutirato desidrogenase NAD- dependente e 4-hidroxibutirato de Coenzima A transferase em um organismo microbiano hospedeiro resultou em uma produção significante de 4-HB com- parado aos organismos microbianos hospedeiros que carecem de uma via biossintética de 4-HB. Em uma modalidade específica adicional, foram gera- dos organismos microbianos produtores de 4-HB que utilizam a- cetoglutarato como um substrato pela introdução de ácidos nucleicos que codificam α-cetoglutarato descarboxilase e 4-hidroxibutirato desidrogenase NAD-dependente.
Em outra modalidade específica, foram construídos organismos microbianos que contêm uma via biossintética de 1,4-butanodiol (BDO) que biossintetizou BDO quando cultivado na presença de 4-HB. A via biossintéti- ca de BDO consistiu em um ácido nucleico que codifica ou um aldeído/álcool desidrogenase multifuncional ou ácidos nucleicos que codificam uma aldeído desidrogenase e uma álcool desidrogenase. Para suportar o crescimento em substratos de 4-HB, estes organismos microbianos produtores de BDO ex- pressaram também 4-hidroxibutirato CoA transferase ou 4-butirato quinase junto com fosfotrans-hidroxibutirase. Em ainda uma outra modalidade espe- cífica, foram gerados organismos microbianos que sintetizaram BDO através da expressão exógena de ácidos nucleicos que codificam uma via biossinté- tica de 4-HB funcional e uma via biossintética de BDO funcional. A via bios- sintética de 4-HB consistiu em succinato coenzima A transferase, semialdeí- do succínico desidrogenase CoA-dependente, 4-hidroxibutirato desidrogena- se NAD-dependente e 4-hidroxibutirato coenzima A transferase. A via de BDO consistiu em uma aldeído/álcool desidrogenase multifuncional.
Como usado aqui, o termo "que não ocorre naturalmente" quan- do usado em referência a um organismo microbiano ou a um micro- organismo da invenção pretende significar que o organismo microbiano tem pelo menos uma alteração genética não-normalmente encontrada em uma cepa que ocorre naturalmente das espécies de referência, incluindo cepas do tipo selvagem das espécies de referência. As alterações genéticas inclu- em, por exemplo, modificações que introduzem ácidos nucleicos expressí- veis que codificam polipeptídeos metabólicos, outras adições de ácido nucle- ico, deleções de ácidos nucleicos e/ou outro rompimento funcional do mate- rial genético microbiano. Tal modificação inclui, por exemplo, regiões de co- dificação e fragmentos funcionais das mesmas, para polipeptídeos heterólo- go, homólogo ou ambos heterólogo e homólogo para as espécies de refe- rência. Modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões regulatórias não-codificantes nas quais as modificações alteram a expressão de um gene ou operon. Polipeptídeos metabólicos exemplares incluem enzimas dentro de uma via biossintética de 4-HB e enzimas dentro de uma via biossintética para uma família de compostos de BDO.
Uma modificação metabólica refere-se a uma reação bioquímica que é alterada a partir de seu estado que ocorre naturalmente. Portanto, mi- cro-organismos que não ocorrem naturalmente que têm modificações gené- ticas para ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos metabólicos ou, frag- mentos funcionais dos mesmos. Ainda são descritas abaixo modificações metabólicas exemplares para ambos os organismos microbianos de E. coli e de levedura.
Como usado aqui, o termo "isolado" quando usado em referên- cia a um organismo microbiano pretende significar um organismo que está substancialmente livre de pelo menos um componente como o organismo microbiano de referência achado na natureza. O termo inclui um organismo microbiano que é removido de alguns ou de todos os componentes como ele é achado em seu ambiente natural. O termo também inclui um organismo microbiano que é removido de alguns ou de todos os componentes como o organismo microbiano é encontrado em ambientes que não ocorrem natu- ralmente. Portanto, um organismo microbiano isolado é parcialmente ou completamente separado de outras substâncias como é encontrado na natu- reza ou como é crescido, armazenado ou subsistido em ambientes que não ocorrem naturalmente. Exemplos específicos de organismos microbianos isolados incluem micróbios parcialmente puros, micróbios substancialmente puros e micróbios cultivados em um meio que não ocorre naturalmente.
Como usado aqui, os termos "microbiano", "organismo microbia- no" ou "micro-organismo" pretende significar qualquer organismo que existe como uma célula microscópica que é incluído dentro dos domínios de archa- ea, bactérias ou eucaria. Portanto, o termo pretende compreender células procarióticas ou eucarióticas ou organismos que têm um tamanho microscó- pico e incluem bactérias, archaea e eubacterias de todas as espécies assim como micro-organismos eucarióticos tais como leveduras e fungos. O termo também inclui culturas de célula de qualquer espécie que pode ser cultivada para a produção de um produto bioquímico.
Como usado aqui, o termo "ácido 4-hidroxibutanoico" pretende significar um derivado 4-hidróxi do ácido butírico que tem a fórmula química C4H8O3 e uma massa molecular de 104,11 g / mol (126,09 g / mol para seu sal de sódio). O composto químico ácido 4-hidroxibutanoico também é co- nhecido na técnica como 4-HB, 4-hidroxibutirato, ácido gama-hidroxibutírico ou GHB. O termo como é usado aqui pretende incluir quaisquer das várias formas de sal do composto e incluir, por exemplo, 4-hidroxibutanoato e 4 hidroxibutirato. Exemplos específicos de formas de sal para 4-HB incluem 4- HB de sódio e 4-HB de potássio. Portanto, os termos ácido 4- hidroxibutanoico, 4-HB, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxibutanoato, ácido gama- hidroxibutírico e GHB assim como outros nomes reconhecidos na técnica são sinonimamente usados aqui.
Como usado aqui, o termo "monomérico" quando usado em refe- rência a 4-HB pretende significar 4-HB em uma forma não-polimérica ou não-derivatizada. Exemplos específicos de 4-HB polimérico incluem ácido poli-4-hidroxibutanoico e copolímeros de, por exemplo, 4-HB e 3-HB. Um exemplo específico de uma forma derivatizada de 4-HB é 4-HB-CoA. Outras formas poliméricas de 4-HB e outras formas derivatizadas de 4-HB também são conhecidas na técnica.
Como usado aqui, o termo "γ-butirolactona" pretende significar uma Iactona que tem a fórmula química C4H6O2 e uma massa molecular de 86,089 g/mol. O composto químico γ-butirolactona também é conhecido na técnica como GBL, butirolactona, 1,4-lactona, 4-butirolactona,4- ácido hidro- xibutírico lactona, e ácido gama-hidroxibutírico lactona. O termo como é u- sado aqui pretende incluir qualquer uma das várias formas de sal do com- posto.
Como é usado aqui, o termo "1,4-butanodiol" pretende significar um derivado de álcool de alcano butano, carreando dois grupos hidroxila, o qual tem a fórmula química C4H10O2 e uma massa molecular de 90,12g/ mol. O composto químico 1,4-butanodiol também é conhecido na técnica como BDO e é um intermediário químico ou precursor para a família de compostos referida aqui como a família de compostos de BDO, alguns dos quais são exemplificados na Figura 1.
Como usado aqui, o termo "tetra-hidrofurano" pretende significar um composto orgânico heterocíclico que corresponde ao composto análogo completamente hidrogenado do composto aromático furano o qual tem a fórmula química C4H8O e uma massa molecular 72,11g/mol. O composto químico tetra-hidrofurano também é conhecido na técnica como THF, tetra- hidrofurano, 1,4-epoxibutano, óxido de butileno, óxido de ciclotetrametileno, oxaciclopentano, óxido de dietileno, oxolano, furanidina, hidrofurano, óxido tetrametileno. O termo como é usado aqui pretende incluir qualquer uma das várias formas de sal do composto.
Como usado aqui, o termo "CoA" ou "Coenzima A" pretende sig- nificar um cofator orgânico ou grupo protético (porção não-proteica de uma enzima) cuja presença é requerida para a atividade de muitas enzimas (a apoenzima) para formar um sistema de enzima ativo. A coenzima A funciona em certas enzimas condensadoras, atua em acetila ou outros grupos de transferência de acila e na síntese de ácidos graxos e oxidação, oxidação de piruvato e em outra acetilação.
Como usado aqui, o termo "substancialmente anaeróbio" quando usado em referência a uma cultura ou a uma condição de crescimento pre- tende significar que a quantidade de oxigênio é menos do que cerca de 10% de saturação para oxigênio dissolvido em meio líquido. O termo também pre- tende incluir câmaras lacradas de líquido ou meio sólido mantidas com uma atmosfera de menos do que cerca de 1% de oxigênio.
Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção podem conter alterações genéticas estáveis, as quais se referem a micro-organismos que podem ser cultivados para mais do que cinco gera- ções sem a perda da alteração. Geralmente, alterações genéticas estáveis incluem modificações que persistem mais do que 10 gerações, modificações particularmente estáveis persistirão mais do que cerca de 25 gerações e mais particularmente, modificações genéticas estáveis serão mais do que 50 gerações, incluindo indefinidamente.
Aqueles versados na técnica irão entender que as alterações genéticas, incluindo as modificações metabólicas exemplificadas aqui são descritas com referência a genes de E. coli e de levedura e suas reações metabólicas correspondentes. No entanto, dado o sequenciamento completo do genoma de uma ampla variedade de organismos e o alto nível de habili- dade na área de genômica, aqueles versados na técnica irão prontamente estar aptos para aplicar os ensinamentos e orientação fornecidas aqui para essencialmente todos os outros organismos. Por exemplo, as alterações me- tabólicas de E. coli exemplificadas aqui, podem prontamente ser aplicadas para outras espécies incorporando o mesmo ou ácido nucleico codificante análogo a partir de espécies diferentes outras que não as espécies de refe- rência. Tais alterações genéticas incluem, por exemplo, alterações genéticas de espécies homólogas, em geral, e em particular, ortólogos, parálogos ou deslocamentos de genes nonortólogos.
Um ortólogo é um gene ou genes que estão relacionados atra- vés de descida vertical e são responsáveis por substancialmente as mesmas ou funções idênticas em organismos diferentes. Por exemplo, epóxido hidro- lase de camundongo e epóxido hidrolase humana podem ser considerados ortólogos para a função biológica de hidrólise de epóxidos. Os genes estão relacionados através de descida vertical quando, por exemplo, eles compar- tilham similaridade de seqüência de quantidade suficiente para indicar eles são homólogos ou relacionados através de evolução a partir de um ancestral comum. Genes também podem ser considerados ortólogos se eles comparti- lharem de estrutura tridimensional mas não necessariamente de similaridade de seqüência, de uma quantidade suficiente indicar que eles evoluíram de um ancestral comum á extensão de que a similaridade de seqüência primá- ria não é identificável. Genes que são ortólogo podem codificar proteínas com similaridade de seqüência de cerca de 25% a 100% identidade de se- qüência de aminoácido. Genes que codificam proteínas que compartilham uma similaridade de aminoácido de menos que 25% também podem ser considerados que surgiram através de descida vertical se sua estrutura tri- dimensional também mostrar similaridades. Membros da família de enzimas de serina protease, incluindo ativador de plasminogênio de tecido e elastase, são considerados de terem surgido através de descida vertical a partir de um ancestral comum.
Ortólogos incluem genes ou seus produtos de gene codificados que, por exemplo, por evolução, divergiram em estrutura ou atividade global. Por exemplo, onde uma espécie codifica um produto de gene que exibe du- as funções e onde tais funções estiveram separadas em genes distintos em uma segunda espécie, é considerado que os três genes e seus produtos correspondentes são ortólogos. Para a produção de um produto bioquímico acoplado ao crescimento, aqueles versados na técnica irão entender que o gene ortólogo que abriga a atividade metabólica a ser rompida será escolhi- do para construção do micro-organismo que não ocorre naturalmente. Um exemplo de ortólogo que exibe atividades separáveis é onde atividades dis- tintas estiveram separadas em produtos de genes distintos entre duas ou mais espécies ou dentro de uma única espécie. Um exemplo específico é a separação de proteólise de elastase e proteólise de plasminogênio, dois ti- pos de atividade de serina protease, em moléculas distintas tal como ativa- dor de plasminogênio e elastase. Um segundo exemplo é a separação de micoplasma 5-3' exonuclease e atividade de Drosophila DNA polimerase III. A DNA polimerase a partir da primeira espécie pode ser considerada um or- tólogo para qualquer um ou ambas as exonuclease ou polimerase da segun- da espécie e vice-versa.
Em contraste, parálogos são homólogos relacionados, por e- xemplo, por duplicação seguida de divergência evolutiva e tem funções simi- lares ou comuns, mas não idênticas. Parálogos podem originar-se ou deri- var-se, por exemplo, da mesma espécie ou de uma espécie diferente. Por exemplo, epóxido hidrolase microsomal (epóxido hidrolase I) e epóxido hi- drolase solúvel (epóxido hidrolase II) podem ser considerados parálogos porque elas representam duas enzimas distintas, coevoluídas de um ances- tral comum que catalisa reações distintas e tem funções distintas nas mes- mas espécies. Parálogos são proteínas das mesmas espécies com similari- dade de seqüência significante de um ao outro sugerindo que eles são ho- mólogos ou relacionados por coevolução de um ancestral comum. Grupos de famílias de proteína de parálogos incluem homólogos de HipA, genes de luciferase, peptidases, e outros.
Um deslocamento de gene nonortólogo é um gene nonortólogo de uma espécie que podem substituir uma função de gene de referência em uma espécie diferente. Por exemplo, a substituição inclui a capacidade de executar substancialmente a mesma ou uma função similar nas espécies de origem comparadas à função de referência nas espécies diferentes. Embora geralmente, um deslocamento de gene nonortólogo será identificável como estruturalmente relacionado a um gene conhecido codificando a função de referência, menos estruturalmente relacionado, mas genes funcionalmente similares e seus produtos de gene correspondentes não obstante ainda cai- rão dentro do significado do termo como é usado aqui. A similaridade funcio- nal requer, por exemplo, um pouco de similaridade estrutural pelo menos no sítio ativo ou região de ligação de um gene nonortólogo comparado a um gene que codifica a função a ser substituída. Portanto, um gene nonortólogo inclui, por exemplo, um parálogo ou um gene não-relacionado.
Portanto, identificando e construindo os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção que possuem capacidade bios- sintética de 4-HB, GBL e/ou BDO, aqueles versados na técnica irão entender que, com a aplicação do ensino e orientação fornecida aqui para uma espé- cie particular, que a identificação de modificações metabólicas pode incluir a identificação e inclusão ou a inativação de ortólogos. Para a extensão que parálogos e/ou deslocamentos do gene nonortólogo estão presentes no mi- cro-organismo de referência que codifica uma enzima que catalisa uma rea- ção metabólica similar ou substancialmente similar, aqueles versados na técnica também podem utilizar estes genes evolucionalmente relacionados.
Ortólogos, parálogos e deslocamentos de gene nonortólogo po- dem ser determinados por métodos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a inspeção de ácido nucleico ou seqüências de aminoácido para dois polipeptídeos irá revelar a identidade de seqüência e similaridades entre as seqüências comparadas. Baseado em tais similarida- des, uma pessoa versada na técnica pode determinar se a similaridade é suficientemente alta para indicar se as proteínas estão relacionadas por evo- lução a partir de um ancestral comum. Algoritmos bem-conhecidos por aque- les versados na técnica, tais como Align, BLAST, Clustal W e outros compa- ram e determinam uma similaridade de seqüência bruta ou identidade e também determina a presença ou significação de espaços na seqüência que podem ser assinalados em peso ou pontuação. Tais algoritmos também são conhecidos na técnica e são similarmente aplicáveis para determinar a simi- laridade ou identidade de seqüência de nucleotídeos. São computados pa- râmetros para similaridade suficiente para determinar a relação baseado em métodos bem-conhecidos para o cálculo da similaridade estatística, ou a chance de encontrar uma similaridade de emparelhamento em um polipeptí- deo aleatório, e a significância do emparelhamento é determinada. Uma comparação de computador de duas ou mais seqüências pode, se desejado, também ser aperfeiçoada visualmente por aqueles versados na técnica. Po- dem ser esperados produtos de gene relacionados ou proteínas com uma similaridade alta, por exemplo, de 25% a 100% de identidade de seqüência. Proteínas que são não relacionadas podem ter uma identidade igual à qual seria essencialmente esperada que ocorresse naturalmente, se um banco de dados de tamanho suficiente é analisado (cerca de 5%). Seqüências entre 5% e 24% podem ou não podem representar homologia suficiente para con- cluir que as seqüências comparadas estão relacionadas. Análise estatística adicional para determinar a significância de tal emparelhamento dado o ta- manho do conjunto de dados pode ser realizado para determinar a relevân- cia destas seqüências.
Parâmetros exemplares para determinar a relação de duas ou mais seqüências que usam o algoritmo BLAST, por exemplo, podem estar adiante como apresentado abaixo. Resumidamente, pode ser executado o alinhamento de seqüência de aminoácido usando a versão de BLASTP 2.0.8 (Jan-05-1999) e os seguintes parâmetros: Matriz: 0 BLOSUM62; espaço a - berto: 11; extensão do espaço: 1; x_dropoff: 50; expectativa: 10,0; tamanho da palavra: 3; filtro: ligado. Alinhamentos de seqüência de ácidos nucleicos podem ser executado usando a versão de BLASTN 2.0.6 (Setembro-16 - 1998) e os seguintes parâmetros: emparelhamento: 1; desemparelhamento: -2; espaço aberto: 5; extensão do espaço: 2; x_dropoff: 50; expectativa: 10,0; tamanho da palavra: 11; filtro: desligado. Aqueles versados na técnica saberão que modificações podem ser feitas aos parâmetros anteriores ou aumentar ou diminuir a estringência da comparação, por exemplo, e deter- mina a relação de duas ou mais seqüências.
A invenção fornece um biocatalisador microbiano que não ocorre naturalmente incluindo um organismo microbiano que tem uma via biossinté- tica de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que inclui pelo menos um ácido nu- cleico exógeno codificando 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase CoA-independente, succinil-CoA sintetase, semial- deído succínico desidrogenase CoA-dependente, glutamato:succínico semi- aldeído transaminase, alfa-cetoglutarato descarboxilase ou glutamato des- carboxilase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades suficientes para produzir o ácido 4-hidroxibutanoico monomérico (4-HB). A 4- hidroxibutanoato desidrogenase também é chamada 4-hidroxibutirato desi- drogenase ou 4-HB desidrogenase. A succinil-CoA sintetase também é chamada de succinil-CoA sintase ou de succinil-CoA ligase.
Também é fornecido um biocatalisador microbiano que não ocor- re naturalmente incluindo um organismo microbiano que tem uma via bios- sintética de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que tem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4-hidroxibutanoato desidrogenase, succinil- CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente, ou a- cetoglutarato descarboxilase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades suficientes para produzir ácido 4-hidroxibutanoico monomé- rico (4-HB).
O biocatalisador microbiano que não ocorre naturalmente da in- venção inclue organismos microbianos que empregam combinações das reações metabólicas para biossinteticamente produzir os compostos da in- venção. Os compostos biossintetizados podem ser produzidos intracelular- mente e/ou secretado no meio de cultura. Compostos exemplares produzi- dos pelos micro-organismos que não ocorrem naturalmente incluem, por e- xemplo, ácido 4-hidroxibutanoico, 1,4-butanodiol, e γ-butirolactona. As rela- ções desses compostos exemplares com respeito a síntese química ou bios- síntese são exemplificadas na Figura 1.
Em uma modalidade, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente é criado para produzir 4-HB. Este composto é um ponto de entrada útil na família de compostos de 1,4-butanodiol. As reações bioquími- cas para formação de succinato de 4-HB, succinil-CoA succinato ou a- cetoglutarato é mostrado nas etapas 1-8 da Figura 2.
A invenção é descrita aqui com referência geral à reação meta- bólica, reagente ou produto da mesma, ou com referência específica para um ou mais ácidos nucleicos ou genes que codificam uma enzima associada ou com a catálise da reação metabólica de referência, reagente ou produto da mesma. A menos que de outra forma expressamente declarado aqui, a- queles versados na técnica também irão entender aquela referência a uma reação constitui referência aos reagentes e produtos da reação. Similarmen- te, a menos que de outra forma expressamente declarado aqui, a referência para um reagente ou produto também se refere à reação e aquela referência para quaisquer destes metabólitos também constituem referências ao gene ou genes que codificam as enzimas que catalisam a reação de referência, reagente ou produto. Igualmente, determinado os campos bem-conhecidos de bioquímica metabólica, enzimologia e genômica, referência aqui para um gene ou também codificando ácido nucleico constitui uma referência à enzi- ma codificada correspondente e a reação catalisa como também os reagen- tes e produtos da reação.
A produção de 4-HB por meios biossintéticos que usam os orga- nismos microbianos da invenção é particularmente útil porque pode produzir 4-HB monomérico. Os organismos microbianos que não ocorrem natural- mente da invenção e sua biossíntese de compostos das famílias de 4-HB e BDO também são particularmente úteis porque o produto de 4-HB é (1) se- cretado; (2) pode ser destituído de qualquer derivatização com a Coenzima A; (3) evita mudanças termodinâmicas durante a biossíntese; (4) permite a biossíntese direta de BDO, e (5) permite a conversão química espontânea de 4-HB para γ-butirolactona (GBL) em meio de pH ácido. Esta característica posterior também é particularmente útil para síntese química eficiente ou biossíntese de compostos da família de BDO tal como 1,4-butanodiol e/ou tetra-hidrofurano (THF), por exemplo.
Organismos microbianos geralmente carecem da capacidade para sintetizar 4-HB e então, quaisquer dos compostos mostrados na Figura 1 são conhecidos por estarem dentro da família de compostos de 1,4- butanodiol ou conhecidos por aqueles versados na técnica por estarem den- tro da família de compostos de 1,4-butanodiol. Além disso, organismos que possuem todos os requisito metabólicos enzimáticos não são conhecidos por produzir 4-HB a partir das enzimas descritas e vias bioquímicas exemplifica- das aqui. Como descrito acima, a biossíntese de 4-HB em sua forma mono- mérica não só é particularmente útil na síntese química da família de com- postos de BDO, mas também permite a biossíntese adicional de compostos da família de BDO e evita completamente procedimentos de síntese quími- ca.
Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente que podem produzir 4-HB são produzidos assegurando que um organismo mi- crobiano inclui capacidades funcionais para a síntese bioquímica completa de pelo menos uma via biossintética de 4-HB da invenção. Assegurando que pelo menos um requisito da via biossintética de 4-HB confere capacidade biossintética de 4-HB sobre o organismo microbiano hospedeiro.
Cinco requisitos das vias biossintéticas de 4-HB são exemplifi- cados aqui e mostrados para propósitos de ilustração na Figura 2. Um requi- sito da via biossintética de 4-HB inclui a biossíntese de 4-HB a partir de suc- cinato (a via do succinato). As enzimas que participam desta via de 4-HB inclui semialdeído succínico desidrogenase CoA-independente e 4- hidroxibutanoato desidrogenase. Nesta via, a semialdeído succínico desi- drogenase CoA-independente catalisa a reação reversa à seta mostrada na Figura 2. Outro requisito da via biossintética de 4-HB inclui a biossíntese a partir de succinato por meio de succinil-CoA (a via do succinil-CoA). As en- zimas que participam desta via de 4-HB incluem succinil-CoA sintetase, se- mialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente e 4-hidroxibutanoato desidrogenase. Três outros requisito das vias biossintéticas de 4-HB incluem a biossíntese de 4-HB a partir de α-cetoglutarato (as vias do a- cetoglutarato). Consequentemente, um terceiro requisito da via biossintética de 4-HB é a biossíntese de semialdeído succínico por meio de glutama- to:succínico semialdeído transaminase, glutamato descarboxilase e 4- hidroxibutanoato desidrogenase. Um quarto requisito da via biossintética de 4-HB também inclui a biossíntese de 4-HB a partir de α-cetoglutarato, mas utiliza α-cetoglutarato descarboxilase para catalisar a síntese de semialdeído succínico. 4-hidroxibutanoato desidrogenase catalisa a conversão do semi- aldeído succínico para 4-HB. Um quinto requisito da via biossintética 4-HB inclui a biossíntese a partir de α-cetoglutarato por meio de succinil-CoA e utiliza α-cetoglutarato desidrogenase para produzir succinil-CoA, o que foca- liza na via de succinil-CoA descrita acima. Cada uma dessas vias de 4-HB, seus substratos, reagentes e produtos são ainda descritos abaixo nos E- xemplos.
Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção podem ser produzidos pela introdução de ácidos nucleicos expres- síveis que codificam uma ou mais das enzimas que participam de uma ou mais das vias biossintéticas de 4-HB. Dependendo do organismo microbiano hospedeiro escolhido para biossíntese, os ácidos nucleicos para algumas ou todas de uma via biossintética de 4-HB particular podem ser expressos. Por exemplo, se um hospedeiro escolhido é deficiente em ambas as enzimas na via de succinato para 4-HB e esta via é selecionada para a biossíntese de 4- HB, então ácidos nucleicos expressíveis para ambos semialdeído succínico desidrogenase CoA-independente e 4-hidroxibutanoato desidrogenase são introduzidos no hospedeiro para subsequente expressão exógena. Alternati- vamente, se o hospedeiro escolhido exibe semialdeído succínico desidroge- nase CoA-independente endógeno, mas é deficiente em 4-hidroxibutanoato desidrogenase então um ácido nucleico codificante é necessário para esta enzima para alcançar a biossíntese de 4-HB.
De maneira similar, onde a biossíntese de 4-HB é selecionada para ocorrer através da via de succinato para succinil-CoA (a via do succinil- CoA), ácidos nucleicos codificantes para deficiências de hospedeiro nas en- zimas succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase CoA- dependente e/ou 4-hidroxibutanoato desidrogenase são para ser exogena- mente expressos no hospedeiro receptor. A seleção da biossíntese de 4-HB através da via de α-cetoglutarato para semialdeído succínico (a via do α- cetoglutarato) pode utilizar expressão exógena para deficiências de hospe- deiro em uma ou mais das enzimas para glutamato:succínico semialdeído transaminase, glutamato descarboxilase e/ou 4-hidroxibutanoato desidroge- nase, ou α-cetoglutarato descarboxilase e 4-hidroxibutanoato desidrogena- se.
Dependendo dos costituintes da via biossintética de 4-HB de um organismo microbiano hospedeiro selecionado, o biocatalisador microbiano de 4-HB que não ocorre naturalmente da invenção irá incluir pelo menos um ácido nucleico codificante da via de 4-HB exogenamente expresso e até to- dos os ácidos nucleicos codificantes para uma ou mais vias biossintéticas de 4-HB. Por exemplo, a biossíntese de 4-HB pode ser estabelecida a partir de todas as cinco vias em um hospedeiro deficiente em 4-hidroxibutanoato de- sidrogenase através de expressão exógena de um ácido nucleico que codifi- ca 4-hidroxibutanoato desidrogenase. Em contraste, a biossíntese de 4-HB pode ser estabelecida a partir de todas as cinco vias em um hospedeiro defi- ciente em todas as oito enzimas através da expressão exógena de todas os oito de semialdeído succínico desidrogenase CoA-independente, succinil- CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente, glu- tamato:succínico semialdeído transaminase, glutamato descarboxilase, α- cetoglutarato descarboxilase, α-cetoglutarato desidrogenase e 4- hidroxibutanoato desidrogenase.
Dado os ensinamentos e orientações fornecidas aqui, aqueles versados na técnica irão entender que o número de ácidos nucleicos codifi- cantes para introduzir em uma forma expressível irão, ao menos, comparar as deficiências da via de 4-HB do organismo microbiano hospedeiro selecio- nado. Portanto, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção pode ter um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito ácidos nu- cleicos que codificam as enzimas acima constituindo uma ou mais das vias biossintéticas de 4-HB. Em algumas modalidades, os organismos microbia- nos que não ocorrem naturalmente também podem incluir outras modifica- ções genéticas que facilitam ou aperfeiçoam a biossíntese de 4-HB ou que confira outras funções úteis sobre o organismo microbiano hospedeiro. Uma outra funcionalidade pode incluir, por exemplo, o aumento da síntese de um ou mais dos precursores da via de 4-HB tal como succinato, succinil-CoA e/ou a-cetoglutarato.
Em algumas modalidades, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção é gerado a partir de um hospedeiro que contém a capacidade enzimática para sintetizar 4-HB. Nesta modalidade específica isto pode ser útil para aumentar a síntese ou o acúmulo de um produto da via de 4-HB para, por exemplo, direcionar as reações da via de 4- HB para a produção de 4-HB. Síntese ou acúmulo aumentado pode ser al- cançado através de, por exemplo, superexpressão de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais das enzimas da via de 4-HB descritas acima. A su- perexpressão da enzima ou enzimas da via de 4-HB pode acontecer, por exemplo, através da expressão exógena do gene ou genes endógenos, ou através da expressão exógena do gene ou de genes heterólogos. Portanto, organismos que ocorrem naturalmente podem ser prontamente gerados para ser organismos microbianos que não ocorrem naturalmente produtores de 4- HB da invenção através da superexpressão de um, dois, três, quatro, cinco ou todos os seis ácidos nucleicos que codificam as enzimas da via biossinté- tica de 4-HB. Além disso, um organismo que não ocorre naturalmente pode ser gerado por mutagênese de um gene endógeno que resulta em um au- mento na atividade de uma enzima na via biossintética de 4-HB.
Em modalidades particularmente úteis, a expressão exógena de ácidos nucleicos codificantes é empregada. A expressão exógena confere a habilidade de adequar a expressão e/ou elementos reguladores para o hos- pedeiro e aplicação para alcançar um nível de expressão desejado que é controlado pelo usuário. Porém, a expressão endógena também pode ser utilizada em outras modalidades tal como pela remoção de um efetor regula- tório negativo ou indução do promotor do gene quando ligado a um promotor induzível ou outro elemento regulatório. Assim, um gene endógeno que tem um promotor induzível que ocorre naturalmente pode ser supra-regulado provendo o agente de indução apropriado, ou a região regulatória de um ge- ne endógeno pode ser projetada para incorporar um elemento regulatório induzível, dessa forma permitindo o regulamento da expressão aumentada de um gene endógeno em um momento desejado. Similarmente, um promo- tor induzível pode ser incluído como um elemento regulatório para um gene exógeno introduzido em um organismo microbiano que não ocorre natural- mente (veja, por exemplo, os Exemplos II e IV).
"Exógeno" como é aqui usado pretende significar que a molécula de referência ou a atividade de referência é introduzida no organismo micro- biano hospedeiro incluindo, por exemplo, a introdução de um ácido nucleico codificante no material genético hospedeiro tal como pela integração em um cromossomo de hospedeiro. Portanto, o termo como é usado em referência à expressão de um ácido nucleico codificante refere-se à introdução da codi- ficação ácido nucleico em uma forma expressível dentro do organismo mi- crobiano. Quando usado em referência a um atividade biossintética, o termo refere-se a uma atividade que é introduzida no organismo hospedeiro de referência. A fonte pode ser, por exemplo, um ácido nucleico codificante ho- mólogo ou heterólogo que expressa a atividade de referência seguindo a introdução no organismo microbiano hospedeiro. Portanto, o termo "endóge- no" refere-se a uma molécula ou atividade de referência que está presente no hospedeiro. Similarmente, o termo quando usado em referência à ex- pressão de um ácido nucleico codificante refere-se à expressão de um ácido nucleico codificante contido no organismo microbiano. O termo "heterólogo" refere-se a uma molécula ou atividade derivado de uma fonte diferente das espécies de referência, onde "homólogo" refere-se a uma molécula ou ativi- dade derivado do organismo microbiano hospedeiro. Consequentemente, a expressão exógena de um ácido nucleico codificante da invenção pode utili- zar qualquer um ou ambos um heterólogo ou um ácido nucleico codificante homólogo.
Fontes de ácidos nucleicos codificantes para uma enzima da via de 4-HB pode incluir, por exemplo, qualquer espécie onde o produto do gene codificado é capaz de catalisar a reação de referência. Tais espécies inclu- em organismos procarióticos e eucarióticos incluindo, mas não limitados a, bactérias, incluindo archaea e eubactéria, e eucariotas, incluindo levedura, planta, inseto, animal e mamífero, incluindo ser humano. Espécies exempla- res para tais fontes incluem, por exemplo, E. coli, Saccharomyces cerevisia- e, Clostridium kluyveri, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium perfringens, Ciostridi- um diffieile, Ralstonia eutropha, Myeobaeterium bovis, Myeobaeterium tuber- eulosis e Porphyromonas gingivalis. Por exemplo, os organismos microbia- nos que têm produção biossintética de 4-HB são exemplificados aqui com referência aos hospedeiros de E. coli e de levedura. Entretanto, com a se- quência completa do genoma disponível para agora mais de 550 espécies (com mais da metade destas disponíveis em bancos de dados públicos co- mo o NCBI), incluindo 395 genomas de micro-organismos e uma variedade de genomas de leveduras, fungos, plantas e mamíferos, a identificação dos genes que codificam a atividade biossintética de 4-HB requerida para um ou mais genes em espécies relacionadas ou distantes, incluindo por exemplo, homólogos, ortólogos, parálogos e deslocamentos de genes nonortólogos desses genes conhecidos, e o intercâmbio de alterações genéticas entre os organismos são rotineiras e bem-conhecidas na técnica. Consequentemen- te, as alterações metabólicas que habilitam a biossíntese de 4-HB e outros 20 compostos da invenção descritos aqui com referência a um organismo parti- cular tal como E. coli ou levedura podem prontamente ser aplicados a outros micro-organismos, incluindo organismos procarióticos e eucarióticos simila- res. Dados os ensinamentos e orientações fornecidas aqui, aqueles versa- dos na técnica irão saber que uma alteração metabólica exemplificada em um organismo, pode ser aplicado igualmente a outros organismos.
Em alguns exemplos, tal como quando uma via biossintética de 4-HB alternativa existe em uma espécie não relacionada, a biossíntese de 4- HB pode ser conferida sobre espécies hospedeiras, por exemplo, por ex- pressão exógena de um parálogo ou parálogos a partir das espécies não relacionadas que catalisam uma reação metabólica similar, embora não- idêntica para substituir a reação de referência. Porque certas diferenças en- tre redes metabólicas existem entre organismos diferentes, aqueles versa- dos na técnica irão entender que o uso atual de genes entre organismos di- ferentes pode diferir. Entretanto, dado os ensinamentos e orientações forne- cidas aqui, aqueles versados na técnica também irão entender que os ensi- namentos e métodos da invenção podem ser aplicados para todos os orga- nismos microbianos que usam alterações metabólicas cognatas àquelas e- xemplificadas aqui para construir um organismo microbiano em uma espécie de interesse que irá sintetizar 4-HB monomérico.
Organismos microbianos hospedeiros podem ser selecionados a partir de, e os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente po- dem ser gerados em, por exemplo, bactérias, leveduras, fungos ou qualquer um de uma variedade de outros micro-organismos aplicáveis a processos de fermentação. Bactérias exemplares incluem espécies selecionadas de E. coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succinicoiproducens, Actinobacil- lus succinogenes, Mannheimia succinicoiproducens, Rhizobium etli, Bacilo subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelico- lor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas putida. Leveduras ou fungos exemplares incluem espécies selecionadas de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger e Pi- chia pastoris.
Podem ser realizados métodos para construir e testar níveis de expressão de um hospedeiro que não ocorre naturalmente produtor de 4-HB, por exemplo, por métodos recombinantes e de detecção bem-conhecidos na técnica. Tais métodos podem ser encontrados descritos em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel et al., Current Proto- cols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999). 4-HB e GBL podem ser separados por, por exemplo, HPLC usando uma coluna Spherisorb 5 ODS1 e uma fase móvel de 70% de tampão fosfato de 10 mM (pH =7) e 30% de metanol, e detectado usando um detector de UV a 215 nm (Hennessy et al. 2004, J. Forensic Sei. 46(6):1-9). BDO é detectado por cro- matografia a gás ou por HPLC e detector de índice refrativo usando uma coluna Aminax HPX-87H e uma fase móvel de ácido sulfúrico a 0,5 mM (Gonzalez-Pajuelo et al., Met. Eng.7:329-336 (2005)).
Por exemplo, um vetor ou vetores de expressão podem ser construídos para abrigar uma ou mais vias biossintéticas de 4-HB e/ou um ou mais ácidos nucleicos codificando BDO biossintético como exemplificado aqui operavelmente ligado a seqüências de controle de expressão funcionais no organismo hospedeiro. Vetores de expressão aplicáveis para uso nos organismos microbianos hospedeiros da invenção incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores de fago, vetores virais, epissomos e cromossomos arti- ficiais, incluindo vetores e seqüências de seleção ou marcadores operáveis para integração estável em um cromossomo hospedeiro. Também podem ser incluídos genes de marcador selecionávéis que, por exemplo, forneçam resistência a antibióticos ou toxinas, deficiências auxotróficas de comple- mento, ou forneçam nutrientes críticos não no meio de cultura. Seqüências de controle de expressão podem incluir promotores constitutivos e induzí- veis, evidenciadores de transcrição, terminadores de transcrição, e seme- lhantes, os quais são bem-conhecidos na técnica. Quando dois ou mais áci- dos nucleicos codificantes exógenos irão ser co-expressos, ambos os ácidos nucleicos podem ser inseridos, por exemplo, em um único vetor de expres- são ou em vetores de expressão separados. Para expressão em um único vetor, os ácidos nucleicos codificantes podem ser operacionalmente ligados uma seqüência de controle de expressão comum ou ligado a seqüências de controle de expressão diferentes, tais como um promotor induzível e um promotor constitutivo. A transformação das seqüências de ácido nucléicas exógenas envolvidas em uma via metabólica ou sintética pode ser confirma- da usando métodos bem-conhecidos na técnica.
Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção são construídos usando métodos bem-conhecidos na técnica como exemplificado acima para expressar exogenamente pelo menos um ácido nucleico codificando uma enzima da via de 4-HB em quantidades suficientes produzir 4-HB monomérico. Níveis de expressão exemplares para enzimas de 4-HB em cada via são ainda descritos abaixo nos Exemplos. Seguindo os ensinamentos e orientações fornecidas aqui, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção podem alcançar a biossíntese de 4- HB monomérico resultando em concentrações intracelulares entre cerca de 0,1-25 mM ou mais. Geralmente, a concentração intracelular de 4-HB mo- nomérico está entre cerca de 3-20mM, particularmente entre cerca de 5-15 mM e mais particularmente entre cerca de 8-12 mM, incluindo cerca de 10 mM ou mais. Concentrações intracelulares entre e acima de cada uma des- tas faixas exemplares também podem ser alcançadas a partir dos organis- mos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção.
Como ainda descrito abaixo, uma condição de crescimento e- xemplar para alcançar a biossíntese de 4-HB inclui a cultura anaeróbica ou condições de fermentação. Em certas modalidades, os organismos microbi- anos que não ocorrem naturalmente da invenção podem ser sustentados, cultivados ou fermentados sob condições anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas. Resumidamente, condições anaeróbicas referem-se a um am- biente destituído de oxigênio. Por exemplo, condições substancialmente a- naeróbicas incluem, uma cultura, fermentação em batelada ou fermentação contínua de tal forma que a concentração de oxigênio dissolvida no meio permanece entre 0 e 10% de saturação. Condições substancialmente anae- róbicas também incluem o crescimento ou o descanso de células em meio líquido ou em ágar sólido dentro de uma câmara selada mantida com uma atmosfera de menos que 1% de oxigênio. Os percentuais de oxigênio podem ser mantidos por, por exemplo, aspergindo a cultura com uma misura de N2/CO2 ou outro gás ou gases não-oxigênio satisfatórios.
A invenção também fornece um biocatalisador microbiano que não ocorre naturalmente incluindo um organismo microbiano que tem vias biossintéticas de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO) que incluem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4- hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase CoA- independente, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico CoA- dependente desidrogenase, 4-hidroxibutirato: CoA transferase, glutama- to:succínico semialdeído transaminase, glutamato descarboxilase, aldeído desidrogenase CoA-independente, aldeído desidrogenase CoA-dependente ou álcool desidrogenase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades suficientes para produzir 1,4-butanodiol (BDO). 4- Hidroxibutirato: CoA transferase também é conhecido como 4-hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferase.
A invenção ainda fornece um biocatalisador microbiano que não ocorre naturalmente incluindo um organismo microbiano que tem vias bios- sintéticas do ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO), as vias incluem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4- hidroxibutanoato desidrogenase, succinil-CoA sintetase, succínico CoA- dependente, desidrogenase de semialdeído, 4-hidroxibutirato: CoA transfe- rase, 4-butirato quinase, fosfotransbutirilase, α-cetoglutarato descarboxilase, aldeído desidrogenase, álcool desidrogenase ou um aldeído/álcool desidro- genase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades sufi- cientes para produzir 1,4-butanodiol (BDO).
Também podem ser gerados organismos microbianos que não ocorrem naturalmente os quais biossintetizam BDO. Como com os organis- mos microbianos que produzem 4-HB da invenção, os organismos microbia- nos que produzem BDO também podem produzir intracelularmente ou secre- tar o BDO no meio de cultura. Seguindo os ensinamentos e orientações pre- viamente fornecidas para a construção de organismos microbianos que sin- tetizam 4-HB, vias adicionais de BDO podem ser incorporadas nos organis- mos microbianos que produzem 4-HB para gerar organismos que também sintetizam BDO e outros compostos da família do BDO. A síntese química de BDO e seus produtos a jusante são ilustrados na Figura 1. Os organis- mos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção capazes de biossintetisar BDO evitam esta síntese química que usa 4-HB como um pon- to de entrada como ilustrado na Figura 2. Como ainda descrito abaixo, os produtores de 4-HB também podem ser ainda usados para converter quimi- camente 4-HB para GBL e então de BDO ou THF, por exemplo. Alternativa- mente, os produtores de 4-HB ainda podem ser modificados para incluir ca- pacidades biossintéticas para a conversão de 4-HB e/ou GBL para BDO.
As vias adicionais de BDO para introduzir produtores de 4-HB incluem, por exemplo, a expressão exógena em um hospedeiro antecedente deficiente ou a superexpressão de uma ou mais das enzimas exemplificadas na Figura 2 como etapas 9-13. Uma de tal via inclui, por exemplo, as ativi- dades enzimáticas necessárias para realizar as reações mostradas como as etapas 9, 12 e 13 na Figura 2, onde os aldeído e álcool desidrogenases po- dem ser enzimas separadas ou uma enzima multifuncional que tem ambas as atividades de aldeído e de álcool desidrogenase. Outra de tal via inclui, por exemplo, as atividades enzimáticas necessárias para realizar as reações mostradas como as etapas 10, 11, 12 e 13 na Figura 2, também onde as aldeído e álcool desidrogenases podem ser enzimas separadas ou uma en- zima multifuncional que tem ambas as atividades de aldeído e álcool desi- drogenase. Consequentemente, as vias de BDO adicionais para introduzir em produtores de 4-HB incluem, por exemplo, a expressão exógena em um hospedeiro antecedente deficiente ou a superexpressão de uma ou mais de uma 4-hidroxibutirato: CoA transferase, butirato quinase, fosfotransbutirilase, aldeído desidrogenase CoA-independente, aldeído desidrogenase CoA- dependente ou um álcool desidrogenase. Na ausência de acil-CoA sintetase endógena capaz de modificar 4-HB, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente produtores de BDO ainda podem incluir uma acil-CoA sintetase exógena seletiva para 4-HB, ou a combinação de enzimas múlti- plas que têm como uma reação de conversão em rede de 4-HB para 4-HB- CoA. Como ainda exemplificado abaixo nos Exemplos, butirato quinase e fosfotransbutirilase exibem atividade de via de BDO e catalisam as conver- sões ilustradas na Figura 2 com um substrato 4-HB. Portanto, estas enzimas também podem se referir aqui como 4-hidroxibutirato quinase e fosfotranshi- droxibutirilase, respectivamente.
São listadas abaixo na Tabela 1 álcool e aldeído desidrogenases exemplares que podem ser usadas para estas conversões in vivo a partir de 4-HB para BDO.
Tabela 1. Álcool e aldeído desidrogenases para conversão de 4-HB para BDO.
ÁLCOOL DESIDROGENASES
ec:1. 1.1.1 álcool desidrogenase ec:1. 1.1.2 álcool desidrogenase (NADP+) ec:1. 1.1.4 (R,R)-butanodiol desidrogenase ec:1. 1.1.5 acetoína desidrogenase ec:1. 1.1.6 glicerol desidrogenase ec:1. 1.1.7 propanodiol-fosfato desidrogenase ec:1. 1.1.8 glicerol-3-fosfato desidrogenase (NAD+) ec:1. 1.1.11 D-arabinitol 4-desidrogenase ec:1. 1.1.12 L-arabinitol 4-desidrogenase ec:1. 1.1.13 L-arabinitol 2-desidrogenase ec:1. 1.1.14 L-iditol 2-desidrogenase ec:1. 1.1.15 D-iditol 2-desidrogenase ec:1. 1.1.16 galactitol 2-desidrogenase ec:1. 1.1.17 manitol-1 -fosfato 5-desidrogenase ec:1. 1.1.18 inositol 2-desidrogenase ec:1. 1.1.21 aldeído redutase ec:1. 1.1.23 histidinol desidrogenase ec:1. 1.1.26 glioxilato redutase ec:1. 1.1.27 L-Iactato desidrogenase ec:1. 1.1.28 D-Iactato desidrogenase ec:1. 1.1.29 glicerato desidrogenase ec:1. 1.1.30 3-hidroxibutirato desidrogenase ec:1. 1.1.31 3-hidroxiisobutirato desidrogenase ec:1. 1.1.35 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase ec:1. 1.1.36 acetoacetil-CoA redutase ec:1. 1.1.37 malato desidrogenase ec:1. 1.1.38 malato desidrogenase (oxaloacetato-descarboxilação) ec:1. 1.1.39 malato desidrogenase (descarboxilação) ec:1. 1.1.40 malato desidrogenase (oxaloacetato-descarboxilação)
(NADP+) ec:1.1.1.41 isocitrato desidrogenase (NAD+) ec:1.1.1.42 isocitrato desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.54 alil-álcool desidrogenase ec:1.1.1.55 lactaldeído redutase (NADPH) ec:1.1.1.56 ribitol 2-desidrogenase ec:1.1.1.59 3-hidroxipropionato desidrogenase ec:1.1.1.60 2-hidróxi-3-oxopropionato redutase ec:1.1.1.61 4-hidroxibutirato desidrogenase ec:1.1.1.66 omega-hidroxidecanoato desidrogenase ec:1.1.1.67 manitol 2-desidrogenase ec:1.1.1.71 álcool desidrogenase [NAD(P)+] ec:1.1.1.72 glicerol desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.73 octanol desidrogenase ec:1.1.1.75 (R)-aminopropanol desidrogenase ec:1.1.1.76 (S.S)-butanodiol desidrogenase ec:1.1.1.77 lactaldeído redutase ec:1.1.1.78 metilglioxal redutase (NADH-dependente) ec:1.1.1.79 glioxilato redutase (NADP+) ec:1.1.1.80 isopropanol desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.81 hidroxipiruvato redutase ec:1.1.1.82 malato desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.83 D-malato desidrogenase (descarboxilação) ec:1.1.1.84 dimetilmalato desidrogenase ec:1.1.1.85 3-isopropilmalato desidrogenase ec:1.1.1.86 cetol-ácido reductoisomerase ec:1.1.1.87 homoisocitrato desidrogenase ec:1.1.1.88 hidroximetilglutaril-CoA redutase ec:1.1.1.90 aril-álcool desidrogenase ec:1.1.1.91 aril-álcool desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.92 oxaloglicolato redutase (descarboxilação) ec:1.1.1.94 glicerol-3-fosfato desidrogenase [NAD(P)+] ec:1.1.1.95 fosfoglicerato desidrogenase <table>table see original document page 32</column></row><table> ec:1. .1.202 1.3-propanodiol desidrogenase ec:1. .1.207 (-)-mentol desidrogenase ec:1. .1.208 (+)-neomentol desidrogenase ec:1. .1.216 farnesol desidrogenase ec:1. .1.217 benzil-2-metil-hidroxibutirato desidrogenase ec:1. .1.222 (R)-4-hidroxifenilactato desidrogenase ec:1. .1.223 isopiperitenol desidrogenase ec:1. .1.226 4-hidroxiciclohexanocarboxilato desidrogenase ec:1. .1.229 dietil 2-metil-3-oxossuccinato redutase ec:1. .1.237 hidroxifenilpiruvato redutase ec:1. .1.244 metanol desidrogenase ec:1. .1.245 ciclohexanol desidrogenase ec:1. .1.250 D-arabinitol 2-desidrogenase ec:1. .1.251 galactitol 1-fosfato 5-desidrogenase ec:1. .1.255 manitol desidrogenase ec:1. .1.256 fluoren-9-ol desidrogenase ec:1. .1.257 4-(hidroximetil)benzenossulfonato desidrogenase ec:1. .1.258 6-hidroxihexanoato desidrogenase ec:1. .1.259 3-hidroxipimeloil-CoA desidrogenase ec:1. .1.261 glicerol-1-fosfato desidrogenase [NAD(P)+] ec:1. .1.265 3-metilbutanal redutase ec:1. .1.283 metilglioxal redutase (NADPH-dependente) ec:1. .1.286 isocitrato-homoisocitrato desidrogenase ec:1. .1.287 D-arabinitol desidrogenase (NADP+) butanol desidroge- nase
ALDEÍDO DESIDROGENASES ec:1.2.1.2 formiato desidrogenase ec:1.2.1.3 aldeído desidrogenase (NAD+) ec:1.2.1.4 aldeído desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.5 aldeído desidrogenase [NAD(P)+] ec:1.2.1.7 benzaldeído desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.8 betaína-aldeído desidrogenase ec:1.2.1.9 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (NADP+)
ec:1.2.1.10 acetaldeído desidrogenase (acetilação)
ec:1.2.1.11 aspartato-semialdeído desidrogenase
ec:1.2.1.12 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (fosforilação)
ec: 1.2.1.13 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (NADP+) (fosfori- lação)
ec:1.2.1.15 malonato-semialdeído desidrogenase
ec:1.2.1.16 succinato-semialdeído desidrogenase [NAD(P)+]
ec:1.2.1.17 glioxilato desidrogenase (acilação)
ec:1.2.1.18 malonato-semialdeído desidrogenase (acetilação)
ec:1.2.1.19 aminobutiraldeído desidrogenase
ec:1.2.1.20 glutarato-semialdeído desidrogenase
ec:1.2.1.21 glicolaldeído desidrogenase
ec:1.2.1.22 lactaldeído desidrogenase
15 ec:1.2.1.23 2-oxoaldeído desidrogenase (NAD+)
ec: 1.2.1.24 succinato-semialdeído desidrogenase
ec: 1.2.1.25 2-oxoisovalerato desidrogenase (acilação)
ec:1.2.1.26 2,5-dioxovalerato desidrogenase
ec:1.2.1.27 metilmalonato-semialdeído desidrogenase (acilação)
ec:1.2.1.28 benzaldeído desidrogenase (NAD+)
ec:1.2.1.29 aril-aldeído desidrogenase
ec:1.2.1.30 aril-aldeído desidrogenase (NADP+)
ec:1.2.1.31 L-aminoadipato-semialdeído desidrogenase
ec:1.2.1.32 aminomuconato-semialdeído desidrogenase
ec:1.2.1.36 retinal desidrogenase
ec:1.2.1.39 fenilacetaldeído desidrogenase
ec:1.2.1.41 glutamato-5-semialdeído desidrogenase
ec:1.2.1.42 hexadecanal desidrogenase (acilação)
ec:1.2.1.43 formiato desidrogenase (NADP+)
ec:1.2.1.45 4-carbóxi-2-hidroximuconato-6-semialdeído desidroge- nase
ec:1.2.1.46 formaldeído desidrogenase ec:1.2.1.47 4-trimetilamôniobutiraldeído desidrogenase ec:1.2.1.48 aldeído de cadeia longa desidrogenase ec:1.2.1.49 2-oxoaldeído desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.51 piruvato desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.52 oxoglutarato desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.53 4-hidroxifenilacetaldeído desidrogenase ec: 1.2.1.57 butanal desidrogenase ec: 1.2.1.58 fenilglioxilato desidrogenase (acilação) ec:1.2.1.59 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (NAD(P)+) (fosfo- rilação) ec: 1.2.1.62 4-formilbenzenossulfonato desidrogenase ec: 1.2.1.63 6-oxohexanoato desidrogenase ec:1.2.1.64 4-hidroxibenzaldeído desidrogenase ec:1.2.1.65 salicilaldeído desidrogenase ec:1.2.1.66 micotiol-dependente formaldeído desidrogenase ec:1.2.1.67 vanilina desidrogenase ec:1.2.1.68 coniferil-aldeído desidrogenase ec:1.2.1.69 fluoroacetaldeído desidrogenase ec:1.2.1.71 succinilglutamato-semialdeído desidrogenase
Outras vias que não as exemplificadas acima também podem ser empregadas para gerar a biossíntese de BDO em organismos microbia- nos que não ocorrem naturalmente. Em uma modalidade, a biossíntese pode ser alcançada usando uma via de L-homosserina para BDO. Esta via tem um rendimento molar de 0,90 mol/mol de glicose, o qual parece restringido pela disponibilidade de reduzir equivalentes. Uma segunda via sintetiza BDO a partir de acetoacetato e é capaz de alcançar o rendimento máximo teórico de 1,091 mol/mol de glicose. A implementação de qualquer via pode ser al- cançada por meio da introdução de duas enzimas exógenas e ambas as vias podem adicionalmente complementar a produção de BDO por meio de suc- cinil-CoA. Ainda são descritas abaixo enzimas de vias, termodinâmicas, ren- dimentos teóricos e viabilidade global.
Uma via de homosserina também pode ser projetada para gerar organismos microbianos produtores de BDO. A homosserina é um interme- diário no metabolismo de treonina e metionina, formados a partir de oxaloa- cetato por meio de aspartato. A conversão de oxaloacetato para homosseri- na requer um NADH, dois NADPH e um ATP (Figura 3). Uma vez formada, a homosserina alimenta as vias biossintéticas para treonina e metionina. Na maioria dos organismos, altos níveis de treonina ou metionina fazem feed- back para reprimir a via de biossíntese de homosserina (Caspi et al., Nucleic Acids Res. 34:D511 - D516 (1990)).
A transformação de homosserina para 4-hidroxibutirato (4-HB) pode ser realizada em duas etapas enzimáticas como mostrado na Figura 4. A primeira etapa desta via é a desaminação de homosserina por uma liase de amônia putativa. Esta reação tem uma barreira termodinâmica estimada de 12 kJ / mol, mas pode provavelmente ser dirigida na direção dianteira por um gradiente de concentração. Na etapa 2, o produto de alqueno, 4- hidroxibut-2-enoato é reduzido para 4-HB por uma redutase putativa às cus- tas de um NADH. Esta etapa da reação é altamente termodinamicamente favorável na direção da síntese de 4-HB, com um ArxnG estimado de -59 kJ / mol. 4-HB pode então ser convertido para BDO como na Figura 2 acima.
Enzimas disponíveis para catalisar as transformações acima são mostradas na Figura 5. Por exemplo, a Iiase de amônia na etapa 1 da via se assemelha intimamente à química da aspartato amônia-liase (aspartase). A aspartase é uma enzima difundida em micro-organismos e foi caracterizada extensivamente (Viola, R.E., Mol. Bioi 74:295-341 (2008)). A estrutura cris- talina da aspartase de E.coli foi solucionada (Shi et al., Biochemistry 36:9136-9144 (1997)), assim é então possível projetar mutações diretamente no sítio ativo da enzima o que iria alterar sua especificidade de substrato para incluir homosserina. A oxidorredutase na etapa 2 tem química similar a diversas enzimas bem-caracterizadas incluindo fumarato redutase no ciclo TCA de E. coli. Uma vez que a termodinâmica desta reação é altamente fa- vorável, uma redutase endógena com ampla especificidade de substrato irá provavelmente ser capaz de reduzir 4-hidroxibut-2-enoato. O rendimento desta via sob condições anaeróbicas é de 0,9 mol de BDO por mol de glico- se embora, quando comparado à via na Figura 2 (1,09 mol / mol de glicose), ambas as vias parecem ter energia similar e exigências redutivas a partir do precursor metabólico de oxaloacetato (Figura 6).
A via de succinil-CoA foi descoberta por ter um rendimento mais alto devido ao fato de que é mais energicamente eficiente. A conversão de uma molécula de oxaloacetato para BDO pela via de homosserina irá reque- rer a despesa de 2 equivalentes de ATP. Devido a conversão de glicose pa- ra duas moléculas de oxaloacetato poder gerar um máximo de 3 moléculas de ATP, assumindo a carboxiquinase de PEP ser reversível, a conversão global de glicose para BDO por meio de homosserina tem um rendimento energético negativo. Como esperado, se foi assumido que aquela energia pode ser gerada por meio de respiração, o rendimento de máximo da via de homosserina aumenta para 1,05 mol/mol de glicose o qual é 96% do rendi- mento da via de succinil-CoA. A via de succinil-CoA pode canalizar um pou- co do fluxo de carbono através da piruvato desidrogenase e a ramificação oxidativa do ciclo de TCA para gerar ambos os equivalentes de redução e succinil-CoA sem uma despesa energética. Assim, ela não encontra as mesmas dificuldades energéticas como a via de homosserina porque nem todo o fluxo é canalizado por meio de oxaloacetato para succinil-CoA para BDO. Globalmente, a via de homosserina demonstra uma via de rendimento moderadamente alto para BDO. Uma característica particularmente útil é que envolve o mínimo de engenharia, somente com duas etapas não nati- vas. A via é provavelmente termodinamicamente favorável na direção da síntese de BDO.
Uma via de acetoacetato também pode ser projetada para gerar organismos microbianos produtores de BDO. Em E. coli o acetoacetato é produzido a partir da degradação de acetona e de leucina. O acetoacetato também pode ser formado a partir de acetil-CoA por meio de enzimas envol- vidas no metabolismo de ácidos graxos, incluindo acetil-CoA acetiltransfera- se e acetoacetil-CoA transferase (Figura 7). Vias biossintéticas através de acetoacetato também são particularmente úteis em organismos microbianos que podem metabolizar compostos de carbono únicos para formar acetil- CoA.
Uma via de três etapas a partir de acetoacetato para semialdeí- do succínico (Figura 8) pode ser usada para sintetizar BDO através de ace- toacetato. O semialdeído succínico, o qual é removido em uma etapa de re- dução de succinil-CoA ou removido em uma etapa de descarboxilação de a- cetoglutarato, pode ser convertido para BDO seguindo três etapas de redu- ção (Figura 2). Resumidamente, a etapa 1 da biovia de acetoacetato requer a conversão do acetoacetato para 3-aminobutanoato por meio de uma ω- aminotransferase. A ω-amino ácido:piruvato aminotransferase (ω-ΑΤΡ) a partir de Alcaligens denitrificans foi superexpresso em E. coli e mostrado para ter uma alta atividade para 3-aminobutanoato in vitro (Yun et al., Appi Environ. Microbiol. 70:2529-2534 (2004)). A atividade de ω-ΑΤΡ na direção requerida aqui não foi medida neste estudo, devido à decomposição espon- tânea do acetoacetato para acetona na mistura reacional. Entretanto, as termodinâmicas indicam que é possível.
Na etapa 2, uma aminomutase putativa troca o grupo amino da posição 3- para a 4- da estrutura principal de carbono. Uma aminomutase que realiza esta função em 3-aminobutanoato não foi caracterizada, mas uma enzima a partir de Clostridium sticklandii de tem um mecanismo muito similar (Figura 9). A enzima, D-lisina-5,6-aminomutase, é envolvida na bios- síntese de lisina.
A via sintética para BDO a partir de acetoacetato passa através de 4-aminobutanoato, um metabólito em E. coli que normalmente é formado a partir da descarboxilação do glutamato. Uma vez formado, o 4- aminobutanoato pode ser convertido para semialdeído succínico através de 4-aminobutanoato transaminase (2.6.1.19), uma enzima que foi caracteriza- da bioquimicamente. As termodinâmicas desta enzima e outras etapas da via estão próximas do equilíbrio, assim a operação de enzimas na direção de interesse será provavelmente direcionada pelas concentrações do substrato e do produto.
Uma consideração para selecionar candidatos de enzimas nesta via é a estereosseletividade das enzimas envolvida nas primeiras duas eta- pas. O ω-ΑΒΤ em Alcaligens denitrificans é específico ao L-estereoisômero de 3-aminobutanoato, enquanto a D-lisina-5,6-aminomutase requer prova- velmente o D-estereoisômero. Se enzimas com estereosseletividades com- plementares não podem ser encontradas ou projetadas, seria necessário adicionar uma terceira enzima à via com atividade de racemase que pode converter L-3-aminobutanoato para D-3-aminobutanoato. Enquanto as ra- cemases de aminoácido são difundidas, não se sabe se estas enzimas po- dem funcionar em ω-aminoácidos.
O máximo rendimento molar teórico desta via sob condições a- naeróbicas é 1,091 mol/mol de glicose. A fim de gerar fluxo a partir do ace- toacetato para BDO foi necessário assumir que acetil-CoA:acetoacetil-CoA transferase (enzima 3 na Figura 10) é reversível. A função desta enzima em E. coli é metabolizar ácidos graxos de cadeia curta convertendo-os primeiro em tioésteres.
Enquanto a operação de acetil-CoA:acetoacetil-CoA transferase na direção do consumo de acetato não foi demonstrada experimentalmente em E. coli, estudos em enzimas similares dentro de outros organismos su- portam a suposição de que esta reação é reversível. A enzima de butiril- CoA:acetato:CoA transferase em micróbios de intestino Roseburia sp. e F. prasnitzii opera no acetato utilizando a direção para produzir butirato (Dun- can et al., Appi Environ. Microbiol 68:5186-5190 (2002)). Outra enzima mui- to similar, acetihsuccinato CoA-transferase em Trypanosoma brucei, também opera nessa direção de utilização do acetato. Esta reação tem um ArxnG per- to do equilíbrio, assim concentrações altas de acetato podem provavelmente direcionar a reação na direção de interesse. Na taxa de produção máxima teórica de BDO 1,09 mol/mol de simulações de glicose predizem que E. coli pode gerar 1,098 mol de ATP por mol de glicose com nenhum subproduto de fermentação. Este rendimento de ATP deveria ser suficiente para o cresci- mento, manutenção e produção de células. A biovia de acetoacetato é uma via de alto rendimento para BDO a partir de acetil-CoA. Da mesma forma que a via de homosserina, esta via requer manipulação mínima de cepa, com apenas duas etapas não nativas além da via de BDO. Portanto, em adição a qualquer uma das várias modificações exemplificadas previamente para estabelecer a biossíntese de 4-HB em um hospedeiro selecionado, os organismos microbianos produtores de BDO po- dem incluir qualquer uma das prévias combinações e permutações de modi- ficações das vias metabólicas de 4-HB assim como qualquer combinação de expressão para aldeído desidrogenase CoA-independente, aldeído desidro- genase CoA-dependente ou um álcool desidrogenase para gerar vias bios- sintéticas para GBL e/ou BDO. Portanto, os produtores de BDO da invenção pode ter expressão exógena de, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou todas as 10 enzimas que correspondem a qualquer uma das seis vias de 4-HB e/ou qualquer uma das enzimas da via de 4 BDO.
O projeto e a construção dos organismos microbianos genetica- mente modificados é realizado usando métodos bem-conhecidos na técnica para alcançar quantidades suficientes de expressão para produzir BDO. Em particular, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da in- venção podem alcançar a biossíntese de BDO resultando em concentrações intracelulares entre cerca de 0,1-25 mM ou mais. Geralmente, a concentra- ção intracelular de BDO está entre cerca de 3-20mM, particularmente entre cerca de 5-15 mM e mais particularmente entre cerca de 8-12 mM, incluindo cerca de 10 mM ou mais. Concentrações intracelulares entre e acima de ca- da das faixas exemplares também podem ser alcançadas a partir dos orga- nismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção. Como com os produtores de 4-HB, os produtores de BDO também podem ser sustenta- dos, cultivados ou fermentados sob condições anaeróbicas.
A invenção ainda fornece um método para a produção de 4-HB. O método compreende o cultivo de um organismo microbiano que não ocor- re naturalmente que tem uma via biossintética de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que inclui pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4- hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase CoA- independente succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente, glutamato:succínico semialdeído transaminase, a- cetoglutarato descarboxilase ou glutamato descarboxilase sob condições substancialmente anaeróbicas por um período suficiente de tempo para pro- duzir ácido 4-hidroxibutanoico monomérico (4-HB). O método pode adicio- nalmente incluir a conversão química de 4-HB para GBL e para BDO ou THF1 por exemplo.
Adicionalmente é fornecido um método para a produção de 4- HB. O método inclui o cultivo de um organismo microbiano que não ocorre naturalmente que tem uma via biossintética de ácido 4-hidroxibutanoico (4- HB) que inclui pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4- hidroxibutanoato desidrogenase, succinil-CoA sintetase, semialdeído succí- nico desidrogenase CoA-dependente ou α-cetoglutarato descarboxilase sob condições substancialmente anaeróbicas por um período suficiente de tem- po para produzir ácido 4-hidroxibutanoico monomérico (4-HB). O produto 4- HB pode ser secretado dentro do meio de cultura.
Ainda é fornecido um método para a produção de BDO. O méto- do inclui o cultivo de um biocatalisador microbiano que não ocorre natural- mente, compreendendo um organismo microbiano que tem vias biossintéti- cas de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO), a vias inclu- indo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4-hidroxibutanoato desidrogenase, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente, 4-hidroxibutirato: CoA transferase, 4-hidroxibutirato quina- se, fosfotranshidroxibutirilase, α-cetoglutarato descarboxilase, aldeído desi- drogenase, álcool desidrogenase ou um aldeído/álcool desidrogenase por um período suficiente de tempo produzir 1,4-butanodiol (BDO). O produto de BDO pode ser secretado dentro do meio de cultura.
É compreendido que, nos métodos da invenção, qualquer um de um ou mais ácidos nucleicos exógenos pode ser introduzido em um orga- nismo microbiano para produzir um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção. Os ácidos nucleicos podem ser introduzidos para conferir, por exemplo, uma via biossintética de 4-HB, BDO, THF ou GBL so- bre o organismo microbiano. Alternativamente, ácidos nucleicos codificantes podem ser introduzidos para produzir um organismo microbiano intermediá- rio que tem a capacidade biossintética para catalisar algumas das reações requeridas para conferir a capacidade biossintética para 4-HB, BDO1 THF ou GBL. Por exemplo, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente que tem uma via biossintética de 4-HB pode compreender pelo menos dois ácidos nucleicos exógenos que codificam as enzimas desejadas, tais como a combinação de 4-hidroxibutanoato desidrogenase e α-cetoglutarato descar- boxilase; 4-hidroxibutanoato desidrogenase e semialdeído succínico desi- drogenase CoA-independente; 4-hidroxibutanoato desidrogenase e semial- deído succínico desidrogenase CoA-dependente; semialdeído succínico de- sidrogenase CoA-dependente e succinil-CoA sintetase; succinil-CoA sinteta- se e glutamato descarboxilase e semelhantes. Assim, é compreendido que pode ser incluída qualquer combinação de duas ou mais enzimas de uma via biossintética em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção. Similarmente, é compreendido que pode ser incluída qualquer combinação de três ou mais enzimas de uma via biossintética em um orga- nismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção, por exemplo, 4- hidroxibutanoato desidrogenase, α-cetoglutarato descarboxilase e semialde- ído succínico desidrogenase CoA-dependente; semialdeído succínico desi- drogenase CoA-independente e succinil-CoA sintetase; 4-hidroxibutanoato desidrogenase, CoA semialdeído succínico desidrogenase dependente e glutamato:succínico semialdeído transaminase, e assim por diante, como desejado, de forma que a combinação de enzimas da via biossintética dese- jada resulte na produção do produto desejado correspondente.
Similarmente, por exemplo, com respeito a qualquer um ou mais ácidos nucleicos exógenos introduzidos para conferir a produção de BDO, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente que tem uma via biossintética de BDA pode compreender pelo menos dois ácidos nucleicos exógenos codificando as enzimas desejadas, tal como a combinação de 4- hidroxibutanoato desidrogenase e α-cetoglutarato descarboxilase; 4- hidroxibutanoato desidrogenase e 4-hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferase; 4-hidroxibutanoato desidrogenase e butirato quinase; 4-hidroxibutanoato de- sidrogenase e fosfotransbutirilase; 4-hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferase e aldeído desidrogenase; 4-hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferase e álcool desidrogenase; 4-hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferase e uma aldeí- do/álcool desidrogenase e semelhantes. Assim, é compreendido que qual- quer combinação de duas ou mais enzimas de uma via biossintética pode ser incluída em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção. Similarmente, é compreendido que qualquer combinação de três ou mais enzimas de uma via biossintética pode ser incluída em um organis- mo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção, por exemplo, 4- hidroxibutanoato desidrogenase, α-cetoglutarato descarboxilase e 4- hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferase; 4-hidroxibutanoato desidrogenase, butirato quinase e fosfotransbutirilase; 4-hidroxibutanoato desidrogenase, 4- hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferase e aldeído desidrogenase; 4- hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferase, aldeído desidrogenase e álcool de- sidrogenase; butirato quinase, fosfotransbutirilase e um aldeído/álcool desi- drogenase e semelhantes. Similarmente, qualquer combinação de quatro, cinco ou mais enzimas de uma via biossintética como descoberto aqui pode ser incluída em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção, como desejado, de forma que a combinação de enzimas da via biossintética desejada resulte na produção do produto desejado correspon- dente.
Qualquer um dos organismos microbianos que não ocorrem na- turalmente previamente descritos ser cultivado para produzir e/ou secretar os produtos biossintéticos da invenção. Por exemplo, os produtores de 4-HB podem ser cultivados para a produção biossintética de 4-HB. O 4-HB pode ser isolado ou pode ser tratado como descrito abaixo para gerar GBL, THF e/ou BDO. Similarmente, os produtores de BDO podem ser cultivados para a produção biossintética de BDO. O BDO pode ser isolado ou submetido a outros tratamentos para a síntese química da família de compostos de BDO tais como aqueles compostos a jusante exemplificados na Figura 1.
O meio de crescimento pode ser, por exemplo, qualquer fonte de carboidrato que pode fornecer uma fonte de carbono ao micro-organismo que não ocorre naturalmente. Tais fontes incluem, por exemplo, açúcares tais como glicose, xilose, arabinose, galactose, mannose, frutose e amido. Outras fontes de carboidrato incluem, por exemplo, matérias-primas renová- veis e biomassa. Tipos exemplares de biomassas que podem ser usadas como matérias-primas nos métodos da invenção incluem biomassa celulósi- ca, biomassa hemicelulósica e matérias-primas de Iignina ou porções de ma- térias-primas. Tais matérias-primas de biomassa contêm, por exemplo, subs- tratos de carboidrato úteis como fontes de carbono tais como glicose, xilose, arabinose, galactose, mannose, frutose e amido. Dado os ensinamentos e orientações fornecidas aqui, aqueles versados na técnica irão entender que aquelas matérias-primas renováveis e biomassas diferentes daquelas exem- plificadas acima também podem ser usadas para cultivar os organismos mi- crobianos da invenção para a produção de 4-HB e outros compostos da in- venção.
Consequentemente, dado os ensinamentos e orientações forne- cidas aqui, aqueles versados na técnica irão entender que um organismo microbiano que não ocorre naturalmente pode ser produzido o qual secreta os compostos biossintetizados da invenção quando crescido em uma fonte de carbono tal como um carboidrato. Tais compostos incluem, por exemplo, 4-HB, BDO e qualquer um dos metabólitos intermediários da via de 4-HB, da via de BDO e/ou das vias combinadas de 4-HB e de BDO. Tudo isto é reque- rido para projetar em uma ou mais das atividades enzimáticas mostradas na Figura 2 para alcançar a biossíntese do composto desejado ou intermediário incluindo, por exemplo, a inclusão de alguns ou de todas as vias biossintéti- cas de 4-HB e/ou de BDO. Consequentemente, a invenção fornece um or- ganismo microbiano que não ocorre naturalmente o qual secreta 4-HB quan- do crescido em um carboidrato, secreta BDO quando crescido em um car- boidrato e/ou secreta qualquer um dos metabólitos intermediários mostrados na Figura 2 quando crescido em um carboidrato. Os organismos microbianos que produzem BDO da invenção podem iniciar a síntese a partir de, por e- xemplo, succinato, succinil-CoA, α-cetoglutarato, semialdeído succínico, 4- HB, 4-hidroxibutirilfosfato, 4-hidroxibutiril-CoA (4-HB-CoA) e/ou 4- hidroxibutiraldeído. Em algumas modalidades, condições de cultura incluem condi- ções de crescimento anaeróbio ou substancialmente anaeróbio ou de manu- tenção. Condições anaeróbicas exemplares foram previamente descritas e são bem-conhecidas na técnica. Condições anaeróbicas exemplares para processos de fermentação são descritas abaixo nos Exemplos. Qualquer uma destas condições pode ser empregada com os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente, assim como outras condições anaeróbicas bem-conhecidas na técnica. Sob tais condições anaeróbicas, os produtores de 4-HB e de BDO podem sintetizar 4-HB e BDO monoméricos, respectiva- mente, em concentrações intracelulares de 5-10 mM ou mais, assim como todas as outras concentrações previamente exemplificadas.
Vários compostos a jusante também podem ser gerados para os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente produtores de 4-HB e BDO da invenção. Com respeito aos organismos microbianos produtores de 4-HB da invenção, 4-HB e GBL monoméricos existem em equilíbrio no meio de cultura. A conversão de 4-HB para GBL pode ser eficientemente alcançada, por exemplo, pelo cultivo dos organismos microbianos em meio de pH ácido. Um pH menor ou igual a 7,5, em particular em ou abaixo de pH 5,5, espontaneamente converte 4-HB para GBL como ilustrado na Figura 1.
O GBL resultante pode ser separado de 4-HB e de outros com- ponentes na cultura usando uma variedade de métodos bem-conhecidos na técnica. Tais métodos de separação incluem, por exemplo, os procedimen- tos de extração exemplificados nos Exemplos assim como métodos que in- cluem extração contínua líquido-líquido, pervaporação, filtração de membra- na, separação de membrana, osmose reversa, eletrodiálise, destilação, cris- talização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de adsorção e ultrafil- tração. Todos os métodos anteriores são bem-conhecidos na técnica. O GBL separado ainda pode ser purificado por, por exemplo, destilação.
Outro composto a jusante que pode ser produzido a partir dos organismos microbianos que não ocorrem naturalmente produtores de 4-HB da invenção inclui, por exemplo, BDO. Este composto pode ser sintetizado, por exemplo, pela hidrogenação química de GBL. As reações de hidrogena- ção química são bem-conhecidas na técnica. Um procedimento exemplar inclui a redução química de 4-HB e/ou GBL ou de uma mistura destes dois componentes derivando da cultura que usa um catalisador de hidrogenação heterogêneo ou homogêneo junto com hidrogênio ou um agente redutor ba- seado em hidreto usado estequiometricamente ou cataliticamente, para pro- duzir 1,4-butanodiol.
Outros procedimentos bem-conhecidos na técnica são igualmen- te aplicáveis para a reação química acima e inclui, por exemplo, o WO No. 82/03854 (Bradley, et al.), o qual descreve a hidrogenólise de gama- butirolactona na fase de vapor sobre um catalisador de óxido de cobre e de oxido de zinco. A Patente Britânica No. 1.230.276 que descreve a hidroge- nação de gama-butirolactona usando um catalisador de óxido de cobre - óxi- do de cromo. A hidrogenação é realizada em fase líquida. Também são e- xemplificadas reações em batelada tendo altas pressões de reator. Reagen- tes e produtos de pressões parciais nos reatores estão bem sobre os res- pectivos pontos de condensação. A Patente Britânica No. 1.314.126 que descreve a hidrogenação de gama-butirolactona na fase líquida sobre um catalisador de óxido de níquel-cobalto-tório. São exemplificadas reações em batelada que têm pressões totais altas e pressões parciais componentes bem sobre os respectivos pontos de condensação dos componentes. A Pa- tente Britânica No. 1.344.557 que descreve a hidrogenação de gama- butirolactona na fase líquida sobre um catalisador de óxido de cobre - óxido de cromo. Uma fase de vapor ou fase misturada contendo vapor é indicada como satisfatória em alguns exemplos. Um reator tubular de fluxo contínuo é exemplificado usando pressões totais de reator altas. A Patente Britânica No. 1.512.751 que descreve a hidrogenação de gama-butirolactona para 1,4- butanodiol na fase líquida sobre um catalisador de óxido de cobre - óxido de cromo. São exemplificadas reações em batelada com pressão total de reator alta e, onde determinável, pressões parciais do reagente e do produto bem sobre os respectivos pontos de condensação. A Patente US N0 4.301.077 que descreve a hidrogenação para 1,4-butanodiol de gama-butirolactona sobre um catalisador de Ru-Ni-Co-Zn. A reação pode ser conduzida na fase líquida ou gasosa ou em uma fase misturada líquida-gasosa. São exemplifi- cadas reações em fase líquida de fluxo contínuo em altas pressões totais de reator e produtividades de reator relativamente baixas. A Patente US N0 4.048.196 que descreve a produção de 1,4-butanodiol pela hidrogenação em fase líquida de gama-butirolactona sobre um catalisador de óxido de cobre - óxido de zinco. Ainda é exemplificado um reator tubular de fluxo contínuo que opera em alta pressão de reator total e altas pressões parciais de rea- gente e de produto. E a Patente US No. 4.652.685 que descreve a hidroge- nação de Iactonas para glicóis.
Um outro composto a jusante que pode ser produzido a partir dos organismos microbianos produtores de 4-HB da invenção inclui, por e- xemplo, THF. Este composto pode ser sintetizado por, por exemplo, hidro- genação química de GBL. Um procedimento exemplar bem-conhecido na técnica aplicável para a conversão de GBL para THF inclui, por exemplo, a redução química de 4-HB e/ou GBL ou uma mistura destes dois componen- tes que derivam de uma cultura que usa um catalisador de hidrogenação heterogêneo ou homogêneo junto com hidrogênio ou um agente redutor ba- seado em hidreto usado estequiometricamente ou cataliticamente, para pro- duzir tetra-hidrofurano. Outros procedimentos bem-conhecidos na técnica são igualmente aplicáveis para a reação química acima e inclui, por exem- plo, a Patente US N0 6.686.310, que descreve catalisadores de hidrogena- ção preparados em uma via de sol-gel de alta área de superfície. Os proces- sos para a redução do ácido maleico para tetra-hidrofurano (THF) e 1,4- butanodiol (BDO) e para a redução de gama-butirolactona para tetra- hidrofurano e 1,4-butanodiol também é descrito.
As condições de cultura podem incluir, por exemplo, procedi- mentos de cultura líquida, assim como a fermentação e outros procedimen- tos de cultura em larga escala. Como ainda descrito abaixo nos Exemplos, rendimentos particularmente úteis dos produtos biossintéticos da invenção podem ser obtidos sob condições de cultura anaeróbicas ou substancialmen- te anaeróbicas. A invenção ainda fornece um método para fabricar 4-HB. O mé- todo inclui a fermentação de um organismo microbiano que não ocorre natu- ralmente que tem uma via biossintética do ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que inclui pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4- hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase CoA- independente, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase CoA-dependente, glutamato:succínico semialdeído transaminase, a- cetoglutarato descarboxilase ou glutamato descarboxilase sob condições substancialmente anaeróbicas por um período suficiente de tempo para pro- duzir ácido 4-hidroxibutanoico monomérico (4-HB), o processo compreen- dendo fermentação de alimentação em batelada e separação em batelada; fermentação de alimentação em batelada e separação contínua ou fermen- tação contínua e separação contínua.
A cultura e as hidrogenações químicas também descritas acima podem ser aumentadas e crescer continuamente para a fabricação de 4-HB, GBL, BDO e/ou THF. Procedimentos de crescimento exemplares incluem, por exemplo, fermentação de alimentação em batelada e separação em ba- telada; fermentação de alimentação em batelada e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua. Todos estes processos são bem-conhecidos na técnica. Empregando os produtores de 4-HB permite a biossíntese de 4-HB e a conversão química para GBL, BDO e/ou THF simul- taneamente empregando os procedimentos de hidrogenação acima simultâ- neos com métodos de cultura contínuos tal como fermentação. Outros pro- cedimentos de hidrogenação também são bem-conhecidos na técnica e po- dem ser aplicados igualmente aos métodos da invenção.
Procedimentos de fermentação são particularmente úteis para a produção biossintética de quantidades comerciais de 4-HB e/ou BDO. Ge- ralmente, e como com procedimentos de cultura não-contínuos, a produção contínua e/ou quase contínua de 4-HB ou BDO irá incluir o cultivo de um organismo produtor de 4-HB ou BDO que não ocorre naturalmente da inven- ção em nutrientes e meio suficientes para sustentar e/ou quase sustentar o crescimento em uma fase exponencial. A cultura contínua sob tais condições pode incluir, por exemplo, 1 dia, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou mais. Adicional- mente, a cultura contínua pode incluir 1 semana, 2, 3, 4 ou 5 ou mais sema- nas e até vários meses. Alternativamente, os organismos da invenção po- dem ser cultivados por horas, se adequado para uma aplicação particular.
Será entendido que condições de cultura contínuas e/ou quase contínuas também podem incluir todos os intervalos de tempo entre estes períodos exemplares.
Procedimentos de fermentação são bem-conhecidos na técnica. Resumidamente, a fermentação para a produção biossintética de 4-HB, BDO ou outros produtos derivados de 4-HB da invenção pode ser utilizada, por exemplo, na fermentação de alimentação em batelada e separação em bate- lada; fermentação de alimentação em batelada e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua. Exemplos de procedimentos de fermentação em batelada e contínua bem-conhecidos na técnica são ainda exemplificados abaixo nos Exemplos.
Além disso, aos procedimentos de fermentação acima que usam os produtores de 4-HB ou de BDO da invenção para a produção contínua de quantidades significativas de 4-HB e BDO monoméricos, respectivamente, os produtores de 4-HB também podem ser, por exemplo, simultaneamente submetidos a procedimentos de síntese química como previamente descrito para a conversão química de 4-HB monomérico, por exemplo, para GBL, BDO e/ou THF. Os produtores de BDO podem ser similarmente, por exem- plo, simultaneamente submetidos a procedimentos de síntese química como previamente descrito para a conversão química de BDO para, por exemplo, THF, GBL, pirrolidonas e/ou outros compostos da família de BDO. Além dis- so, os produtos dos produtores de 4-HB e BDO podem ser separados da cultura de fermentação e consecutivamente ser submetidos à conversão química, como descrito aqui.
Resumidamente, a hidrogenação de GBL no caldo de fermenta- ção pode ser realizado como descrito por Frost et al., Biotechnology Pro- gress 18: 201-211 (2002). Outro procedimento para hidrogenação durante a fermentação inclui, por exemplo, os métodos descritos, por exemplo, na Pa- tente Americana No. 5.478.952. Este método ainda é exemplificado nos E- xemplos abaixo.
Então, a invenção adicionalmente fornece um método para fabri- car γ-butirolactona (GBL), tetra-hidrofurano (THF) ou 1,4-butanodiol (BDO).
O método inclui a fermentação de um organismo microbiano que não ocorre naturalmente que tem vias biossintéticas do ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e/ou 1,4-butanodiol (BDO), as vias compreendem pelo menos um ácido nu- cleico exógeno que codifica 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase CoA-independente, succinil-CoA sintetase, semial- deído succínico desidrogenase CoA-dependente, 4-hidroxibutirato: CoA transferase, glutamato:succínico transaminase de semialdeído, a- cetoglutarato descarboxilase, glutamato descarboxilase, 4-hidroxibutanoato quinase, fosfotransbutirilase, 1,4-butanodiol desidrogenase de semialdeído CoA-independente, 1,4-butanodiol desidrogenase de semialdeído CoA- dependente, 1,4-butanodiol álcool desidrogenase CoA-independente ou 1,4- butanodiol álcool desidrogenase CoA-dependente, sob condições substanci- almente anaeróbicas por um período suficiente de tempo para produzir 1,4- butanodiol (BDO), GBL ou THF, a fermentação compreendendo fermentação de alimentação em batelada e separação em batelada; fermentação de ali- mentação em batelada e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua.
Além da biossíntese de 4-HB, BDO e de outros produtos da in- venção como descrito aqui, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente e métodos da invenção também podem ser utilizados em vá- rias combinações entre si e com outros organismos microbianos e métodos bem-conhecidos na técnica para alcançar a biossíntese de produto através de outras vias. Por exemplo, uma alternativa para produzir BDO diferente de uso dos produtores de 4-HB e etapas químicas ou diferente de uso do pro- dutor de BDO diretamente é a adição de outro organismo microbiano capaz de converter 4-HB ou um produto de 4-HB exemplificado aqui para BDO.
Um de tais procedimentos inclui, por exemplo, a fermentação de um organismo microbiano produtor de 4-HB da invenção para produzir 4-HB, como descrito acima e abaixo. O 4-HB pode então ser usado como um subs- trato para um segundo organismo microbiano que converte 4-HB para, por exemplo, BDO, GBL e/ou THF. O 4-HB pode ser adicionado diretamente a outra cultura do segundo organismo ou a cultura original dos produtores de 4-HB pode ser esvaziada destes organismos microbianos por, por exemplo, separação celular e então a adição subsequente do segundo organismo pa- ra o caldo de fermentação utilizado para produzir o produto final sem etapas de purificação intermediárias. Um segundo organismo exemplar que tem a capacidade para utilizar bioquimicamente o 4-HB como um substrato para a conversão para BDO, por exemplo, é Clostridium acetobutylicum (veja, por exemplo, Jewell et al., Current Microbiology 13:215-19 (1986)).
Em outras modalidades, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente e os métodos da invenção podem ser reunidos em uma ampla variedade de subvias para alcançar a biossíntese de, por exem- pio, 4-HB e/ou BDO como descrito. Nestas modalidades, as vias biossintéti- cas para um produto desejado da invenção podem ser secretadas em orga- nismos microbianos diferentes e os organismos microbianos diferentes po- dem ser co-cultivados para produzir o produto final. Em tal esquema biossin- tético, o produto de um organismo microbiano é o substrato para um segun- do organismo microbiano até que o produto final seja sintetizado. Por exem- plo, a biossíntese de BDO pode ser realizada como previamente descrito pela construção de um organismo microbiano que contém vias biossintéticas para a conversão de um substrato tal como succinato endógeno por meio de 4-HB para o produto final BDO. Alternativamente, o BDO também pode ser biossinteticamente produzido a partir de organismos microbianos através da co-cultura ou co-fermentação usando dois organismos no mesmo recipiente. Um primeiro organismo microbiano sendo um produtor de 4-HB com genes para produzir 4-HB a partir de ácido succínico e um segundo organismo mi- crobiano que é um produtor de BDO com genes para converter 4-HB para BDO.
Dado os ensinamentos e orientações fornecidas aqui, aqueles versados na técnica irão entender que uma ampla variedade de combina- ções e permutações existe para os organismos microbianos que não ocor- rem naturalmente e métodos da invenção junto com outros organismos mi- crobianos, com a co-cultura de outros organismos microbianos que não o- correm naturalmente que têm subvias e com combinações de outros proce- dimentos químicos e/ou bioquímicos bem-conhecidas na técnica para produ- zir 4-HB, BDO, GBL e produtos de THF da invenção.
Um método computacional para identificar e projetar alterações metabólicas que favorecem a biossíntese de um produto é o sistema compu- tacional OptKnock, Burgard et al., Biotechnol Bioeng 84: 647-57 (2003). OptKnock é um programa de modelagem e simulação metabólica que suge- re estratégias de deleção de genes que resultam em micro-organismos ge- neticamente estáveis com a superprodução do produto alvo. Especificamen- te, o sistema examina a rede metabólica e/ou bioquímica completa de um micro-organismo a fim de sugerir manipulações genéticas que forçam a bio- química desejada a se tornar um subproduto obrigatório do crescimento ce- lular. Pela produção bioquímica de acoplamento com o crescimento celular através de deleções de genes estrategicamente localizadas ou outras ruptu- ras de gene funcionais, as pressões de seleção de crescimento impuseram nas cepas manipuladas depois de longos períodos de tempo em um biorrea- tor levou a aperfeiçoamentos no desempenho como resultado da produção bioquímica acoplada ao crescimento compulsória. Por último, quando as de- leções de gene são construídas há uma possibilidade desprezível das cepas manipuladas reverterem o seu estado de tipo selvagem porque os genes selecionados por OptKnock devem ser completamente removidos do geno- ma. Portanto, esta metodologia computacional pode ser usada ou para iden- tificar vias alternativas que conduzem a biossíntese de 4-HB e/ou BDO ou usada em conjunto aos organismos microbianos que não ocorrem natural- mente para otimização adicional da biossíntese de 4-HB e/ou BDO.
Em síntese, OptKnock é um termo usado aqui para se referir a um método computacional e sistema para modelagem do metabolismo celu- lar. O programa de OptKnock refere-se a um sistema de modelos e métodos que incorporam obstáculos particulares em modelos de análise de equilíbrio de fluxo (FBA). Estes obstáculos incluem, por exemplo, informação cinética qualitativa, informação regulatória qualitativa, e/ou dados experimentais de microensaio de DNA. OptKnock também computa soluções para vários pro- blemas metabólicos por, por exemplo, apertando os limites de fluxo deriva- dos através dos modelos de equilíbrio de fluxo e subseqüentemente sondar os limites de desempenho das redes metabólicas na presença de adições ou deleções de gene. O sistema computacional OptKnock permite a construção de formulações modelo que habilitam uma questão efetiva dos limites de desempenho das redes metabólicas e fornece métodos para solucionar os problemas de programação linear de misturado-inteiro resultantes. Os méto- dos de modelagem e simulação metabólica referidos aqui como OptKnock são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente Americano No. de Série 10/043.440, depositado em 10 de janeiro de 2002, e na Patente Internacio- nal No. PCT/US02/00660, depositada em 10 de janeiro de 2002.
Outro método computacional para identificar e projetar altera- ções metabólicas que favorecem a produção biossintética de um produto é um sistema de modelagem e simulação metabólica nomeado SimPheny®. Este método e sistema computacional é descrito, por exemplo, no Pedido de Patente US N0 de série 10/173.547, depositado em 14 de junho de 2002, e no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US03/18838, depositado em 13 de junho de 2003.
SimPheny® é um sistema computacional que pode ser usado para produzir um modelo de rede in silico e simular o fluxo de massa, ener- gia ou carga através das reações químicas de um sistema biológico para definir um espaço de solução que contém qualquer e todas as funcionalida- des possíveis das reações químicas no sistema, determinando assim uma faixa de atividades permitidas para o sistema biológico. Esta abordagem é referida como modelagem baseada em obstáculos porque o espaço de solu- ção é definido por obstáculos tais como a estequiometria conhecida das rea- ções incluídas assim como a termodinâmica da reação e capacidade de obs- táculos associados com fluxos máximos através das reações. O espaço de- finido por estes obstáculos pode ser interrogado para determinar as capaci- dades fenotípicas e comportamento do sistema biológico ou de seus compo- nentes bioquímicos. Métodos de análise tais como análise convexa, progra- mação linear e o cálculo de vias extremas como descrito, por exemplo, em Schilling et al., J. Theor. Biol. 203:229-248 (2000); Schilling et al., Biotech. Bioeng. 71:286-306 (2000) e Schilling et al., Biotech. Prog. 15:288-295 (1999), pode ser usado para determinar tais capacidades fenotípicas. Como descrito nos Exemplos abaixo, esta metodologia de computação foi usada para identificar e analisar a possibilidade, assim como as vias biossintéticas de 4-HB ótimas em organismos microbianos não-produtores de 4-HB.
Como descrito acima, um método baseado em obstáculos usado nos programas computacionais aplicáveis à invenção é a análise de equilí- brio de fluxo. Análise de equilíbrio de fluxo está baseada no equilíbrio de flu- xo em uma condição estável fixa e pode ser executada como descrito em, por exemplo, Varma e Palsson, Biotech. Bioeng. 12:994-998 (1994). As a - bordagens de equilíbrio de fluxo foram aplicadas a redes de reação para si- mular ou predizer propriedades sistêmicas, por exemplo, do metabolismo do adipócito como descrito em Fell e Small, J. Biochem. 138:781-786 (1986), secreção de acetato a partir de E. coli sob condições de maximização de ATP como descrito em Majewski e Domach, Biotech. Bioeng. 35:732-738 (1990) ou secreção de etanol por uma levedura como descrito em Vanrolle- ghem et al., Biotech. Prog. 12:434-448 (1996). Adicionalmente, esta aborda- gem pode ser usada para predizer ou simular o crescimento de E. coli em uma variedade de fontes de carbono único, assim como o metabolismo de H. influenzae como descrito em Edwards e Palsson, Proc. Natl. Acad. Sei. 97:5528-5533 (2000), Edwards e Palsson, J. Bio. Chem. 274:17410-17416 (1999) e Edwards et al., Nature Biotech. 19:125-130 (2001).
Uma vez que o espaço de solução foi definido, ele pode ser ana- lisado para determinar possíveis soluções sob várias condições. Esta abor- dagem computacional é consistente com realidades biológicas porque sis- temas biológicos são flexíveis e podem alcançar o mesmo resultado de mui- tos modos diferentes. Sistemas biológicos são projetados através de meca- nismos evolutivos que foram restringidos por obstáculos fundamentais que todos os sistemas vivos têm que enfrentar. Portanto, estratégias de modela- gem baseadas em obstáculos abrange estas realidades gerais. Além disso, a habilidade para impor restrições adicionais continuamente em um modelo de rede através do estreitamento de resultados de obstáculos em uma redu- ção no tamanho do espaço de solução, dessa forma aumentando a precisão com a qual o desempenho fisiológico ou fenótipo podem ser previstos.
Dado os ensinamentos e orientações fornecidas aqui, aqueles versados na técnica poderão aplicar vários sistemas computacionais para modelagem e simulação metabólica para projetar e implementar a biossínte- se de 4-HB, BDO, GBL, THF e outros compostos da família de BDO em or- ganismos microbianos hospedeiros diferentes de E. coli e levedura. Tais mé- todos de modelagem e simulação metabólica incluem, por exemplo, os sis- temas computacionais exemplificados acima tais como SimPheny® e OptK- nock. Para ilustração da invenção, alguns métodos são descritos aqui com referência ao sistema de computação OptKnock para modelagem e simula- ção. Aqueles versados na técnica saberão como aplicar a identificação, o projeto e a implementação das alterações metabólicas usando OptKnock para qualquer um de tais outros sistemas computacionais de modelagem e simulação metabólica e métodos bem-conhecidos na técnica.
A habilidade de uma célula ou organismo para biossinteticamen- te produzir um produto bioquímico pode ser ilustrado no contexto dos limites da produção bioquímica em uma rede metabólica típica calculada usando um modelo in silico. Estes limites são obtidos fixando a(s) taxa(s) de capta- ção do(s) substrato(s) limitantes para o(s) seu(s) valor(es) experimentalmen- te medido(s) e calculando as taxas máximas e mínimas da produção bio- química em cada nível atingível de crescimento.
A produção de um produto bioquímico desejado geralmente está na competição direta com a formação de biomassa para recursos intracelula- res. Sob estas circunstâncias, taxas aumentadas de produção bioquímica resultarão necessariamente em taxas de crescimento sub-máximas. Os no- cautes sugeridos pelos programas de modelagem e simulação metabólica acima tais como OptKnock são projetado para restringir os limites de solução permissíveis forçando uma mudança no comportamento metabólico da cepa do tipo selvagem. Embora os limites de solução atuais para uma determina- da cepa irão expandir ou contrair, enquanto as taxas de captação de subs- trato aumentam ou diminuem, cada ponto experimental mentirá dentro de seu limite de solução estimado. Dados como estes habilitam predições pre- cisas de quão próximo as cepas projetadas estão de seus limites de desem- penho o que também indica quanto alojamento está disponível para melhori- a.
O sistema matemático OptKnock é exemplificado aqui por definir as deleções de gene que conduzem a biossíntese do produto e, particular- mente, a biossíntese de produto acoplado ao crescimento. O procedimento constrói sobre modelagem metabólica baseada em obstáculo o que estreita a faixa de fenótipos possíveis que um sistema celular pode exibir através da imposição sucessiva de obstáculos de substâncias físico-químicas adminis- trativas, Price et al., Nat Rev Microbiol 2: 886-97 (2004). Como descrito aci- ma, modelos e simulações baseados em obstáculo são bem-conhecidos na técnica e geralmente invocam a otimização de um objetivo celular particular, submetido a estequiometria de rede, para sugerir uma distribuição de fluxo provável.
Em síntese, a maximização de um objetivo celular quantificado como um fluxo de reação agregado para uma rede metabólica de estado estável que inclui um conjunto N = {1..., N} de metabólitos e um conjunto M = {1..., M} de reações metabólicas é expressa matematicamente como segue: maximizar V objetivo celular
submetido
<formula>formula see original document page 56</formula>
Vsubstrato=Vsubstrato_captação mmol/gDW.h
<formula>formula see original document page 56</formula>
(substrato(s) limitantes}
Vatp-vatp média mmol/gDW.h
Vj≥0,
<formula>formula see original document page 56</formula>
{reações irreversíveis}
onde Sij; é o coeficiente estequiométrico do metabólito i na reação j, Vj é o fluxo de reação j, VSUbstrato_captação representa a(s) taxa(s) de captação assu- mida ou medida do(s) substrato(s) limitantes e Vatp_média é o não-crescimento associado ao requerimento de manutenção de ATP. O vetor ν inclui ambos os fluxos internos e externos. Neste estudo, o objetivo celular está freqüen- temente assumido para ser um dreno de precursores biossintéticos nas ra- zões requeridas para a formação de biomassa, Neidhardt, F.C. et al., Esche- richia coli e Salmonella: Cellular e Molecular Biology, 2° ed. 1996, Washing- ton, D.C.: ASM Press. 2 v. (xx, 2822, Ixxvi). Os fluxos geralmente são infor- mados por 1 gDW.hr (grama de peso seco vezes hora) de tal forma que a formação de biomassa é expressa como g de biomassa produzida /gDW.hr ou 1/hr.
A modelagem de deleções de gene, e assim da eliminação de reação, primeiro emprega a incorporação de variáveis binárias no sistema de abordagem baseado em obstáculo, Burgard et al., Biotechnol Bioeng 74: 364-375 (2001), Burgard et al., Biotechnol Prog 17: 791-797 (2001). Estas variáveis binárias,
yj = 1, se o fluxo de reação Vj está ativo
0, se o fluxo de reação Vj não está ativo ,
<formula>formula see original document page 57</formula>
assuma um valor de 1 se a reação j é ativa e um valor de 0 se é inativa. O obstáculo seguinte,
<formula>formula see original document page 57</formula>
assegura que o fluxo de reação Vj é fixado para só zerar se a variável y, for igual a zero. Alternativamente, quando y, for igual a um, Vj é livre para assu- mir qualquer valor entre um Vjmin inferior e um Vjmax superior. Aqui, Vjmin e Vjmax são identificados por minimizado e maximizado, respectivamente, todo fluxo de reação submetido aos obstáculos de rede descritos acima, Mahadevan et al., Metab Eng 5: 264-76 (2003).
Ótimos nocautes de gene / reação são identificados resolvendo um problema de otimização de binível que escolhe o conjunto de reações ativas (yj = 1) tal que uma solução de crescimento ótima para a rede resul- tante superproduz o produto químico de interesse. Matematicamente, este problema de otimização de binível é expresso como o seguinte problema de otimização de binível misturado-inteiro:
<formula>formula see original document page 58</formula>
onde Vchemicai é a produção do produto alvo desejado, por exemplo succinato ou outro produto bioquímico, eKéo número de nocautes permissíveis. Note que selecionando K igual a zero retorna a solução de biomassa máxima da rede completa, enquanto selecionando K igual a um identifica o nocaute de gene / reação único (y, = 0) de tal forma que a rede resultante envolve a su- perprodução máxima dado seu rendimento de biomassa máximo. O obstácu- lo final assegura que a rede resultante encontra um rendimento de biomassa mínimo. Burgard et al., Biotechnol Bioeng 84: 647-57 (2003), fornece uma descrição mais detalhada da formulação modelo e procedimento de solução.
Podem ser resolvidos problemas que contêm centenas de variáveis binárias na ordem de 10 minutos a horas usando CPLEX 8.0, GAMS: The Solver Manuais. 2003: GAMS Development Corporation, acessada pelo GAMS, Brooke et al., GAMS Development Corporation (1998), modelando o ambien- te em uma estação de trabalho IBM RS6000-270. O sistema de OptKnock já é capaz de identificar estratégias de deleção de gene promissoras para a superprodução bioquímica, Burgard et al., Biotechnol Bioeng 84: 647-57 (2003), Pharkya et al., Biotechnol Bioeng 84: 887 899 (2003), e estabelece um sistema sistemático que irá naturalmente abranger melhorias futuras em sistemas de modelagem metabólica e regulatória. Qualquer solução do problema de binível de OptKnock descrito acima irá fornecer um conjunto de reações metabólicas para romper. A eli- minação de cada reação dentro do conjunto ou modificação metabólica pode resultar em 4-HB ou BDO como um produto obrigatório durante a fase de crescimento do organismo. Porque as reações são conhecidas, uma solução para o problema de binível de OptKnock também fornecerá o gene ou genes associados que codificam uma ou mais enzimas que catalisam cada reação dentro de um conjunto de reações. A identificação de um conjunto de rea- ções e de seus genes correspondentes que codificam as enzimas que parti- cipam de cada reação geralmente é um processo automatizado, realizado pela correlação das reações com um banco de dados de reação tendo uma relação entre as enzimas e os genes codificantes.
Uma vez identificado, o conjunto de reações que serão rompidas a fim de alcançar a produção de 4-HB ou BDO é implementado na célula ou organismo alvo pelo rompimento funcional de pelo menos um gene que codi- fica cada reação metabólica dentro do conjunto. Um meio particularmente útil para alcançar o rompimento funcional do conjunto de reação é pela dele- ção de cada gene codificante. Porém, em alguns exemplos, pode ser benéfi- co romper a reação por meio de outras aberrações genéticas incluindo, por exemplo, mutação, deleção de regiões regulatórias tais como promotores ou sítios de ligação eis para fatores regulatórios, ou pela mutilação da seqüên- cia de codificação em qualquer um de vários locais. Estas últimas aberra- ções, resultando em menos que a deleção total do conjunto de gene pode ser útil, por exemplo, quando são desejadas avaliações rápidas do succinato juntar ou quando a reversão genética é menos provável de acontecer.
Para identificar soluções produtivas adicionais ao problema de binível de OptKnock descrito acima que conduz a conjuntos adicionais de reações para romper ou modificações metabólicas que podem resultar na biossíntese, incluindo a biossíntese ligada ao crescimento de 4-HB ou outro produto bioquímico, um método de otimização, chamado cortes inteiros, po- de ser implementado. Este método procede pela resolução iterativa do pro- blema de OptKnock exemplificado acima com a modalidade de um obstáculo adicional referido como corte inteiro em cada interação. Obstáculos de corte inteiro eficazmente impedem o procedimento de solução de escolher exata- mente o mesmo conjunto de reações identificadas em uma interação prévia que acopla obrigatoriamente a biossíntese do produto ao crescimento. Por exemplo, se uma modificação metabólica acoplada ao crescimento previa- mente identificada especifica as reações 1, 2 e 3 para ruptura, então o se- guinte obstáculo previne as mesmas reações de serem simultaneamente consideradas em soluções subsequentes: yl + y2 + y3 1. O método de corte inteiro é bem-conhecido na técnica e pode ser encontrado descrito em, por exemplo, referência, Burgard et al., Biotechnol Prog 17: 791-797 (2001). Como com todos os métodos descritos aqui com referência ao seu uso em combinação com o sistema computacional OptKnock para modelagem e si- mulação metabólica, o método de corte inteiro para reduzir a redundância na análise computacional interativa com outros sistemas computacionais co- nhecidos o técnica incluindo, por exemplo, SimPheny®.
Obstáculos da forma acima impedem a identificação de conjun- tos de reação maiores que incluem conjuntos previamente identificados. Por exemplo, empregando o método de otimização de corte inteiro acima em uma interação adicional impediria a identificação de um conjunto de reação quádruplo que especificou as reações 1, 2 e 3 para o rompimento uma vez que estas reações tenham sido previamente identificadas. Para assegurar a identificação de todos os conjuntos de reação possíveis conduzindo à pro- dução biossintética de um produto, uma modificação do método de corte inteiro pode ser empregado.
Em síntese, o procedimento de corte inteiro modificado começa com a interação 'zero' que calcula a produção máxima do produto bioquími- co desejado em um crescimento ótimo para uma rede do tipo selvagem. Es- te cálculo corresponde a uma solução de OptKnock com K igualando a 0. A seguir, nocautes únicos são considerados e dois conjuntos de parâmetros, objstoreiter e ystoreiterj, para armazenar a função objetiva (Vchemical) e a re- ação de informação on-off (yj), respectivamente, a cada repetição, iter. Os obstáculos seguintes são então acrescentados sucessivamente à formula- ção de OptKnock a cada repetição.
<formula>formula see original document page 61</formula>
Na equação acima, ε e M estão em números pequenos e gran- des, respectivamente. Em geral, ε pode ser fixado em cerca de 0,01 e M po- de ser fixado em cerca de 1000. Porém, números menores e/ou maiores que estes números também podem ser usados. M assegura que o obstáculo só pode ser ligado para estratégias de nocaute previamente identificadas, en- quanto que ε assegura que nocautes de adição a uma estratégia previamen- te identificada deve levar a um aumento de pelo menos ε na produção bio- química em crescimento ótimo. A abordagem se move sobre deleções du- plas sempre que uma estratégia de deleção única falha no aperfeiçoamento da cepa do tipo selvagem. Deleções triplas são então consideradas quando nenhuma estratégia de deleção dupla aperfeiçoa a cepa do tipo selvagem, e assim por diante. O resultado final é uma lista ranqueada, representada co- mo produção bioquímica desejada em crescimento ótimo, de estratégias de deleção distintas que diferem uma da outra por pelo menos um nocaute. Es- te procedimento de otimização bem como a identificação de uma ampla va- riedade de conjuntos de reação que, quando rompidas, conduzem à biossín- tese, incluindo a produção ligada ao crescimento, de um produto bioquímico. Dado os ensinamentos e orientações fornecidas aqui, aqueles versados na técnica irão entender que os métodos e projetos de engenharia metabólica exemplificados aqui são igualmente aplicáveis para a identificação de novas vias biossintéticas e/ou para o acoplamento obrigatório do crescimento celu- lar ou de micro-organismo para qualquer produto bioquímico.
Os métodos exemplificados acima e adicionalmente ilustrados nos Exemplos abaixo habilita a construção de células e organismos que pro- duzem biossinteticamente, incluindo a produção de acoplamento obrigatório de um produto bioquímico alvo para crescimento da célula ou organismo manipulado para abrigar as alterações genéticas identificadas. Nesta consi- deração, alterações metabólicas foram identificadas o que resulta na bios- síntese de 4-HB e 1,4-butanodiol. Cepas de micro-organismo construídas com as alterações metabólicas identificadas produzem níveis elevados de 4- HB ou BDO comparados a organismos microbianos inalterados. Estas cepas podem ser usadas vantajosamente para a produção comercial de 4-HB, BDO1 THF e GBL1 por exemplo, em processo de fermentação contínua sem ser submetido a pressões seletivas negativas.
Portanto, os métodos computacionais descritos aqui permitem a identificação e implementação de modificações metabólicas que são identifi- cadas em um método in silico selecionado de OptKnock ou SimPheny. O conjunto de modificações metabólicas pode incluir, por exemplo, a adição de uma ou mais enzimas da via biossintética e/ou rompimento funcional de uma ou mais reações metabólicas incluindo, por exemplo, rompimento através de deleção de gene.
É compreendido que modificações que não afetam substancial- mente a atividade das várias modalidades desta invenção também estão incluídas dentro da definição da invenção fornecida aqui. Consequentemen- te, os exemplos a seguir pretendem ilustrar mas não limitar a presente in- venção.
EXEMPLO I
Biossíntese do Ácido 4-Hidroxibutanoico
Este Exemplo descreve as vias bioquímicas para a produção de 4-HB.
Relatórios prévios da síntese de 4-HB em micróbios focaram neste composto como um intermediário na produção do poli-hidroxialcanoato de plástico biodegradável (PHA) (a Patente Americana No. 6.117.658). O uso de copolímeros 4-HB/3-HB sobre o polímero poli-3-hidroxibutirato (PHB) pode resultar em um plástico que é menos frágil (Saito e Doi, Intl. J. Bioi MacromoL 16:99-104 (1994)). A produção de 4-HB monomérico descrita a- qui é um processo fundamentalmente distinto por várias razões: (1) o produ- to é secretado, ao contrário de PHA que é produzido intracelularmente e permanece na célula; (2) para organismos que produzem polímeros de hi- droxibutanoato, 4-HB livre não é produzido, mas de preferência o derivado da Coenzima A é usado pela polihidroxialcanoato sintase; (3) no caso do polímero, a formação do produto granular muda a termodinâmica; e (4) o pH extracelular não é um assunto para a produção do polímero, considerando que afetará se 4-HB está presente no ácido livre ou no estado de base con- jugado, e também o equilíbrio entre 4-HB e GBL.
4-HB pode ser produzido em duas etapas de redução enzimática a partir de succinato, um metabólito central do ciclo de TCA, com semialdeí- do succínico como o intermediário (Figura 2). A primeira destas enzimas, semialdeído succínico desidrogenase, é nativa para muitos organismos in- cluindo E. coli em que ambas as enzimas NADH - e NADPH-dependentes foram encontradas (Donnelly e Cooper, Eur. J. Biochem. 113:555-561 (1981); Donnelly e Cooper, J. Bacteriol. 145:1425-1427 (1981); Marek e Henson, J. Bacteriol. 170:991-994 (1988)). Também há evidência suportan- do a atividade da semialdeído succínico desidrogenase em S. cerevisiae (Ramos et al., Eur. J. Biochem. 149:401-404 (1985)), e um gene putativo foi identificado através de homologia de seqüência. Porém, a maioria dos rela- tórios indica que esta enzima procede na direção da síntese de succinato, como mostrado na Figura 2 (Donnelly e Cooper, supra; Lutke-Eversloh e Steinbuchel, FEMS Microbiol. Lett. 181:63-71 (1999)), participando da via de degradação de 4-HB e gama-aminobutirato. Semialdeído succínico também é nativamente produzido por certos organismos microbianos tais como E. coli através do intermediário α-cetoglutarato do ciclo de TCA pela ação de duas enzimas: glutamato:succínico semialdeído transaminase e glutamato descarboxilase. Uma via alternativa, usada pelo Clostridium kluyveri obriga- toriamente anaeróbio para degradar succinato, ativa succinato para succinil- CoA, então converte succinil-CoA para semialdeído succínico que usa uma semialdeído succínico desidrogenase alternativa que é conhecido para fun- cionar nesta direção (Sohling e Gottschalk, Eur. J. Biochem. 212:121-127 (1993)). Porém, esta via tem o custo energético de ATP exigido para conver- ter succinato para succinil-CoA.
A segunda enzima da via, 4-hidroxibutanoato desidrogenase, não é nativa em E. coli ou em levedura mas é encontrada em várias bacté- rias tais como C. kluyveri e Ralstonia eutropha (Lutke-Eversloh e Steinbu- chel, supra-, Sohling e Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996); Valentin et al., Eur. J. Biochem. 227:43-60 (1995); Wolff e Kenealy, Protein Expr. Pu- rif. 6:206-212 (1995)). Estas enzimas são conhecidas por serem NADH- dependentes, embora formas NADPH-dependentes também existam. Uma via adicional para 4-HB a partir de alfa cetoglutarato foi demonstrada em E. coli que resulta no acúmulo de poli (ácido 4-hidroxibutírico) (Song et al., Wei Sheng Wu Xue.Bao. 45:382-386 (2005)). A cepa recombinante requereu a superexpressão de três genes heterólogos, PHA sintase (R. eutropha), 4- hidroxibutirato desidrogenase {R. eutropha) e 4-hidroxibutirato: CoA transfe- rase (C. kluyveri), junto com dois genes de E. coli nativos: glutama- to:semialdeído succínico transaminase e glutamato descarboxilase. As eta- pas 4 e 5 na Figura 2 podem ser alternativamente realizados por uma alfa- cetoglutarato descarboxilase tal como a identificada em Euglena gracilis (Shigeoka et al., Biochem. J. 282 (Pt2): 319-323 (1992); Shigeoka e Nakano, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28 (1991); Shigeoka e Nakano, Biochem J. 292 (Pt 2):463-467 (1993)). Porém, esta enzima não foi previamente aplica- da para impactar a produção de 4-HB ou polímero relacionados em qualquer organismo.
A direcionalidade relatada de semialdeído succínico desidroge- nase levou à investigação da termodinâmica do metabolismo de 4-HB. Es- pecificamente, este estudo investigou se ou não as reações envolvidas na conversão de succinato ou succinil-CoA para 4-HB são termodinamicamente favoráveis (i.e., ΔGr < 0) sob as condições fisiológicas típicas presentes em E coli e S. cerevisiae. Foi assumido que todas as reações de oxida- ção/redução utilizam NADH, embora os resultados para assumir a utilização de NADPH seriam similares. As energias livres de Gibbs padrão de forma- ção (AGf°) foram calculadas para cada composto nas vias de succinato e succinil-CoA mostrados na Figura 2 baseado no método de contribuição em grupo (Mavrovouniotis, M.L., J. Biol. Chem. 266:14440-14445 (1991)). Cada energia de Gibbs padrão de formação foi então transformada para obter um critério de mudança espontânea em uma pressão, temperatura, pH e força tônica especificada (Alberty, R.A., Biochem. Biophys. Acta 1207:1-11 (1994)) (equação 1). <formula>formula see original document page 65</formula>
onde AGf0 é a energia de Gibbs padrão de formação, o Nh é o número de átomos de hidrogênio no composto, R é a constante universal dos gases, T é constante a 298K, ζ é a carga da molécula ao pH de interesse, I é a força iônica em M e B é uma constante igual a 1,6 L0,5/mol0,5.
A equação 1 revela que o pH intracelular e a força iônica de- sempenham um papel na determinação da viabilidade termodinâmica. Nor- malmente, o pH intracelular das células é muito bem regulado, até mesmo quando há grandes variações no pH da cultura. O pH intracelular de E. coli e S. cerevisiae foram ambos informados na literatura. E. coli mantém um pH intracelular de 7,4-7,7 durante condições de crescimento típicas em tampões neutros, mas pode cair para 7,2 em meio de pH 6 e até mesmo vai tão baixo quanto 6,9 para pH externo de 5 (Riondet et al., Biotechnology Tech. 11:735- 738 (1997)). Porém, o crescimento de E. coli é severamente inibido por pH externo abaixo de 6. O pH de levedura exibe mais variação. Durante a fase de crescimento exponencial, o pH interno de S. cerevisiae foi medido para estar na faixa de 6,7-7,0 com pH externo controlado a 5,0 (Dombek e In- gram, AppI. Environ. Microbiol. 53:1286-1291 (1987)). Por outro lado, nas células em repouso o pH interno cai para abaixo de 6 quando o pH externo for 6 ou menos (lmai e Ohno, J. Biotechno!. 38:165-172 (1995)). Esta análise assume um pH intracelular de 7,4 para E. coli e 6,8 para S. cerevisiae. Uma força iônica de 0,15 também foi assumida (Valenti et al., supra).
As energias de Gibbs de formação transformadas foram calcula- das no estado padrão (pH = 7,0, I = 0) e nos estados fisiológicos de E. coli (pH = 7,4, I = 0,15) e S. cerevisiae (pH = 6,8,1 = 0,15). As energias de Gibbs de reação transformadas (AGr') foram então calculadas levando a diferença em AGf', entre os produtos e os reagentes. As energias de Gibbs das rea- ções transformadas necessárias para converter succinato ou succinil-CoA para 4-HB são fornecidas na Tabela 2. Embora algumas das etapas tenham valores de delta G positivo calculados, os erros padrões para estes cálculos e gradientes de concentração indicam que qualquer uma das etapas é pos- sível. Note que o erro padrão, Uf.est, em AGf calculado pela teoria de contri- buição em grupo é de 4 kcal/mol. A incerteza em AGr, Ur,est, pode ser calcu- lado como a norma de Euclidean da incerteza para AGf de cada composto (Equação).
<formula>formula see original document page 66</formula>
onde n é o coeficiente de estequiometria e i é o composto. Para as reações examinadas, esta incerteza está na ordem de 8 kcal/mol. Tabela 2. Energia de Gibbs livre de reação (kcal/mol) em valores de pH e de força iônica diferentes. A primeira coluna está sob condições padrões, en- quanto as outras são ajustadas de acordo com a equação 1. A temperatura é constante a 298 K. As barras de erro destes valores estão na ordem de 8 kcal/mol, como calculado pela equação 2. Abreviações: sue, succinato; suc- sa, semialdeído succínico; succoa, succinil-CoA; Pi, fosfato inorgânico.
<table>table see original document page 66</column></row><table>
A Tabela 2 revela que a maioria das reações provavelmente en- contram uma barreira termodinâmica depois de considerar a incerteza po- tencial nesses cálculos é semialdeído succínico desidrogenase (etapa 1 na Figura 2). Se esta reação pode ser direcionada mais próximo a viabilidade termodinâmica também variando as concentrações assumidas dos metabóli- tos participantes também foi estudado. Por exemplo, as energias de Gibbs padrão assumem concentrações de 1M para todos os compostos participan- tes (menos água). Em um ambiente anaeróbio, NADH estará presente em concentrações vários-vezes mais alta que NAD. Assumindo [NADH] = 5 x [NAD], foi calculado o efeito em AGr' usando a equação
<formula>formula see original document page 67</formula>
Esta mudança resulta em uma diferença de cerca de 1 kcal/mol nos valores de delta G para semialdeído succínico desidrogenase. A equa- ção 3 também foi usada para calcular outros efeitos em AG, tal como a alta concentração de succinato para direcionar as reações. Uma diferença de 1000-vezes nas concentrações de succinato e semialdeído succínico contri- buirá cerca de 5 kcal/mol para delta G. Levado em conjunto com uma incer- teza assumida de 8 kcal/mol, a possibilidade de que a semialdeído succínico desidrogenase irá operar na direção para semialdeído de succínico sob al- gum conjunto de condições fisiológicas não pode ser eliminada. Assim, a via direta a partir de succinato para 4-HB permanece em consideração na análi- se subsequente.
As capacidades de produção microbianas de 4-hidroxibutirato foram exploradas em dois micróbios, Escherichia coli e Saccharomyces ce- revisiae, usando modelos metabólicos in silico de cada organismo. Vias po- tenciais para 4-HB procedem por meio de succinato, succinil-CoA, ou alfa- cetoglutarato intermediário como mostrado na Figura 2.
Uma primeira etapa na via de produção de 4-HB a partir de suc- cinato envolve a conversão de succinato para semialdeído succínico por meio de semialdeído succínico desidrogenase NADH- ou NADPH- dependente. Em E. coli, gabD é uma semialdeído succínico desidrogenase NADP-dependente e é parte de um grupo de genes envolvido na captação e degradação de 4-aminobutirato (Niegemann et al., Arch. Microbiol. 160:454- 460 (1993); Schneider et al., J. Bacteriol. 184:6976-6986 (2002)). Acredita-se que sad codifica a enzima para a atividade semialdeído succínico desidro- genase NAD-dependente (Marek e Henson, supra). S. cerevisiae contém somente semialdeído succínico desidrogenase NADPH-dependente, putati- vamente nomeado para UGA2, o qual localiza o citosol (Huh et al., Nature 425:686-691 (2003)). Os cálculos de rendimento máximo que assumem a via de succinato para 4-HB entre ambos E. coli e S. cerevisiae requerendo so- mente a suposição que uma 4-HB desidrogenase não nativa foi adicionado às suas redes metabólicas.
A via a partir de succinil-CoA para 4-hidroxibutirato foi descrito na Patente US N0 6.117.658 como parte de um processo para fazer polihi- droxialcanoatos compreendendo unidades de monômero de 4- hidroxibutirato. Clostridium kluyveri é um exemplo de organismo conhecido por possuir atividade de semialdeído succínico desidrogenase CoA- dependente (Sohling e Gottschalk, supra, Sohling e Gottschalk1 supra). Nes- te estudo, é assumido que esta enzima, a partir de C. kluyveri ou outro orga- nismo, é expresso em E. coli ou S. cerevisiae junto com uma 4-HB desidro- genase não nativa ou heteróloga para completar a via a partir de succinil- CoA para 4-HB. A via a partir de alfa-cetoglutarato para 4-HB foi demonstra- do em E. coli que resulta no acúmulo de poli(ácido 4-hidroxibutírico) para 30% de peso seco de célula (Song et al., supra). Como E. coli e S. cerevisi- ae possuem nativamente ou endogenamente ambos glutamato:semialdeído succínico transaminase e glutamato descarboxilase (Coleman et al., J. Biol. Chem. 276:244-250 (2001)), a via a partir de AKG para 4-HB pode ser com- pletada em ambos os organismos somente assumindo que uma 4-HB desi- drogenase não nativa está presente.
EXEMPLO Il
Produção do Ácido 4-Hidroxibutanoico em E. coli
Este Exemplo descreve os rendimentos biossintéticos para ácido 4-hidroxibutanoico resultante a partir de cada via bioquímica.
Nesta seção, os rendimentos máximos teóricos de 4-HB a partir de glicose são calculados assumindo que cada uma das três vias metabóli- cas descritas na Figura 2 é funcional em E. coli. Um modelo metabólico em escala de genoma de E. coli, similar àquele descrito em Reed et al., Genoma Biol. 4:R54 (2003), foi usado como a base para a análise. O ganho energéti- co, em termos de moléculas de ATP produzidas, de cada via o rendimento máximo é calculado assumindo condições anaeróbicas, a menos que de ou- tra forma declarado. 4-Hidroxibutirato é assumido para sair de E. coli através de simporte de próton, como é o caso com a maioria dos ácidos orgânicos. Também é possível que GBL seja secretado por difusão simples, e neste caso as energéticas seriam mais favoráveis do que no caso considerado aqui. O impacto de cofator de especificidade (isto é, dependência de NADH ou NADPH) das enzimas participantes no rendimento máximo e as energéti- cas de cada via também foram investigadas.
Os resultados da análise são mostrados nas Tabelas 3 Α-C. A partir de uma enérgica e um ponto de vista de rendimento, o succinato para a via de 4-HB é o mais promissor. Especificamente, os cálculos revelam o rendimento máximo teórico de 4-HB a partir de glicose é 1,33 mol/mol (0,77 g/g; 0,89 Cmol/Cmol) assumindo que o succinato para a via de 4-HB é fun- cional. Em adição, a produção anaeróbica de 4-HB através de succinato re- sultaria na produção líquida de 1,8, 1,5, ou 1,1 mol de ATP por glicose de- pendendo da especificidade do cofator assumida das enzimas participantes. Estes rendimentos energéticos são comparáveis a 2,0 ATP por glicose que pode ser obtida por nivel de fosforilação de substrato pela produção de eta- nol ou Iactato que sugerindo o potencial para a produção anaeróbica de ho- mo-4-ΗΒ em E. coli.
A via de succinil-CoA para 4-HB é outra via promissora quando considerado o rendimento máximo e energéticas. Um rendimento de 1,33 mol/mol de 4-HB é realizável em E. coli se pelo menos um das etapas da via é considerado NADH-dependente. Porém, porque esta via requer a forma- ção de succinil-CoA, seu rendimento energético é inferior que o da via de succinato. Uma exigência de oxigênio é antecipada em altos rendimentos de 4-HB se ambas as etapas de semialdeído succínico desidrogenase CoA- dependente e 4-HB desidrogenase forem considerados NADPH-dependente. Neste caso, a produção de 4-HB no rendimento máximo não resultaria em nenhum ganho de ATP líquido e possivelmente não suportaria as demandas de manutenção energéticas necessárias para a sobrevivência de E. coli. As- sim, alguma energia deveria ter que se originar da fosforilação oxidativa para permitir a produção de 4-HB homo-fermentativa. A via de alfa-cetoglutarato que utiliza glutamato:semialdeído succinato transaminase e glutamato des- carboxilase para 4-HB é o menos favorável das três vias potenciais com um rendimento máximo realizável de 1,0 mol de 4-HB por mol de glicose. Além do rendimento máximo inferior, esta via requer a utilização de 1,5 mois de oxigênio por mol de glicose convertida para 4-HB. As energéticas desta via não são afetadas pela especificidade de cofator de 4-HB desidrogenase considerada.
Tabela 3. A estequiometria de conversão de substrato global para 4-HB as- sumindo que as vias de produção A) succinato, B) succinil-CoA ou C) alfa- cetoglutarato são funcionais em E. coli. Glicose e oxigênio são recolhidos enquanto todas as outras moléculas são produzidas.
A) via de Succinato
<table>table see original document page 70</column></row><table>
B) Via de SucciniI-CoA
<table>table see original document page 70</column></row><table> C) Alfa - Via de cetoglutarato
<table>table see original document page 71</column></row><table>
Para corroborar as predições computacionais propostas neste relatório, as cepas expressando uma via completa para 4-HB podem ser construídos e testadas. A corroboração é executada com ambos E. coli (E- xemplos Il e IV) e S. cerevisiae (Exemplo III). Em E. coli, os genes pertinen- tes são expressos em um operon sintético atrás de um promotor de induzível em um plasmídeo de cópia média ou alta; por exemplo, o promotor PBad o qual é induzido pela arabinose, em um plasmídeo da série de pBAD (Guz- man et al., J. Bacteriol. 177:4121-4130 (1995)). Em S. cerevisiae, os genes são integrados nos cromossomos atrás do promotor PDC1, realocando o gene de piruvato carboxilase nativo. Foi relatado que esses resultados em alta expressão de genes estrangeiros do que a partir de um plasmídeo (Ishi- da et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:1964-1970 (2005)), e também irá asse- gurar a expressão durante condições anaeróbicas.
Células que contêm os construtos pertinentes são crescidas em meio mínimo contendo glicose, com adição de arabinose no caso de E. coli que contêm genes expressos sob o promotor Pbad- Amostras periódicas são levadas para ambas as análises de expressão de gene e de atividade enzi- mática. Ensaios de atividade enzimática são realizados em extratos celula- res brutos que usam procedimentos bem-conhecidos na técnica. Alternati- vamente, ensaios baseados na oxidação de NAD(P)H, o qual é produzido em todas as etapas de reação de desidrogenase e detectável através de espectrofotometria, podem ser utilizados. Além disso, anticorpos podem ser usados para descobrir o nível de enzimas particulares. Em vez de ou em adição a medidas de atividade enzimática, o RNA pode ser isolado de amos- tras paralelas e transcrito do gene de interesse medido por PCR de trans- criptase reversa. Qualquer construto carecendo de expressão de transcrito detectável é reanalizado para assegurar que os ácidos nucleicos codifican- tes são abrigados em uma forma expressível. Onde são detectados transcri- tos, este resultado ou indica uma carência de tradução ou a produção de uma enzima inativa. Uma variedade de métodos bem-conhecidos na técnica pode adicionalmente ser empregada, tais como a otimização de codon, o projeto de um sítio de ligação de ribossomo forte, uso de um gene de uma espécie diferente, e prevenção de N-glicosilação (para expressão de enzi- mas bacterianas em levedura) pela conversão de resíduos de Asn para Asp. Uma vez que todas as atividades enzimáticas exigidas foram detectadas, a próxima etapa é medir a produção de 4-HP in vivo. Culturas em frascos de agitação em triplicata são crescidas ou anaerobiamente ou microaeróbica- mente, dependendo das condições requeridas (veja acima) e amostras peri- ódicas são tomadas. Ácidos orgânicos presentes nos sobrenadantes de cul- tura são analisados por HPLC usando a coluna de Aminax AI-87X. O tempo de eluição de 4-HB será determinado usando um padrão comprado de um fornecedor químico.
A via CoA-independente pode ser implementada e ser testado para corroboração. Neste caso, os genes superexpressos são a semialdeído succínico desidrogenase nativa de cada organismo e 4-hidroxibutanoato de- sidrogenase de Ralstonia eutropha. Uma vez que ambas as atividades en- zimáticas são detectadas como discutido acima, as cepas são testadas para a produção de 4-HB. Corroboração também pode ser obtida a partir da im- plementação da via CoA-dependente. A semialdeído succínico desidrogena- se CoA-dependente e a 4-hidroxibutanoato desidrogenase a partir de Clos- tridium kluyveri são expressos como descrito acima. Além disso, a superex- pressão da succinil-CoA sintetase nativa também pode ser realizada, para canalizar mais succinato na via heteróloga. Finalmente, se a produção de 4- HB é desfavorável, podem ser testadas condições de cultura diferentes, tais como uma mudança no estado de oxigenação o que pode manipular a razão de NAD(P)H/NAD(P). EXEMPLO III
Produção do Ácido 4-Hidroxibutanoico em Levedura
Este Exemplo descreve os rendimentos biossintéticos para o ácido 4-hidroxibutanoico resultante de cada via bioquímica em S. cerevisiae.
Nesta seção, os rendimentos máximos teóricos de 4-HB a partir de glicose são calculados assumindo que cada uma das três vias metabóli- cas descritas na Figura 2 é funcional em S. cerevisiae. Um modelo metabóli- co em escala de genoma de S. cerevisiae, similar àquele descrito em Forster et al. Genome Res. 13:244-253 (2003) foi usado como a base para a análi- se. O ganho energético de cada via de rendimento máximo é calculado as- sumindo condições anaeróbicas a menos que de outra forma declarado. 4- hidroxibutirato é considerado para sair de S. cerevisiae por simporte de pró- ton, como é o caso com a maioria dos ácidos orgânicos. O impacto da espe- cificidade de cofator (isto é, dependência de NADH ou NADPH) das enzimas participando no rendimento máximo e as energéticas de cada via também foram investigadas.
Os resultados da análise são mostrados nas Tabelas 4 A-C. Como com E. coii, a via de succinato para 4-HB é a mais promissora contan- to que as preocupações termodinâmicas que surgiram no Exemplo I possam ser superadas. Os cálculos revelam que o rendimento máximo teórico de 4- HB a partir de glicose são 1,33 mol/mol (0,77 g/g; 0,89 Cmol/Cmol) em S. cerevisiae. Além disso, a produção anaeróbica de 4-HB por meio de succina- to ou resultaria na produção líquida de 1,4, 1,1, ou de 0,5 mol de ATP por glicose dependendo da especificidade de cofator assumida das enzimas par- ticipantes.
A via de succinil-CoA para 4-HB é a segunda via mais favorável. Um rendimento de máximo de 1,33 mol de 4-HB / mol de glicose é realizável em S. cerevisiae apesar da especificidade de cofator. Porém, a geração de energia líquida ao rendimento máximo teórico só é possível se ambas as etapas de succínico semialdeído desidrogenase CoA-dependente e de 4-HB desidrogenase são consideradas como sendo NADH-dependente. Se qual- quer etapa for dependente de NADPH, nenhum ATP líquido será ganho a partir da produção anaeróbica de 4-HB e uma fonte de energia alternada (por exemplo, fosforilação oxidativa) poderia ser requerida para suportar o crescimento e manutenção celular. A via de alfa-cetoglutarato para 4-HB é a menos favorável das três vias potenciais em S. cerevisiae embora o rendi- mento máximo de 1,1-1,2 mol de 4-HB por mol de glicose seja ligeiramente mais alto do que foi encontrado em E. coli. Não obstante, esta via requer uma captação de oxigênio de 0,8-0,9 mol de oxigênio por mol de glicose pa- ra se tornar energeticamente neutro.
Tabela 4. A estequiometria global de conversão do substrato para 4-HB em S. cerevisiae., assumindo que as vias de produção de A) succinato, B) suc- cinil-CoA ou C) alfa-cetoglutarato são funcionais em S. cerevisiae. Glicose e oxigênio são recolhidos enquanto todas as outras moléculas são produzidas.
A) Via de Succinato
<table>table see original document page 74</column></row><table>
B) Via de Succinil-CoA
<table>table see original document page 74</column></row><table> C) Via de alfa-cetoqlutarato
<table>table see original document page 75</column></row><table>
EXEMPLO IV
Biosslntese de 1.4-Butanodiol a partir de Succinato e g-Cetoqlutarato
Este Exemplo ilustra a construção e produção biossintética de 4- HB e BDO a partir de organismos microbianos.
Como previamente descrito nos Exemplos I-III, as características termodinâmicas das etapas de biotransformação de 4-HB para BDO mostra- das na Figura 1 também foram calculadas baseado na energia livre de Gibbs padrão de formação determinada pela contribuição em grupo. Os resultados são fornecidos na Tabela 5. Similarmente, embora algumas das etapas te- nham valores de delta G positivo calculados, os erros padrões para estes cálculos e gradientes de concentração indicam que qualquer uma das eta- pas é possível.
Tabela 5. Energia livre Gibbs de reação (kcal/mol) sob condições padrões (valores de pH e de força iônica). A temperatura foi constante a 298 K. As barras de erro para estes valores estão na ordem de 8 kcal/mol, como calcu- lado pela equação 2. Abreviações: 4-HBald, 4 hidroxibutiraldeído.
<table>table see original document page 75</column></row><table>
Rendimentos teóricos foram calculados assumindo que todas as vias na Figura 2 estão incorporadas em E. coli. Um modelo metabólico em escala de genoma de E coli, similar àquele descrito em Reed et al., Genoma Biol 4:R54 (2003), foi usado como a base para a análise. O rendimento má- ximo teórico assumindo a neutralidade energética e nenhum crescimento de célula ou manutenção foi 1,09 mol de BDO / mol de glicose sob condições microaeróbicas. Simulações realizadas sob condições anaeróbicas que po- dem ser utilizadas para direcionar a via para a produção de BDO, ou acetato ou etanol é produzido como um coproduto. Sob estas condições, os rendi- mentos máximos eram de 1,04 e 1,00 mol / mol, respectivamente. Uma al- ternativa é adicionar quantidades Iimitativas de nitrato como um receptor de elétron, controlando assim a quantidade de respiração que pode acontecer. Sob esta condição, o rendimento máximo retorna para 1,09 mol / mol. Outra alternativa é substituir a fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase nativa de E. coli com um heterólogo ou fosfoenolpiruvato carboxiquinase manipulada que é capaz de funcionar na direção da carboxilação de PEP. Esta enzima produz ATP, enquanto que a PEP carboxilase não produz. Sob esta suposição, o rendimento máximo retorna para 1,09 mol / mol.
Além disso, existem várias enzimas alternativas que podem ser utilizadas na via descrita acima. A enzima nativa ou endógena para conver- são de succinato para succinil-CoA (Etapa 1 na Figura 2) pode ser substituí- do por uma CoA transferase tal como aquele codificado pelo gene cat1 de C. kluyveri (Sohling, B. e G. Gottschalk, Eur.J Biochem. 212:121-127 (1993)) o qual funciona de uma maneira similar à Etapa 9. Entretanto, a produção de acetato por esta enzima pode não ser ótima, como pode ser secretado ao invés de ser convertido de volta para acetil-CoA. Neste respeito, também pode ser benéfico eliminar a formação de acetato na Etapa 9. Como uma alternativa para este CoA transferase, pode ser empregado um mecanismo no qual o 4-HB é primeiro fosforilado por ATP e então convertido ao derivado de CoA, similar à via de acetato quinase / fosfotransacetilase em E coli para a conversão de acetato para acetil-CoA. O custo líquido desta via é um ATP, o qual é o mesmo exigido para regenerar acetil-CoA a partir de acetato. As enzimas fosfotransbutirilase (ptb) e butirato quinase (bk) são conhecidas por realizar estas etapas nas moléculas não hidroxiladas a para produção de butirato em C. acetobutylicum (Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576- 1583 (1990); Valentine, R. C. e R. S. Wolfe, J Biol Chem. 235:1948-1952 (1960)). Estas enzimas são reversíveis, permitindo a síntese para proceder na direção de 4-HB.
BDO também pode ser produzido por α-cetoglutarato em adição a ou em vez de através de succinato. Como previamente descrito e ainda exemplificado abaixo, uma via para realizar a biossíntese do produto está com a produção de semialdeído succínico por meio de α-cetoglutarato u- sando as enzimas endógenas (Figura 2, Etapas 4-5). Uma alternativa é usar uma α-cetoglutarato descarboxilase que pode executar esta conversão em uma etapa (Figura 2, Etapa 8; Tian et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A 102: 10670-10675 (2005)).
Para a construção de cepas diferentes de organismos microbia- nos produtores de BDO, uma lista de genes aplicáveis foi reunida para cor- roboração. Resumidamente, foram identificados um ou mais genes dentro das vias biossintéticas de 4-HB e/ou BDO para cada etapa da via produtora de BDO completa mostrada na Figura 2, usando os recursos disponíveis na literatura, o banco de dados genético NCBI, e buscas de homologia. Os ge- nes clonados e avaliados neste estudo são apresentados abaixo na Tabela 6, junto com as referências apropriadas e as citações de URL para a se- qüência de polipeptídeo. Como ainda discutido abaixo, alguns genes foram sintetizados para otimização de codon enquanto outros foram clonados por PCR a partir do DNA genômico do organismo nativo ou do tipo selvagem. Para alguns genes ambas as abordagens foram usadas e no caso dos ge- nes nativos são indicados por um sufixo "n" ao número de identificação de gene quando usado em um experimento. Note que somente as seqüências de DNA diferem; as proteínas são idênticas. Tabela 6
<table>table see original document page 78</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 79</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 80</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 81</column></row><table> Construção do Vetor de Expressão para a via de BDO.
As estruturas principais de vetor e algumas cepas foram obtidas do Dr. Rolf Lutz de Expressys (www.expressys.de/). Os vetores e cepas são baseados no Sistema de Expressão pZ desenvolvido pelo Dr. Rolf Lutz e Prof. Hermann Bujard (Lutz, R. e H. Bujard, NucIeicAcid Res. 25:1203-1210 (1997)). Os vetores obtidos foram pZE13luc, pZA33luc, pZS*13luc e pZE22luc e contiveram o gene de Iuciferase como um fragmento de preen- chimento. Para substituir o fragmento de preenchimento de Iuciferase com um fragmento de lacZ-alfa flanqueado por sítios de enzima de restrição a- propriados, o fragmento de recheio de Iuciferase foi primeiramente removido de cada vetor através de digestão com EcoRI e Xbal. O fragmento de IacZ- alfa foi amplificado por PCR a partir de pUC19 com os seguintes iniciadores: IacZaIpha-RI
5'GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGG 15 CCGTCGTTTTAC3' lacZaIpha 3'BB
5'-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCA- GA-3'.
Isto gerou um fragmento com uma extremidade 5' do sítio EcoRI, sítio Nhel, um Sítio de Ligação Ribosomal, um sítio Sall e o codon de inicia- ção. As extremidades 3' do fragmento continham o codon de parada, Xbal, Hindlll e sítios AvrlI. O produto de PCR foi digerido com EcoRI e Avrll e ligou em os vetores básicos digeridos com EcoRI e Xbal (Xbal e Avrll têm extre- midades compatíveis e geram um não-sítio). Devido aos sítios de restrição enzimática Nhel e Xbal gerarem extremidades compatíveis que podem ser ligadas juntas (mas gera um não-sítio de Nhel / Xbal que não é digerido por qualquer enzima), os genes clonados nos vetores poderiam ser "Biobricked" juntos (http:// openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks). Em suma, este método permite a ligação de um número ilimitado de genes no vetor usando os mesmos 2 sítios de restrição (contanto que os sítios não pareçam internos aos genes), devido os sítios entre os genes serem destruídos de- pois de cada adição. Todos os vetores têm a designação de pZ seguida por letras e números indicando a origem de réplica, marcador de resistência antibiótica e promotor / unidade regulatória. A origem da replicação é a segunda letra e é denotada por E para ColE1, A para pl5A e S para pSC101 - origens basea- das. O primeiro número representa o marcador de resistência a antibiótico (1 para Ampicilina, 2 para Canamicina, 3 para Cloranfenicol, 4 para Espectino- micina e 5 para Tetraciclina). O número final define o promotor que regula o gene de interesse (1 para Piteto_1, 2 para Piaco_1. 3 para Pallaco_1 e 4 para Plac/ara_1). O MCS e o gene de interesse seguem imediatamente depois. Para o trabalho discutido aqui foram empregados dois vetores básicos, pZA33 e pZE13, modificado para as inserções de biobricks como discutido acima. Uma vez que o gene de interesse foi clonado neles, os plasmídeos resultan- tes são indicados usando os quatro códigos de gene de 4 dígitos dados na Tabela 6; por exemplo, pZA33-XXXX-YYYY -....
Construção de Cepa de Hospedeiro.
A cepa de origem em todos os estudos descritos aqui é E. coli K- cepa MG1655. Cepas de deleção marcadoras em adhE, gabD e aldA fo- ram construídas sob contrato de serviço por uma terceira parte que usa o método de redET (Datsenko, K. A. e B. L. Wanner, Proc Natl Acad Sci U.S.A 97:6640-6645 (2000)). Foram construídas, cepas subsequentes por transdu- ção mediada em bacteriófago P1 (Miller, J. 1973. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Habor Laboratories, Nova lorque). Cepa C600Z1 (la- ciq, PN25-tetR, SpR, lacYI, leuB6, mcrB+, supE44, thi-1, thr-1, tonA21) foi obtido a partir de Expressys e foi usado como uma fonte de um alelo de laclq para transdução de P1. O bacteriófago Plvir foi crescido na cepa C600Z1 E. coli, a qual tem o gene de resistência de espectinomicina ligado ao laclq. O lisado de P1 crescido em C600Z1 foi usado para infectar MG1655 com sele- ção para resistência à espectinomicina. As colônias resistentes à espectino- micina que foram então peneirados para o laclq ligado determinando a habi- lidade do transdutor para reprimir a expressão de um gene ligado a um pro- motor de PAllaco-1- A cepa resultante foi designada MG1655 laclq. Um proce- dimento similar foi usado para introduzir lacl0 nas cepas de deleção. Produção de 4-HB a partir de Succinato.
Para construção de um produtor de 4-HB a partir de succinato, genes que codificam as etapas a partir do succinato para 4-HB e 4-HB-CoA (1, 6, 7 e 9 na Figura 2) foram reunidos sobre os vetores pZA33 e pZE13 como descrito abaixo. Várias combinações de genes foram avaliadas, como também os construtos produzindo vias incompletas como controles (Tabelas 7 e 8). Os plasmídeos foram transformados então em cepas hospedeiras que contêm Iacl01 o que permite a expressão induzível pela adição de iso- propil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). Ambos do tipo selvagem e hospe- deiros com deleções em genes que codificam a semialdeído succínico desi- drogenase nativa (etapa 2 na Figura 1) foram testados.
A atividade das enzimas heterólogas foi testada primeiro em en- saios in vitro, enquanto usando a cepa Iacl0 de MG1655 como o hospedeiro para os construtos de plasmídeo contendo os genes da via. As células foram crescidas aerobiamente em meio de LB (Difco) contendo os antibióticos a- propriados para cada construto e induzido pela adição de IPTG a 1 mM quando a densidade óptica (OD6OO) atingiu aproximadamente 0,5. As célu- las foram coletadas depois de 6 horas e os ensaios enzimáticos conduzidos como discutido abaixo.
Ensaios enzimáticos in vitro.
Para obter extratos brutos para ensaios de atividade, as células foram colhidas através de centrifugação a 4.500 rpm (Beckman-Coulter, Al- legera X-15R) durante 10 min. Os péletes foram ressuspensos em 0,3 ml do reagente de BugBuster (Novagen) com benzonase e lisozima e lise realizada durante 15 minutos a temperatura ambiente com agitação suave. O lisado livre de células foi obtido através de centrifugação a 14.000 rpm (centrífuga Eppendorf 5402) durante 30 min a 4°C. A proteína celular na amostra foi de- terminada usando o método de Bradford et al., Anal. Biochem. 72:248-254 (1976), e ensaios de enzima específicos foram conduzidos como descrito abaixo. As atividades são relatadas em Unidades/mg de proteína, onde uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima exigida para converter 1 μmol de substrato em 1 min a temperatura ambiente. Em geral, valores informados são médias de pelo menos 3 replicatas de ensaios.
A atividade de succinil-CoA transferase (CatI) foi determinada monitorando a formação de acetil-CoA a partir de succinil-CoA e acetato, seguindo um procedimento previamente descrito Sohling e Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996). A atividade de succinil-CoA sintetase (SucCD) foi determinada seguindo a formação de succinil-CoA a partir de succinato e CoA na presença de ATP. O experimento seguiu um procedi- mento descrito por Cha e Parks1 J. Biol. Chem. 239:1961-1967 (1964). A atividade de semialdeído succinato desidrogenase (SucD) CoA-dependente foi determinada seguindo a conversão de NAD para NADH a 340 nm na pre- sença de succinato de semialdeído e CoA (Sohling e Gottschalk, Eur. J. Bio- chem. 212: 121-127 (1993)). A atividade enzimática de 4-HB desidrogenase (4-HBd) foi determinada monitorando a oxidação de NADH para NAD a 340 nm na presença de succinato de semialdeído. O procedimento seguiu um procedimento publicado (Sohling e Gerhardt et al. Arch. MicrobioL 174:189- 199 (2000). A atividade de 4-HB CoA transferase (Cat2) foi determinada u- sando um procedimento modificado de Scherf e Buckel, Appi. Environ. Mi- crobioi. 57:2699-2702 (1991). A formação de 4-HB-CoA ou a formação de butiril-CoA a partir de acetil-CoA e 4-HB ou butirato foi determinada usando HPLC.
Álcool (ADH) e aldeído (ALD) desidrogenase foram analisadas na direção redutiva usando um procedimento adaptado de várias fontes de literatura (Durre et al., FEMS Microbioi. Rev. 17:251-262 (1995); Palosaari e Rogers, J. Bacteriol. 170:2971-2976 (1988) e Welch et al., Arch. Biochem. Biophys. 273:309-318 (1989). A oxidação de NADH é seguida pela leitura da absorbância a 340 nM a cada quatro segundos para um total de 240 segun- dos a temperatura ambiente. Os ensaios redutivos foram realizados em MOPS de 100 mM (ajustados para pH 7,5 com KOH), NADH de 0,4 mM, e de 1 a 50 μl de extrato celular. A reação é iniciada pela adição dos seguintes reagentes: 100 μl de acetaldeído ou butiraldeído de 100 mM para ADH ou 100 μl de acetil-CoA ou butiril-CoA de 1 mM para ALD. O Espectrofotômetro é colocado em branco rapidamente e então a leitura cinética é iniciada. O declive resultante da redução na absorbância a 340 nM por minuto, junto com o coeficiente de extinção molar de NAD(P)H a 340 nM (6000) e a con- centração de proteína do extrato, pode ser usado para determinar a ativida- de específica.
A atividade enzimática de PTB é medida na direção de butiril- CoA para butiril-fosfato como descrito em Cary et al. J. Bacteriol. 170:4613- 4618 (1988). Isto fornece fosfato inorgânico para a conversão, e segue o aumento em CoA livre com o reagente 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico), ou DTNB. O DTNB rapidamente reage com grupos tiol tais como CoA livre para liberar o ácido 2-nitro-5- mercaptobenzoico (TNB) colorido de amarelo que absorve a 412 nm com um coeficiente de extinção molar de 14.140 M cm"1. O tampão do ensaio continha fosfato de potássio de 150 mM em pH 7,4, DTNB de 0,1 mM, e butiril-CoA de 0,2 mM, e a reação foi iniciada pela adição de 2 a 50 μΙ_ de extrato celular. A atividade enzimática de BK é medi- da na direção de butirato para a formação de butiril-fosfato à despesa de ATP. O procedimento é similar ao ensaio para acetato quinase previamente descrito por Rose et al., J. Biol. Chem. 211:737-756 (1954). Porém foi en- contrado outro protocolo de ensaio enzimático de acetato quinase fornecido por Sigma para ser mais útil e sensível. Este ensaio liga a conversão de ATP para ADP através de acetato quinase para a conversão ligada de ADP e pi- ruvato de fosfoenol (PEP) para ATP e piruvato através da piruvato quinase, seguida pela conversão de piruvato e NADH para Iactato e NAD+ através da lactato desidrogenase. Substituindo butirato por acetato é a única modifica- ção principal para permitir o ensaio a seguir a atividade de enzima BK. A mistura de ensaio continha tampão de trietanolamina de 80 mM a pH 7,6, butirato de sódio de 200 mM, MgCI2 de 10 mM, NADH de 0,1 mM, ATP de 6,6 mM, fosfoenolpiruvato de 1,8 mM. Piruvato quinase, Iactato desidroge- nase e mioquinase foram adicionados de acordo com as instruções do fabri- cante. A reação foi iniciada adicionando de 2 a 50 μΙ_ de extrato celular e a reação foi monitorada baseado na diminuição da absorbância a 340 nm indi- cando a oxidação de NADH.
Análise de Derivados de CoA por HPLC. Um ensaio baseado em HPLC foi desenvolvido para monitorar as reações enzimáticas que envolvem transferência de coenzima A (CoA). O método desenvolvido permitiu a caracterização da atividade enzimática por meio da determinação quantitativa de CoA1 acetil CoA (AcCoA), butil CoA (BuCoA) e 4-hidroxibutirato CoA (4-HBCoA) presentes em misturas reacio- nais in vitro. Sensibilidade até tão baixo quanto μΜ foi alcançada, assim co- mo uma excelente resolução de todos os derivados de CoA de interesse.
A preparação da química e da amostra foi realizada como a se- guir. Em síntese, CoA, AcCoA, BuCoA e todos os outros produtos químicos, foram obtidos de Sigma-AIdrich. Os solventes, metanol e acetonitrila, eram de grau de HPLC. Curvas de calibração padrão exibiram linearidade exce- lente dentro da faixa de concentração de 0,01-1 mg / ml. Misturas reacionais enzimáticas continham IOOmM de tampão Tris HCl (pH 7), alíquotas foram tomadas em diferentes pontos de tempo, extintas com ácido fórmico (con- centração final de 0,04%) e diretamente analisado por HPLC.
A análise de HPLC foi realizada usando um sistema Agilent 1100 HPLC equipado com uma bomba binária, degasser, autoamostrador termos- tático e compartimento de coluna, e um detector de ensaio de diodo (DAD), foi usado para a análise. Uma coluna de fase reversa, Kromasil 100 5um C18 4,6x150mm (Peeke Scientific), foi empregada. 25mM de fosfato de po- tássio (pH 7) e metanol ou acetonitrila, foram usados solventes aquosos e orgânicos a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Foram desenvolvidos dois méto- dos: um curto com um gradiente mais rápido para a análise de CoA, AcCoA e BuCoA bem-resolvidos, e um método mais longo para distinguir entre de perto a eluição de AcCoA e 4-HBCoA. O método curto empregado no gradi- ente de acetonitrila (0min - 5%, 6min - 30% 6,5min - 5%, IOmin - 5%) e re- sultados nos tempos de retenção 2,7, 4,1 e 5,5 min para CoA, AcCoA e Bu- CoA, respectivamente. No método longo o metanol para usado com o gradi- ente linear seguinte: 0min - 5%, 20 min. - 35% 20,5min - 5%, 25min - 5%. Os tempos de retenção para CoA, AcCoA, 4-HBCoA e BuCoA eram de 5,8, 8,4, 9,2 e 16,0 min, respectivamente. O volume de injeção era de 5pL, tempera- tura da coluna de 30°C e aabsorbância de UV foi monitorada a 260nm. Os resultados demonstraram atividade de cada uma das quatro etapas da via (Tabela 6), entretanto a atividade é claramente dependente da fonte de gene, posição do gene no vetor, e o contexto de outros genes com que é expresso. Por exemplo, o gene 0035 codifica uma semialdeído succí- nico desidrogenase que é mais ativa do que aqueles codificados para 0008 e 0036 e 0,010 mais ativos do que as mais 4-HB genes de desidrogenase que 0009. Assim também parece ter uma melhor atividade de 4-HB desidrogena- se se houvesse outro gene que precisando disto no mesmo operon. Tabela 7. Atividades enzimaticas in vitro em extratos celulares de lacl"q de MG1655 contendo os plasmideos que expressam ge- nes da via de 4-HB- CoA. As atividades sao relatadas em Unidades/mg de proteina. onde uma unidade ou atividade esta defi- nida como a quantidade de enzima exigida para converter 1 umol de substrato em 1 min a temperatura ambiente.
<table>table see original document page 89</column></row><table> Genes expressados a partir de Plac em pZE13, um plasmídeo de cópia alta com origem de colE1 e resistência de ampicilina. Os números de identificação de genes são como determinado na Tabela 2. Genes são expressos a partir de Plac em pZA33, um plasmídeo de cópia média com origem de pACYC e resistência de cloranfenicol.
(c) Proteína célular dada como mg de proteína por ml de extrato.
Cepas recombinantes contendo genes na via de 4-HB foram en- tão avaliadas para a habilidade para produzir 4-HB in vivo a partir de inter- mediários metabólicos centrais. As células foram crescidas anaerobiamente em meio de LB para OD6OO de cerca de 0,4, então induzidas com IPTG de 1 mM. Uma hora depois, succinato de sódio foi adicionado a 10 mM e amos- tras tomadas para análise seguindo 24 e 48 horas adicionais. 4-HB no caldo de cultura foi analisado por GC-MS como descrito abaixo. Os resultados in- dicam que a cepa recombinante pode produzir acima de 2 mM de 4-HB após 24 horas, comparado a essencialmente zero na cepa de controle (Tabela 8). Tabela 8
<table>table see original document page 91</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 92</column></row><table> (a) Concentração de 4-HB normalizada. uM/unidades de QD600.
Um substituto para usar uma CoA transferase (catl) para produ- zir succinil-CoA a partir de succinato é usar os genes de sucCD nativos de E. coli, codificando succinil-CoA sintetase. Este agrupamento de gene foi clonado sobre pZE13 junto com genes candidatos para as etapas restantes para 4-HB criar pZE13-0038-0035 -0036.
Produção de 4-HB a partir de glicose.
Embora as experiências acima demonstrem uma via funcional para 4-HB a partir de um intermediário metabólico central (succinato), um processo industrial iria requerer a produção de produtos químicos a partir de matérias-primas de carboidratos de baixo custo tal como glicose ou sacaro- se. Assim, o próximo conjunto de experiências foi apontado para determinar se o succinato endógeno produzido pelas células durante crescimento em glicose poderia abastecer a via de 4-HB. As células foram anaerobiamente crescidas em meio mínimo de M9 (Na2HP04 a 6,78 g/L, KH2PO4 a 3,0 g/L, NaCl a 0,5 g/L, NH4Cl a 1,0 g/L, MgSO4 de 1 mM, CaCl2 de 0,1 mM) suple- mentado com glicose de 20 g/L, ácido 3 - (N-morfolino) propanosulfônico (MOPS) de 100 mM para melhorar a capacidade de tamponação, tiamina de 10 µg / ml, e os antibióticos apropriados. IPTG de 0,25 mM foi adicionado quando OD6OO alcançou aproximadamente 0,2 e amostras tomadas para análise de 4-HB a cada de 24 horas seguindo de indução. Em todos os ca- sos 4-HB alcançou um platô depois de 24 horas, com um máximo de cerca de 1 mM nas melhores cepas (Figura 11a), enquanto a concentração de succinato continuou subindo (Figura 11b). Isto indica que o fornecimento de succinato para a via não é provavelmente limitante, e que o gargalo pode estar na atividade das enzimas por si só ou na disponibilidade de NADH. 0035 e 0036 são claramente os melhores candidatos de gene para semial- deído succínico desidrogenase CoA-dependente e 4-HB desidrogenase, respectivamente. A eliminação de um ou ambos os genes que codificam semialdeído succínico desidrogenases nativas conhecidas (gabD) ou putati- vas (aldA) teve pouco efeito no desempenho. Finalmente, deveria ser notado que as células cresceram a uma OD muito inferior nas cepas produtoras de 4-HB do que nos controles (Figura 11c).
Uma via alternada para a produção de 4-HB a partir de glicose é por meio de α-cetoglutarato. Foi explorado o uso de uma a-cetoglutarato descarboxilase a partir de Mycobacterium tuberculosis Tian et al., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 102:10670-10675 (2005) para produzir semialdeído succíni- co diretamente de α-cetoglutarato (etapa 8 na Figura 2). Para demonstrar que este gene (0032) foi funcional in vivo, o próprio foi expressado em pZE13 no mesmo hospedeiro que 4-HB desidrogenase (gene 0036) em pZA33. Esta cepa foi capaz de produzir 4 HB acima de 1,0 mM dentro de 24 horas seguindo a indução com IPTG de 1 mM (Figura 12). Uma vez que esta cepa não expressa uma semialdeído succínico desidrogenase CoA- dependente, a possibilidade de produção de semialdeído succínico por meio de succinil-CoA é eliminada. Também é possível que os genes nativos res- ponsáveis para a produção de semialdeído succínico poderia funcionar nes- ta via (etapas 4 e 5 na Figura 2); porém, a quantidade de 4-HB produzido quando o plasmídeo pZE13-0032 foi excluído do hospedeiro é desprezível.
Produção de BDO a partir de 4-HB.
A produção de BDO a partir de 4-HB requeriu duas etapas de redução, catalisadas pelas desidrogenases. Álcool e aldeído desidrogenases (ADH e ALD1 respectivamente) são enzimas dependentes de NAD+/H e/ou NADP+/H- que juntas podem reduzir um grupo de ácido carboxílico em uma molécula para um grupo de álcool, ou ao contrário, pode realizar a oxidação de um álcool para um ácido carboxílico. Esta biotransformação foi demons- trada em Clostridium acetobutylicum do tipo selvagem (Jewell et al., Current Microbiology 13:215-19 (1986)), mas nem as enzimas responsáveis nem os genes responsáveis foram identificados. Além disso, não é conhecido se a ativação para 4-HB-CoA é primeiro requerida (etapa 9 na Figura 2), ou se a aldeído desidrogenase (etapa 12) pode agir diretamente em 4-HB. Foi de- senvolvido uma lista de enzimas candidatas de C. acetobutylicum e orga- nismos relacionados baseado na atividade conhecida com os análogos não- hidroxilados para 4-HB e intermediários da via, ou pela similaridade a estes genes caracterizados (Tabela 6). Uma vez que alguns dos candidatos são desidrogenases multifuncionais, eles poderiam potencialmente catalisar am- bas as reduções dependentes de NAD(P)H do ácido (ou derivado de CoA) para o aldeído, e do aldeído para o álcool. Antes de começar a trabalhar com estes genes em E. coli, foi primeiramente validado o resultado com refe- rência acima usando C. acetobutylicum ATCC 824. As células foram cresci- das em caldo de Schaedler (Accumedia, Lansing1 Ml) suplementado com 4- HB de 10 mM, em uma atmosfera anaeróbica de 10% de CO2, 10% de H2 e 80% de N2 a 30°C. Amostras de cultura periódicas foram tomadas, centrifu- gadas, e o caldo analisado para BDO por GC-MS como descrito abaixo. As concentrações de BDO de 0,1 mM, 0,9 mM, e 1,5 mM foram detectadas de- pois de 1 dia, 2 dias e 7 dias de incubação, respectivamente. Nenhum BDO foi detectado na cultura crescida sem a adição de 4-HB. Para demonstrar que o BDO produzido foi derivado de glicose, foi cultivada a melhor cepa produtora de BDO MG1655 laclQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036 em meio mínimo de M9 suplementado 13C-glicose uniformemente marcada de 4 g/L. As células foram induzidas a uma OD de 0,67 com IPTG de 1 mM, e uma amostra foi tomada depois de 24 horas. A análise do sobrenadante da cultura foi realizada por espectrometria de massa.
Os candidatos de gene para a via de conversão de 4-HB para BDO foram então testados para atividade quando expressos no hospedeiro MG1655 laclQ de E coli. Cepas recombinantes contendo cada um dos can- didatos de gene expresso em pZA33 foi crescido na presença de IPTG de 0,25 mM durante quatro horas a 37°C para induzir completamente a expres- são da enzima. Quatro horas depois da indução, as células foram coletadas e analisadas para atividade de ADH e de ALD como descrito acima. Uma vez que 4-HB-CoA e 4-hidroxibutiraldeído não estão comercialmente dispo- níveis, foram executados ensaios usando substratos não-hidroxilados (Tabe- la 9). A razão da atividade entre substratos de 4 carbonos e de 2 carbonos para C. acetobutylicum adhE2 (0002) e E coli adhE (0011) foram similares àquelas previamente descritas na literatura Atsumi et al., Biochim. Biophys. Acta. 1207:1-11 (1994).
Tabela 9. Atividades enzimáticas in vitro em extratos celulares a partir de MG1655 laclQ contendo pZA33 que expressa os candidatos de gene para aldeído e álcool desidrogenases. As atividades são expressas em μιτιοΙ min"1 mg proteína celular-1. N.D., não determinado.
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Para os experimentos de produção de BDO1 cat2 de Porphyro- monas gingivalis W83 (gene 0034) foi incluído em pZA33 para a conversão de 4-HB para 4-HB-CoA, enquanto os genes candidatos de desidrogenase foi expressos em pZE13. A cepa hospedeira era MG1655 Iacl0. Junto com os candidatos de álcool e aldeído desidrogenase, foi também testado a habi- lidade de semialdeído succínico desidrogenase CoA dependente (sucD) pa- ra funcionar nesta etapa, devido à similaridade do substratos. As células fo- ram crescidas a uma OD de cerca de 0,5 em meio LB suplementado com 4- HB de 10 mM, induzido com IPTG de 1 mM, e amostras do caldo de cultura foram tomadas depois de 24 horas e analisadas para BDO como descrito abaixo. A melhor produção de BDO ocorreu usando adhE2 de C. acetobut- ylicum, sucD de C. kluyveri ou sucD de P. gingivalis (Figura 13). De forma interessante, a quantidade absoluta de BDO produzida foi mais alta sob condições aeróbicas; porém, isto é primariamente devido à densidade celu- lar inferior alcançada em culturas anaeróbicas. Quando normalizado para OD celular, a produção de BDO por unidade de biomassa é mais alta em condições anaeróbicas (Tabela 10).
Tabela 10. Concentrações absolutas e normalizadas de BDO a partir de cul- turas de células que expressam adhE2 de C. acetobutyiicum, sucD de C. kluyveri ou sucD de P. gingivalis (dados dos experimentos 2, 9 e 10 na Figu- ra 11), assim como o controle negativo (experimento 1). <table>table see original document page 97</column></row><table>
Como discutido na Seção 2, pode ser vantajoso usar uma via para converter 4-HB para 4 HB-CoA que não gera acetato como um subpro- duto. Neste sentido, foi testado o uso de fosfotransbutirilase (ptb) e de butira- to quinase (bk) de C. acetobutylicum para realizar esta conversão por meio das etapas 10 e 11 na Figura 2. O operon de ptb / bk nativo de C. acetobut- ylicum (genes 0020 e 0021) foi clonado e expressado em pZA33. Os extra- tos de células contendo o construto resultante foi tomado e analisado para as duas atividades enzimáticas como descrito aqui. A atividade específica de BK foi aproximadamente 65 U/mg, enquanto a atividade específica de PTB foi aproximadamente 5 U/mg. Uma unidade (U) de atividade é definida como conversão de 1μΜ substrato em 1 minuto a temperatura ambiente. Final- mente, o construto foi testado para participação na conversão de 4-HB para BDO. As cepas hospedeiras foram transformadas com o construto pZA33- 0020-0021 descrito e pZE13-0002, e comparado para o uso de cat2 na pro- dução de BDO usando o procedimento aeróbio usado acima na Figura 13. A cepa de BK / PTB produziu BDO de 1 mM, comparado a 2 mM quando é usado o cat2 (Tabela 11). De forma interessante, os resultados foram de- pendentes se a cepa hospedeira contivesse uma deleção no gene adhE na- tivo. Tabela 11. Concentrações absolutas e normalizadas de BDO a partir de cul- turas de células que expressam adhE2 de C. acetobutylicum em pZE13 junto com qualquer cat2 de P. gingivalis (0034) ou com os genes PTB/BK de C. acetobutylicum em pZA33. As cepas hospedeiras foram ou MG1655 laclQ ou MG1655 ∆adhE laclQ.
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Produção de BDO a partir de glicose.
A etapa final de corroboração da via é expressar ambos os seg- mentos de 4-HB e BDO da via em E. coli e demonstrar a produção de BDO em meio mínimo de glicose. Novos plasmídeos foram construídos de forma que todos os genes requeridos se encaixem em dois plasmídeos. Em geral, os genes de cat1, adhE e sucD foram expressos a partir de pZE13 e cat2 e 4-HBd foram expressos a partir de pZA33. Várias combinações de fontes de gene e ordem de gene foram testadas no antecedente MG1655 laclQ. As células foram crescidas anaerobiamente em meio mínimo de M9 (Na2HP04 6,78 g/L, KH2PO4 3,0 g/L, NaCI 0,5 g/L, NH4CI 1,0 g/L, MgSO4 de 1 mM, CaCl2 de 0,1 mM) suplementado com glicose de 20 g/L, ácido 3 - (N- morfolino) propanossulfônico (MOPS) de 100 mM para melhorar a capacida- de de tamponação, tiamina de 10 pg / ml, e os antibióticos apropriados. IPTG de 0,25 mM foi adicionado aproximadamente 15 horas seguido de ino- culação e amostras do sobrenadante de cultura foram tomadas para análise de BDO, 4-HB e succinato 24 e 48 horas a seguir da indução. A produção de BDO pareceu mostrar uma dependência na ordem de gene (Tabela 12). A produção de BDO mais alta, acima de 0,5 mM, foi obtida com cat2 expresso primeiro, seguido por 4-HBd em pZA33, e cat1 seguido por sucD de P. gingi- valis em pZE13. A adição de adhE2 de C. acetobutylicum na última posição em pZE13 resultou em leve aperfeiçoamento. 4-HB e succinato também fo- ram produzidos em concentrações mais altas. Tabela 12. A producao de BDI, 4-HB e succinato em cepas recombinantes de E. coli expressando combinacoes de genes da via de BDO, crescido em meio minimo suplementado com glicose de 20g/L. As concentracoes sao dadas em NM
<table>table see original document page 100</column></row><table> Análise de BDO. 4-HB e succinato por GCMS.
BDO1 4 - HB e succinato em amostras de fermentação e de cul- tura celular foram derivatizados através de sililação e quantitativamente ana- lisados por GCMS usando métodos adaptados de relatórios da literatura ((Simonov et al., J. Anal. Chem 59:965-971 (2004)). O método desenvolvido demonstrou boa sensibilidade até 1 μΜ, linearidade até pelo menos 25 mM, assim como excelente seletividade e reprodutibilidade
A preparação da amostra foi realizada como se segue: 100L de amostras filtradas (0,2 pm ou 0,45 pm filtros de seringa), por exemplo, caldo de fermentação, cultura de células ou soluções padrão, foram secas em um Speed Vac Concentrator (Savant SVC-100H) durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente, seguido pela adição de 20pL de solução de ciclohexanol 10mM, como um padrão interno, em dimetilformamida. As mis- turas foram submetidas ao vortex e ultrassom em um banho de água (Bran- son 3510) durante 15 min para assegurar homogeneidade. 100 pL de rea- gente de derivatização de sililação, N,0-bis(trimetilsilil) triflúor-acetimida (BSTFA) com 1 % de trimetilclorossilano, foi adicionado e a mistura foi incu- bada a 70°C durante 30 min. As amostras derivatizadas foram centrifugadas durante 5 min, e as soluções limpas foram injetadas diretamente em GCMS. Todos os produtos químicos e reagentes foram de Sigma-AIdrich, com a ex- ceção de BDO que foi comprado de J.T.Baker.
GCMS foi executado em um cromatografia gás de Agilent 6890N, conectada a um detector seletivo de massa (MSD) 5973N operado no modo de ionização de impacto de elétron (El) foi usado para a análise. Uma coluna capilar DB-5MS (J&W Scientific, Agilent Technologies), 30m x 0,25mm i.d. x 0,25 pm de espessura de filme, foi usado. O GC foi operado em um modo de injeção de split introduzindo 1 pL de amostra a uma razão de split de 20:1. A injeção a temperatura de porto foi 250°C. O hélio foi usa- do como um gás carreador, e a taxa de fluxo foi mantida a 1,0 ml/min. Um programa de gradiente térmico foi aperfeiçoado para assegurar boa resolu- ção do analito de interesse e mínima interferência de matriz. O forno foi mantido inicialmente a 80°C por 1 min, então aquecido para 120°C a 2°C/min, seguido pelo rápido aquecimento para 320°C a 100°C/min e manti- do no final por 6min a 320°C. A linha de interface de transferência MS foi mantida a 280°C. Os dados foram adquiridos usando um cenário de tom MS 'de baixa massa' e varredura da faixa de massa de 30-400 m/z. O tempo de análise total foi de 29 min incluindo um atraso de 3 min de solvente. Os tem- pos de retenção corresponderam a 5,2, 10,5, 14,0 e 18,2 min para ciclohe- xanol de derivatizado BSTFA, BDO, 4-HB e succinato, respectivamente. Pa- ra a análise quantitativa, foram selecionados os seguintes fragmentos de massa específicos (extraído de cromatogramas de íon): m/z 157 para o pa- drão interno ciclohexanol, 116 para BDO e 147 para 4-HB e succinato. Fo- ram construídas curvas de calibração padrões usando soluções de analito na cultura celular correspondente ou meio de fermentação para correspon- der a matriz de amostra tão próximo quanto possível. Os dados de GCMS foram processados usando o programa Enviroment Data Analysis ChemSta- tion (Agilent Technologies).
Os resultados indicaram que a maioria dos 4-HB e BDO produ- zidos foram marcados com 13C (Figura 14, lados à direita). São mostrados espectros de massa de uma cultura paralela crescida em glicose sem etique- ta para comparação (Figura 14, lados à esquerda). Note que os picos vistos são para fragmentos da molécula derivatizada contendo diferentes números de átomos de carbono a partir do metabólito. O reagente de derivatização também contribui com alguns átomos de carbono e de silicone para a distri- buição de marcação que ocorre naturalmente, assim os resultados não são estritamente quantitativos.
Produção de BDO a partir de 4-HB usando vias alternadas.
As várias vias alternadas também foram testadas para a produ- ção de BDO. Isto inclui o uso da enzima nativa SucCD de E. coli para con- verter succinato para succinil-CoA (Tabela 13, coluna 2-3), uso de a- cetoglutarato descarboxilase na via de α-cetoglutarato (Tabela 13, linha 4), e o uso de PTB / BK como um meio alternado para gerar o derivado de CoA de 4HB (Tabela 13, linha 1). Foram construídas cepas contendo plasmídeos que expressam os genes indicados na Tabela 13, os quais abrangem estas variantes. Os resultados mostram que em todos os casos, a produção de 4- HB e BDO ocorreu (Tabela 13).
Tabela 13. A produção de BDO1 4-HB e succinato em genes de cepas re- combinantes de E. coli para diferentes variantes da via de BDO, crescidas anaerobiamente em meio mínimo suplementado com glicose de 20 g/L, e coletado 24 horas depois da indução com IPTG de 0,1 mM. As concentra- ções são dadas em mM.
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EXEMPLO V
Biosslntese do Ácido 4-Hidroxibutanoico, γ-Butirolactona e Butanodiol
Este Exemplo descreve a produção biossintética do ácido 4- hidroxibutanoico, γ-butirolactona e 1,4-butanodiol usando fermentação e ou- tros bioprocessos.
Métodos para a integração da etapa de fermentação de 4-HB em um processo completo para a produção de GBL1 1,4-butanodiol (BDO) e te- tra-hidrofurano (THF) purificados são descritos abaixo. Uma vez que 4-HB e GBL estão em equilíbrio, o caldo de fermentação conterá ambos os compos- tos. Em baixo pH este equilíbrio é trocado para favorecer GBL. Então, a fer- mentação pode operar em pH 7,5 ou menos, geralmente pH 5,5 ou menos. Depois da remoção de biomassa, o fluxo de produto entra em uma etapa de separação na qual o GBL é removido e o fluxo restante enriquecido em 4-HB é reciclado. Finalmente, GBL é destilado para remover qualquer impureza. O processo opera em um dos três modos: 1) fermentação de alimentação em batelada e separação em batelada; 2) fermentação de alimentação em bate- lada e separação contínua; 3) fermentação contínua e separação contínua. Os primeiros dois destes modos são mostrados esquematicamente na Figu- ra 15. Os procedimentos de fermentação integrados descritos abaixo tam- bém são usados para as células produtoras de BDO da invenção para bios- síntese de BDO e subsequente família de produtos de BDO.
Protocolo de fermentação para produzir 4-HB / GBL (batelada):
O organismo de produção é crescido em um biorreator de 10L aspergido com uma mistura de N2/CO2, usando 5 L de caldo que contém fosfato de potássio de 5 g/L, cloreto de amônio de 2,5 g/L, sulfato de magné- sio de 0,5 g/L, e 30 g/L licor de infusão de milho e uma concentração de gli- cose inicial de 20 g/L. A medida que as células crescem e utilizam a glicose, 70% de glicose adicional é alimentada no biorreator em uma taxa que equili- bra aproximadamente o consumo de glicose. A temperatura do biorreator é mantida a 30 graus C. O crescimento continua durante cerca de 24 horas, até que 4-HB alcance uma concentração entre 20-200 g/L, com a densidade celular estando entre de 5 e 10 g/L. O pH não é controlado e diminuirá tipi- camente para pH 3-6 ao final da corrida. Em conclusão do período de culti- vo, os conteúdos fermentadores são passados através de uma unidade de separação celular (por exemplo, centrífuga) para remover células e resíduos celulares, e o caldo de fermentação é transferido para uma unidade de sepa- rações de produto. O isolamento de 4-HB e/ou GBL aconteceria por proce- dimentos de separações padrões empregados na técnica para separar os produtos orgânicos a partir de soluções aquosas diluídas, tal como a extra- ção líquido-líquido usando um solvente orgânico imiscível em água (por e- xemplo, tolueno) para fornecer uma solução orgânica de 4-HB /GBL. A solu- ção resultante é então submetida a métodos de destilação padrão para re- mover e reciclar o solvente orgânico e fornecer GBL (ponto de ebulição 204- 205°C) o qual é isolado como um líquido purificado.
Protocolo de fermentação para produzir 4-HB / GBL (completamente contí- nuo):
O organismo de produção é primeiro crescido em modo de bate- lada usando o aparelho e composição do meio descrito acima, a não ser que a concentração de glicose inicial seja 30-50 g/L. Quando glicose for exausta, o meio de alimentação da mesma composição é fornecido continuamente a uma taxa entre 0,5 L / hr e 1 L / hr e o líquido é retirado à mesma taxa. A concentração de 4-HB no biorreator permanece constante em 30-40 g/L e a densidade de célula permanece constante entre 3-5 g/L. A temperatura é mantida a 30 graus C e o pH é mantido a 4,5 usando NaOH e HCI concen- trados, como exigido. O biorreator é operado continuamente durante um mês, com amostras tomadas diariamente para assegurar a consistência da concentração de 4-HB. No modo contínuo, conteúdos fermentadores são constantemente removidos à medida que meio de alimento novo é fornecido. O fluxo de saída, contendo células, meio e produtos 4-HB e/ou GBL, é então submetido a um procedimento de separações de produto contínuo, com ou sem a remoção de células e resíduos celulares, e ocorreria por métodos de separações contínuos padrão empregados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tal como a extração líquido-líquido contínua usando um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, to- lueno) para fornecer uma solução orgânica de 4-HB /GBL. A solução resul- tante é subseqüentemente submetida a métodos de destilação contínua pa- drão para remover e reciclar o solvente orgânico e fornecer GBL (ponto de ebulição 204-205°C) que é isolado como um líquido purificado. Protocolo de redução de GBL:
Uma vez que GBL está isolado e purificado como descrito aci- ma, ele será então submetido a protocolos de redução tais como aqueles bem-conhecidos na técnica (referências citadas) para produzir 1,4- butanodiol ou tetra-hidrofurano (THF) ou uma mistura dos mesmos. Catali- sadores de hidrogenação heterogêneos ou homogêneos combinados com GBL sob pressão de hidrogênio são bem-conhecidos por fornecer os produ- tos 1,4-butanodiol ou tetra-hidrofurano (THF) ou uma mistura dos mesmos. É importante notar que a mistura dos produto 4-HB / GBL que é separada a partir do caldo de fermentação, como descrito acima, pode ser submetido diretamente, antes do isolamento e purificação de GBL, para estes mesmos protocolos de redução para fornecer os produtos 1,4-butanodiol ou tetra- hidrofurano ou uma mistura dos mesmos. Os produtos resultantes, 1,4- butanodiol e THF são então isolados e purificados por procedimentos bem- conhecidos na técnica.
Protocolo de fermentação e hidrogenação para produzir BDO ou THF dire- tamente (batelada):
Células são crescidas em um biorreator de 10L aspergido com uma mistura de N2/CO2, usando 5 L de caldo contendo fosfato de potássio de 5 g/L, cloreto de amônio de 2,5 g/L, sulfato de magnésio de 0,5 g/L e licor de infusão de milho de 30 g/L e uma concentração de glicose inicial de 20 g/L. Como as células crescem e utilizam a glicose, 70% glicose adicional é alimentada no biorreator em uma taxa que aproximadamente equilibra o consumo de glicose. A temperatura do biorreator é mantida a 30 graus C. O crescimento continua durante cerca de 24 horas, até que 4-HB alcance uma concentração entre 20-200 g/L, com a densidade celular estando entre de 5 e 10 g/L. O pH não é controlado e diminuirá tipicamente para pH 3-6 ao final da corrida. Em conclusão do período de cultivo, os conteúdos fermentadores são passados através de uma unidade de separação celular (por exemplo, centrífuga) para remover células e resíduos celulares, e o caldo de fermen- tação é transferido para uma unidade de redução (por exemplo, recipiente de hidrogenação), onde a mistura de 4-HB / GBL é reduzido diretamente ou para 1,4-butanodiol ou THF ou uma mistura dos mesmos. Seguindo a con- clusão do procedimento de redução, os conteúdos do reator são transferidos para uma unidade de separações de produto. O isolamento de 1,4- butanodiol e/ou THF aconteceria através de procedimentos de separações padrão empregados na técnica para separar os produtos orgânicos de solu- ções aquosas diluídas, tal como a extração líquido-líquido que usa um sol- vente orgânico imiscível em água (por exemplo, tolueno) para fornecer uma solução orgânica de 1,4-butanodiol e/ou THF. A solução resultante é então submetida a métodos de destilação padrão para remover e reciclar o solven- te orgânico e fornecer 1,4-butanodiol e/ou THF são isolados como líquidos purificados.
Protocolo de fermentação e hidrogenação para produzir BDO ou THF dire- tamente (completamente contínuo):
As células são primeiro crescidas em modo de batelada usando o aparelho e composição do meio descrito acima, a não ser que a concen- tração de glicose inicial seja 30-50 g/L. Quando glicose for exausta, o meio de alimentação da mesma composição é fornecido continuamente a uma taxa entre 0,5 L / hr e 1 L / hr e o líquido é retirado à mesma taxa. A concen- tração de 4-HB no biorreator permanece constante em 30-40 g/L e a densi- dade de célula permanece constante entre 3-5 g/L. A temperatura é mantida a 30 graus C e o pH é mantido a 4,5 usando NaOH e HCI concentrados, co- mo exigido. O biorreator é operado continuamente durante um mês, com amostras tomadas diariamente para assegurar a consistência da concentra- ção de 4-HB. No modo contínuo, os conteúdos fermentadores são constan- temente removidos à medida que meio de alimento novo é fornecido. O fluxo de saída, contendo células, meio e produtos 4-HB e/ou GBL, é então passa- do através de uma unidade de separação (por exemplo, centrífuga) para re- mover células e resíduos de célula e o caldo de fermentação é transferido para uma unidade de redução contínua (por exemplo, recipiente de hidroge- nação) onde a mistura 4-HB / GBL é reduzida diretamente disso para 1,4- butanodiol ou THF ou uma mistura dos mesmos. Seguindo a conclusão do procedimento de redução, os conteúdos do reator são transferidos para uma unidade de separações de produto contínua. O isolamento de 1,4-butanodiol e/ou THF aconteceria por procedimentos de separações contínuos padrão empregados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquo- sas diluídas, tal como a extração líquido-líquido que usa um solvente orgâni- co imiscível em água (por exemplo, tolueno) para fornecer uma solução or- gânica de 1,4-butanodiol e/ou THF. A solução resultante é então submetida a métodos de destilação contínuos padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e fornecer 1,4-butanodiol e/ou THF que são isolados como líquidos purificados.
Protocolo de fermentação para produzir BDO diretamente (batelada):
O organismo de produção é crescido em um biorreator de 10L aspergido com uma mistura de N2/C02, usando 5 L de caldo contendo fosfa- to de potássio de 5 g/L, cloreto de amônio de 2,5 g/L, sulfato de magnésio de 0,5 g/L e licor de infusão de milho de 30 g/L e uma concentração de glicose inicial de 20 g/L. Como as células crescem e utilizam a glicose, 70% glicose adicional é alimentada no biorreator em uma taxa que aproximadamente e- quilibra o consumo de glicose. A temperatura do biorreator é mantida a 30 graus C. O crescimento continua durante cerca de 24 horas, até que BDO alcance uma concentração entre 20-200 g/L, com a densidade celular estan- do entre de 5 e 10 g/L. Em conclusão do período de cultivo, os conteúdos fermentadores são passados através de uma unidade de separação celular (por exemplo, centrífuga) para remover células e resíduos celulares, e o cal- do de fermentação é transferido para uma unidade de separações de produ- to. O isolamento de BDO aconteceria através de procedimentos de separa- ções padrão empregados na técnica para separar os produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tal como a extração líquido-líquido que usa um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, tolueno) para fornecer uma solução orgânica de BDO. A solução resultante é então submetida a métodos de destilação padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e fornecer BDO (ponto de ebulição 228-229°C o qual é isolado como um líqui- do purificado.
Protocolo de fermentação para produzir BDQ diretamente (completamente contínuo):
O organismo de produção é primeiro crescido em modo de bate- lada usando o aparelho e composição do meio descrito acima, a não ser que a concentração de glicose inicial seja 30-50 g/L. Quando glicose for exausta, o meio de alimentação da mesma composição é fornecido continuamente a uma taxa entre 0,5 L / hr e 1 L / hr e o líquido é retirado à mesma taxa. A concentração de BDO no biorreator permanece constante em 30-40 g/L e a densidade de célula permanece constante entre 3-5 g/L. A temperatura é mantida a 30 graus C e o pH é mantido a 4,5 usando NaOH e HCI concen- trados, como exigido. O biorreator é operado continuamente durante um mês, com amostras tomadas diariamente para assegurar a consistência da concentração de BDO. No modo contínuo, conteúdos fermentadores são constantemente removidos à medida que meio de alimento novo é fornecido.
O fluxo de saída, contendo células, meio e o produto BDO, é então submeti- do a um procedimento de separações de produto contínuo, com ou sem a remoção de células e resíduos celulares, e ocorreria por métodos de sepa- rações contínuos padrão empregados na técnica para separar produtos or- gânicos de soluções aquosas diluídas, tal como a extração líquido-líquido contínua usando um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, to- lueno) para fornecer uma solução orgânica de BDO. A solução resultante é subseqüentemente submetida a métodos de destilação contínua padrão pa- ra remover e reciclar o solvente orgânico e fornecer BDO (ponto de ebulição 228-229°C) que é isolado como um líquido purificado (pf 20°C).
Ao longo desta aplicação várias publicações foram referência dentro de parênteses. As descrições destas publicações em sua totalidades estão por este meio incorporadas por referência nesta aplicação a fim de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual esta invenção pertence.
Embora a invenção tenha sido descrita com referência às moda- lidades divulgadas, aqueles versados na técnica apreciarão prontamente que os exemplos específicos e os estudos detalhados acima são somente ilustrativos da invenção. Deve ser entendido que várias modificações podem ser feitas sem sair do espírito da invenção. Consequentemente, a invenção é limitada somente pelas reivindicações a seguir.

Claims (13)

1. Micro-organismo que não ocorre naturalmente, caracterizado pelo fato de que possui as vias de biossíntese de ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB) e 1,4-butanodiol (1,4-BDO), tais vias compreendendo ácidos nucléi- cos exógenos codificando a) uma α-cetoglutarato descarboxilase, b) uma 4- hidroxibutanoato desidrogenase, c) uma butirato cinase, d) uma fosfotrans- butirilase, e) uma aldeído desidrogenase, e f) uma álcool desidrogenase, em que tais ácidos nucléicos exógenos são expressos em quantidade suficiente para produzir 1,4-butanodiol (1,4-BDO).
2. Micro-organismo que não ocorre naturalmente como descrito na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma semial- deído succinico desidrogenase CoA-dependente.
3. Micro-organismo que não ocorre naturalmente como descrito na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos ácidos nucléi- cos exógenos compreendem pelo menos um ácido nucléico heterólogo.
4. Micro-organismo que não ocorre naturalmente como descrito na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um meio de cultura substancialmente anaeróbio.
5. Método para produção de 1,4-BDO, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o micro-organismo que não ocorre naturalmente como definido na reivindicação 1 sob condições substancialmente anaeró- bias por um período de tempo suficiente para produzir 1,4-BDO.
6. Método como descrito na reivindicação 5, caracterizado pelo fa- to de que pelo menos um ácido nucléico exógeno compreende um ácido nu- cléico heterólogo.
7. Micro-organismo que não ocorre naturalmente, caracterizado pelo fato de que possui as vias de biossíntese de ácido 4-hidroxibutanóico e (4-HB) e 1,4-butanodiol (1,4-BDO), tais vias compreendendo ácidos nucléi- cos exógenos codificando a) uma α-cetog luta rato descarboxilase, b) uma 4- hidroxibutanoato desidrogenase, c) uma 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferase, d) uma aldeído desidrogenase, e e) uma álcool desidrogenase, em que referidos ácidos nucléicos são expressos em quantidades suficientes para produzir 1,4-butanodiol (1,4-BDO).
8. Micro-organismo que não ocorre naturalmente como descrito na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma semial- deído succinico desidrogenase CoA-dependente.
9. Micro-organismo que não ocorre naturalmente como descrito na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os referidos ácidos nucléi- cos exógenos compreendem pelo menos um ácido nucléico heterólogo.
10. Micro-organismo que não ocorre naturalmente como descrito na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um meio de cultura substancialmente anaeróbio.
11. Método para produção de 1,4-BDO, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o micro-organismo que não ocorre naturalmente como definido na reivindicação 7 sob condições substancialmente anaeró- bias por um período de tempo suficiente para produzir 1,4-BDO.
12. Método como descrito na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um ácido nucléico exógeno compreende um ácido nucléico heterólogo.
13. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revela- da no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.
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