BR122018011330B1 - Micro-organismo de ocorrência não-natural e método para a produção de 1,4-butanodiol - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um micro-organismo de ocorrência não-natural compreendendo um ou mais rompimentos de gene, o um ou mais rompimentos de gene acontecendo em genes codificando uma enzima obrigatória para acoplamento à produção de 1,4-butanodiol para crescimento do micro-organismo quando o rompimento do gene reduz uma atividade da enzima, com o que o um ou mais rompimentos de gene conferem produção acoplada a crescimento estável de 1,4- butanodiol ao micro-organismo de ocorrência não-natural. O micro-organismo pode compreender ainda um gene codificando uma enzima em uma via biossintética de 1,4-butanodiol (BDO). A invenção refere- se ainda a métodos de uso de micro-organismos para produzir BDO.

Description

[0001] Dividido do PI0815138-5, depositado em 06.08.2008.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se em geral ao projeto in silico de organismos e, mais especificamente, a organismos tendo capacidade biossintética de 1,4-butanodiol.

[0003] 1,4-Butanodiol (BDO) é um diálcool de quatro carbonos que é atualmente fabricado exclusivamente através de várias vias petroquímicas. BDO é parte de uma família de volume grande de intermediários de solventes e polímero que inclui gama-butirolactona (GBL), tetraidrofurano (THF), pirrolidona, N-metilpirrolidona (NMP) e N- vinil-pirrolidona. A oportunidade de mercado geral para esta família excede $4,0 B.

[0004] Aproximadamente 2,5B lb de BDO são produzidos globalmente por ano com 4-5% de crescimento anual e um preço de venda recente variando a partir de $1,00-1,20/lb. A demanda por BDO vem muito de seu uso como intermediário para resinas de plástico de polibutileno tereftalato (PBT), termoplásticos de poliuretano e copoliéster éteres. BDO também serve como um precursor primário para THF, que é empregado como um intermediário para copolímeros de PTMEG poli(tetrametileno glicol) requeridos para produção de lycra e spandex. Aproximadamente 0,7 B lb de THF é produzido globalmente por ano com uma taxa de crescimento anual de mais de 6%. Uma porcentagem significante de crescimento (>30%) para ambos o BDO e o THF está acontecendo na Ásia (China e Índia). GBL atualmente é um produto de volume menor (0,4 B kg/lb/ano) que tem várias aplicações como um solvente, como um aditivo para tintas e corantes, bem como o precursor primário para derivados de pirrolidona tal como NMP.

[0005] Processos convencionais para a síntese de BDO usam matérias-primas petroquímicas para seus materiais de partida. Por exemplo, acetileno é reagido com 2 moléculas de formaldeído na reação de síntese Reppe (Kroschwitz e Grant, Encyclopedia of Chem. Tech., John Wiley and Sons, Inc., Nova York (1999)), seguido por hidrogenação catalítica para formar 1,4 butanodiol. Foi estimado que 90% do acetaldeído produzido nos Estados Unidos sejam consumidos para produção de butanodiol. Alternativamente, ele pode ser formado através de esterificação e hidrogenação catalítica de anidrido maleico, que é derivado de butano. A jusante, butanodiol pode ser transformado mais; por exemplo, através de oxidação para Y-butirolactona, que pode ser convertida mais em pirrolidona e N-metilpirrolidona, ou hidrogenólise para tetraidrofurano (figura 1). Esses compostos têm usos variados como intermediários de polímero, solvente e aditivos e têm um mercado combinado de quase 2 bilhões lb/ano.

[0006] A abordagem baseada em matéria-prima de hidrocarbono convencional utiliza metano para produzir formaldeído. Então, uma grande porcentagem da produção comercial de BDO se apóia em metano como um material de partida. A produção de acetileno também se apóia em material de partida baseado em petróleo (vide Figura 1). Desta maneira, os custos de produção de BDO flutuam com o preço do petróleo e do gás natural.

[0007] É desejável desenvolver um método para produção desses agentes químicos através de meios alternativos que não apenas substituam matérias-primas à base de petróleo por renováveis, mas que também usem processos de menos energia e capital intensivo. O Departamento de Energia propôs 1,4-diácidos, e particularmente ácido succínico, como intermediários-chave biologicamente produzidos para a fabricação da família butanodiol de produtos (Relatório DOE, "Top Value-Added Chemicals from Biomass", 2004). No entanto, o ácido succínico é caro de isolar e purificar e requer temperaturas e pressões altas para redução catalítica em butanodiol.

[0008] Então, existe uma necessidade de meios alternativos para produção eficaz de quantidades comerciais de 1,4-butanodiol e seus precursores químicos. A presente invenção satisfaz essa necessidade e provê vantagens relacionadas também.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A invenção provê um micro-organismo de ocorrência não- natural compreendendo um ou mais rompimentos de gene, o um ou mais rompimentos de gene acontecendo em genes codificando uma enzima obrigatória para acoplamento da produção de 1,4-butanodiol a crescimento do micro-organismo quando o rompimento do gene reduz uma atividade da enzima, com o que o um ou mais rompimentos de gene conferem produção de 1,4-butanodiol acoplada a crescimento ao micro-organismo de ocorrência não-natural. O micro-organismo pode compreender ainda um gene codificando uma enzima em uma via biossintética de 1,4-butanodiol (BDO). A invenção refere-se ainda a métodos de uso de micro-organismos para produzir BDO.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00010] O arquivo da patente ou pedido de patente contém pelo menos um desenho colorido. Cópias desta publicação de patente ou pedido de patente com desenhos coloridos serão providas pelo Escritório quando do pedido e pagamento da taxa necessária.

[00011] A Figura 1 é um diagrama esquemático mostrando um ponto de entrada de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) na tubulação de produto da família 1,4-butanodiol (BDO) de agentes químicos, e comparação com vias de síntese química de matérias-primas petroquímicas. Setas pretas sólidas mostram vias de síntese química; setas azuis pontilhadas mostram uma via biossintética para 4-HB e etapas de conversão subsequentes para agentes químicos da família BDO.

[00012] A Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando vias bioquímicas para produção de 4-hidroxibutirato (4-HB) e Y— butirolactona (GBL). Enzimas catalisando as reações biossintéticas de 4-HB são: (1) semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA; (2) succinil-CoA sintetase; (3) semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA; (4) glutamato: semialdeído succínico transaminase; (5) glutamato descarboxilase; (6) 4- hidroxibutanoato desidrogenase. A conversão (7) corresponde a uma reação não-enzimática, espontânea, que converte 4-HB em GBL.

[00013] A Figura 3 é um diagrama esquemático mostrando a síntese química de 1,4-butanodiol (BDO) e produtos a jusante Y- butirolactona (GBL), tetraidrofurano (THF) e várias pirrolidonas.

[00014] A Figura 4 é um fluxograma de processo esquemático de bioprocessos para a produção de Y-butirolactona. O painel (a) ilustra fermentação em batelada alimentada com separação em batelada e o painel (b) ilustra fermentação em batelada alimentada com separação contínua.

[00015] A Figura 5 mostra os envelopes de produção hipotéticos de uma cepa projetada por OptKnock contrastada contra uma cepa de produção acoplada a não-crescimento típica. Note que as trajetórias de evolução potenciais da cepa OptKnock são fundamentalmente diferentes pelo fato de que elas levam a um fenótipo de alta produção.

[00016] A Figura 6 mostra vias bioquímicas para 1,4-butanodiol. 1) semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA; 2) succinil-CoA sintetase; 3) semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA; 4) glutamato:succinato semialdeído transaminase; 5) glutamato descarboxilase; 6) 4-hidroxibutanoato desidrogenase; 7) 4-hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferase; 8) aldeído desidrogenase; 9) álcool desidrogenase.

[00017] A Figura 7 mostra a taxa de crescimento anaeróbico versus limites de solução de rendimento de BDO para uma cepa de E. coli possuindo as vias de produção de BDO mostradas e knockouts previstos de OptKnock na Figura 5 supondo a) irreversibilidade de PEP carboxiquinase e b) reversibilidade de PEP carboxiquinase. Uma taxa de absorção de glicose base de 20 mmols/gDW/h é suposta junto com uma necessidade de manutenção de ATP associada a não- crescimento de 7,6 mmols/gDW/h.

[00018] A Figura 8 mostra uma representação gráfica de metabolismo central de E. coli.

[00019] A Figura 9 mostra a taxa de crescimento anaeróbico versus limites de solução de rendimento de BDO para uma cepa de E. coli possuindo as vias de produção de BDO mostradas e knockouts previstos de OptKnock na Figura 5 supondo reversibilidade de PEP carboxiquinase. Uma taxa de absorção de glicose base de 20 mmols/gDW/h é suposta junto com uma necessidade de manutenção de ATP associada com não-crescimento de 7,6 mmols/gDW/h.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00020] A presente invenção refere-se ao projeto e à produção de células e organismos tendo capacidades de produção biossintética de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB), Y-butirolactona e 1,4-butanodiol. Em uma modalidade, a invenção utiliza modelos estequiométricos in silico de metabolismo de Escherichia coli que identificam projetos metabólicos para produção biossintética de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO). Os resultados descritos aqui indicam que a via metabólica pode ser projetada e recombinantemente engenheirada para realizar a biossíntese de 4-HB e produtos a jusante tal como 1,4-butanodiol em Escherichia coli e outras células ou organismos. Produção biossintética de 4-HB, por exemplo, para os projetos in silico, pode ser confirmada através da construção de cepas tendo o genótipo metabólico projetado. Essas células ou organismos metabolicamente engenheirados podem ser também submetidos à evolução adaptativa para aumentar mais a biossíntese de 4-HB, incluindo outras condições se aproximando do crescimento máximo teórico.

[00021] A invenção refere-se ainda a estratégias de engenharia metabólica para atingir rendimentos altos de 1,4-butanodiol (BDO) em Escherichia coli (vide Exemplos V-VII). Conforme aqui descrito, um modelo estequiométrico de escala de genoma de metabolismo de E. coli foi empregado usando a estrutura de otimização em dois níveis OptKnock para identificar estratégias in silico com knockouts múltiplos. As deleções são localizadas de modo que a redundância na rede seja reduzida com o efeito final de crescimento por acoplamento para a produção de BDO no sistema. A característica de produção de BDO acoplada a crescimento das cepas projetadas as torna geneticamente estáveis e condescendentes a bioprocesso contínuo. Estratégias de projeto de cepa foram identificadas supondo a adição de capacidades de reação não-nativas em E. coli levando a uma via metabólica de semialdeído succinato em BDO. Das centenas de estratégias identificadas pelo OptKnock, um projeto emergiu satisfazendo critérios múltiplos. Este projeto, utilizando a reação de adhE, ldhA, mdh, aspA e pflAB, 1) levou a um rendimento de BDO previsto alto em crescimento máximo, 2) necessitou de um número razoável de knockouts , 3) não teve nenhum efeito prejudicial sobre o rendimento de BDO teórico máximo, 4) causou um acoplamento firme de produção de BDO com crescimento celular e 5) era robusto com relação à irreversibilidade ou reversibilidade suposta de PEP carboxiquinase. São também descritos aqui métodos para o teste experimental dos projetos de cepa e sua evolução em direção ao crescimento máximo teórico.

[00022] Em certas modalidades, as características de biossíntese de 4-HB das cepas projetadas as tornam geneticamente estáveis e particularmente úteis em bioprocessos contínuos. Estratégias de projeto de cepa separadas foram identificadas com incorporação de capacidades não-nativas ou heterólogas diferentes em E. coli levando a cursos metabólicos de produção de 4-HB e 1,4-butanodiol a partir ou de semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, succinil-CoA sintetase e semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA ou glutamato:semialdeído succínico transaminase. Projetos metabólicos in silico foram identificados, os quais resultaram na biossíntese de 4-HB em ambas as espécies de E. coli e levedura de cada um desses cursos metabólicos. O intermediário de 1,4-butanodiol Y-butirolactona pode ser gerado em cultura através de ciclização espontânea sob condições em pH <7,5, particularmente sob condições ácidas, tal como abaixo de pH 5,5, por exemplo, pH<7, pH<6,5, pH<6 e particularmente em pH<5,5 ou menor.

[00023] Linhagens identificadas através do componente computacional da plataforma podem ser postas em produção real através de engenharia genética de qualquer uma das alterações metabólicas previstas que leve à produção biossintética de 4-HB, 1,4- butanodiol ou outros produtos intermediários e /ou a jusante. Em uma modalidade adicional, as cepas exibindo produção biossintética desses compostos podem ser submetidas mais à evolução adaptativa para aumentar mais a biossíntese de produto. Os níveis de rendimento de biossíntese de produto seguindo evolução adaptativa podem ser também previstos através do componente computacional do sistema.

[00024] Conforme aqui usado, o termo "de ocorrência não-natural" quando usado em referência a um organismo ou micro-organismo microbiano da invenção pretende significar que o organismo microbiano tem pelo menos uma alteração genética não encontrada normalmente em uma cepa de ocorrência natural da espécie referida, incluindo cepas do tipo selvagem da espécie referida. Alterações genéticas incluem, por exemplo, modificações introduzindo ácidos nucleicos expressáveis codificando polipeptídeos metabólicos, outras adições de ácido nucleico, deleções de ácido nucleico e/ou outro rompimento funcional do material genético microbiano. Tal modificação inclui, por exemplo, regiões de codificação e fragmentos funcionais da mesma, para peptídeos heterólogos, homólogos ou ambos heterólogos e homólogos para a espécie referida. Modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões reguladoras de não- codificação, em que as modificações alteram a expressão de um gene ou opéron. Polipeptídeos metabólicos exemplares incluem enzimas dentro de uma via biossintética de 4-HB e enzimas dentro de uma via biossintética para uma família BDO de compostos.

[00025] Uma modificação metabólica refere-se a uma reação bioquímica que é alterada de seu estado de ocorrência natural. Então, micro-organismos de ocorrência não-natural tendo modificações genéticas nos ácidos nucleicos codificando polipeptídeos metabólicos ou fragmentos funcionais dos mesmos. Modificações metabólicas exemplares são descritas mais abaixo para ambos os organismos microbianos E. coli e levedura.

[00026] Conforme aqui usado, o termo "isolado" quando usado em referência a um organismo microbiano pretende significar um organismo que é substancialmente livre de pelo menos um componente como o organismo microbiano referido é encontrado na natureza. O termo inclui um organismo microbiano que é removido de alguns ou todos os componentes como ele é encontrado em seu ambiente natural. O termo também inclui um organismo microbiano que é removido de alguns ou todos os componentes como o organismo microbiano é encontrado em ambientes de ocorrência não- natural. Desta maneira, um organismo microbiano isolado é parcialmente ou completamente separado de outras substâncias como ele é encontrado na natureza ou como ele é cultivado, armazenado ou subsistido em um ambiente de ocorrência não-natural. Exemplos específicos de organismos microbianos isolados incluem micróbios parcialmente puros, micróbios substancialmente puros e micróbios culturados em um meio que é de ocorrência não-natural.

[00027] Conforme aqui usado, o termo "microbiano", "organismo microbiano" ou "micro-organismo" pretende significar qualquer organismo que exista como uma célula microscópica que está incluída dentro dos domínios de archaea, bactérias ou eucárias. Desta maneira, o termo pretende compreender células ou organismos procarióticos ou eucarióticos tendo tamanho microscópico e inclui bactérias, archeae e eubactérias de todas as espécies bem como micro-organismos eucarióticos tais como levedura e fungos. O termo também inclui culturas de célula de qualquer espécie que podem ser culturadas para a produção de um agente bioquímico.

[00028] Conforme aqui usado, o termo "ácido 4-hidroxibutanoico" pretende significar um derivado 4-hidróxi de ácido butírico tendo a fórmula química C4H8O3 e uma massa molecular de 104,11 g/mol (126,09 g/mol para seu sal de sódio). O composto químico ácido 4- hidroxibutanoico também é conhecido na técnica como 4-HB, 4- hidroxibutirato, ácido gama-hidroxibutírico ou GHB. O termo como é usado aqui pretende incluir qualquer uma das várias formas de sal do composto e inclui, por exemplo, 4-hidroxibutanoato e 4-hidroxibutirato. Exemplos específicos de formas de sal de 4-HB incluem 4-HB de sódio e 4-HB de potássio. Desta maneira, os termos ácido 4- hidroxibutanoico, 4-HB, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxibutanoato, ácido gama-hidroxibutírico e GHB bem como outros nomes reconhecidos na técnica são usados sinonimamente aqui.

[00029] Conforme aqui usado, o termo "monomérico" quando usado em referência a 4-HB pretende significar 4-HB em uma forma não- polimérica ou não-derivatizada. Exemplos específicos de 4-HB polimérico incluem ácido poli-4-hidroxibutanoico e copolímeros de, por exemplo, 4-HB e 3-HB. Um exemplo específico de uma forma derivatizada de 4-HB é 4-HB-CoA. Outras formas de 4-HB poliméricas e outras formas derivatizadas de 4-HB são também conhecidas na técnica.

[00030] Conforme aqui usado, o termo "Y-butirolactona" pretende significar uma lactona tendo a fórmula química C4H6O2 e uma massa molecular de 86,089 g/mol. O composto químico Y-butirolactona é também conhecido na técnica como GBL, butirolactona, 1,4-lactona, 4- butirolactona, lactona do ácido 4-hidroxibutírico e lactona do ácido gama-hidroxibutírico. O termo conforme aqui usado pretende incluir qualquer uma das formas de sal do composto.

[00031] Conforme aqui usado, o termo "1,4-butanodiol" pretende significar um derivado álcool do alcano butano, carregando dois grupos hidroxila que têm a fórmula química C4H10O2 e uma massa molecular de 90,12 g/mol. O composto químico 1,4-butanodiol é também conhecido na técnica como BDO e é um intermediário ou precursor químico para uma família de compostos referidos aqui como família BDO de compostos, alguns deles são conforme exemplificado na Figura 1.

[00032] Conforme aqui usado, o termo "tetraidrofurano" pretende significar um composto orgânico heterocíclico correspondendo ao análogo integralmente hidrogenado do composto aromático furano que tem a fórmula química C4H8O e uma massa molecular de 72,11 g/mol. O composto químico tetraidrofurano é também conhecido na técnica como THF, tetraidrofurano, 1,4-epoxibutano, óxido de butileno, óxido de ciclotetrametileno, oxaciclopentano, óxido de dietileno, oxolano, furanidina, hidrofurano, óxido de tetrametileno. O termo conforme aqui usado pretende incluir qualquer uma das várias formas de sal do composto.

[00033] Conforme aqui usado, o termo "CoA" ou "coenzima A" pretende significar um cofator orgânico ou grupo prostético (porção não-proteína de uma enzima) cuja presença é requerida para a atividade de muitas enzimas (a apoenzima) para formar um sistema de enzima ativo. A coenzima A funciona em certas enzimas de condensação, age em transferência de acetila ou outro grupo acila e em síntese e oxidação de ácido graxo, oxidação de piruvato e em outra acetilação.

[00034] Conforme aqui usado, o termo "substancialmente anaeróbica" quando usado em referência a uma condição de cultura ou crescimento pretende significar que a quantidade de oxigênio é menos do que cerca de 10% da saturação para oxigênio dissolvido em meios líquidos. O termo também pretende incluir câmaras vedadas de meio líquido ou sólido mantido com uma atmosfera de menos do que cerca de 1% de oxigênio.

[00035] Os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção podem conter alterações genéticas estáveis, que referem-se a micro-organismos que podem ser culturados por mais de cinco gerações sem perda da alteração. Em geral, alterações genéticas estáveis incluem modificações que persistem mais de 10 gerações, particularmente modificações estáveis vão persistir mais do que cerca de 25 gerações, e mais particularmente, modificações genéticas estáveis serão maiores do que 50 gerações, incluindo indefinidamente.

[00036] Aqueles versados na técnica vão compreender que as alterações genéticas, incluindo modificações metabólicas exemplificadas aqui, são descritas com referência a genes de E. coli e levedura e suas reações metabólicas correspondentes. No entanto, dado o sequenciamento de genoma completo de uma ampla variedade de organismos e o nível alto de habilidade na área de genômicos, aqueles versados na técnica serão prontamente capazes de aplicar os ensinamentos e orientações providos aqui a essencialmente todos os outros organismos. Por exemplo, as alterações metabólicas de E. coli exemplificadas aqui podem ser prontamente aplicadas a outras espécies através de incorporação do mesmo ácido nucleico de codificação ou um análogo de espécies outras que não a espécie referida. Tais alterações genéticas incluem, por exemplo, alterações genéticas de homólogos de espécie, em geral, e em particular, deslocamentos de gene ortólogo, parálogo ou não-ortólogo.

[00037] Um ortólogo é um gene ou genes que são relacionados por descendência vertical e são responsáveis por substancialmente as mesmas funções ou funções idênticas em organismos diferentes. Por exemplo, hidrolase de epóxido de camundongo e hidrolase de epóxido humana podem ser consideradas ortólogos para a função biológica de hidrólise de epóxidos. Os genes são relacionados por descendência vertical quando, por exemplo, eles compartilham similaridade de sequência de quantidade suficiente para indicar que eles são homólogos ou relacionados por evolução a partir de um ancestral comum. Genes podem ser também considerados ortólogos se eles compartilharem estrutura tridimensional, mas não necessariamente similaridade de sequência, de uma quantidade suficiente para indicar que eles se desenvolveram de um ancestral comum até o ponto que a similaridade de sequência primária não seja identificável. Genes que são ortólogos podem codificar proteínas com similaridade de sequência de cerca de 25% a 100% de identidade de sequência de aminoácido. Genes codificando proteínas compartilhando uma similaridade de aminoácido de menos do que 25% podem ser também considerados ter surgido através de descendência vertical se sua estrutura tridimensional também mostrar similaridades. Membros da família serina protease de enzimas, incluindo ativador de plasminogênio de tecido e elastase, são considerados ter surgido através de descendência vertical a partir de um ancestral comum.

[00038] Ortólogos incluem genes ou seus produtos de gene codificados que através de, por exemplo, evolução, divergiram em estrutura ou atividade geral. Por exemplo, em que uma espécie codificar um produto de gene exibindo duas funções e onde tais funções foram separadas em genes distintos em uma segunda espécie, os três genes e seus produtos correspondentes são considerados ortólogos. Para a produção acoplada a crescimento de um produto bioquímico, aqueles versados na técnica vão compreender que o gene ortólogo carregando a atividade metabólica a ser rompida deve ser escolhido para construção do micro-organismo de ocorrência não-natural. Um exemplo de ortólogos exibindo atividades separáveis é onde atividades distintas foram separadas em produtos de gene distintos entre duas ou mais espécies ou dentro de uma única espécie. Um exemplo específico é a separação de proteólise de elastase e proteólise de plasminogênio, dois tipos de atividade de serina protease, em moléculas distintas como ativador de plasminogênio e elastase. Um segundo exemplo é a separação de atividade de exonuclease 5'-3' de micoplasma e polimerase III de DNA de Drosophila. A polimerase de DNA da primeira espécie pode ser considerada um ortólogo para uma ou ambas a exonuclease ou a polimerase da segunda espécie e vice-versa.

[00039] Em contraste, parálogos são homólogos relacionados através de, por exemplo, duplicação seguida por divergência evolucionária e têm funções similares ou comuns, mas não idênticas. Parálogos podem se originar ou derivar, por exemplo, da mesma espécie ou de uma espécie diferente. Por exemplo, epóxido hidrolase microssomal (epóxido hidrolase I) e epóxido hidrolase solúvel (epóxido hidrolase II) podem ser considerados parálogos porque eles representam duas enzimas distintas, codesenvolvidas a partir de um ancestral comum, que catalisam reações distintas e têm funções distintas na mesma espécie. Parálogos são proteínas da mesma espécie com similaridade de sequência significante uma com a outra sugerindo que elas são homólogos ou relacionadas através de coevolução a partir de um ancestral comum. Grupos de famílias de proteína parálogas incluem homólogos de HipA, genes da luciferase, peptidases e outros.

[00040] Um deslocamento de gene não-hortólogo é um gene não- hortólogo de uma espécie que pode substituir uma função de gene referida em uma espécie diferente. Substituições incluem, por exemplo, sendo capaz de realizar substancialmente a mesma função ou uma similar na espécie de origem comparado com a função referida na espécie diferente. Embora geralmente um deslocamento de gene não-hortólogo seja identificável como estruturalmente relacionado com um gene conhecido codificando a função referida, genes menos estruturalmente relacionados, mas funcionalmente similares, e seus produtos de gene correspondentes não obstante vão ainda se encaixar no significado do termo conforme aqui usado. Similaridade funcional requer, por exemplo, pelo menos uma similaridade estrutural no sítio ativo ou região de ligação de um gene não- hortólogo comparado com um gene codificando a função procurada ser substituída. Deste modo, um gene não-hortólogo inclui, por exemplo, um gene parálogo ou um não-relacionado.

[00041] Desta maneira, na identificação e construção dos organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção tendo capacidade biossintética de 4-HB, GBL e/ou BDO, aqueles versados na técnica vão compreender com aplicação do ensinamento e orientação providos aqui para uma espécie particular que a identificação de modificações metabólicas pode incluir identificação e inclusão ou inativação de ortólogos. Uma vez que deslocamentos de gene parálogos e/ou não-ortólogos estão presentes no microorganismo referido que codifica uma enzima catalisando uma reação metabólica similar ou substancialmente similar, aqueles versados na técnica podem também utilizar esses genes evolucionalmente relacionados.

[00042] Deslocamentos de genes ortólogos, parálogos e não- ortólogos podem ser determinados através de métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, inspeção de sequências de ácido nucleico ou aminoácido quanto a dois polipeptídeos vai revelar identidade de sequência e similaridades entre as sequências comparadas. Com base em tais similaridades, um versado na técnica pode determinar se a similaridade é suficientemente alta para indicar que as proteínas estão relacionadas através de evolução a partir de um ancestral comum. Algoritmos bem conhecidos daqueles versados na técnica, tais como Align, BLAST, Clustal W e outros, comparam e determinam uma similaridade ou identidade de sequência, e também determinam a presença ou significância de lacunas na sequência que podem ter atribuído um peso ou score. Tais algoritmos são também conhecidos na técnica e são similarmente aplicados para determinação de similaridade ou identidade de sequência de nucleotídeo. Parâmetros para similaridade suficiente para determinar relação são computados com base em métodos bem conhecidos para cálculo de similaridade estatística, ou a chance de encontrar um par similar em um polipeptídeo aleatório, e significância do par determinado. Uma comparação em computador de duas ou mais sequências pode, se desejado, ser também otimizada visualmente por aqueles versados na técnica. Produtos de gene ou proteínas relacionadas podem ser esperados ter uma alta similaridade, por exemplo, 25% a 100% de identidade de sequência. Proteínas que não são relacionadas podem ter uma identidade que é essencialmente igual como seria esperado acontecer por acaso, se um banco de dados de tamanho suficiente for varrido (cerca de 5%). Sequências entre 5% e 24% podem ou não representar homologia suficiente para concluir que as sequências comparadas são relacionadas. Análise estatística adicional para determinar a significância de tais pares dado o tamanho do conjunto de dados pode ser realizada para determinar a relevância dessas sequências.

[00043] Parâmetros exemplares para determinação da relação de duas ou mais sequências usando o algoritmo BLAST, por exemplo, podem ser conforme mostrado abaixo. Resumidamente, alinhamentos de sequência de aminoácido podem ser realizados usando a versão BLASTP 2.0.8 (05 de janeiro de 1999) e os parâmetros que seguem: Matrix: 0 BLOSUM62; abertura de lacuna: 11; extensão da lacuna: 1; x_dropoff: 50; esperado: 10,0; tamanho da palavra: 3; filtro: ligado. Alinhamentos de sequência de ácido nucleico podem ser realizados usando BLASTN versão 2.0.6 (16 de setembro de 1998) e os parâmetros que seguem: Combinação: 1; falta de combinação: -2; lacuna aberta: 5; extensão da lacuna: 2; x_dropoff: 50; esperado: 10,0; tamanho da palavra: 11; filtro: desligado. Aqueles versados na técnica saberão que modificações podem ser feitas nos parâmetros acima para ou aumentar ou diminuir a adstringência da comparação, por exemplo, e determinar a relação de duas ou mais sequências.

[00044] A invenção provê um biocatalisador microbiano de ocorrência não-natural incluindo um organismo microbiano tendo uma via biossintética do ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que inclui pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, glutamato:semialdeído succínico transaminase ou glutamato descarboxilase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades suficientes para produzir ácido 4- hidroxibutanoico (4-HB) monomérico. Succinil-CoA sintetase é também referida como succinil-CoA sintase ou succinil CoA ligase.

[00045] Os biocatalisadores microbianos de ocorrência não-natural da invenção incluem organismos microbianos que empregam combinações de reações metabólicas para produzir biossinteticamente os compostos da invenção. Compostos exemplares produzidos pelos micro-organismos de ocorrência não-natural incluem, por exemplo, ácido 4-hidroxibutanoico, 1,4-butanodiol e Y-butirolactona. As relações desses compostos exemplares com relação à síntese química ou biossíntese são exemplificadas na Figura 1.

[00046] Em uma modalidade, um organismo microbiano de ocorrência não-natural é engenheirado para produzir 4-HB. Este composto é um ponto de entrada útil na família de 1,4-butanodiol de compostos. As reações bioquímicas para formação de 4-HB a partir de succinato, a partir de succinato através de succinil-CoA ou a partir de α-cetoglutarato são mostradas na Figura 2.

[00047] A invenção é descrita aqui com referência geral à reação metabólica, reagente ou produto da mesma ou com referência específica a um ou mais ácidos nucleicos ou genes codificando uma enzima associada a ou catalisando a reação metabólica, reagente ou produto referido. A menos que de outro modo expressamente declarado aqui, aqueles versados na técnica vão compreender que referência a uma reação também constitui referência aos reagentes e produtos da reação. Similarmente, a menos que de outro modo expressamente aqui declarado, referência a um reagente ou produto também faz referência à reação e esta referência a qualquer um desses constituintes metabólicos também faz referência ao gene ou genes codificando as enzimas que catalisam a reação, reagente ou produto referido. Da mesma maneira, dados os campos bem conhecidos de bioquímica metabólica, enzimologia e genômica, referência aqui a um gene ou ácido nucleico de codificação também constitui uma referência à enzima codificada correspondente e a reação que ela catalisa bem como os reagentes e produtos da reação.

[00048] A produção de 4-HB através de modos biossintéticos usando os organismos microbianos da invenção é particularmente útil porque ela resulta em 4-HB monomérico. Os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção e sua biossíntese de compostos das famílias 4-HB e BDO também são particularmente úteis porque o produto de 4-HB (1) é secretado; (2) é destituído de quaisquer derivatizações tais como Coenzima A; (3) evita mudanças termodinâmicas durante a biossíntese e (4) permite a conversão química espontânea de 4-HB em Y-butirolactona (GBL) em meio de pH ácido. Esta última característica é exemplificada como etapa 7 na Figura 2 e é particularmente útil para síntese química ou biossíntese eficiente de compostos da família BDO tal como 1,4-butanodiol e/ou tetraidrofurano (THF), por exemplo.

[00049] Organismos microbianos geralmente não têm a capacidade de sintetizar 4-HB e então qualquer um dos compostos mostrados na Figura 1 é conhecido estar dentro da família de compostos 1,4- butanodiol ou conhecido daqueles versados na técnica estar dentro da família de compostos 1,4-butanodiol. Além disso, organismos tendo todas as capacidades enzimáticas metabólicas requisitadas não são conhecidos produzir 4-HB a partir das enzimas descritas e cursos bioquímicos exemplificados aqui. Ao contrário, com a possível exceção de alguns micro-organismos anaeróbicos descritos mais abaixo, os micro-organismos tendo a capacidade enzimática usam 4-HB como um substrato para produzir, por exemplo, succinato. Em contraste, os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção geram 4-HB como subproduto. Conforme acima descrito, a biossíntese de 4- HB em sua forma monomérica não é apenas particularmente útil em síntese química de família de compostos BDO, ela também permite a biossíntese adicional de compostos da família BDO e evita procedimentos de síntese química no geral.

[00050] Os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção que podem produzir 4-HB não-monomérico são produzidos ao assegurar que um organismo microbiano hospedeiro inclua capacidades funcionais para a síntese bioquímica completa de pelo menos uma via biossintética de 4-HB da invenção. Assegurar pelo menos uma via biossintética de 4-HB requerido confere capacidade de biossíntese de 4-HB ao organismo microbiano hospedeiro.

[00051] Três vias biossintéticas de 4-HB requeridas são exemplificadas aqui e mostradas para propósitos de ilustração na Figura 2. Uma via biossintética de 4-HB requerida inclui a biossíntese de 4-HB a partir de succinato. As enzimas que participam nesta via de 4-HB incluem semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA e 4-hidroxibutanoato desidrogenase. Outra via biossintética de 4- HB requerida inclui a biossíntese a partir de succinato através de succinil-CoA. As enzimas que participam nesta via de 4-HB incluem succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA e 4-hidroxibutanoato desidrogenase. Uma terceira via biossintética de 4-HB requerida inclui a biossíntese de 4-HB a partir de α-cetoglutarato. As enzimas que participam desta via biossintética de 4-HB incluem glutamato: semialdeído succínico transaminase, glutamato descarboxilase e 4-hidroxibutanoato desidrogenase. Cada uma dessas vias biossintéticas de 4-HB, seus substratos, reagentes e produtos são descritos mais abaixo nos Exemplos.

[00052] Os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção podem ser produzidos introduzindo ácidos nucleicos expressáveis codificando uma ou mais enzimas que participam em uma ou mais vias biossintéticas de 4-HB. Dependendo do organismo microbiano escolhido para biossíntese, os ácidos nucleicos para um pouco ou toda uma via biossintética de 4-HB particular podem ser expressos. Por exemplo, se um hospedeiro escolhido for deficiente em ambas as enzimas na via de succinato para 4-HB (a via de succinato) e esta via fpr selecionada para biossíntese de 4-HB, então ácidos nucleicos expressáveis para ambas a semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA e a 4-hidroxibutanoato desidrogenase são introduzidas no hospedeiro para expressão exógena subsequente. Alternativamente, se o hospedeiro escolhido for deficiente em 4-hidroxibutanoato desidrogenase então um ácido nucleico de codificação é necessário para esta enzima realizar a biossíntese de 4-HB.

[00053] De uma maneira similar, em que a biossíntese de 4-HB for selecionada para acontecer através da via de succinato em succinil- CoA (a via de succinil-CoA), ácidos nucleicos de codificação para deficiências de hospedeiro nas enzimas succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA e/ou 4- hidroxibutanoato desidrogenase devem ser exogenamente expressos no hospedeiro recipiente. Seleção de biossíntese de 4-HB através de uma via de α-cetoglutarato em semialdeído succínico (a via α- cetoglutarato) vai utilizar expressão exógena para deficiências de hospedeiro em uma ou mais enzimas para glutamato:semialdeído succínico transaminase, glutamato descarboxilase e/ou 4- hidroxibutanoato desidrogenase.

[00054] Dependendo dos constituintes da via biossintética de 4-HB de um organismo microbiano hospedeiro selecionado, os biocatalisadores de 4-HB microbianos de ocorrência não-natural da invenção vão incluir pelo menos um ácido nucleico de codificação de via de 4-HB exogenamente expresso e até todos os seis ácidos nucleicos de codificação de via de 4-HB. Por exemplo, biossíntese de 4-HB pode ser estabelecida a partir de todos os três cursos em um hospedeiro deficiente em 4-hidroxibutanoato desidrogenase através de expressão exógena de um ácido nucleico codificando 4-hidroxibu- tanoato desidrogenase. Em contraste, biossíntese de 4-HB pode ser estabelecida a partir de todos os três cursos em um hospedeiro deficiente em todas as seis enzimas através de expressão exógena de todas as seis de semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, glutamato: semialdeído succínico transaminase, glutamato descarboxilase e 4-hidroxibutanoato desidrogenase.

[00055] Dados os ensinamentos e a orientação providos aqui, aqueles versados na técnica vão compreender que o número de ácidos nucleicos de codificação para introduzir em uma forma expressável vai emparelhar com as deficiências da via de 4-HB do organismo microbiano hospedeiro selecionado. Desta maneira, um organismo microbiano de ocorrência não-natural da invenção pode ter um, dois, três, quatro, cinco ou seis ácidos nucleicos de codificação codificando as enzimas acima constituindo as vias biossintéticas de 4-HB. Em algumas modalidades, os organismos microbianos de ocorrência não-natural podem também incluir outras modificações genéticas que facilitam ou otimizam a biossíntese de 4- HB ou que conferem outras funções úteis ao organismo microbiano hospedeiro. Outra funcionalidade deste tipo pode incluir, por exemplo, aumento da síntese de um ou mais dos precursores da via de 4-HB tal como succinato, succinil-CoA e/ou α-cetoglutarato.

[00056] Em algumas modalidades, um organismo microbiano de ocorrência não-natural da invenção é gerado a partir de um hospedeiro que contém a capacidade enzimática de sintetizar 4-HB. Nesta modalidade específica pode ser útil aumentar a síntese ou o acúmulo de um produto de via de 4-HB para, por exemplo, direcionar as reações de via de 4-HB para a produção de 4-HB. Síntese ou acúmulo maior pode ser realizado através de, por exemplo, superexpressão de ácidos nucleicos codificando uma ou mais das enzimas de via de 4-HB acima descritas. Superexpressão da enzima ou enzimas da via de 4- HB pode acontecer, por exemplo, através da expressão exógena do gene ou genes endógenos ou através da expressão exógena do gene ou genes heterólogos. Desta maneira, organismos de ocorrência natural podem ser prontamente gerados para serem organismos microbianos de produção de 4-HB não-natural da invenção através da superexpressão de um, dois, três, quatro, cinco ou todos os seis ácidos nucleicos codificando as enzimas da via biossintética de 4-HB. Ainda, um organismo de ocorrência não-natural pode ser gerado através de mutagênese de um gene endógeno que resulta em um aumento em atividade de uma enzima na via biossintética de 4-HB.

[00057] Em modalidades particularmente úteis, expressão exógena dos ácidos nucleicos de codificação é empregada. Expressão exógena confere a habilidade em fazer sob medida a expressão e/ou elementos reguladores para o hospedeiro e a aplicação para atingir um nível de expressão desejado que é controlado pelo usuário. No entanto, expressão endógena pode ser também utilizada em outras modalidades tal como através da remoção de um efeito regulador negativo ou indução do promotor do gene quando ligado a um promotor induzível ou outro elemento regulador. Então, um gene endógeno tendo um promotor induzível de ocorrência natural pode ser suprarregulado através da provisão do agente de indução apropriado, ou a região reguladora de um gene endógeno pode ser engenheirada para incorporar um elemento regulador induzível, desta maneira permitindo a regulagem de expressão maior de um gene endógeno em um momento desejado. Similarmente, um promotor induzível pode ser incluído como um elemento regulador para um gene endógeno introduzido em um organismo microbiano de ocorrência não-natural (vide Exemplo II).

[00058] "Exógeno" conforme aqui usado pretende significar que a molécula referida ou a atividade referida é introduzida no organismo microbiano hospedeiro. Desta maneira, o termo como é usado em referência à expressão de um ácido nucleico de codificação refere-se à introdução do ácido nucleico de codificação em uma forma expressável no organismo microbiano. Quando usado em referência a uma atividade biossintética, o termo refere-se a uma atividade que é introduzida no organismo hospedeiro de referência. A fonte pode ser, por exemplo, um ácido nucleico de codificação homólogo ou heterólogo que expressa a atividade referida seguindo introdução no organismo microbiano hospedeiro. Desta maneira, o termo "endógeno" refere-se a uma molécula ou atividade referida que está presente no hospedeiro. Similarmente, o termo quando usado em referência à expressão de um ácido nucleico de codificação refere-se à expressão de um ácido nucleico de codificação contido dentro do organismo microbiano. O termo "heterólogo" refere-se a uma molécula ou atividade derivada de uma fonte outra que não a espécie referida enquanto "homólogo" refere-se a uma molécula ou atividade derivada do organismo microbiano hospedeiro. Desta maneira, expressão exógena de um ácido nucleico de codificação da invenção pode utilizar um ou ambos o ácido nucleico de codificação heterólogo ou homólogo.

[00059] Fontes de ácidos nucleicos de codificação para uma enzima da via de 4-HB podem incluir, por exemplo, quaisquer espécies onde o produto de gene codificado for capaz de catalisar a reação referida. Tais espécies incluem ambos os organismos procarióticos e eucarióticos incluindo, mas não limitados a, bactérias, incluindo archaea e eubactérias, e eucariontes, incluindo levedura, planta, inseto, animal e mamífero, incluindo ser humano. Por exemplo, os organismos microbianos tendo produção biossintética de 4-HB são exemplificados aqui com referência oas hospedeiro E. coli e levedura. No entanto, com a sequência de genoma completa disponível para agora mais de 550 espécies (com mais de metade dessas disponíveis em bancos de dados públicos tal como o NCBI), incluindo 395 genomas de micro-organismo e uma variedade de genomas de levedura, fungos, planta e mamífero, a identificação de genes codificando a atividade biossintética de 4-HB requisitada para um ou mais genes em espécies relacionadas ou distantes, incluindo, por exemplo, deslocamentos de genes homólogos, ortólogos, parálogos e não-ortólogos de genes conhecidos, e a intertroca de alterações genéticas entre organismo é rotina e bem conhecida na técnica. Desta maneira, as alterações metabólicas que permitem a biossíntese de 4- HB e outros compostos da invenção descritos aqui com referência a um organismo particular tal como E. coli ou levedura podem ser prontamente aplicadas a outros micro-organismos, incluindo organismos procarióticos e eucarióticos similares. Dados os ensinamentos e orientação providos aqui, aqueles versados na técnica saberão que uma alteração metabólica exemplificada em um organismo pode ser aplicada igualmente a outros organismos.

[00060] Em alguns casos, tal como quando uma via biossintética de 4- HB alternativa existe em uma espécie não-relacionada, a biossíntese de 4- HB pode ser conferida à espécie hospedeira através de, por exemplo, expressão exógena de um parálogo ou parálogos da espécie não- relacionada que catalisa uma reação metabólica similar, embora não idêntica, para substituir a reação referida. Por causa de certas diferenças entre redes metabólicas existir entre organismos diferentes, aqueles versados na técnica vão compreender que uso de gene real entre organismos diferentes pode diferir. No entanto, dados os ensinamentos e orientação providos aqui, aqueles versados na técnica vão também compreender que os ensinamentos e métodos da invenção podem ser aplicados a todos os organismos microbianos usando as alterações metabólicas cognatas àquelas exemplificadas aqui para construir um organismo microbiano em uma espécie de interesse que vai sintetizar 4-HB monomérico.

[00061] Organismos hospedeiros microbianos podem ser selecionados de, e os organismos microbianos de ocorrência não- natural gerados em, por exemplo, bactérias, levedura, fungos ou qualquer um de uma variedade de outros micro-organismos aplicáveis a processos de fermentação. Bactérias exemplares incluem espécies selecionadas de E. coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, and Pseudomonas putida. Leveduras ou fungos exemplares incluem espécies selecionadas de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger e Pichia pastoris.

[00062] Métodos para construção e teste dos níveis de expressão de um hospedeiro de produção de 4-HB de ocorrência não-natural podem ser realizados, por exemplo, através de métodos recombinantes e de detecção bem conhecidos na técnica. Tais métodos podem ser encontrados descritos em, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (2001); Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999). 4-HB e GLB podem ser separados através de, por exemplo, HPLC usando uma coluna Spherisorb 5 DOS1 e uma fase móvel de tampão de fosfato a 10 mM 70% (pH=7) e metanol a 30%, e detectados usando um detector de UV a 215 nm (Hennesy e outros, J. Forensic Sci,. 46(6):1-9 (2004). BDO é detectado através de cromatografia de gás ou através de HPLC e detector de índice refrativo usando uma coluna Aminex HPX-87H e uma fase móvel de ácido sulfúrico 0,5 mM (Gonzalez-Pajuelo e outros, Met. Eng., 7:329336 (2005)).

[00063] Os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção são construídos usando métodos bem conhecidos na técnica conforme exemplificado acima para expressar exogenamente pelo menos um ácido nucleico codificando uma enzima de via de 4-HB em quantidades suficientes para produzir 4-HB monomérico. Níveis exemplares de expressão de enzimas 4-HB em cada via são descritos mais abaixo nos Exemplos. Seguindo os ensinamentos e a orientação providos aqui, os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção podem realizar biossíntese de 4-HB monomérico resultando em concentrações intracelulares entre cerca de 0,1-25 mM ou mais. Em geral, a concentração intracelular de 4-HB monomérico é entre cerca de 3-20 mM, particularmente entre cerca de 5-15 mM e mais particularmente entre cerca de 8-12 mM, incluindo cerca de 10 mM ou mais. Concentrações intracelulares entre e acima de cada uma dessas faixas exemplares também podem ser atingidas a partir de organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção.

[00064] Conforme descrito mais abaixo, uma condição de crescimento exemplar para realizar biossíntese de 4-HB inclui condições de cultura ou fermentação anaeróbica. Em certas modalidades, os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção podem ser sustentados, culturados ou fermentados sob condições anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas. Resumidamente, condições anaeróbicas referem-se a um ambiente destituído de oxigênio. Condições substancialmente anaeróbicas incluem, por exemplo, uma cultura, fermentação em batelada ou fermentação contínua de maneira que a concentração de oxigênio dissolvido no meio permaneça entre 0 e 10% de saturação. Condições substancialmente anaeróbicas também incluem cultivo ou descanso de células em meio líquido ou em ágar sólido dentro de uma câmara vedada mantida com uma atmosfera de menos do que 1% de oxigênio. A porcentagem de oxigênio pode ser mantida através de, por exemplo, aspersão da cultura com uma mistura de N2/CO2 ou outro gás ou gases não-oxigênio adequados.

[00065] A invenção também provê um biocatalisador microbiano de ocorrência não-natural incluindo um organismo microbiano tendo cursos biossintéticos de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e 1,4- butanodiol (BDO) que incluem pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, 4- hidroxibutirato:CoA transferase, glutamato:semialdeído succínico transaminase, glutamato descarboxilase, aldeído desidrogenase independente de CoA, aldeído desidrogenase dependente de CoA ou álcool desidrogenase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades suficientes para produzir 1,4-butanodiol (BDO).

[00066] Organismos microbianos de ocorrência não-natural podem ser também gerados que biossintetizam BDO. Seguindo os ensinamentos e a orientação providos anteriormente para a construção de organismos microbianos que sintetizam 4-HB, cursos de BDO adicionais podem ser incorporados aos organismos microbianos produzindo 4-HB para gerar organismos que também sintetizam BDO e outros compostos da família BDO. A síntese química de BDO e seus produtos a jusante são ilustrados na Figura 3. Os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção capazes de biossíntese de BDO evitam essas sínteses químicas usando 4-HB como um ponto de entrada conforme ilustrado na Figura 2. Conforme descrito mais abaixo, os produtos de 4-HB podem ser usados para converter quimicamente 4-HB em GBL e então em BDO ou THF, por exemplo. Alternativamente, os produtores de 4-HB podem ser modificados mais para incluir capacidades biossintéticas para conversão de 4-HB e/ou GBL em BDO.

[00067] Os cursos de BDO adicionais para introduzir em produtores de 4-HB incluem, por exemplo, a expressão exógena em uma base deficiente de hospedeiro ou a superexpressão de uma aldeído desidrogenase independente de CoA, aldeído desidrogenase dependente de CoA ou uma álcool desidrogenase. Na ausência de acil-CoA sintetase endógena capaz de modificar 4-HB, os organismos microbianos de produção de BDO de ocorrência não-natural podem incluir ainda uma acil-CoA sintetase exógena seletiva para 4-HB. Álcool e aldeído desidrogenases exemplares que podem ser usadas para essas conversões in vivo de 4-HB para BDO são listados abaixo na Tabela 1. Tabela 1. Álcool e Aldeído Desidrogenases para Conversão de 4-HB em BDO. ÁLCOOL DESIDROGENASES ec:1.1.1.1 álcool desidrogenase ec:1.1.1.2 álcool desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.4 (R,R)-butanodiol desidrogenase ec:1.1.1.5 acetoína desidrogenase ec:1.1.1.6 glicerol desidrogenase ec:1.1.1.7 propanodiol-fosfato desidrogenase ec:1.1.1.8 glicerol-3-fosfato desidrogenase (NAD+) ec:1.1.1.11 D-arabinitol 4-desidrogenase ec:1.1.1.12 L-arabinitol 4-desidrogenase ec:1.1.1.13 L-arabinitol 2-desidrogenase ec:1.1.1.14 L-iditol 2-desidrogenase ec:1.1.1.15 D-iditol 2-desidrogenase ec:1.1.1.16 galactitol 2-desidrogenase ec:1.1.1.17 manitol-1-fosfato 5-desidrogenase ec:1.1.1.18 inositol 2-desidrogenase ec:1.1.1.21 aldeído redutase ec:1.1.1.23 histidinol desidrogenase ec:1.1.1.26 glioxalato redutase ec:1.1.1.27 L-lactato desidrogenase ec:1.1.1.28 D-lactato desidrogenase ec:1.1.1.29 glicerato desidrogenase ec:1.1.1.30 3-hidroxibutirato desidrogenase ec:1.1.1.31 3-hidróxi-isobutirato desidrogenase ec:1.1.1.35 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase ec:1.1.1.36 acetoacetil-CoA redutase ec:1.1.1.37 malato desidrogenase ec:1.1.1.38 malato desidrogenase (oxaloacetato-descarboxilação) ec:1.1.1.39 malato desidrogenase (descarboxilação) ec:1.1.1.40 malato desidrogenase (oxaloacetato-descarboxilação) (NADP+) ec:1.1.1.41 isocitrato desidrogenase (NAD+) ec:1.1.1.42 isocitrato desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.54 alil-álcool desidrogenase ec:1.1.1.55 lactaldeído redutase (NADPH) ec:1.1.1.56 ribitol 2-desidrogenase ec:1.1.1.59 3-hidroxipropionato desidrogenase ec:1.1.1.60 2-hidróxi-3-oxopropionato redutase ec:1.1.1.61 4-hidroxibutirato desidrogenase ec:1.1.1.66 omega-hidroxidecanoato desidrogenase ec:1.1.1.67 manitol 2-desidrogenase ec:1.1.1.71 álcool desidrogenase [NAD(P)+] ec:1.1.1.72 glicerol desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.73 octanol desidrogenase ec:1.1.1.75 (R)-aminopropanol desidrogenase ec:1.1.1.76 (S,S)-butanodiol desidrogenase ec:1.1.1.77 lactaldeído redutase ec:1.1.1.78 metilglioxal redutase (dependente de NADH) ec:1.1.1.79 glioxilato redutase (NADP+) ec:1.1.1.80 isopropanol desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.81 hidroxipiruvato redutase ec:1.1.1.82 malato desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.83 D-malato desidrogenase (descarboxilação) ec:1.1.1.84 dimetilmalato desidrogenase ec:1.1.1.85 3-isopropilmalato desidrogenase ec:1.1.1.86 cetol-ácido redutoisomerase ec:1.1.1.87 homoisocitrato desidrogenase ec:1.1.1.88 hidroximetilglutaril-CoA redutase ec:1.1.1.90 aril-álcool desidrogenase ec:1.1.1.91 aril-álcool desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.92 oxaloglicolato redutase (descarboxilação) ec:1.1.1.94 glicerol-3-fosfato desidrogenase [NAD(P)+] ec:1.1.1.95 fosfoglicerato desidrogenase ec:1.1.1.97 3-hidroxibenzil-álcool desidrogenase ec:1.1.1.101 acilglicerona-fosfato redutase ec:1.1.1.103 L-treonina 3-desidrogenase ec:1.1.1.104 4-oxoprolina redutase ec:1.1.1.105 retinol desidrogenase ec:1.1.1.110 indol-lactato desidrogenase ec:1.1.1.112 indanol desidrogenase ec:1.1.1.113 L-xilose 1-desidrogenase ec:1.1.1.129 L-treonato 3-desidrogenase ec:1.1.1.137 ribitol-5-fosfato 2-desidrogenase ec:1.1.1.138 manitol 2-desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.140 sorbitol-6-fosfato 2-desidrogenase ec:1.1.1.142 D-pinitol desidrogenase ec:1.1.1.143 sequoitol desidrogenase ec:1.1.1.144 perilil-álcool desidrogenase ec:1.1.1.156 glicerol 2-desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.157 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase ec:1.1.1.163 ciclopentanol desidrogenase ec:1.1.1.164 hexadecanol desidrogenase ec:1.1.1.165 2-alquin-1-ol desidrogenase ec:1.1.1.166 hidroxiciclo-hexanocarboxilato desidrogenase ec:1.1.1.167 hidroximalonato desidrogenase ec:1.1.1.174 ciclo-hexano-1,2-diol desidrogenase ec:1.1.1.177 glicerol-3-fosfato 1-desidrogenase (NADP+) ec:1.1.1.178 3-hidróxi-2-metilbutiril-CoA desidrogenase ec:1.1.1.185 L-glicol desidrogenase ec:1.1.1.190 indol-3-acetaldeído redutase (NADH) ec:1.1.1.191 indol-3-acetaldeído redutase (NADPH) ec:1.1.1.192 álcool desidrogenase de cadeia longa ec:1.1.1.194 coniferil-álcool desidrogenase ec:1.1.1.195 cinamil-álcool desidrogenase ec:1.1.1.198 (+)-borneol desidrogenase ec:1.1.1.202 1,3-propanodiol desidrogenase ec:1.1.1.207 (-)-mentol desidrogenase ec:1.1.1.208 (+)-neomentol desidrogenase ec:1.1.1.216 farnesol desidrogenase ec:1.1.1.217 benzil-2-metil-hidroxibutirato desidrogenase ec:1.1.1.222 (R)-4-hidroxifenil-lactato desidrogenase ec:1.1.1.223 isopiperitenol desidrogenase ec:1.1.1.226 4-hidroxiciclo-hexanocarboxilato desidrogenase ec:1.1.1.229 2-metil-3-oxossuccinato de dietila redutase ec:1.1.1.237 hidroxifenilpiruvato redutase ec:1.1.1.244 metanol desidrogenase ec:1.1.1.245 ciclo-hexanol desidrogenase ec:1.1.1.250 D-arabinitol 2-desidrogenase ec:1.1.1.251 galactitol 1-fosfato 5-desidrogenase ec:1.1.1.255 manitol desidrogenase ec:1.1.1.256 fluoren-9-ol desidrogenase ec:1.1.1.257 4-(hidroximetil)benzenossulfonato desidrogenase ec:1.1.1.258 6-hidróxi-hexanoato desidrogenase ec:1.1.1.259 3-hidroxipimeloil-CoA desidrogenase ec:1.1.1.261 glicerol-1-fosfato desidrogenase [NAD(P)+] ec:1.1.1.265 3-metilbutanal redutase ec:1.1.1.283 metilglioxal redutase (dependente de NADPH) ec:1.1.1.286 isocitrato-homoisocitrato desidrogenase ec:1.1.1.287 D-arabinitol desidrogenase (NADP+) butanol desidrogenase

[00068] ALDEÍDO DESIDROGENASES ec:1.2.1.2 formiato desidrogenase ec:1.2.1.3 aldeído desidrogenase (NAD+) ec:1.2.1.4 aldeído desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.5 aldeído desidrogenase [NAD(P)+] ec:1.2.1.7 benzaldeído desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.8 betaína-aldeído desidrogenase ec:1.2.1.9 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.10 acetaldeído desidrogenase (acetilação) ec:1.2.1.11 aspartato-semialdeído desidrogenase ec:1.2.1.12 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (fosforilação) ec:1.2.1.13 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (NADP+) (fosforilação) ec:1.2.1.15 malonato-semialdeído desidrogenase ec:1.2.1.16 succinato-semialdeído desidrogenase [NAD(P)+] ec:1.2.1.17 glioxalato desidrogenase (acilação) ec:1.2.1.18 malonato-semialdeído desidrogenase (acetilação) ec:1.2.1.19 aminobutiraldeído desidrogenase ec:1.2.1.20 glutarato-semialdeído desidrogenase ec:1.2.1.21 glicolaldeído desidrogenase ec:1.2.1.22 lactaldeído desidrogenase ec:1.2.1.23 2-oxoaldeído desidrogenase (NAD+) ec:1.2.1.24 succinato-semialdeído desidrogenase ec:1.2.1.25 2-oxoisovalerato desidrogenase (acilação) ec:1.2.1.26 2,5-dioxovalerato desidrogenase ec:1.2.1.27 metilmalonato-semialdeído desidrogenase (acilação) ec:1.2.1.28 benzaldeído desidrogenase (NAD+) ec:1.2.1.29 aril-aldeído desidrogenase ec:1.2.1.30 aril-aldeído desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.31 L-aminoadipato-semialdeído desidrogenase ec:1.2.1.32 aminomuconato-semialdeído desidrogenase ec:1.2.1.36 retinal desidrogenase ec:1.2.1.39 fenilacetaldeído desidrogenase ec:1.2.1.41 glutamato-5-semialdeído desidrogenase ec:1.2.1.42 hexadecanal desidrogenase (acilação) ec:1.2.1.43 formiato desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.45 4-carbóxi-2-hidroximuconato-6-semialdeído desidrogenase ec:1.2.1.46 formaldeído desidrogenase ec:1.2.1.47 4-trimetilamoniobutiraldeído desidrogenase ec:1.2.1.48 aldeído desidrogenase de cadeia longa ec:1.2.1.49 2-oxoaldeído desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.51 piruvato desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.52 oxoglutarato desidrogenase (NADP+) ec:1.2.1.53 4-hidroxifenilacetaldeído desidrogenase ec:1.2.1.57 butanal desidrogenase ec:1.2.1.58 fenilglioxalato desidrogenase (acilação) ec:1.2.1.59 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (NAD(P)+) (fosforilação) ec:1.2.1.62 4-formilbenzenossulfonato desidrogenase ec:1.2.1.63 6-oxo-hexanoato desidrogenase ec:1.2.1.64 4-hidroxibenzaldeído desidrogenase ec:1.2.1.65 salicilaldeído desidrogenase ec:1.2.1.66 formaldeído desidrogenase dependente de micotiol ec:1.2.1.67 vanilina desidrogenase ec:1.2.1.68 coniferil-aldeído desidrogenase ec:1.2.1.69 fluoracetaldeído desidrogenase ec:1.2.1.71 succinilglutamato-semialdeído desidrogenase

[00069] Desta maneira, em adição a qualquer uma das várias modificações exemplificadas previamente para estabelecimento de biossíntese de 4-HB em um hospedeiro selecionado, os organismos microbianos de produção de BDO podem incluir qualquer uma das combinações e permutações anteriores de modificações metabólicas da via de 4-HB bem como qualquer combinação de expressão para aldeído desidrogenase independente de CoA, aldeído desidrogenase dependente de CoA ou uma álcool desidrogenase para gerar cursos sintéticos para BDO. Desta maneira, os produtores de BDO da invenção podem ter expressão exógena de, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou todas as 10 enzimas correspondendo a qualquer um dos seis cursos de 4-HB e/ou qualquer uma das 4 enzimas da via de BDO.

[00070] Projeto e construção dos organismos microbianos geneticamente modificados são realizados usando métodos bem conhecidos na técnica para obter quantidades suficientes de expressão para produzir BDO. Em particular, os organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção podem realizar biossíntese de BDO resultando em concentrações intracelulares entre cerca de 0,1-25 mM ou mais. Em geral, a concentração intracelular de BDO está entre cerca de 3-20 mM, particularmente entre cerca de 515 mM e mais particularmente entre cerca de 8-12 mM, incluindo cerca de 10 mM ou mais. Concentrações intracelulares entre e acima de cada uma dessas faixas exemplares podem ser obtidas a partir dos organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção. Como com os produtores de 4-HB, os produtores de BDO podem ser também mantidos, culturados ou fermentados sob condições anaeróbicas.

[00071] A invenção provê ainda um método para a produção de 4- HB. O método inclui cultura de um organismo microbiano de ocorrência não-natural tendo uma via biossintética de ácido 4- hidroxibutanoico (4-HB) compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, succinil- CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, glutamato:semialdeído succínico transaminase ou glutamato descarboxilase sob condições substancialmente anaeróbicas por um período de tempo suficiente para produzir ácido 4-hidroxibutanoico (4- HB) monomérico. O método pode incluir ainda conversão química de 4-HB em GBL e em BDO ou THF, por exemplo.

[00072] É compreendido que, nos métodos da invenção, qualquer um dos um ou mais ácidos nucleicos endógenos pode ser combinado em um organismo microbiano de ocorrência não-natural da invenção contanto que o produto desejado seja produzido, por exemplo, 4-HB, BDO, THF ou GBL. Por exemplo, um organismo microbiano de ocorrência não-natural tendo uma via biossintética de 4-HB pode compreender pelo menos dois ácidos nucleicos exógenos codificando enzimas desejadas, tal como a combinação de 4-hidroxibutanoato desidrogenase e semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA; 4-hidroxibutanoato desidrogenase e semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA; semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA e succinil-CoA sintetase; succinil- CoA sintetase e glutamato descarboxilase e similar. Então, é compreendido que qualquer combinação de duas ou mais enzimas de uma via biossintética pode ser incluída em um organismo microbiano de ocorrência não-natural da invenção. Similarmente, é compreendido que qualquer combinação de três ou mais enzimas de uma via biossintética pode ser incluída em um organismo microbiano de ocorrência não-natural da invenção, por exemplo, 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA e succinil-CoA sintetase; 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA e glutamato:semialdeído succínico transaminase, e assim por diante, conforme desejado, contanto que a combinação de enzimas da via biossintética desejada resulte em produção do produto desejado correspondente.

[00073] Qualquer um dos organismos microbianos de ocorrência não-natural descritos previamente pode ser culturado para produzir os produtos biossintéticos da invenção. Por exemplo, os produtores de 4- HB podem ser culturados para a produção biossintética de 4-HB. O 4- HB pode ser isolado ou ser tratado conforme descrito abaixo para gerar GBL, THF e/ou BDO. Similarmente, os produtores de BDO podem ser culturados para a produção biossintética de BDO. O BDO pode ser isolado ou submetido a tratamentos adicionais para a síntese química de compostos da família BDO tais como aqueles compostos a jusante exemplificados na Figura 3.

[00074] Em algumas modalidades, condições de cultura incluem condições de crescimento e manutenção anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas. Condições anaeróbicas exemplares foram previamente descritas e são bem conhecidas na técnica. Condições anaeróbicas exemplares para processos de fermentação são descritas abaixo nos Exemplos. Qualquer uma dessas condições pode ser empregada com os organismos microbianos de ocorrência não- natural bem como outras condições anaeróbicas bem conhecidas na técnica. Sob tais condições anaeróbicas, os produtores de 4-HB e BDO podem sintetizar 4-HB e BDO monoméricos, respectivamente, em concentrações intracelulares de 5-10 mM ou mais bem como outras condições previamente exemplificadas.

[00075] Vários compostos a jusante podem ser também gerados para a produção de 4-BH e BDO produzindo organismos microbianos de ocorrência não-natural da invenção. Com relação aos organismos microbianos de produção de 4-HB da invenção, 4-HB e GBL monoméricos existem equilíbrio em meio de cultura. A conversão de 4- HB em GBL pode ser eficientemente realizada através de, por exemplo, cultura dos organismos microbianos em meio de pH ácido. Um pH de menos do que ou igual a 7,5, em particular em ou abaixo de pH 5,5, converte espontaneamente 4-HB em GBL conforme ilustrado na Figura 1.

[00076] O GBL resultante pode ser separado de 4-HB e outros compostos na cultura usando uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos de separação incluem, por exemplo, os procedimentos de extração exemplificados nos Exemplos bem como métodos que incluem extração líquido-líquido contínua, pervaporação, filtragem membrana, separação em membrana, osmose reversa, eletrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtragem extrativa, cromatografia de troca de íon, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de adsorção e ultrafiltragem. Todos os métodos acima são bem conhecidos na técnica. GBL separado pode ser purificado mais através de, por exemplo, destilação.

[00077] Outro composto a jusante que pode ser produzido a partir de organismos microbianos de ocorrência não-natural de produção de 4-HB da invenção inclui, por exemplo, BDO. Este composto pode ser sintetizado através de, por exemplo, hidrogenação química de GBL. Reações de hidrogenação química são bem conhecidas na técnica. Um procedimento exemplar inclui a redução química de 4-HB e/ou GBL ou uma mistura desses dois componentes derivando da cultura usando um catalisador de hidrogenação heterogêneo ou homogêneo junto com hidrogênio, ou um agente de redução de base hidreto usado estequiometricamente ou cataliticamente, para produzir 1,4-butanodiol.

[00078] Outros procedimentos bem conhecidos na técnica são igualmente aplicáveis para a reação química acima e incluem, por exemplo, WO N°. 82/03854 (Bradley e outros), que descreve a hidrogenólise de gama-butirolactona na fase de vapor sobre um catalisador de óxido de cobre e óxido de zinco. Patente Britânica N°. 1.230.276, que descreve a hidrogenação de gama-butirolactona usando um catalisador de óxido de cobre-óxido de cromo. A hidrogenação é realizada na fase líquida. Reações em batelada também são exemplificadas tendo pressão de reator total alta. Pressões parciais de reagente e de produto nos reatores estão bem acima do respectivo ponto de orvalho. Patente Britânica N°. 1.314.126, que descreve a hidrogenação de gama-butirolactona na fase líquida sobre catalisador de níquel-cobalto-óxido de tório. Reações em batelada são exemplificadas como tendo pressões totais altas e pressões parciais componentes bem acima dos respectivos pontos de orvalho do componente. A Patente Britânica N°. 1.344.557, que descreve a hidrogenação de gama-butirolactona na fase líquida sobre um catalisador de óxido de cobre-óxido de cromo. Uma fase de vapor ou fase mista contendo vapor é indicada como adequada em alguns casos. Um reator tubular de fluxo contínuo é exemplificado usando pressões de reator totais altas. Patente Britânica N°. 1.512.751, que descreve a hidrogenação de gama-butirolactona em 1,4-butanodiol na fase líquida sobre um catalisador de óxido de cobre-óxido de cromo. As reações em batelada são exemplificadas com pressões de reator totais altas e, em que determinável, pressões parciais de reagente e produto bem acima dos respectivos pontos de orvalho. A Patente U.S. N°. 4.301.077, que descreve a hidrogenação de 1,4-butanodiol de gama-butirolactona sobre catalisador de Ru-Ni-Co-Zn. A reação pode ser conduzida na fase líquida ou de gás ou em uma fase líquida-gás misturada. São exemplificadas reações de fase líquida de fluxo contínuo em pressões de reator totais altas e produtividades de reator relativamente baixas. A Patente U.S. N°. 4.048.196, que descreve a produção de 1,4-butanodiol através de hidrogenação de fase líquida de gama-butirolactona sobre um catalisador de óxido de cobre-óxido de zinco. É exemplificado mais um reator tubular de fluxo contínuo operando em pressões de reator totais altas e pressões parciais de reagente e produto altas. E a Patente U.S. N°. 4.652.685, que descreve a hidrogenação de lactonas em glicóis.

[00079] Um composto a jusante adicional que pode ser produzido a partir dos organismos microbianos de produção de 4-HB da invenção inclui, por exemplo, THF. Este composto pode ser sintetizado através de, por exemplo, hidrogenação química de GBL. Um procedimento exemplar bem conhecido na técnica aplicável para a conversão de GBL em THF inclui, por exemplo, redução química de 4-HB e/ou GBL ou uma mistura desses dois componentes derivando da cultura usando um catalisador de hidrogenação heterogêneo ou homogêneo junto com hidrogênio, ou um agente de redução de base hidreto usado estequiometricamente ou cataliticamente para produzir tetraidrofurano. Outros procedimentos bem conhecidos na técnica são igualmente aplicáveis para a reação química acima e incluem, por exemplo, Patente U.S. N°. 6.686.310, que descreve catalisadores de hidrogenação preparados via sol-gel de reação de superfície alta. Processos para a redução de gama butirolactona em tetraidrofurano e 1,4-butanodiol são também descritos.

[00080] As condições de cultura podem incluir, por exemplo, procedimentos de cultura líquida bem como fermentação e outros procedimentos de cultura de grande escala. Conforme descrito mais abaixo nos Exemplos, rendimentos particularmente úteis dos produtos biossintéticos da invenção podem ser obtidos sob condições de cultura anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas.

[00081] A invenção provê ainda um método de fabricação de 4-HB. O método inclui fermentação de um organismo microbiano de ocorrência não-natural tendo via biossintética de ácido 4- hidroxibutanoico (4-HB) compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando 4-hidroxibutaoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, succinil- CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, glutamato:semialdeído succínico transaminase ou glutamato descarboxilase sob condições substancialmente anaeróbicas por um período de tempo suficiente para produzir ácido 4-hidroxibutanoico (4- HB) monomérico, o processo compreendendo fermentação em batelada alimentada e separação em batelada; fermentação em batelada e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua.

[00082] A cultura e hidrogenações químicas descritas acima podem ser também aumentadas e cultivadas continuamente para fabricação de 4-HB, GBL, BDO e/ou THF. Procedimentos de crescimento exemplares incluem, por exemplo, fermentação em batelada alimentada e separação em batelada; fermentação fed-batch e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua. Todos esses processos são bem conhecidos na técnica. Emprego dos produtores de 4-HB permite biossíntese de 4-HB simultânea e conversão química em GBL, BDO e/ou THF através do emprego dos procedimentos de hidrogenação acima simultâneos a métodos de cultura contínuos tal como fermentação. Outros procedimentos de hidrogenação são também bem conhecidos na técnica e podem ser igualmente aplicados aos métodos da invenção.

[00083] Procedimentos de fermentação são particularmente úteis para a produção biossintética de quantidades comerciais de 4-HB e/ou BDO. Em geral, e como com os procedimentos de cultura não- contínuos, a produção contínua e/ou quase contínua de 4-HB ou BDO vai incluir cultura de um organismo de produção de 4-HB ou BDO de ocorrência não-natural da invenção em nutrientes e meios suficientes para manter e/ou quase manter o crescimento em uma fase exponencial. Cultura contínua sob tais condições podem ser incluídas, por exemplo, 1 dia, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou mais. Adicionalmente, cultura contínua pode incluir uma semana, 2, 3, 4 ou 5 ou mais semanas e até vários meses. Alternativamente, os organismos da invenção podem ser culturados por horas, se adequado para uma aplicação particular. Deve ser compreendido que as condições de cultura contínuas e/ou quase contínuas podem também incluir todos os intervalos de tempo entre esses períodos exemplares.

[00084] Procedimentos de fermentação são bem conhecidos na técnica. Resumidamente, fermentação para a produção biossintética de 4-HB, BDO e outros produtos derivados de 4-HB da invenção pode ser utilizada em, por exemplo, fermentação em batelada alimentada e separação em batelada; fermentação em batelada alimentada e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua. Exemplos de procedimentos de fermentação em batelada e contínuos bem conhecidos na técnica são exemplificados mais abaixo nos Exemplos.

[00085] Ainda, para os procedimentos de fermentação acima usando os produtores de 4-HB ou BDO da invenção para produção contínua de quantidades substanciais de 4-HB e BDO monoméricos, respectivamente, os produtores de 4-HB podem ser também, por exemplo, simultaneamente submetidos a procedimentos de síntese química conforme previamente descrito para a conversão química de 4-HB monomérico, por exemplo, GBL, BDO e/ou THF. Os produtores de BDO podem similarmente ser, por exemplo, simultaneamente submetidos a procedimentos de síntese química conforme previamente descrito para a conversão química de BDO para, por exemplo, THF, GBL, pirrolidonas e/ou outros compostos da família BDO. Ainda, os produtos dos produtores de 4-HB e BDO podem ser separados da cultura de fermentação e sequencialmente submetidos à conversão química, conforme aqui descrito.

[00086] Resumidamente, hidrogenação de GBL no caldo de fermentação pode ser realizada conforme descrito pro Frost e outros, Biotechnology Progress 18:201-211 (2002). Outro procedimento para hidrogenação durante fermentação inclui, por exemplo, os métodos descritos na, por exemplo, Patente U.S. No. 5.478.952. Este método é exemplificado mais nos Exemplos abaixo.

[00087] Dessa maneira, a invenção provê ainda um método de fabricação de Y-butirolactona (GBL), tetraidrofurano (THF) ou 1,4- butanodiol (BDO). O método inclui fermentação de um organismo microbiano de ocorrência não-natural tendo cursos biossintéticos de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO), os cursos compreendem pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando 4- hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferase, glutamato:semialdeído succínico transaminase, glutamato descarboxilase, 1,4-butanodiol semialdeído desidrogenase independente de CoA, 1,4-butanodiol semialdeído desidrogenase dependente de CoA, 1,4-butanodiol álcool desidrogenase, ou dependente ou independente de CoA, sob condições substancialmente anaeróbicas por um período de tempo suficiente para produzir 1,4-butanodiol (BDO), GBL ou THF, a fermentação compreendendo fermentação em batelada alimentada e separação por batelada; fermentação em batelada alimentada e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua.

[00088] Em adição à biossíntese de 4-HB, BDO e outros produtos da invenção conforme descrito aqui, os organismos microbianos de ocorrência não-natural e métodos da invenção podem ser também utilizados em várias combinações uns com os outros e com outros organismos microbianos e métodos bem conhecidos na técnica para realizar biossíntese de produto através de outras vias. Por exemplo, uma alternativa para produzir BDO que não o uso dos produtores de 4- HB e etapas químicas ou que não o uso do produtor de BDO diretamente é através da adição de outro organismo microbiano capaz de converter 4-HB ou um produto de 4-HB exemplificado aqui em BDO.

[00089] Tal procedimento inclui, por exemplo, a fermentação de um organismo microbiano de produção de 4-HB da invenção para produzir 4-HB, conforme descrito acima e abaixo. O 4-HB pode ser usado como um substrato para um segundo organismo microbiano que converte 4- HB em, por exemplo, BDO, GBL e/ou THF. O 4-HB pode ser adicionado diretamente a outra cultura do segundo organismo ou a cultura original dos produtores de 4-HB pode ser depletada desses organismos microbianos através de, por exemplo, separação celular, e então adição subsequente do segundo organismo ao caldo de fermentação pode ser utilizada para produzir o produto final sem etapas de purificação intermediárias. Um segundo organismo exemplar tendo a capacidade de utilizar bioquimicamente 4-HB como um substrato para conversão em BDO, por exemplo, é Clostridium acetobutylicum (vide, por exemplo, Jewell e outros, Current Microbiology, 13:215-19 (1986)).

[00090] Em outras modalidades, os organismos microbianos de ocorrência não-natural e métodos da invenção podem ser montados em uma ampla variedade de subcursos para realizar biossíntese de, por exemplo, 4-HB e/ou BDO conforme descrito. Nessas modalidades, cursos biossintéticos para um produto desejado da invenção podem ser segregados em organismos microbianos diferentes e os organismos microbianos diferentes podem ser coculturados para produzir o produto final. Em tal esquema biossintético, o produto de um organismo microbiano é o substrato para um segundo organismo microbiano até que o produto final seja sintetizado. Por exemplo, a biossíntese de BDO pode ser realizada conforme previamente descrito através da construção de um organismo microbiano que contém cursos biossintéticos para conversão de um substrato tal como succinato endógeno através de 4-HB no produto final BDO. Alternativamente, BDO pode ser também biossinteticamente produzido a partir de organismos microbianos através de co-cultura ou co- fermentação usando dois organismos no mesmo recipiente. Um primeiro organismo microbiano sendo um produtor de 4-HB com genes para produzir 4-HB a partir de ácido succínico e um segundo organismo microbiano sendo um produtor de BDO com genes para converter 4-HB em BDO.

[00091] Dados os ensinamentos e orientação providos aqui, aqueles versados na técnica vão compreender que uma ampla variedade de combinações e permutações existe para os organismos microbianos de ocorrência não-natural e métodos da invenção junto com outros organismos microbianos, com a cocultura de outros organismos microbianos de ocorrência não-natural tendo subcursos e com combinações de outros procedimentos químicos e/ou bioquímicos bem conhecidos na técnica para produzir produtos de 4-HB, BDO, GBL e THF da invenção.

[00092] Um método computacional para identificação e projeto de alterações metabólicas que favorecem biossíntese de um produto é a estrutura computacional OptKnock, Burgard e outros, Biotechnol Bioeng., 84: 647-57 (2003). OptKnock é um programa de modelagem e simulação metabólica que sugere estratégias de deleção de gene que resultam em micro-organismos geneticamente estáveis que produzem excesso o produto-alvo. Especificamente, a estrutura examina o sistema metabólico e/ou bioquímico completo de um microorganismo a fim de sugerir manipulações genéticas que forcem o agente bioquímico desejado a se tornar um subproduto obrigatório de crescimento celular. Ao acoplar produção bioquímica com crescimento celular através de deleções de gene estrategicamente localizados ou outro rompimento de gene funcional, as pressões de seleção de crescimento impostas às cepas engenheiradas após longos períodos de tempo em um biorreator levam a aperfeiçoamentos em desempenho como um resultado da produção bioquímica acoplada a crescimento compulsório. Por fim, quando deleções de gene são construídas há possibilidade ínfima das cepas projetadas reverterem para seus estados do tipo selvagem porque os genes selecionados pelo OptKnock devem ser completamente removidos do genoma. Desta maneira, esta metodologia computacional pode ser usada ou para identificar cursos alternativos que levam à biossíntese de 4-HB e/ou BDO ou usados em conexão com os organismos microbianos de ocorrência não-natural para otimização adicional da biossíntese de 4- HB e/ou BDO.

[00093] Resumidamente, OptKnock é um termo usado aqui para se referir a um método e a um sistema computacional para modelagem de metabolismo celular. O programa OptKnock refere-se a uma estrutura de modelos e métodos que incorpora restrições particulares aos modelos de análise de equilíbrio de fluxo (FBA). Essas restrições incluem, por exemplo, informação cinética qualitativa, informação reguladora qualitativa e/ou dados experimentais de microdisposição de DNA. OptKnock também computa soluções para vários problemas metabólicos através de, por exemplo, fortalecimento dos limites de fluxo derivados através de modelos de equilíbrio de fluxo e subsequentemente testando os limites de desempenho de sistemas metabólicos na presença de adições ou deleções de gene. A estrutura computacional de OptKnock permite a construção de formulações modelo que permitem uma pesquisa eficaz dos limites de desempenho de sistemas metabólicos e provê métodos para solução dos problemas de programação linear mista-inteira resultantes. Os métodos de modelagem e simulação metabólicos referidos aqui como OptKnock são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. No. de Série 10/043.440 depositado em 10 de janeiro de 2002 e no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US02/00660 depositado em 10 de janeiro de 2002.

[00094] Outro método computacional para identificação e projeto de alterações metabólicas favorecendo produção biossintética de um produto é o sistema de modelagem e simulação metabólicas chamado SimPheny®. Este método e sistema computacional é descrito no, por exemplo, Pedido de Patente U.S. No. de Série 10/173.547 depositado em 14 de junho de 2002 e no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US03/18838 depositado em 13 de junho de 2003.

[00095] SimPheny® é um sistema computacional que pode ser usado para produzir um modelo de sistema in silico e estimular o fluxo de massa, energia ou carga através das reações químicas de um sistema biológico para definir um espaço de solução que contém qualquer uma e todas as funcionalidades possíveis das reações químicas no sistema, deste modo determinando uma faixa de atividades permitidas para o sistema biológico. Esta abordagem é referida como modelagem baseada em restrição porque o espaço de solução é definido por restrições tal como a estequiometria conhecida das reações conhecidas bem como restrições termodinâmicas e de capacidade de reação associadas com fluxos máximos através das reações. O espaço definido por essas restrições pode ser interrogado para determinar as capacidades e o comportamento fenotípico do sistema biológico ou de seus componentes bioquímicos. Métodos de análise tais como análise convexa, programação linear e o cálculo de cursos extremos conforme descrito, por exemplo, em Schilling e outros, J. Theor. Biol., 203:229-248 (2000); Schilling e outros, Biochem. Bioeng., 71:286-306 (2000) e Schilling e outros, Biotech. Prog., 15:288-295 (1999), podem ser usados para determinar tais capacidades fenotípicas. Conforme descritos nos Exemplos abaixo, esta metodologia computacional foi usada para identificar e analisar a possibilidade bem como os cursos biossintéticos de 4-HB ótimos em organismos microbianos de não-produção de 4-HB.

[00096] Conforme acima descrito, um método baseado em restrições usado nos programas computacionais aplicável à invenção é análise de equilíbrio de fluxo. Análise de equilíbrio de fluxo é baseada em equilíbrio de fluxo em uma condição de estado uniforme e pode ser realizada conforme descrito em, por exemplo, Varma e Palsson, Biotech. Bioeng., 12:994-998 (1994). Abordagens de equilíbrio de fluxo têm sido aplicadas a sistemas de reação para simular ou prever propriedades sistêmicas de, por exemplo, metabolismo de adipócito conforme descrito em Fell e Small, J. Biochem., 138:781-786 (1986), secreção de acetato a partir de E. coli sob condições de maximização de ATP conforme descrito em Majewski e Domach, Biotech. Bioeng., 35:732-738 (1990) ou secreção de etanol por levedura conforme descrito em Vanrolleghem e outros, Biotech. Prog., 12:434-448 (1996). Adicionalmente, esta abordagem pode ser usada para prever ou simular o crescimento de E. coli em uma variedade de fontes de carbono único em como o metabolismo de H. influenza conforme descrito em Edwards e Palsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:5528-5533 (2000), Edwards e Palsson, J. Biol. Chem., 274:17410-17416 (1999) e Edwards e outros, Nature Biotech., 19:125-130 (2001).

[00097] Uma vez o espaço de solução tendo sido definido, ele pode ser analisado para determinar possíveis soluções sob várias condições. Esta abordagem computacional está de acordo com realidades biológicas porque sistemas biológicos são flexíveis e podem atingir o mesmo resultado de muitas maneiras diferentes. Sistemas biológicos são projetados através de mecanismos evolucionários que têm sido restritos por restrições fundamentais que todos os sistemas vivos têm que enfrentar. Desta maneira, estratégia de modelagem baseada em restrições compreende essas realidades gerais. Ainda, a habilidade em impor continuamente restrições adicionais a um modelo de sistema através do reforço de restrições resulta em uma redução no tamanho do espaço de solução, desta maneira fortalecendo a precisão com a qual o desempenho fisiológico ou fenótipo pode ser previsto.

[00098] Dados os ensinamentos e a orientação providos aqui, aqueles versados na técnica serão capazes de aplicar várias estruturas computacionais para modelagem e simulação metabólicas para projetar e implementar biossíntese de 4-HB, BDO, GBL, THF e outros compostos da família BDO em organismos microbianos hospedeiros outros que não E. coli e levedura. Tais métodos de modelagem e simulação metabólicas incluem, por exemplo, os sistemas computacionais exemplificados acima como SimPheny® e OptKnock. Para ilustração da invenção, alguns métodos são descritos aqui com referência à estrutura computacional do OptKnock para modelagem e simulação. Aqueles versados na técnica saberão como aplicar a identificação, projeto e implementação das alterações metabólicas usando OptKnock a quaisquer outras estruturas e métodos computacionais de modelagem e simulação metabólicas bem conhecidos na técnica.

[00099] A habilidade de uma célula ou organismo em produzir biossinteticamente um produto bioquímico pode ser ilustrada no contexto dos limites de produção bioquímica de sistema metabólico típico calculados usando um modelo in silico. Esses limites são obtidos através do estabelecimento da(s) taxa(s) de absorção do(s) substrato(s) limitantes para o(s) seu(s) valor(es) experimentalmente medido(s) e cálculo das taxas máxima e mínima de produção bioquímica em cada nível de crescimento atingível. A produção de um agente bioquímico desejado geralmente está em competição direta com formação de biomassa para recursos intracelulares. Sob essas circunstâncias, taxas maiores de produção bioquímica vão necessariamente resultar em taxas de crescimento submáximas. Os knockouts sugeridos pelos programas de modelagem e simulação metabólicos tal como OptKnock são projetados para restringir os limites de solução permissíveis forçando uma mudança em comportamento metabólico da cepa do tipo selvagem. Embora os limites de solução reais para uma dada cepa vão expandir ou contrair conforme a(s) taxa(s) de absorção de substrato aumenta(m) ou diminui(em), cada ponto experimental vai se encontrar dentro de seu limite de solução calculado. Gráficos tais como esses permitem previsões precisas de quão próximas essas cepas projetadas estão de seus limites de desempenho que também indica quanto espaço há para aperfeiçoamento.

[000100] A estrutura matemática do OptKnock é exemplificada aqui para deleções de gene de localização precisa levando à biossíntese de produto e, particularmente, biossíntese de produto acoplada a crescimento. O procedimento se baseia em modelagem metabólica baseada em restrição que estreita a faixa de fenótipos possíveis que um sistema celular pode mostrar através de imposição sucessiva de restrições físico-químicas administradas, Price e outros, Nat. Rev. Microbiol., 2:886-97 (2004). Conforme acima descrito, modelos e simulações baseados em restrições são bem conhecidos na técnica e geralmente evocam a otimização de um objetivo celular particular, submetido à estequiometria de rede, para sugerir uma distribuição de fluxo similar.

[000101] Resumidamente, a maximização de um objetivo celular quantificado como um fluxo de reação de agregado para um sistema metabólico de estado uniforme compreende um conjunto N = {1,...,N} de metabolitos e um conjunto M = {1,...,M} de reações metabólicas é expresso matematicamente como segue: em que Sij é o coeficiente estequiométrico de metabolito i na reação j, vj é o fluxo de reação j, vabsorção_ substrato representa a(s) taxa(s) de reação suposta(s) ou medida(s) do(s) substrato(s) limitante(s) e vatp_main é a necessidade de manutenção de ATP associada com não- crescimento. O vetor v inclui ambos os fluxos interno e externo. Neste estudo, o objetivo celular é frequentemente suposto ser um enxugamento de precursores biossintéticos nas razões requeridas para formação de biomassa, Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2a ed. 1996, Washington, D.C.: ASM Press. 2 v. (xx, 2822, lxxvi ). Os fluxos são geralmente relatados por 1 gDW.h (grama de peso seco vezes hora) de modo que a formação de biomassa seja expressa como g de biomassa produzida/gDW.h ou l/h.

[000102] A modelagem de deleções de gene, e então eliminação de reação, primeiro emprega a incorporação de variáveis binárias na estrutura de abordagem baseada em restrição, Burgard e outros, Biotechnol. Bioeng., 74:364-375 (2001), Burgard e outros, Biotechnol. Prog., 17:791-797 (2001). Essas variáveis binárias,

[000103] supondo um valor de 1 se a reação j for ativa e um valor de 0 se ela for inativa. A restrição que segue,

[000104] assegura que o fluxo de reação vj seja ajustado para zero apenas se a variável yj for igual a zero. Alternativamente, quando yj é igual a um, vj é livre para assumir qualquer valor entre uma ligação vjmin inferior e um vjmax superior. Aqui, Vjmin e Vjmax são identificados através da minimização e maximização, respectivamente, de cada fluxo de reação submetido às restrições de sistema descritas acima, Mahadevan e outros, Metab. Eng., 5:264-76 (2003).

[000105] Inativações de gene/reação ótimas são identificadas resolvendo um problema de otimização de dois níveis que escolhe o conjunto de reações ativas (yj = 1) de modo que uma solução de crescimento ótima para o sistema resultante produz em excesso a química de interesse. Matematicamente, o problema de otimização de dois níveis é expresso como o problema de otimização mista-inteira que segue: em que vquímica é a produção do produto-alvo desejado, por exemplo, succinato ou outro produto bioquímico, e K é o número de knockouts permissíveis. Note que o ajuste K igual a zero retorna para a solução de biomassa máxima do sistema completo, enquanto o ajuste K igual a um identifica a inativação de gene/reação única (yj = 0) de modo que o sistema resultante envolva a produção em excesso máxima dado seu rendimento de biomassa máximo. A restrição final assegura que o sistema resultante satisfaça um rendimento de biomassa mínimo. Burgard e outros, Biotechnol. Bioeng., 84:647-57 (2003), proveem uma descrição mais detalhada da formulação do modelo e do procedimento de solução. Problemas contendo centenas de variáveis binárias podem ser resolvidos na ordem de minutos a horas usando CPLEX 8.0, GAMS: The Solver Manuals, 2003: GAMS Development Corporation, acessado através do GAMS, Brooke e outros, GAMS Development Corporation (1998), ambiente de modelagem uma estação de trabalho IBM RS6000-270. A estrutura de trabalho do OptKnock já foi capaz de identificar estratégias de deleção de gene promissoras para produção em excesso bioquímica, Burgar e outros, Biotechnol. Bioeng., 84:647-57 (2003), Pharkya e outros, Biotechnol. Bioeng., 84:887-899 (2003) e estabelece uma estrutura de trabalho sistemática que vai naturalmente compreender aperfeiçoamentos futuros em estruturas de trabalho de modelagens metabólica e reguladora.

[000106] Qualquer solução do problema de OptKnock de dois níveis descrito vai prover um conjunto de reações metabólicas para romper. Eliminação de cada reação dentro do conjunto ou modificação metabólica pode resultar em 4-HB ou BDO como um produto obrigatório durante a fase de crescimento do organismo. Devido ao fato das reações serem conhecidas, uma solução do problema do OptKnock de dois níveis também vai prover o gene ou genes associados codificando uma ou mais enzimas que catalisam cada reação dentro do conjunto de reações. Identificação de um conjunto de reações e seus genes correspondentes codificando as enzimas que participam em cada reação é geralmente um processo automatizado, realizado através de correlação das reações com um banco de dados de reação tendo uma relação entre enzimas e genes de codificação.

[000107] Uma vez identificado, o conjunto de reações que devem ser rompidas a fim de realizar produção de 4-HB ou BDO é implementado na célula ou organismo-alvo através de rompimento funcional de pelo menos um gene codificando cada reação metabólica dentro do conjunto. Um meio particularmente útil para obter rompimento funcional do conjunto de reação é através de deleção de cada gene de codificação. No entanto, em alguns casos, pode ser benéfico romper a reação através de outras aberrações genéticas incluindo, por exemplo, mutação, deleção de regiões reguladoras tais como sítios de ligação de promotores ou cis para fatores de regulagem ou através de truncamento da sequência de codificação em qualquer um de vários locais. Essas últimas aberrações, resultando em menos do que a deleção total do conjunto de gene, podem ser úteis, por exemplo, quando avaliações rápidas do acoplamento de succinato são desejadas ou quando reversão genética é menos provável de acontecer.

[000108] Para identificar soluções produtivas adicionais para o problema de OptKnock de dois níveis descrito acima que levou conjuntos adicionais de reações a rompimento ou modificações metabólicas que podem resultar na biossíntese, incluindo biossíntese acoplada a crescimento de 4-HB ou outro produto bioquímico, um método de otimização, chamado cortes inteiros, pode ser implementado. Este método prossegue através de resolução iterativamente do problema OptKnock exemplificado acima com a incorporação de uma restrição adicional referida como um corte inteiro em cada iteração. Restrições de corte inteiro previnem efetivamente o procedimento de solução da escolha do mesmo conjunto exato de reações identificadas em qualquer iteração anterior que obrigatoriamente acopla biossíntese de produto a crescimento. Por exemplo, se uma modificação metabólica acoplada a crescimento previamente identificada especifica reações 1, 2 e 3 para rompimento, então a restrição que segue previne as mesmas reações de serem simultaneamente consideradas em soluções subsequentes: y1 + y2 + y3 > 1. O método de corte inteiro é bem conhecido no campo e pode ser encontrado descrito em, por exemplo, referência, Burgard e outros, Biotechnol. Prog., 17:791-797 (2001). Como com todos os métodos descritos aqui com referência ao seu uso em combinação com a estrutura computacional do OptKnock para modelagem e simulação metabólicas, o método do corte inteiro de redução de redundância em análise computacional iterativa pode ser também aplicado com outras estruturas computacionais bem conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, SimPheny®.

[000109] Restrições da forma acima precludem identificação de conjuntos de reação maiores que incluem conjuntos previamente identificados. Por exemplo, emprego do método de otimização de corte inteiro acima em uma iteração adicional precludiria identificação de um conjunto de reação quádruplo que especificou reações 1, 2 e 3 para rompimento uma vez que essas reações tinham sido previamente identificadas. Para assegurar identificação de todos os conjuntos de reação possíveis levando à produção biossintética de um produto, uma modificação no método de corte inteiro pode ser empregada.

[000110] Resumidamente, o procedimento de corte inteiro modificado começa com a iteração "zero" que calcula a produção máxima do agente bioquímico desejado em crescimento ótimo para um sistema do tipo selvagem. Este cálculo corresponde a uma solução OptKnock com K igualando a zero.

[000111] Em seguida, knockouts únicos são considerados e os dois conjuntos de parâmetro, objstoreiter e ystoreiter, j, são introduzidos para armazenar a função objetiva (Vquímico) e informação on-off de reação (yj), respectivamente, em cada iteração, iter. As restrições que seguem são então sucessivamente adicionadas à formulação de OptKnock em cada iteração.

[000112] Na equação acima, ε e M são números grande e pequeno, respectivamente. Em geral, ε pode ser ajustado em cerca de 0,01 e M pode ser ajustado em cerca de 1000. No entanto, números menores e/ou maiores do que esses números podem ser também usados. M assegura que a restrição possa ser ligada apenas por estratégias Knockout previamente identificadas, enquanto ε assegura que adição de knockouts a uma estratégia previamente identificada deve levar a um aumento de pelo menos ε em produção bioquímica em crescimento opcional. A abordagem vai para deleções duplas sempre que uma estratégia de deleção única falhar em melhorar na cepa do tipo selvagem. Deleções triplas são então consideradas quando nenhuma estratégia de deleção dupla melhora na cepa do tipo selvagem, e assim por diante. O resultado final é uma lista de classificação, representada como produção bioquímica desejada em crescimento ótimo, de estratégias de deleção distintas que diferem umas das outras em pelo menos uma inativação. Este procedimento de otimização bem como a identificação de uma ampla variedade de conjuntos de reações que, quando rompidas, levam à biossíntese, incluindo produção acoplada a crescimento, de um produto bioquímico. Dados os ensinamentos e orientação providos aqui, aqueles versados na técnica vão compreender que os métodos e projetos de engenharia metabólica exemplificados aqui são igualmente aplicáveis para identificar novos cursos biossintéticos e/ou para o acoplamento obrigatório de crescimento de célula ou micro-organismo a qualquer produto bioquímico.

[000113] Os métodos exemplificados acima e ilustrados mais nos Exemplos abaixo permitem a construção de células e organismos que produzem biossinteticamente, incluindo produção acoplada obrigatória de um produto bioquímico alvo a crescimento da célula ou organismo engenheirado para carregar as alterações genéticas identificadas. Com relação a isso, alterações metabólicas foram identificadas, as quais resultam na biossíntese de 4-HB e 1,4-butanodiol. Linhagens de micro-organismo construídas com as alterações metabólicas identificadas produzem níveis elevados de 4-HB ou BDO comparado com organismos microbianos não-modificados. Essas cepas podem ser beneficamente usadas para a produção comercial de 4-HB, BDO, THF e GBL, por exemplo, em processo de fermentação contínua sem serem submetidas a pressões seletivas negativas.

[000114] Desta maneira, os métodos computacionais descritos aqui permitem a identificação e implementação de modificações metabólicas que são identificadas através de um método in situ selecionado do OptKnock ou SimPheny. O conjunto de modificações metabólicas pode incluir, por exemplo, adição de uma ou mais enzimas de via biossintética e/ou rompimento funcional de uma ou mais reações metabólicas incluindo, por exemplo, rompimentos através de deleção de gene.

[000115] Aplicação do método OptKnock para identificar cursos adequados para produção acoplada a crescimento de 1,4-butanodiol (BDO) é descrita nos Exemplos V-VII. Conforme acima discutido, a metodologia OptKnock foi desenvolvida sob a premissa que sistemas microbianos mutantes podem se desenvolver em direção a seus fenótipos de crescimento máximo computacionalmente previstos quando submetidos a períodos longos de seleção de crescimento. Em outras palavras, a abordagem potencializa a habilidade de um organismo em auto-otimizar sob pressões seletivas. A estrutura de trabalho OptKnock permite a enumeração exaustiva de combinações de deleção de gene que forçam um acoplamento entre produção bioquímica e crescimento celular com base em estequiometria de sistema. A identificação de knockouts de gene/reação ótimas requer a solução de um problema de otimização de dois níveis que escolhe o conjunto de reações ativas de modo que uma solução de crescimento ótima para a rede resultante produz em excesso o agente bioquímico de interesse (Burgard e outros, Biotechnol. Bioeng., 84:647-657 (2003)).

[000116] Produção bioquímica acoplada a crescimento pode ser visualizada no contexto dos limites de produção química de um sistema metabólico típico. Esses limites são obtidos a partir de um modelo metabólico in silico através do estabelecimento da(s) taxa(s) de absorção do(s) substrato(s) limitante(s) para o(s) seu(s) valor(es) experimentalmente medidos e cálculo das taxas máxima e mínima de produção bioquímica em cada nível de crescimento atingível. Os envelopes de produção agrupam essencialmente o que é possível ao compreender todos os fenótipos biológicos potenciais disponíveis para uma dada cepa. Embora exista exceção, tipicamente a produção de um agente bioquímico desejado está em competição direta com formação de biomassa quanto a recursos intracelulares (vide Figura 5, região cinza). Então, rendimentos bioquímicos altos vão necessariamente resultar em crescimento submáximo. Ainda, a aplicação de pressões seletivas de crescimento pode dirigir o desempenho de uma cepa de produção não-acoplada a crescimento para um fenótipo de baixa produção (ponto A, Figura 5), sem importar seu ponto de partida inicial. Os knockouts sugeridos pelo OptKnock são projetados para restringir o limite de solução permissível, forçando uma mudança em comportamento metabólico conforme mostrado na Figura 5 (região ciano). Abordagens de engenharia evolucionárias podem então ser aplicadas para dirigir o desempenho de uma cepa projetada por OptKnock para o limite mais à direita. Isto vai resultar em uma cepa de produção alta que deve ser inerentemente estável a pressões seletivas de crescimento adicionais (ponto B, Figura 5).

[000117] Um modelo estequiométrico in silico de metabolismo de E. coli foi empregado para identificar genes essenciais para cursos metabólicos conforme exemplificado anteriormente e descrito nas, por exemplo, publicações de patente U.S. 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 e US 2004/0009466 e na Patente U.S. No. 7.127.379. Conforme aqui descrito, a estrutura de trabalho matemática do OptKnock foi aplicada para localizar com precisão deleções de gene levando à produção acoplada a crescimento de BDO (vide Exemplos V-VII). As estratégias foram inicialmente determinadas empregando um modelo reduzido do sistema de trabalho metabólico de E. coli. Este modelo "pequeno" captura as funcionalidades metabólicas-chave no sistema, então eliminando a redundância associada aos sistemas metabólicos de escala de genoma. Deve ser tomado cuidado para assegurar que o modelo não tenha sido reduzido para o ponto onde cursos potencialmente ativos possuindo alvos viáveis foram negligenciados. No geral, o modelo reduzido continha 262 reações e sua implementação reduziu tempo de CPU de OptKnock aproximadamente dez vezes quando comparado com a aplicação de OptKnock ao modelo de E. coli de escala de genoma (Reed e outros, Genome Biol., 4:R54 (2003)).

[000118] Ainda, a solução do problema do OptKnock de dois níveis provê apenas um conjunto de deleções. Para enumerar todas as soluções significativas, isto é, todos os conjuntos de knockouts que levam à formação de produção acoplada a crescimento, uma técnica de otimização, chamada cortes inteiros, pode ser implementada. Isto implica resolver iterativamente o problema OptKnock com a incorporação de uma restrição adicional referida como corte inteiro em cada iteração, conforme acima discutido.

[000119] Para vias bioquímicas para 1,4-butanodiol, a conversão de glicose em BDO em E. coli é esperada derivar de um total de três etapas de redução intracelular a partir de semialdeído succinato (vide Figura 6). Semialdeído succinato é nativamente produzido por E. coli através do intermediário de ciclo TCA, alfa-cetoglutarato, através da ação de duas enzimas, glutamato:semialdeído succínico transaminase e glutamato descarboxilase. Uma via alternativa usada pelo anaeróbio forçado Clostridium kluyveri para degradar succinato, ativa succinato em succinil-CoA e então converte succinil-CoA em semialdeído succínico usando uma semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA (Sohling e Gottschalk, Eur. J. Biochem., 212:121127 (1993)). A conversão de semialdeído succinato em BDO primeiro requer a atividade de 4-hidroxibutanoato (4-HB) desidrogenase, uma enzima que não é nativa para E. coli ou levedura mas é encontrada em várias bactérias tais como C. kluyveri e Ralstonia eutropha (Lutke- Eversloh e Steinbuchel, FEMS Microbiol. Lett. 181:63-71 (1999); Sohling e Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996); Valentin e outros, Eur. J. Biochem. 227:43-60 (1995); Wolff e Keneali, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)). Precedente para a conversão de 4-HB em BDO foi demonstrado no anaeróbio absoluto, Clostridium acetobutilicum, que quando alimentado 4-HB, foi mostrado produzir quantitativamente BDO (Jewell e outros, Current Microbiology, 13:215219 (1986)). As biotransformações requeridas de 4-HB em BDO são supostas ser similares àquelas da conversão de ácido butírico em butanol comum para espécie Clostridia que prossegue através de um derivado de CoA (Girbal e outros, FEMS Microbiology Reviews, 17:287-297 (1995)).

[000120] Em uma modalidade adicional, a invenção provê um microorganismo de ocorrência não-natural compreendendo um ou mais rompimentos de gene, o um ou mais rompimentos de gene ocorrendo em genes codificando uma enzima obrigatória para acoplamento da produção de 1,4-butanodiol ao crescimento do micro-organismo quando o rompimento do gene reduz uma atividade da enzima, com o que o um ou mais rompimentos de gene conferem produção acoplada a crescimento estável de 1,4-butanodiol ao micro-organismo de ocorrência não-natural. O um ou mais rompimentos de gene podem, por exemplo, ser aqueles descritos na Tabela 6 ou 7. O um ou mais rompimentos de gene podem compreender uma deleção de um ou mais genes, tais como aqueles genes descritos na Tabela 6 ou 7.

[000121] Conforme aqui descrito, o micro-organismo de ocorrência não-natural pode ser uma bactéria, levedura ou fungo. Por exemplo, o micro-organismo de ocorrência não-natural pode ser uma bactéria tal como Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas putida. O micro-organismo de ocorrência não-natural pode ser também uma levedura tal como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromices lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger e Pichia pastoris.

[000122] Um micro-organismo de ocorrência não-natural da invenção pode compreender um conjunto de modificações metabólicas obrigatórias para acoplamento da produção de 1,4-butanodiol a crescimento do micro-organismo, o conjunto de modificações metabólicas compreendendo rompimento de um ou mais genes selecionados do conjunto de genes compreendendo adhE, ldhA, pflAB; adhE, ldhA, pflAB, mdh; adhE, ldhA, pflAB, mdh, mqo; adhE, ldhA, pflAB, mdh, aspA; adhE, mdh, ldhA, pflAB, sfcA; adhE, mdh, ldhA, pflAB, maeB; adhE, mdh, ldhA, pflAB, sfcA, maeB; adhE, ldhA, pflAB, mdh, pntAB; adhE, ldhA, pflAB, mdh, gdhA; adhE, ldhA, pflAB, mdh, pikA, pikF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW; and adhE, ldhA, pflAB, mdh, pikA, pikF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC, gsk, ou um ortólogo do mesmo, em que o micro-organismo exibe produção acoplada a crescimento estável de 1,4-butanodiol.

[000123] Em uma modalidade, a invenção provê um microorganismo de ocorrência não-natural compreendendo um conjunto de modificações metabólicas obrigatórias para acoplamento de produção de 1,4-butanodiol a crescimento de micro-organismo, o conjunto de modificações metabólicas compreendendo rompimento de um ou mais genes, ou um ortólogo do mesmo, em que o conjunto de modificações metabólicas compreende rompimento de adhE e ldhA, em que o micro-organismo exibe produção de 1,4-butanodiol acoplada a crescimento estável. Em uma modalidade adicional, o conjunto de modificações metabólicas pode compreender ainda rompimento de mdh. Em outra modalidade, o conjunto de modificações metabólicas pode compreender ainda rompimento de um ou mais genes selecionados do conjunto de genes compreendendo mqo, aspA, sfcA, maeB, pntAB e gdhA e pode incluir, por exemplo, rompimento de sfcA e maeB. Em ainda outra modalidade, o conjunto de modificações metabólicas pode compreender ainda rompimento de um ou mais genes selecionados do conjunto de genes compreendendo pykA, pikF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC e gsk, incluindo o rompimento de todos de pikA, pikF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE e ycdW, e pode compreender ainda rompimento de prpC e gsk. Qualquer uma do conjunto acima descrito de modificações metabólicas pode compreender ainda rompimento de pflAB. Em uma modalidade particular, o conjunto de modificações metabólicas compreende rompimento de um ou mais genes selecionados do conjunto de genes compreendendo adhE, ldhA, pflAB, mdh e aspA.

[000124] Um micro-organismo de ocorrência não-natural da invenção pode compreender ainda uma via biossintética de 1,4-butanodiol (BDO) compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando 4-hidroxiutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, 4- hidroxibutirato:CoA transferase, glutamato: semialdeído succínico transaminase, glutamato descarboxilase, aldeído desidrogenase independente de CoA, aldeído desidrogenase dependente de CoA ou álcool desidrogenase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades suficientes para produzir 1,4-butanodiol (BDO), conforme aqui descrito.

[000125] A invenção provê ainda um método de produção de um micro-organismo de ocorrência não-natural tendo produção acoplada a crescimento estável de 1,4-butanodiol através da identificação in silico de um conjunto de modificações metabólicas requerendo produção de 1,4-butanodiol durante crescimento exponencial sob um conjunto definido de condições e modificação genética de um micro-organismo para conter o conjunto de modificações metabólicas requerendo produção de 1,4-butanodiol. Tais métodos podem incluir ainda a adição de genes exógenos expressando atividades de enzima desejadas a um micro-organismo. Tal conjunto de modificações metabólicas pode ser identificado através de um método in silico selecionado de OptKnock ou SimPheny (vide acima e Exemplos VVII).

[000126] A invenção provê ainda um micro-organismo produzido através dos métodos descritos aqui. Ainda, a invenção provê um método de produção de 1,4-butanodiol acoplado a crescimento de um micro-organismo. O método pode incluir as etapas de cultura sob fase de crescimento exponencial em uma quantidade suficiente de nutrientes e meios de um micro-organismo de ocorrência não-natural compreendendo um conjunto de modificações metabólicas acoplando obrigatoriamente produção de 1,4-butanodiol a crescimento do microorganismo, em que o micro-organismo exibe produção acoplada a crescimento estável de 1,4-butanodiol, e isolamento do 1,4-butanodiol produzido a partir do micro-organismo de ocorrência não-natural. O conjunto de modificações metabólicas compreendendo rompimento de um ou mais genes pode ser selecionado de um conjunto de genes compreendendo adhE, ldhA, pflAB; adhE, ldhA, pflAB, mdh; adhE, ldhA, pflAB, mdh, mqo; adhE, ldhA, pflAB, mdh, aspA; adhE, mdh, ldhA, pflAB, sfcA; adhE, mdh, ldhA, pflAB, maeB; adhE, mdh, ldhA, pflAB, sfcA, maeB; adhE, ldhA, pflAB, mdh, pntAB; adhE, ldhA, pflAB, mdh, gdhA; adhE, ldhA, pflAB, mdh, pikA, pikF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW; and adhE, ldhA, pflAB, mdh, pikA, pikF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC, gsk ou um ortólogo do mesmo.

[000127] Em uma modalidade, a invenção provê um método de produção de 1,4-butanodiol acoplada ao crescimento de um microorganismo. O método pode incluir as etapas de cultura sob fase de crescimento exponencial em uma quantidade suficiente de nutrientes e meios de um micro-organismo de ocorrência não-natural compreendendo um conjunto de modificações metabólicas obrigatoriamente acoplando produção de 1,4-butanodiol a crescimento do micro-organismo, o conjunto de modificações metabólicas compreendendo rompimento de um ou mais genes, ou um ortólogo dos mesmos, em que o conjunto de modificações metabólicas compreende rompimento de adhE e ldhA, em que o micro-organismo exibe produção de 1,4-butanodiol acoplada a crescimento estável; e isolamento do 1,4-butanodiol produzido a partir do micro-organismo de ocorrência não-natural. Em uma modalidade adicional, o conjunto de modificações metabólicas pode compreender ainda rompimento de mdh. Em outra modalidade, o conjunto de modificações metabólicas pode compreender ainda rompimento de um ou mais genes selecionados do conjunto de genes compreendendo mqo, aspA, sfcA, maeB, pntAB e gdhA e pode incluir, por exemplo, rompimento de sfcA e maeB. Em ainda outra modalidade, o conjunto de modificações metabólicas pode compreender ainda rompimento de um ou mais genes selecionados do conjunto de genes compreendendo pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC e gsk, incluindo rompimento de todos os pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE e ycdW, e pode ainda compreender rompimento de prpC e gsk. Qualquer uma do conjunto acima descrito de modificações metabólicas pode compreender ainda rompimento de pflAB.

[000128] Em um método de produção de BDO, o micro-organismo de ocorrência não-natural pode compreender ainda uma via biossintética de 1,4-butanodiol (BDO) compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferase, glutamato:semialdeído succínico transaminase, glutamato descarboxilase, aldeído desidrogenase independente de CoA, aldeído desidrogenase dependente de CoA ou álcool desidrogenase, em que o ácido nucleico exógeno é expresso em quantidades suficientes para produzir 1,4-butanodiol (BDO).

[000129] É compreendido que modificações que não afetem substancialmente a atividade das várias modalidades da presente invenção são também incluídas na definição da invenção provida aqui. Desta maneira, os exemplos que seguem pretendem ilustrar, mas não limitar a presente invenção.

EXEMPLO 1 Biossíntese de Ácido 4-Hidroxibutanoico

[000130] Este Exemplo descreve os cursos bioquímicos para produção de 4-HB.

[000131] Relatos anteriores de síntese de 4-HB em micróbios focaram neste composto como um intermediário na produção do plástico biodegradável poli-hidroxialcanoato (PHA) (Patente U.S. N°. 6.117.658). O uso de copolímeros de 4-HB/3-HB pode ser vantajoso sobre o polímero de 3-hidroxibutirato (PHB) tradicional porque o plástico resultante é menos quebradiço (Saito e Doi, Intl. J. Biol. Macromol., 16:99-104 (1994)). A produção de 4-HB monomérico descrita aqui é um processo fundamentalmente diferente por várias razões: 1) O produto é secretado, oposto a PHA que é produzido intracelularmente e permanece na célula; 2) para organismos que produzem polímeros de hidroxibutanoato, 4-HB livre não é produzido, mas ao invés disso o derivado da Coenzima A é usado pela poliidroxialcanoato sintase; 3) no caso do polímero, formação do produto granular muda a termodinâmica; e 4) pH extracelular não é um problema para produção do polímero, visto que ele vai afetar se 4-HB está presente no estado de ácido livre ou base conjugada, e também o equilíbrio entre 4-HB e GBL.

[000132] 4-HB pode ser produzido em duas etapas de redução enzimática a partir de succinato, um metabolito central do ciclo de TCA, com semialdeído succínico como o intermediário (figura 2). A primeira dessas enzimas, semialdeído succínico desidrogenase, é nativa para muitos organismos incluindo E. coli, em que ambas as enzimas dependentes de NADH e NADPH foram encontradas (Donnelli e Cooper, Eur. J. Biochem. 113:555-561 (1981); Donnelli e Cooper, J. Bacteriol. 145:1425-1427 (1981); Marek e Henson, J. Bacteriol. 170:991-994 (1988)). Há também evidência apoiando atividade de semialdeído succínico desidrogenase em S. cerevisiae (Ramos e outros, Eur. J. Biochem., 149:401-404 (1985)) e um gene putativo foi identificado através de homologia de sequência. No entanto, a maioria dos relatórios indica que esta enzima prossegue na direção de síntese de succinato, oposto àquela mostrada na Figura 2 (Donnely e Cooper, supra; Lutke-Eversloh e Steinbuchel, FEMS Microbiol Lett., 181:63-71 (1999)), participando na via de degradação de 4-HB e gama-aminobutirato. Uma via alternativa, usada pelo anaeróbio forçado Clostridium kluyveri para degradar succinato, ativa succinato para succinil-CoA, então converte succinil-CoA em semialdeído succínico usando uma semialdeído succínico desidrogenase alternativa que é conhecida funcionar nesta direção (Sohling e Gottschalk, Eur. J. Biochem., 212:121-127 (1993)). No entanto, esta via tem o custo energético de ATP necessária para converter succinato em succinil-CoA.

[000133] A segunda enzima da via, 4-hidroxibutanoato desidrogenase, não é nativa para E. coli ou levedura mas é encontrada em várias bactérias tais como C. kluyveri e Ralstonia eutropha (Lutke-Eversloh e Steinbuchel, supra; Sohling e Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996); Valentin e outros., Eur. J. Biochem. 227:43-60 (1995); Wolff e Keneali, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)). Essas enzimas são conhecidas ser dependentes de NADH, embora formas dependentes de NADPH possam existir. Uma via adicional para 4-HB a partir de alfa-cetoglutarato foi demonstrado em E. coli resultando no acúmulo de ácido poli(4-hidroxibutírico) (Song e outros., Wei Sheng Wu Xue.Bao. 45:382-386 (2005)). A cepa recombinante necessitou da superexpressão de três genes heterólogos, PHA sintase (R. eutropha), 4-hidroxibutirato desidrogenase (R. eutropha) e 4-hidroxibutirato:CoA transferase (C. kluyveri), junto com dois genes de E. coli nativos: glutamato: semialdeído succínico transaminase e glutamato descarboxilase. As Etapas 4 e 5 na Figura 2 podem ser realizadas alternativamente por uma alfa- cetoglutarato descarboxilase tal como a identificada em Euglena gracilis (Shigeoka e outros, Biochem. J. 282(Pt2):319-323 (1992); Shigeoka e Nakano, Arch. Biochem. Biofis. 288:22-28 (1991); Shigeoka e Nakano, Biochem J. 292(Pt 2):463-467 (1993)). No entanto, esta enzima não foi ainda aplicada para impactar a produção de 4-HB ou polímeros relacionados em qualquer organismo.

[000134] A direcionalidade relatada de semialdeído succínico desidrogenase levou à investigação da termodinâmica do metabolismo de 4-HB. Especificamente, este estudo investigou se ou não as reações envolvidas na conversão de succinato ou succinil-CoA em 4- HB são termodinamicamente favoráveis (isto é, ΔGr < 0) sob as condições fisiológicas típicas presentes em E. coli e S. cerevisiae). Todas as reações de oxidação/redução foram supostas utilizar NADH, embora os resultados para suposição de utilização de NADPH fossem similares. Energias livres Gibbs padrão de formação (ΔGf0) foram calculadas para cada composto na Figura 2 com base no método de contribuição de grupo (Mavrovouniotis, M.L., J. Biol. Chem., 266: 14440-14445 (1991)). Cada energia Gibbs de formação padrão foi então transformada a fim de obter um critério de mudança espontânea em pressão, temperatura, pH e resistência iônica especificados (Alberty, R.A., Biochem. Biophys. Acta, 1207:1-11 (1994)) (equação 1). em que ΔGf0 é a energia Gibbs de formação padrão, NH é o número de átomos de hidrogênio no composto, R é a constate de gás universal, T é constante a 298K, z é a carga da molécula no pH de interesse, I é a resistência iônica em M e B é a constante igual a 1,6 L0,5/mol0,5.

[000135] A equação 1 revela que ambos o pH intracelular e a resistência iônica desempenham um papel na determinação de possibilidade termodinâmica. Normalmente, o pH intracelular de células é muito bem regulado, mesmo quando há grandes variações no pH da cultura. O pH intracelular de ambos E. coli e S. cerevisiae foi relatado na literatura. E. coli mantém um pH intracelular de 7,4-7,7 durante condições de crescimento típicas em tampões neutros, mas pode cair para 7,2 em meio de pH 6, e mesmo tão baixo quanto 6,9 para pH externo de 5 (Riondet e outros, Biotechnology Tech., 11:735738 (1997)). No entanto, crescimento de E. coli é severamente inibido em pH externo abaixo de 6. pH de levedura exibe mais variação. Durante fase de crescimento exponencial, o pH interno de S. cerevisiae foi medido estar na faixa de 6,7-7,0 com pH externo controlado a 5,0 (Dombek e Ingram, Appl. Environ. Microbiol., 53:12861291 (1987)). Por outro lado, em células em descanso o pH interno cai para abaixo de 6 quando o pH externo é 6 ou menos (Imai e Ohno, J. Biotechnol., 38:165-172 (1995)). Esta análise supõe um pH intracelular de 7,4 para E. coli e 6,8 para S. cerevisiae. Uma resistência iônica de 0,15 foi também suposta (Valenti e outros, supra).

[000136] Energias Gibbs de formação transformadas foram calculadas no estado padrão (pH = 7,0, I = 0) e em estados fisiológicos de E. coli (pH = 7,4, I = 0,15) e S. cerevisiae (pH = 6,8, I = 0,15). Energias Gibbs de reação transformadas (ΔGr') foram então calculadas tirando a diferença em ΔGf' entre os produtos e reagentes. As energias Gibbs transformadas das reações necessárias para converter succinato ou succinil-CoA em 4-HB são providas na Tabela 2. Note que o erro padrão, Uf,est, em ΔGf calculado pela teoria de contribuição de grupo é 4 kcal/mol. A incerteza em ΔGr, Ur,est, pode ser calculada como a norma Euclideana da incerteza para ΔGf de cada composto (Equação). mm em que n é o coeficiente estequiométrico e i é o composto. Para as reações examinadas, esta incerteza é da ordem de 8 kcal/mol.

[000137] Tabela 2. Energia de reação livre Gibbs (kcal/mol) em valores de pH e resistência iônica diferentes. A primeira coluna está sob condições padrão, enquanto as outras são ajustadas de acordo com a equação 1. A temperatura é constante a 298 K. Barras de erro para esses valores são da ordem de 8 kcal/mol, conforme calculado pela equação 2. Abreviações: suc, succinato; sucsa, semialdeído succínico; succoa, succinil-CoA; Pi, fosfato inorgânico.

[000138] A Tabela 2 revela que a reação mais provável de encontrar uma barreira termodinâmica após consideração de incerteza potencial nos cálculos da requerente é semialdeído succínico desidrogenase (etapa 1 na Figura 2). Se esta reação pode ser conduzida mais próximo da possibilidade termodinâmica através da variação das concentrações supostas dos metabolitos participantes foi também estudado. Por exemplo, as energias Gibbs padrão supõem concentrações de 1 M para todos os compostos participantes (exceto água). Em um ambiente anaeróbico, NADH estará presente em concentração várias vezes maior do que NAD. Supondo [NADH] = 5 x [NAD], foi calculado o efeito sobre ΔGr' usando a equação

[000139] Esta mudança resulta em uma diferença de apenas cerca de 1 kcal/mol nos valores delta G para semialdeído succínico desidrogenase. A equação 3 foi também usada para calcular outros efeitos sobre ΔGr, tal como concentração de succinato alta para dirigir as reações. Uma diferença de 1000 vezes nas concentrações de succinato e semialdeído succínico vai contribuir com cerca de 5 kcal/mol para delta G. Tomada junto com uma incerteza suposta de 8 kcal/mol, a possibilidade que semialdeído succínico desidrogenase vai operar na direção do semialdeído succínico sob algum conjunto de condições fisiológicas não pode ser eliminada. Então a requerente ainda considera a via direta de succinato para 4-HB na sua análise teórica subsequente.

[000140] As capacidades de produção microbiana de 4- hidroxibutirato foram exploradas em dois micróbios, Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae, usando modelos metabólicos in silico de cada organismo. Cursos potenciais para 4-HB prosseguiram através de um succinato, succinil-CoA ou intermediário alfa-cetoglutarato conforme mostrado na Figura 2.

[000141] A primeira etapa na via de produção de 4-HB a partir de succinato envolve a conversão de succinato em succinil semialdeído através de uma semialdeído succínico desidrogenase dependente de NADH ou NADPH. Em E. coli, gabD é uma semialdeído succínico desidrogenase dependente de NADP e é parte de um agrupamento de gene envolvido em absorção e degradação de 4-aminobutirato (Niegemann e outros, Arch. Microbiol., 160: 454-460 (1993); Schneider e outros, J. Bacteriol., 184:6976-6986 (2002)). sad é acreditado codificar a enzima para atividade de semialdeído succínico desidrogenase dependente de NAD (Marek e Heson, supra). S. cerevisiae contém apenas a semialdeído succínico desidrogenase dependente de NADPH, putativamente determinada UGA2, que se localiza no citosol (Huh e outros, Nature, 425:686-691 (2003)). Os cálculos de rendimento máximo supondo a via de succinato para 4-HB em ambos o E. coli e o S. cerevisiae requerem apenas a suposição que uma 4-HB desidrogenase não-nativa foi adicionada aos seus sistemas metabólicos.

[000142] A via de succinil-CoA para 4-hidroxibutirato foi descrita na Patente U.S. N°. 6.117.658 como parte de um processo da fabricação de poliidroxialcanoatos compreendendo unidades de monômero de 4- hidroxibutirato. Clostridium kluyveri é um organismo exemplar conhecido possuir atividade de semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA (Sohling e Gottschalk, supra; Sohling e Gottschalk, supra). Neste estudo, é suposto que esta enzima, de C. kluyveri e outros organismos, seja expressa em E. coli ou S. cerevisiae junto com uma 4-HB desidrogenase não-nativa ou heteróloga para completar a via de succinil-CoA em 4-HB. A via de alfa-cetoglutarato para 4-HB foi demonstrada em E. coli resultando no acúmulo de ácido poli(4-hidroxibutírico) para 30% de peso de célula seca (Song e outros, supra). Como E. coli e S. cerevisiae nativamente ou endogenamente possuem ambas a glutamato:semialdeído succínico transaminase e a glutamato descarboxilase (Coleman e outros, J. Biol. Chem., 276:244250 (2001)), a via de AKG para 4-HB pode ser completada em ambos os organismos supondo apenas que uma 4-HB desidrogenase não- nativa esteja presente.

EXEMPLO II Produção de Ácido 4-Hidroxibutanoico em E. coli'

[000143] Este Exemplo descreve os rendimentos biossintéticos para ácido 4-hidroxibutanoico resultante de cada via bioquímica.

[000144] Nesta seção, os rendimentos teóricos máximos de 4-HB a partir de glicose são calculados supondo que cada um dos três cursos metabólicos mostrados na Figura 2 seja funcional em E. coli. Um modelo metabólico de escala de genoma de E. coli, similar àquele descrito em Reed e outros, Genome Biol., 4:R54 (2003) foi usado como a base para a análise. O ganho de energia, em termos de moléculas de ATP produzidas, de cada via de rendimento máximo é calculado supondo condições anaeróbicas, a menos que de outro modo declarado. 4-Hidroxibutirato é suposto sair em E. coli através de transporte simultâneo de próton, como é o caso com a maioria dos ácidos orgânicos. É também possível que GBL seja secretado através de difusão simples, e neste caso os energéticos seriam mais favoráveis do que no caso considerado aqui. O impacto de especificidade de cofator (isto é, dependência de NADH ou NADPH) das enzimas participantes no rendimento máximo e energéticas de cada via foi também investigado.

[000145] Os resultados das análises são mostrados nas Tabelas 3 AC. A partir de um ponto de vista energético e de rendimento, a via de succinato para 4-HB é a mais promissora contanto que as questões termodinâmicas levantadas no Exemplo I possam ser superadas. Especificamente os cálculos revelam que o rendimento teórico máximo de 4-HB a partir de glicose é 1,33 mol/mol (0,77 g/g; 0,89 Cmol/Cmol) supondo que a via de succinato para 4-HB seja funcional. Ainda, a produção anaeróbica de 4-HB através de succinato resultaria na produção líquida ou de 1,8, 1,5 ou 1,1 mol de ATP por glicose dependendo da especificidade de cofator suposta das enzimas participantes. Esses rendimentos energéticos são comparáveis a 2,0 ATP por glicose que podem ser obtidos através de fosforilação no nível de substrato através da produção de etanol ou lactato sugerindo o potencial para produção de homo-4-HB anaeróbica em E. coli.

[000146] A via de succinil-CoA em 4-HB é a segunda via mais promissora quando considerando rendimento máximo e energética. Um rendimento de 1,33 mol/mol de 4-HB pode ser obtido em E. coli se pelo menos uma das etapas da via for suposta ser dependente de NADH. No entanto, devido ao fato desta via requerer a formação de succinil-CoA, seu rendimento energético é consideravelmente menor do que aquele da via de succinato. Uma necessidade de oxigênio é antecipada em rendimentos de 4-HB altos se ambas as etapas de semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA e 4-HB desidrogenase forem supostas ser dependentes de NADPH. Neste caso, a produção de 4-HB no rendimento máximo não resultaria em nenhum ganho de ATP líquido e poderia não apoiar as demandas de manutenção energética necessárias para sobrevivência de E. coli. Então, alguma energia teria que se originar de fosforilação oxidativa para permitir produção de 4-HB homofermentativa. A via de alfa- cetoglutarato para 4-HB é o menos favorável das três vias potenciais com um rendimento atingível máximo de 1,0 mol de 4-HB por mol de glicose. Em adição ao rendimento máximo menor, esta via requer a utilização de 1,5 mol de oxigênio por mol de glicose convertido em 4- HB. A energética desta via não é afetada pela especificidade de cofator suposta de 4-HB desidrogenase.

[000147] Tabela 3. A estequiometria de conversão de substrato geral em 4-HB supondo que as vias de produção de A) succinato, B) succinil-CoA ou C) alfa-cetoglutarato sejam funcionais em E. coli. Glicose e oxigênio são absorvidos enquanto todas as outras moléculas são produzidas. A) Via de Succinato

[000148] A fim de corroborar as previsões computacionais propostas neste relatório, as cepas expressando uma via completa para 4-HB podem ser construídas e testadas. Corroboração é realizada com ambas E. coli (Exemplo II) e S. cerevisiae (Exemplo III). Em E. coli, os genes relevantes são expressos em um opéron sintético por trás de um promotor induzível em um plasmídeo de cópia média ou alta; por exemplo, o promotor PBAD que é induzido por arabinose, em um plasmídeo da série pBAD (Guzman e outros, J. Bacteriol., 177:41214130 (1995)). Em S. cerevisiae, os genes são integrados nos cromossomos por trás do promotor PDC1, substituindo o gene da piruvato carboxilase nativo. Foi relatado que isto resulta em expressão maior de genes estrangeiros do que a partir de um plasmídeo (Ishida e outros, Appl. Environ. Microbiol., 71:1964-1970 (2005)), e vai também assegurar expressão durante condições anaeróbicas.

[000149] Células contendo os construtos relevantes são cultivadas em meios mínimos contendo glicose, com adição de arabinose no caso de E. coli contendo genes expressos sob o promotor PBAD. Amostras periódicas são obtidas para ambas as análises de expressão de gene e atividade enzimática. Ensaios de atividade de enzima são realizados em extratos de célula brutos usando procedimentos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, ensaios baseados na oxidação de NAD(P)H, que é produzido em todas as etapas de reação de desidrogenase e detectável através de espectrometria, podem ser utilizados. Ainda, anticorpos podem ser usados para detectar o nível de enzimas particulares. Em lugar de ou em adição às medições de atividade de enzima, RNA pode ser isolado de amostras paralelas e transcrito do gene de interesse medido através de PCR de transcriptase reversa. Quaisquer construtos sem expressão de transcrito detectável são novamente analisados para assegurar que os ácidos nucleicos de codificação sejam carregados em uma forma expressável. Onde transcritos são detectados, este resultado indica ou uma falta de tradução ou produção de enzima inativa. Uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica pode adicionalmente ser empregada, tal como otimização de códon, engenharia de um sítio de ligação de ribossomo forte, uso de um gene de uma espécie diferente e prevenção de N-glicosilação (para expressão de enzimas bacterianas em levedura) através de conversão de resíduos Asn em Asp. Uma vez todas as atividades de enzima requeridas sendo detectadas, a próxima etapa é medir a produção de 4-HP in vivo. Culturas em frasco de agitação em triplicata são cultivadas ou anaerobicamente ou microaerobicamente, dependendo das condições requeridas (vide acima), e amostras periódicas obtidas. Ácidos orgânicos presentes nos sobrenadantes de cultura são analisados através de HPLC usando a coluna Aminex AH-87X. O tempo de eluição de 4-HB será determinado usando um padrão comparado de um fornecedor de agente químico.

[000150] A via independente de CoA pode ser implementada e testada para corroboração. Neste caso, os genes superexpressos são a semialdeído succínico desidrogenase nativa de cada organismo e a 4-hidroxibutanoato desidrogenase de Ralstonia eutropha. Uma vez ambas as atividades de enzima sendo detectadas conforme acima discutido, as cepas são testadas quanto à produção de 4-HB. Corroboração pode ser também obtida a partir de implementação da via dependente de CoA. A semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA e a 4-hidroxibutanoato desidrogenase de Clostridium kluyveri são expressas conforme acima descrito. Ainda, superexpressão da succinil-CoA sintetase nativa pode ser também realizada, para canalizar mais succinato para a via heteróloga. Finalmente, se produção de 4-HB for desfavorável, condições de cultura diferentes podem ser testadas, tal como uma mudança em estado de oxigenação que pode manipular a razão de NAD(P)H/NAD(P).

EXEMPLO III Produção de Ácido 4-Hidroxibutanoico em Levedura

[000151] Este Exemplo descreve os rendimentos biossintéticos para ácido 4-hidroxibutanoico resultando de cada via bioquímica em S. cerevisiae.

[000152] Nesta seção, os rendimentos teóricos máximos de 4-HB a partir de glicose são calculados supondo que cada um dos três cursos metabólicos mostrados na Figura 2 seja funcional em S. cerevisiae. Um modelo metabólico de escala de genoma de S. cerevisiae, similar ao descrito em Forster e outros (Genome Res. 13:244-253 (2003)), foi usado como a base para a análise. O ganho energético de cada via de rendimento máximo é calculado supondo condições anaeróbicas a menos que de outro modo relatado. 4-Hidroxibutirato é suposto sair de S. cerevisiae através de transporte simultâneo de próton, como é o caso com a maioria dos ácidos orgânicos. O impacto de especificidade de cofator (isto é, dependência de NADH ou NADPH) das enzimas participantes sobre o rendimento máximo e energético de cada via foi também investigado.

[000153] Os resultados das análises são mostrados nas Tabelas 4 AC. Como com E. coli, a via de succinato para 4-HB é o mais promissora contanto que as questões de termodinâmica levantadas no Exemplo I possam ser superadas. Os cálculos revelam que o rendimento teórico máximo de 4-HB a partir de glicose é 1,33 mol/mol (0,77 g/g; 0,89 Cmol/Cmol) em S. cerevisiae. Ainda, a produção anaeróbica de 4-HB através de succinato resultaria na produção líquida ou de 1,4, 1,1 ou 0,5 mol de ATP por glicose dependendo da especificidade de cofator suposta das enzimas participantes.

[000154] A via de succinil-CoA em 4-HB é a segunda via mais favorável. Um rendimento máximo de 1,33 mol de 4-HB/mol de glicose pode ser obtido em S. cerevisiae sem importar a especificidade do cofator. No entanto, geração de energia líquida no rendimento teórico máximo é possível apenas se ambas as etapas de semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA e 4-HB desidrogenase forem supostas ser dependentes de NADH. Se uma etapa for dependente de NADPH, nenhuma ATP líquida será obtida a partir da produção de 4-HB anaeróbica e uma fonte de energia alternativa (por exemplo, fosforilação oxidativa) seria necessária para apoiar crescimento e manutenção celulares. A via da alfa-cetoglutarato para 4-HB é a menos favorável dos três cursos potenciais em S. cerevisiae, embora o rendimento máximo de 1,1-1,2 mol de 4-HB por mol de glicose fosse ligeiramente maior do que foi encontrado em E. coli. Não obstante, esta via requer uma absorção de oxigênio de 0,8-0,9 mol de oxigênio por mol de glicose para se tornar energeticamente neutro.

[000155] Tabela 4. A estequiometria de conversão de substrato geral para 4-HB em S. cerevisiae, supondo as vias de produção de A) succinato, B) succinil-CoA ou C) alfa-cetoglutarato sejam funcionais em S. cerevisiae. Glicose e oxigênio são absorvidos enquanto todas as outras moléculas são produzidas.

EXEMPLO IV Biossíntese de Ácido 4-Hidroxibutanoico, Y-Butirolactona e 1,4- Butanodiol

[000156] Este exemplo descreve a produção biossintética de ácido 4- hidroxibutanoico, Y-butirolactona e 1,4-butanodiol usando fermentação e outros bioprocessos.

[000157] Métodos para a integração da etapa de fermentação de 4- HB em um processo completo para a produção de GBL, 1,4-butanodiol (BDO) e tetraidrofurano (THF) purificados são descritos abaixo. Uma vez que 4-HB e GBL estão em equilíbrio, o caldo de fermentação vai conter ambos os compostos. Um pH baixo deste equilíbrio é mudado para favorecer GBL. Deste modo, a fermentação pode operar em pH 7,5 ou menos. Após remoção de biomassa, a corrente de produto entra em uma etapa de separação onde GBL é removido e a corrente restante enriquecida em 4-BH é reciclada. Finalmente, GBL é destilado para remover quaisquer impurezas. O processo opera em uma de três maneiras: 1) fermentação em batelada alimentada e separação em batelada; 2) fermentação em batelada alimentada e separação contínua; 3) fermentação contínua e separação contínua. Os dois primeiros desses dois modos são mostrados esquematicamente na Figura 4. Os procedimentos de fermentação integrados descritos abaixo são também usados para as células de produção de BDO da invenção para biossíntese de BDO e subsequente produtos da família BDO.

[000158] Protocolo de fermentação para produzir 4—HB/GBL (batelada): O organismo de produção é cultivado em um biorreator de 10L aspergido com uma mistura de N2/CO2 usando 5L de caldo contendo 5 g/L de fosfato de potássio, 2,5 g/L de cloreto de amônio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio e 30 g/L de água de maceração de milho e uma concentração de glicose inicial de 20 g/L. Conforme as células crescem e utilizam a glicose, mais glicose a 70% é alimentada ao biorreator em uma taxa aproximadamente equilibrando consumo de glicose. A temperatura do biorreator é mantida em 30 graus C. O crescimento continua por aproximadamente 24 horas, até que 4-HB atinja uma concentração entre 20-200 g/L, com a densidade celular estando entre 5 e 10 g/L. O pH não é controlado, e vai tipicamente diminuir para pH 3-6 mais ou menos no final da atividade. Quando do término do período de cultivo, os teores do fermentador são passados por uma unidade de separação de célula (por exemplo, centrífuga) para remover células e restos de célula, e o caldo de fermentação é transferido para uma unidade de separação de produto. Isolamento de 4-HB e/ou GBL aconteceria através de procedimentos de separação padrão empregados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tal como extração líquido-líquido usando um solvente orgânico não-miscível em água (por exemplo, tolueno) para prover uma solução orgânica de 4-HB/GBL. A solução resultante é então submetida a métodos de destilação padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e prover GBL (ponto de ebulição 204205°C) que é isolado como um líquido purificado.

[000159] Protocolo de fermentação para produzir 4-HB/GBL (integralmente contínuo): O organismo de produção é primeiro cultivado em modo em batelada usando aparelho e composição de meio descritos acima, exceto que a concentração de glicose inicial é 30-50 g/L. Quando a glicose é exaurida, meio de alimentação da mesma composição é fornecido continuamente em uma taxa entre 0,5 L/h e 1 L/h, e líquido é retirado na mesma taxa. A concentração de 4- HB no biorreator permanece constante a 30-40 g/L, e a densidade celular permanece constante entre 3-5 g/L. A temperatura é mantida em 30 graus C e o pH é mantido em 4,5 usando NaOH e HCl concentrados, conforme necessário. O biorreator é operado continuamente por um mês, com amostras obtidas todo dia para assegurar consistência de concentração de 4-HB. Em modo contínuo, os teores do fermentador são constantemente removidos conforme um meio de alimentação novo é fornecido. A corrente de saída, contendo células, meio e produtos 4-HB e/ou GBL, é então submetida a um procedimento de separação de produto contínuo, com ou sem células de remoção e restos de célula, e aconteceria através de métodos de separação contínuos padrão empregados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tal como extração líquido-líquido contínua usando um solvente orgânico não-miscível em água (por exemplo, tolueno) para prover uma solução orgânica de 4- HB/GBL. A solução resultante é subsequentemente submetida a métodos de destilação contínuos padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e prover GBL (ponto de ebulição 204-205°C) que é isolado como um líquido purificado.

[000160] Protocolo de Redução de GBL: Uma vez GBL isolado e purificado conforme acima descrito, ele será então submetido a protocolos de redução tais como aqueles bem conhecidos na técnica (referências mencionadas) para produzir 1,4-butanodiol ou tetraidrofurano (THF) ou uma mistura dos mesmos. Catalisadores de hidrogenação heterogêneos ou homogêneos combinados com GBL sob pressão de hidrogênio são bem conhecidos prover produtos, 1,4- butanodiol ou tetraidrofurano (THF) ou mistura dos mesmos. É importante notar que a mistura de produto 4-HB/GBL, que é separada do caldo de fermentação, conforme descrito acima, pode ser submetida diretamente, antes do isolamento e purificação de GBL, aos mesmos protocolos de redução para prover os produtos 1,4-butanodiol ou tetraidrofurano ou uma mistura dos mesmos. Os produtos resultantes, 1,4-butanodiol e THF, são então isolados e purificados através de procedimentos bem conhecidos na técnica. Protocolo de fermentação e hidrogenação para produzir BDO ou THF diretamente (batelada):

[000161] As células são cultivadas em um biorreator de 10L aspergido com uma mistura de N2/CO2 usando 5L de caldo contendo 5 g/L de fosfato de potássio, 2,5 g/L de cloreto de amônio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio e 30 g/L de água de maceração de milho e uma concentração de glicose inicial de 20 g/L. Conforme as células crescem e utilizam a glicose, mais glicose a 70% é alimentada ao biorreator em uma taxa aproximadamente equilibrando o consumo de glicose. A temperatura do biorreator é mantida em 30 graus C. O crescimento continua por aproximadamente 24 horas, até que 4-HB atinja uma concentração entre 20-200 g/L, com a densidade celular estando entre 5 e 10 g/L. O pH não é controlado, e vai tipicamente diminuir para pH 3-6 no final da atividade. Quando do término do período de cultivo, os teores do fermentador são passados por uma unidade de separação celular (por exemplo, centrífuga) para remover células e restos de célula, e o caldo de fermentação é transferido para uma unidade de redução (por exemplo, recipiente de hidrogenação), em que a mistura de 4-HB/GBL é diretamente reduzida para ou 1,4- butanodiol ou THF ou uma mistura dos mesmos. Seguindo o término do procedimento de redução, os teores do reator são transferidos para uma unidade de separação de produto. Isolamento de 1,4-butanodiol e/ou THF aconteceria através de procedimentos de separação padrão empregados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tal como extração líquido-líquido usando um solvente orgânico não-miscível em água (por exemplo, tolueno) para prover uma solução orgânica de 1,4-butanodiol e/ou THF. A solução resultante é então submetida a métodos de destilação padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e prover 1,4-butanodiol e/ou THF que são isolados como líquidos purificados.

[000162] Protocolo de fermentação e hidrogenação para produzir BDO ou THF diretamente (integralmente contínuo): As células são primeiro cultivadas em um modo em batelada usando o aparelho e a composição de meio descritos acima, exceto que a concentração de glicose inicial é 30-50 g/L. Quando a glicose é exaurida, meio de alimentação da mesma composição é fornecido continuamente em uma taxa entre 0,5 L/h e 1 L/h, e líquido é retirado na mesma taxa. A concentração de 4-HB no reator permanece constante a 30-40 g/L e a densidade celular permanece constante entre 3-5 g/L. A temperatura é mantida a 30 graus C e o pH é mantido a 4,5 usando NaOH e HCl concentrados, conforme necessário. O biorreator é operado continuamente por um mês, com amostras obtidas todos os dias para assegurar consistência da concentração de 4-HB. Em modo contínuo, os teores do fermentador são constantemente removidos conforme meio de alimentação novo é fornecido. A corrente de saída, contendo células, meio e produtos 4-HB e/ou GBL, é então passada por uma unidade de separação celular (por exemplo, centrífuga) para remover células e restos de célula, e o caldo de fermentação é transferido para uma unidade de redução contínua (por exemplo, recipiente de hidrogenação), em que a mistura 4-HB/GBL é diretamente reduzida ou para 1,4-butanodiol ou THF ou uma mistura dos mesmos. Seguindo o término do procedimento de redução, os teores do reator são transferidos para uma unidade de separação de produto contínua. Isolamento de 1,4-butanodiol e/ou THF aconteceria através de procedimentos de separação contínuos padrão empregados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tal como extração líquido-líquido usando um solvente orgânico não- miscível em água (por exemplo, tolueno) para prover uma solução orgânica de 1,4-butanodiol e/ou THF. A solução resultante é então submetida a métodos de destilação contínuos padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e prover 1,4-butanodiol e/ou THF que são isolados como líquidos purificados.

[000163] Protocolo de fermentação para produzir BDO diretamente (batelada): O organismo de produção é cultivado em um biorreator de 10L aspergido com uma mistura de N2/CO2, usando 5L de caldo contendo 5 g/L de fosfato de potássio, 2,5 g/L de cloreto de amônio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio e 30 g/L de água de maceração de milho e uma concentração de glicose inicial de 20 g/L. Conforme as células crescem e utilizam a glicose, mais 70% de glicose são alimentados ao biorreator em uma taxa aproximadamente equilibrando o consumo de glicose. A temperatura do biorreator é mantida a 30 graus C. O crescimento continua por aproximadamente 24 horas, até que BDO atinja uma concentração entre 20-200 g/L, com uma densidade celular geralmente estando entre 5 e 10 g/L. Quando do término do período de cultivo, os teores do fermentador são passados por uma unidade de separação celular (por exemplo, centrífuga) para remover células e restos de célula, e o caldo de fermentação é transferido para uma unidade de separação de produto. Isolamento de BDO aconteceria através de procedimentos de separação padrão empregados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tal como extração líquido-líquido usando um solvente orgânico não-miscível em água (por exemplo, tolueno) para prover uma solução orgânica de BDO. A solução resultante é então submetida a métodos de destilação padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e prover BDO (ponto de ebulição 228-229°C) que é isolado como um líquido purificado.

[000164] Protocolo de fermentação para produzir BDO diretamente (integralmente contínuo): O organismo de produção é primeiro cultivado em modo em batelada usando o aparelho e a composição de meio descritos acima, exceto que a concentração de glicose inicial é 30-50 g/L. Quando a glicose é exaurida, meio de alimentação da mesma composição é fornecido continuamente em uma taxa entre 0,5 L/h e 1 L/h, e o líquido é retirado na mesma taxa. A concentração de BDO no biorreator permanece constante a 30-40 g/L e a densidade celular permanece constante entre 3-5 g/L. A temperatura é mantida a 30 graus C e o pH é mantido em 4,5 usando NaOH e HCl concentrados, conforme necessário. O biorreator é operado continuadamente por um mês, com amostras obtidas todos os dias para assegurar consistência da concentração de BDO. Em modo contínuo, os teores do fermentador são constantemente removidos conforme um meio de alimentação novo é fornecido. A corrente de saída, contendo células, meio e o produto BDO, é então submetida a um procedimento de separações de produto contínuo, com ou sem remoção de células e restos de célula, e aconteceria através de métodos de separação contínuos padrão empregados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tal como extração líquido-líquido contínua usando um solvente orgânico não- miscível em água (por exemplo, tolueno) para prover uma solução orgânica de BDO. A solução resultante é subsequentemente submetida a métodos de destilação contínuos padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e prover BDO (ponto de ebulição 228-229°C) que é isolado como um líquido purificado (ponto de fusão 20°C).

EXEMPLO V Estratégias Knockout Derivadas in silico para Produção Acoplada a Crescimento de 1,4-Butanodiol em Escherichia coli'

[000165] Este exemplo descreve o projeto in silico de estratégias Knockout para gerar produção de 1,4-butanodiol acoplada a crescimento em E. coli.

[000166] A estratégia para geração de produção de BDO acoplada a crescimento primeiro envolve a demonstração de uma via funcional que é subsequentemente otimizada através de evolução adaptativa e inserções, deleções e superexpressões de gene direcionadas. São descritas abaixo em mais detalhes estratégias de engenharia de cepa identificadas através de OptKnock para geração de cepas de produção de BDO acopladas a crescimento de Escherichia coli. Todas as implementações de OptKnock supõem que atividades suficientes de todas as enzimas mostradas na Figura 6 estejam disponíveis para E. coli sob todas as condições. Ainda, todas as etapas de redução nesta via são supostas ser dependentes de NADH embora muitos dos projetos sejam esperados ser aplicados sem importar a especificidade do cofator.

[000167] O potencial de rendimento de BDO dos cursos bioquímicos para 1,4-butanodiol em E. coli é detalhado abaixo. Três condições foram usadas, anaeróbica, anaeróbica + adição de nitrato e aeróbica. O rendimento teórico máximo para cada cenário supondo que a produção de BDO deva ser energeticamente neutra é mostrado na Tabela 5. A Tabela 5 mostra os rendimentos teóricos máximos de 1,4- butanodiol (BDO) para cinco conjuntos de condições ambientais: 1) respiração aeróbica, 2) fermentação anaeróbica com co-produção de acetato, 3) fermentação anaeróbica com coprodução de etanol, 4) respiração de nitrato levando à formação de nitrito e 5) separação de nitrato levando à formação de amônia. Valores negativos indicam metabolitos absorvidos; valores positivos indicam metabolitos secretados. Unidades molares são supostas junto com neutralidade energética de via. O rendimento teórico máximo sem supor neutralidade energética é 1,091 mol/mol (0,545 g/g) de glicose para todos os casos. O rendimento mais alto é obtido sob condições aeróbicas onde ATP suficiente para tornar a via energeticamente neutra pode ser gerado com perda mínima de carbono através da respiração. No caso anaeróbico, o rendimento cai conforme ATP é feito através de fosforilação em nível de substrato e ou acetato ou etanol é feito como um subproduto. Adição de nitrato controlada pode prover quase o mesmo rendimento que oxigênio, a quantidade exata dependendo de se mais redução de nitrito em amônia acontece.

[000168] Tabela 5. Rendimentos teóricos máximos de 1,4-butanodiol (BDO) para cinco conjuntos de condições ambientais

[000169] Se fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinase for suposta operar na direção de fosfoenolpiruvato em oxaloacetato, produção de BDO se torna um empreendimento de geração de energia e o rendimento teórico máximo para todos os cenários se torna 0,545 g/g com CO2 como o único subproduto. PEP carboxiquinase é conhecida produzir oxaloacetato a partir de PEP em bactérias do rúmen tal como Mannheimia succiniproducens (Hong e outros, Nat. Biotechnol., 22:1275-1281 (2004)). No entanto, o papel da PEP carboxiquinase em produção de oxaloacetato em E. coli é acreditado ser pouco comparado com PEP carboxilase possivelmente devido ao Km maior para bicarbonato de PEP carboxiquinase (Kim e outros, Appl. Environ. Microbiol., 70:1238-1241 (2004)). Não obstante, a atividade da PEP carboxiquinase de E. coli nativa a partir de PEP para oxaloacetato foi recentemente demonstrada em mutantes ppc de K-12 (Kwon e outros, J. Microbiol. Biotechnol., 16:1448-1452 (2006)).

[000170] Em mais detalhes, os projetos identificados para aumento da produção de BDO em E. coli são descritos abaixo. Uma necessidade de manutenção energética associada a não-crescimento de 7,6 mmol/gDW/h foi suposta junto com uma taxa de absorção de glicose específica máxima de 20 mmol/gDW/hr. BDO foi suposto ser exportado através de difusão. Estratégias Knockout foram identificadas supondo que 1) PEP carboxiquinase é irreversível e funciona apenas para converter oxaloacetato em PEP e 2) PEP carboxiquinase é irreversível. Para ambos os casos, o código do OptKnock descrito em Burgard e outros (Biotechnol. Bioeng., 84:647-657 (2003)) foi modificado para permitir respiração limitada, não-limitada ou sem nenhum nitrato. Adição da possibilidade de respiração com nitrato serve para aumentar o rendimento teórico máximo de BDO quando PEP carboxiquinase é suposta irreversível e também, em alguns casos, permite a seleção de estratégias knockout que de outro modo não seriam selecionadas sob condições anaeróbicas devido à energética desfavorável. Especificamente, seis reações de absorção de nitrato foram adicionadas à rede de trabalho de E. coli com ligações mais baixas de 0, -2, -5, -10, -20 ou -1000 mmols/gDW/h (os valores negativos significam absorção de metabolito no modelo estequiométrico). As restrições duplas de OptKnock foram ajustadas apropriadamente e uma restrição adicional foi adicionada que permitiu que apenas uma reação de absorção de nitrato fosse ativa de cada vez. OptKnock seleciona a quantidade ótima de respiração de nitrato para cada estratégia Knockout identificada. Finalmente, todas as simulações supõem que a reação catalisada por adhE em E. coli (isto é, acetil-CoA + NADH ^ etanol + NAD) tenha sido removida. Devido ao fato de acetil-CoA ser um intermediário necessário para produção de BDO, quase todos os projetos de OptKnock incluiriam esta deleção de qualquer maneira para prevenir produção de etanol de competir com produção de BDO. Inclusão desta deleção a priori foi feita para diminuir o tempo de CPU do procedimento computacional.

[000171] As estratégias knockout derivadas por OptKnock são dadas nas Tabelas 6 e 7 supondo PEP carboxiquinase ser irreversível e reversível, respectivamente. Neste relatório, as estratégias Knockout são listadas por abreviações de reação em todas as letras maiúsculas por questão de simplicidade. Os genes correspondentes que teriam que ser inativados para prevenir uma reação particular de acontecer em E. coli são providos na Tabela 8 junto com a estequiometria de reação. Os nomes dos metabolitos correspondendo à Tabela 8 são listados na Tabela 9. Tabela 6. Estratégias knockout derivadas de OptKnock supondo PEP carboxiquinase ser irreversível

[000172] Vários critérios foram aplicados para selecionar os conjuntos mais práticos de genes para se direcionar para remoção. Primeiro, os projetos foram limitados para incluir apenas knockouts que não reduzissem significantemente (isto é, >5%) o rendimento teórico máximo de BDO sob condições anaeróbicas com ou sem a presença de nitrato como um aceitador de elétron. Tais knockouts criariam um teto artificial sobre quaisquer esforços de engenharia metabólica futuros e são então indesejáveis. Para esta finalidade, uma série de problemas de programação linear (LP) (linear programming) foi resolvida, o que maximizou o rendimento de BDO para o sistema metabólico de E. coli do tipo selvagem supondo que cada reação fosse individualmente deletada do sistema. Conforme aqui usado, referência ao sistema de E. coli do tipo selvagem supõe que a via de BDO esteja disponível. O termo "tipo selvagem" é então um nome substituto para o sistema de E. coli não-deletado. Reações cuja deleção afeta negativamente o rendimento de BDO máximo supondo PEP carboxiquinase ser irreversível ou reversível são mostradas nas Tabelas 10 e 11, respectivamente. A Tabela 10 mostra reações que, quando adicionadas, reduzem o rendimento de BDO teórico máximo sob condições anaeróbicas com ou sem a presença de nitrato, supondo que PEP carboxiquinase não possa ser usada para produzir oxaloacetato. A cepa AB3 contém deleções em ADHE, LDH_D e PFLi. ‘Inf" indica que as necessidades energéticas associadas a não- crescimento não podem ser satisfeitas. Tabela 10. Reações que, quando deletadas, reduzem o rendimento de BDO teórico máximo sob condições anaeróbicas com ou sem a presença de nitrato, supondo que a PEP carboxilase não possa ser usada para produzir oxaloacetato

[00174] A Tabela 11 mostra reações que, quando deletadas, reduzem o rendimento de BDO teórico máximo sob condições anaeróbicas com ou sem a presença de nitrato, supondo que PEP carboxiquinase possa ser usada para produzir oxaloacetato. 'Inf' indica que as necessidades energéticas associadas ao não-crescimento não podem ser satisfeitas. Tabela 11. Reações que, quando deletadas, reduzem o rendimento de BDO teórico máximo sob condições anaeróbicas com ou sem a presença de nitrato, supondo que PEP carboxiquinase possa ser usada para produzir oxaloacetato

[00175] A análise descrita acima levou a três observações críticas. Uma observação crítica era que acetato quinase e fosfotransacetilase são requeridas para obter os rendimentos de BDO máximos sob todas as condições através de regeneração de acetil-CoA a partir de acetato produzido por 4-hidroxibutirato:acetil-CoA transferase. Esta constatação sugere fortemente que eliminação da formação de acetato através da deleção de ackA-pta pode não ser uma opção viável. Então uma cepa bem sucedida provavelmente terá que prover um ambiente intracelular onde conversão de acetato em acetil-CoA é benéfica e termodinamicamente possível. De outra maneira, um conjunto de enzimas capazes de realizar as reduções de BDO necessárias sem passar por um derivado de CoA teria que ser encontrado ou a co- produção de 1 mol de acetato por mol de BDO teria que ser aceita.

[00176] Uma segunda observação clínica era que as enzimas de ciclo de TCA citrato sintase (CS), aconitase (ACONT) e isocitrato desidrogenase (ICDHy) são necessárias para obter o rendimento de BDO máximo sob todas as condições. Isto indica que o fluxo do ciclo de TCA reverso de oxaloacetato em succinato em succinil-CoA deve ser complementado até algum ponto por CS, ACONT e ICDHy para produção máxima.

[00177] Uma terceira observação crítica foi que suplantar PEP carboxilase com PEP carboxiquinase em E. coli pode impactar positivamente o programa de BDO. O rendimento de BDO máximo sob condições anaeróbicas com e sem a presença de nitrato é 3% e 12% menor, respectivamente, se PEP carboxilase realizar a conversão de PEP em oxaloacetato conforme comparado se PEP carboxiquinase realizar a conversão. Ainda, sob condições anaeróbicas sem adição de nitrato, PEP carboxiquinase pode diminuir a necessidade de atividade de piruvato desidrogenase para produção de BDO máxima. Especificamente, o rendimento de BDO máximo cai 11% se esta enzima tipicamente aeróbica não tiver nenhuma atividade, se PEP carboxiquinase for suposta irreversível comparada com uma redução de 3%, se PEP carboxiquinase puder catalisar a produção de oxaloacetato. Uma alternativa para atividade de piruvato desidrogenase pode ser utilizada através de acoplamento de formiato desidrogenase não-nativa, capaz de catalisar a redução de formiato em dióxido de carbono, à atividade de piruvato formiato liase.

[00178] Os próximos dois critérios usados para avaliar os projetos de OptKnock eram o número de knockouts necessários e o rendimento de BDO previsto em crescimento máximo. Análise de uma, duas e três estratégias de deleção de reação na Tabela 6 (isto é, PEP carboxiquinase suposta irreversível) revelou que muitos poucos knockouts eram insuficientes para prevenir rendimentos de acetato altos. As razões de acetato/BDO previstas para todos os um, dois ou três projetos de deleção eram pelo menos 1,5. Mesmo permissão de quatro deleções levou a apenas dois projetos, No. 99 e No. 100, com rendimentos de BDO previstos acima de 0,35 g/g e esses projetos sugeriram a remoção do gene de glicólise, pgi, que codifica fosfoglucoisomerase. Dada a importância antecipada de glicólise na fermentação de E. coli, foi decidido dedicar tal projeto de alto risco apenas como um último recurso. Ainda, as deleções sugeridas diminuíram o rendimento teórico máximo nos projetos N°. 99 e N°. 100 em 8% e 15%, respectivamente. A estratégia de deleção quatro de produção mais alta que não impactou negativamente o rendimento teórico máximo foi o projeto N°. 129, que tinha um rendimento de BDO previsto em crescimento máximo de apenas 0,26 g/g.

[00179] Apenas um de cinco projetos de deleção na Tabela 6 satisfaz todos os critérios para um projeto bem sucedido. Esta estratégia knockout envolve a remoção de ADHEr (álcool desidrogenase), PFLi (piruvato formiato liase), LDH_D (lactato desidrogenase), MDH (malato desidrogenase) e ASPT (aspartato transaminase). Os knockouts sugeridos não reduzem o rendimento de BDO teórico máximo sob nenhuma das condições examinadas. Uma cepa engenheirada com esses knockouts é prevista atingir um rendimento de BDO em crescimento máximo de 0,37 g/g supondo condições anaeróbicas e PEP carboxiquinase irreversivelmente. Este projeto tem várias propriedades desejáveis. Mais notavelmente, ele previne o sistema de produzir rendimentos altos dos produtos de fermentação naturais, etanol, formato, lactato e succinato. A prevenção de produção de homossuccinato através da deleção de MDH oposto à remoção de PEP carboxilase, fumarase ou fumarato redutase, é particularmente intrigante porque ela bloqueia a via de fermentação de rendimento de energia de oxaloacetato em succinato que poderia surgir se PEP carboxiquinase fosse suposta reversível sem impactar negativamente o rendimento de BDO máximo. Neste projeto, succinato semialdeído pode ser feito através de succinil-CoA ou alfa-cetoglutarato. O succinil-CoA é formado a partir de succinato através de succinil-CoA sintetase. O succinato pode ser formado a partir de ambas as reações de ciclo de TCA reverso (PEP carboxilase, PEP carboxiquinase, fumarase, fumarato redutase) e derivação de glioxilato (malato sintase, isocitrato liase).

[00180] Os limites de solução de BDO versus biomassa para as estratégias knockout de ADHEr, PFLi, LDH_D, MDH, ASPT são mostrados nas figuras 7A e 7B, supondo irreversibilidade ou reversibilidade de PEP carboxiquinase, respectivamente. Note que os limites da solução são obtidos usando um modelo de escala de genoma de metabolismo de E. coli oposto ao modelo reduzido porque esses cálculos não são CPU-intensivos. Os limites de solução revelaram que o acoplamento a crescimento de BDO é robusto com relação à suposição de reversibilidade de PEP carboxiquinase. No entanto, a deleção da transidrogenase (THD2) ou glutamato desidrogenase (GLUDy) de bombeamento de próton pode ser necessária para obter um acoplamento obrigatório de crescimento celular com produção de BDO. O único aspecto negativo do projeto é que as deleções de MDH e ASPT caem o rendimento de ATP máximo de produção de BDO ligeiramente (~20%) se reversibilidade de PEP carboxiquinase for suposta. Isto faz com que a solução de crescimento ótima da estratégia de projeto caia abaixo da linha de BDO vs. biomassa preta do sistema do tipo selvagem na Figura 7B. No entanto, essa constatação sugere a possibilidade de engenharia de um equilíbrio ótimo de atividade de MDH onde suficiente está presente para assegurar produção de BDO eficiente enquanto também sendo limitada o suficiente para prevenir succinato de se tornar um produto de fermentação principal. Note que o succinato é previsto ser o produto de fermentação principal do sistema do tipo selvagem se reversibilidade de PEP carboxiquinase for suposta.

[00181] As Tabelas 10 e 11 listam reações cuja deleção impacta negativamente o rendimento de BDO máximo em uma cepa intermediária, referida como AB3, que não tem ADHEr, LDH_D e PFLi bem como uma cepa sem ASPT e MDH em adição às deleções de AB3. Note que as deleções sugeridas acontecem importância muito alta na obtenção de atividade de piruvato desidrogenase, citrato sintase e aconitase sob condições completamente anaeróbicas. Se atividade de piruvato desidrogenase suficiente não puder ser conseguida, uma alternativa é deixar PFLi intacta e suplementar sua atividade com uma formato desidrogenase não-nativa que podem capturar um equivalente de redução enquanto convertendo formato em dióxido de carbono.

[00182] A Figura 8 e a Tabela 12 mostram as faixas de fluxo que a rede de E. coli pode atingir enquanto atingido ou o rendimento de BDO máximo (casos 1-4) ou o rendimento de biomassa máximo (caso 5) sob condições anaeróbicas. Os Casos 1 e 2 supõem que quaisquer deleções de gene aconteceram. O Caso 2 exibe faixas de fluxo mais fortalecidas que no caso 1 devido ao fato que uma restrição adicional reforçando o rendimento de ATP máximo no rendimento de BDO máximo é imposta. Os Casos 3 e 4 são análogos aos casos 1 e 2 exceto que os fluxos codificando as reações para ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH e PFLi foram ajustados para zero. As faixas de fluxo supondo maximização de rendimento de biomassa na presença de knockout de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH e PFLi são mostradas no caso 5.

[00183] A Tabela 12 mostra faixas que podem ser atingidas de fluxos metabólicos centrais sob condições anaeróbicas supondo PEP carboxiquinase ser reversível. Valores de fluxo em negrito foram ajustados como restrições no sistema. Cinco casos são considerados: Caso 1, rendimento de BDO máximo do sistema tipo selvagem; Caso 2, rendimento de ATP máximo supondo o rendimento de BDO máximo da rede do tipo selvagem; Caso 3, rendimento de BDO máximo do sistema com fluxos através de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH e PFLi ajustados para zero; Caso 4, rendimento de ATP máximo supondo o rendimento de BDO máximo da rede com fluxos através de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH e PFLi ajustados para zero; e Caso 5; rendimento de biomassa máximo da rede com fluxos através de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH e PFLi ajustados para zero. Tabela 12. Faixas que podem ser atingidas de fluxos metabólicos centrais sob condições anaeróbicas supondo PEP carboxiquinase ser reversível. As reações que são supostas inativas nos casos 3, 4 e 5 são indicadas com fonte em negrito

[00184] Os dois primeiros projetos de deleção (Nos. 92 e 93) listados na Tabela 7 (isto é, PEP carboxiquinase suposta reversível) foram considerados próximos devido aos seus rendimentos de BDO previstos relativamente altos. O projeto No. 92 (ADHEr, HEX1, PFLi e PGI) necessitaria de knockouts adicionais que eliminassem produção de succinato e lactato e o rendimento de BDO máximo do projeto N°. 93 (ADHEr, EDA, NADH6, PGI) foi apenas 90% do máximo teórico do sistema do tipo selvagem. Ambos os projetos necessitam a remoção de PGI que, conforme acima mencionado, foi decretado indesejável devido à importância antecipada de glicólise na fermentação. O projeto N°. 98 (ADHEr, ATPS4r, FDH2, NADH6) foi o primeiro dos quatro projetos de deleção a necessitar a remoção de ATP sintase sem requerer adicionalmente a inativação de PGI. No entanto, este projeto também necessitaria de deleção de genes para prevenir produção de lactato e succinato a fim de aumentar o rendimento de BDO previsto em crescimento máximo. Quando de análise adicional, foi constatado que quase todos os projetos promissores na Tabela 7 poderiam ser aperfeiçoados ao assegurar que as deleções (isto é, ADHEr, LDH_D, MDG, ASPT e PFLi) fossem também implementadas se já não especificado.

[00185] Esforços foram em seguida focados na identificação de deleções de reação que poderiam suplementar o conjunto de núcleo (isto é, ADHEr, LDH_D, MDH, ASPT, PFLi). A Tabela 13 mostra genes de E. coli conhecidos responsáveis pela catálise das reações alvo para remoção. A designação "[c]" refere-se a citosólico. Os genes codificando essas reações junto com as reações do conjunto de núcleo são providos na Tabela 13. O efeito das deleções adicionais sobre os limites de solução de BDO versus biomassa é mostrado na Figura 9. Notavelmente, o acoplamento entre produção de BDO e biomassa se torna muito mais pronunciado conforme deleções adicionais são acumuladas. O rendimento de BDO previsto em crescimento máximo após acúmulo de todas as deleções é 0,46 g/g. Por fim, nenhuma das deleções impacta negativamente o rendimento de BDO teórico máximo. Tabela 13. Genes de E. coli conhecidos responsáveis pela catálise das reações-alvo para reação

[00186] Nos resultados mostrados na Tabela 13, OptKnock identifica reações a serem eliminadas de um organismo para aumentar a produção bioquímica. Qualquer combinação (isto é, pelo menos uma e no máximo todas) das deleções de gene listadas poderia ter concebivelmente o efeito desejável de assegurar que a reação correspondente fosse não-funcional em E. coli. A estratégia experimental mais prática para eliminação das reações-alvo para remoção deve ser determinada em uma base caso a caso.

EXEMPLO VI Geração de Cepas Engenheiradas

[00187] A fim de validar as previsões computacionais do Exemplo V, as cepas são construídas, desenvolvidas e testadas. Escherichia coli K- 12 MG1655 serve como a cepa do tipo selvagem onde as deleções são introduzidas. As cepas são construídas através da incorporação de deleções em estrutura usando recombinação homóloga através do sistema de recombinase À Red da (Datsenko e Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)). A abordagem envolve substituição de uma sequência de cromossomo (isto é, o gene-alvo para remoção) com um gene de resistência a antibiótico selecionável, que é mais tarde removido. Os knockouts são integrados um por um à cepa recipiente. Quaisquer marcadores de resistência de fármaco ou cicatrizes vão permanecer após cada deleção, permitindo acúmulo de mutações múltiplas em cada cepa-alvo. A tecnologia de deleção remove completamente o gene-alvo para remoção de maneira a reduzir substancialmente a possibilidade dos mutantes construídos reverterem de volta para o tipo selvagem. Durante os estágios iniciais de desenvolvimento de cepa, genes não-nativos que permitem a produção de BDO são expressos em um opéron sintético por trás de um promotor induzível em um plasmídeo de cópia média ou alta; por exemplo, o promotor de PBAD que é induzido por arabinose, em um plasmídeo da série pBAD (Guzman e outros, J. Bacteriol., 177:4121-4130 (1995)). Este promotor é conhecido ser muito facilmente titulável, permitindo expressão ser regulada em uma faixa de mais de 100 vezes de concentrações de arabinose. Se produção de BDO for bem sucedida, esses genes devem então ser integrados ao cromossomo para promover estabilidade.

[00188] As cepas engenheiradas são caracterizadas pela medição da taxa de crescimento, taxa de absorção de substrato e taxa de secreção de produto/subproduto. Essas cepas são inicialmente antecipadas exibir taxas de crescimento subótimas até que seus sistemas metabólicos tenham se ajustado às suas funcionalidades ausentes. Para permitir este ajuste, as cepas são desenvolvidas adaptativamente. Ao submeter as cepas à evolução adaptativa, taxa de crescimento celular se torna a pressão de seleção principal e as células mutantes são compelidas a realocar seus fluxos metabólicos a fim de aumentar suas taxas de crescimento. Esta reprogramação de metabolismo foi recentemente demonstrada para vários mutantes de E. coli que tinham sido desenvolvidos adaptativamente sobre vários substratos para atingir as taxas de crescimento previstas a priori por um modelo in silico (Fong e Palsson, Nat. Genet., 36:1056-1058 (2004)). Tendo sido provadas bem sucedidas as previsões de OptKnock, os aperfeiçoamentos no crescimento causados pela evolução adaptativa são acompanhados por taxas maiores de produção de BDO. Evolução adaptativa é realizada em triplicata (realizada em paralelo) devido a diferenças nos padrões evolucionários testemunhados anteriormente em E. coli (Fong e Palsson, supra, 2004; Fong e outros, J. Bacteriol. 185:6400-6408 (2003); Ibarra e outros, Nature 420:186-189 (2002)) que poderiam resultar potencialmente em uma cepa tendo qualidades de produção superiores sobre outras. Evolução é realizada por um período de 2-6 semanas, dependendo da taxa de aperfeiçoamento de crescimento obtida. Em geral, evoluções q43 pararam uma vez um fenótipo de crescimento estável tendo sido obtido.

[00189] Seguindo o processo de evolução adaptativo, as novas cepas são novamente caracterizadas por medição da taxa de crescimento, taxa de absorção e taxa de secreção de produto/subproduto. Esses resultados são comparados com as previsões OptKnock ao pôr em gráfico crescimento real e rendimentos de produção junto com a produção descrita acima. As combinações de projeto/evolução de OptKnock mais bem sucedidas são escolhidas para continuarem, e são caracterizadas em batelada de escala de laboratório e fermentações contínuas. O conceito de produção bioquímica acoplada a crescimento por trás da abordagem de OptKnock também resulta na geração de superprodutores geneticamente estáveis. Então, as culturas são mantidas em modo contínuo por um mês para avaliar a estabilidade a longo prazo. Amostras periódicas são obtidas para assegurar que rendimento e produtividade sejam mantidos durante o processo.

EXEMPLO VII Cepas de OptKnock para Produção de BDO

[00190] Conforme descrito nos Exemplos V e VI, a aplicação da metodologia OptKnock foi aplicada para a geração de alvos de deleção promissores para gerar cepas de produção de BDO. OptKnock identifica reações a serem eliminadas de um organismo para acoplar a produção bioquímica e rendimentos de biomassa. Os projetos proveem uma lista das reações metabólicas a serem direcionadas para remoção pelo OptKnock. Os genes de E. coli conhecidos codificar as enzimas que catalisam cada reação foram também providos para descrever quais modificações genéticas devem ser implementadas para realizar os fenótipos de produção acoplada a crescimento. Obviamente, se novas constatações revelarem que os genes adicionais no genoma de E. coli podem conferir uma ou mais das funcionalidades de reação direcionadas para remoção em um dado projeto, então esses genes devem ser removidos bem como os descritos aqui. Note que a prevenção da atividade de apenas um subconjunto (isto é, pelo menos um e no máximo todos) das reações em cada um dos projetos pode ser algumas vezes suficiente para conferir um fenótipo de produção acoplada a crescimento. Por exemplo, se um projeto necessitar da remoção de uma reação particular cuja atividade in vivo não é suficiente para desacoplar o crescimento da produção de BDO, então os genes codificando a enzima que catalisa esta reação podem ser deixados intactos. Ainda, qualquer combinação (isto é, pelo menos uma e no máximo todas) das deleções de gene listadas para uma dada reação poderia ter concebivelmente o efeito desejado de assegurar que a reação seja não-funcional em E. coli.

[00191] Estratégias de deleção múltiplas são listadas nas Tabelas 6 e 7 para aumento do acoplamento entre produção de 1,4-butanodiol e crescimento de E. coli supondo PEP carboxiquinase ser irreversível e reversível, respectivamente. Um projeto (isto é, ADHEr, ASPT, MDH, LDH_D, PFLi) emergiu como o mais promissor quando satisfazendo critérios múltiplos. As deleções sugeridas 1) levaram a um rendimento de BDO previsto alto em crescimento máximo, 2) necessitaram de um número razoável de knockouts , 3) não tiveram nenhum efeito prejudicial sobre o rendimento de BDO teórico máximo, 4) causaram um acoplamento forte de produção de BDO com crescimento celular e 5) foram robustas com relação à irreversibilidade/reversibilidade de PEP carboxiquinase. A lista que segue especifica o conjunto mínimo de deleções de gene necessárias previstas para tornar BDO o produto de fermentação principal de E. coli.

[00192] adhE (b1421), ldhA (b1380).

[00193] pflAB (b0902, b0903) não está incluído no conjunto mínimo porque sua deleção força um apoio sobre piruvato desidrogenase para prover acetil-CoA suficiente para crescimento celular e um equivalente de redução de piruvato. Como atividade de piruvato desidrogenase é baixa sob condições anaeróbicas e inibida por concentrações de NADH altas, uma alternativa plausível para a deleção de pflAB é adicionar uma formato desidrogenase não-nativa a E. coli que pode capturar o poder de redução que é de outro modo perdido através de secreção de formato. Não obstante, adição de pflAB ao conjunto de deleção mínimo dá:

[00194] adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903).

[00195] mdh (b3236) não está incluído no conjunto mínimo porque há deleções múltiplas capazes de prevenir succinato de se tornar o produto de fermentação principal de E. coli oposto a BDO. Exemplos incluem os genes codificando fumarase e/ou fumarato redutase. No entanto, eliminação de malato desidrogenase parece ser a escolha mais lógica para atenuar a produção de succinato uma vez que ele deixa intacto uma via para a conversão do produto de derivação de glioxilato, malato, em BDO. Adição da deleção de malato desidrogenase ao conjunto mínimo acima dá:

[00196] adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236).

[00197] O gene, mqo, que codifica uma malato:quinona- oxidorredutase, é acreditado catalisar a oxidação de malato em oxaloacetato (van der Rest e outros, J. Bacteriol., 182:6892-6899 (2000)). No entanto, se ele for mostrado também catalisar a formação de malato a partir de oxaloacetato, sua remoção será necessária para assegurar que ele não burle a deleção de mdh. Isto leva ao conjunto de deleção:

[00198] adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), mqo (b2210).

[00199] aspA é retirado do conjunto mínimo uma vez que é questionável se ou não aspartato desaminase pode carregar fluxo suficiente para burlar a deleção de malato desidrogenase. No entanto, se este cenário for realmente possível, então a lista mínima de deleções necessárias fica:

[00200] adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), aspA (b4139).

[00201] Para os cálculos acima, enzimas málicas dependentes de NADH e NADPH de E. coli foram supostas operar irreversivelmente catalisando apenas a conversão de malato em dióxido de carbono e piruvato. Se essas enzimas puderem também catalisar a formação de malato a partir de piruvato e dióxido de carbono, os genes codificando uma ou ambas as enzimas málicas terão que ser removidos para prevenir succinato de se tornar o produto de fermentação principal. Isto leva ao conjunto de deleções que segue:

[00202] adhE (b1421), mdh (b3236), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), sfcA (b1479)

[00203] adhE (b1421), mdh (b3236), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), maeB (b2463)

[00204] adhE (b1421), mdh (b3236), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), sfcA (b1479), maeB (b2463)

[00205] O conjunto mínimo de deleções pode ser suplementado com deleções adicionais que objetivam o fortalecimento do acoplamento de produção de BDO a crescimento celular. Esses conjuntos de deleções são listados abaixo:

[00206] adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), pntAB (b1602, b1603)

[00207] adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), gdhA (b1761)

[00208] adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), pikA (b1854), pykF (b1676), dhaKLM (b1198, b1199, b1200), deoC (b4381), edd (b1851), yiaE (b3553), ycdW (b1033)

[00209] adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), pykA (b1854), pykF (b1676), dhaKLM (b1198, b1199, b1200), deoC (b4381), edd (b1851), yiaE (b3553), ycdW (b1033), prpC (b0333), gsk (b0477)

[00210] As cepas possuindo as deleções listadas neste Exemplo podem ser suplementadas com deleções adicionais se for constatado que as deleções sugeridas não reduzem a atividade de suas reações correspondentes até o ponto necessário para obter produção de BDO acoplada a crescimento ou se genes de E. coli nativos, através de evolução adaptativa ou mutagênese, realizarem mutações conferindo atividades capazes de burlar as estratégias de projeto propostas.

[00211] Em todo o presente pedido várias publicações foram referidas dentro de parênteses. Os relatórios dessas publicações em suas totalidades são então incorporados a título de referência no presente pedido, a fim de descrever mais integralmente o estado da técnica à qual a presente invenção pertence.

[00212] Embora a invenção tenha sido descrita com referência às modalidades descritas, aqueles versados na técnica vão compreender imediatamente que os exemplos específicos e estudos detalhados acima são apenas ilustrativos da invenção. Deve ser compreendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção. Desta maneira, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações que seguem.

Claims (8)

1. Micro-organismo de ocorrência não-natural, caracterizado pelo fato de que compreende um conjunto de modificações metabólicas compreendendo uma mutação gênica, ou uma deleção total ou parcial de uma região codificante ou uma região regulatória dos genes aldeído- álcool desidrogenase (adhE), D-lactato desidrogenase (ldhA), piruvato formato liase (pflAB) e malato desidrogenase (mdh), em que o micro-organismo compreende ainda uma via biossintética de 1,4-butanodiol (BDO) compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4-hidroxibutanoato desidrogenase, a referida enzima que converte o semialdeído succínico em ácido 4-hidroxibutanoico; semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, a referida enzima que converte 4-hidroxibutirato em succinato; succinil-CoA sintetase, a referida enzima que converte succinato em succinil CoA; semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, a referida enzima que converte succinil-CoA em semialdeído succínico; 4-hidroxibutirato:CoA transferase, a referida enzima que converte ácido 4-hidroxibutanoico em 4-hidroxibutiril-CoA; glutamato:semialdeído succínico transaminase, a referida enzima que converte α-cetoglutarato em semialdeído succínico; glutamato descarboxilase, a referida enzima que converte glutamato em 4-aminobutirato; aldeído desidrogenase independente de CoA, a referida enzima que converte 4-hidroxibutiril- CoA em 4-hidroxibutialdeído; aldeído desidrogenase dependente de CoA, a referida enzima que converte 4-hidroxibutiril-CoA em 4- hidroxibutialdeído; ou álcool desidrogenase, a referida enzima que converte 4-hidroxibutialdeído em 1,4-butanodiol; em que o micro-organismo de ocorrência não-natural produz 1,4-butanodiol (BDO); e em que o microrganismo de ocorrência não natural é selecionado dentre bactérias e leveduras.

2. Micro-organismo de ocorrência não-natural, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido conjunto de modificações metabólicas compreende ainda o rompimento de aspartato transaminase (aspA).

3. Micro-organismo de ocorrência não-natural, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido conjunto de modificações metabólicas compreende ainda o rompimento de um ou mais dentre o grupo consistindo de: um ou mais genes selecionados dentre o conjunto de genes consistindo de malato:quinona-oxidoredutase (mqo), aspartato transaminase (aspA), malato desidrogenase (dependente de NAD) (sfcA), malato desidrogenase (dependente de NADP) (maeB), piridina nucleotídeo transhidrogenase (pntAB) e glutamato desidrogenase (gdhA); sfcA e maeB; um ou mais genes selecionados dentre o conjunto de genes consistindo de piruvato quinase I (pykA), piruvato quinase F (pykF), dihidroxiacetona quinase (dhaKLM), desoxirribose-fosfato aldolase (deoC), fosfogluconato desidratase (edd), glicoxilato-redutase (yiaE), cetoácido redutase (ycdW), 2-metilcitrato sintase (prpC) e inosina/guanosina quinase (gsk); pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE e ycdW; pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC e gsk.

4. Micro-organismo de ocorrência não-natural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os referidos rompimentos de gene compreendem uma deleção gênica.

5. Micro-organismo de ocorrência não-natural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido micro-organismo é E. coli.

6. Micro-organismo de ocorrência não-natural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria ou levedura é uma espécie selecionada de Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, e Pichia pastoris.

7. Método para produção de 1,4-butanodiol, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultura sob fase de crescimento exponencial em uma quantidade suficiente de nutrientes e meio de um micro-organismo de ocorrência não-natural, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e (b) isolamento de 1,4-butanodiol produzido a partir do referido micro-organismo de ocorrência não-natural.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que 1,4-butanodiol é isolado por destilação.