CN108118072A - 一种促进微生物转化生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进微生物转化生产1,3‑丙二醇的方法,包括(1)菌种活化:将菌种保藏液与种子培养基按比例混合后微氧培养,采用氢氧化钾调控pH为6~8,培养10h~16h得到菌种活化液;(2)菌种扩大培养:将菌种活化液与种子培养基按比例混合后微氧培养,采用氢氧化钾调控pH为6~8,培养10h~16h得到种子液;(3)发酵培养:以甘油为底物,将种子液和发酵培养基按比例混合,首先进行微氧发酵,发酵时间为6h~12h,采用氢氧化钾调控pH为6~8;然后进行厌氧发酵,采用氨水调控pH为6~8。本发明根据菌体细胞离子通道的特性,解决了发酵体系渗透压过大的问题,能够有效促进甘油转化,大幅提高最终产物中1,3‑丙二醇的浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,涉及一种促进微生物转化生产1,3-丙二醇的方法。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-Propanediol,PDO)主要用于生产性能优异的新型聚酯PTT(Polytrimethylene Terephthalate)。PTT既具有PET的化学稳定性,又具有尼龙的良好弹性回复性能和抗污染性。随着低成本1,3-丙二醇生产工艺的开发,PTT在纺织品领域拥有广阔的应用前景。另外,1,3-丙二醇还是一种重要的化工原料和医药中间体,在聚酯纤维生产以及聚氨基甲酸乙酯和环状化合物的制造中具有广泛的应用,可替代乙二醇生产其它聚酯(如聚萘二甲酸丙二醇,PTN)、制备新型聚氨酯(包括发泡产品、弹性体、粘合剂等)、防冻液、乳化剂等精细化工产品。由它合成的聚酯有独特的性质和优异的性能,而且可以使聚酯塑料具有易于自然循环的可生物降解特性。近年来,作为重要的有机合成原料和中间体,因其独特性能以及广泛的用途成为研究开发的热点。
1,3-丙二醇工业生产方法主要有化学法和生物法两大类。化学法包括:以丙烯醛为原料,经水合、加氢的丙烯醛水合工艺和以环氧乙烷(EO)为原料,经氢甲酰化、再加氢的环氧乙烷氢甲酰化工艺。生物法是目前研究的热点,根据原料不同可分为葡萄糖一步转化法和甘油转化法。生物法虽然起步较早,但是直到二十世纪八十年代才逐渐引起人们的重视。尽管目前的主要方法仍然是化学法,但是与化学法相比,微生物转化法具有条件温和、操作简便、选择性好、节省能源、设备投资少和环境良好等特点,是一种生产成本最低、污染最少的方法,符合当今“绿色化工”和“可持续性发展”的要求。
通过微生物发酵生产1,3-丙二醇的生产工艺主要分为两类:以葡萄糖为原料利用基因工程菌转化生产1,3-丙二醇和以甘油为原料利用克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)、弗氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)、成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)和巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridium pasteuianu)等细菌转化生产1,3-丙二醇。生物法生产1,3-丙二醇,目前存在产物浓度低、生产周期长和甘油转化率低等问题,直接影响生物法生产1,3-丙二醇的规模化应用。解决上述问题,既可以通过生物化工上游技术,利用基因工程等技术手段,对发酵菌种加以改造,以提高菌种的发酵水平、产物的转化能力,也可以在生物发酵阶段,连续、分批补料、反应分离相耦合的培养方式,优化发酵条件,提高发酵水平。
CN1348007A公开了一种微生物微氧发酵生产1,3-丙二醇的方法,其所使用的微生物细胞不仅在厌氧条件下,而且在微氧条件下都能将甘油转化为1,3-丙二醇。其优点是发酵工艺简单经济,既简化了操作条件,降低了生产成本,又缩短了发酵时间,提高了生产效率,而且微氧条件下发酵液中1,3-丙二醇的浓度与厌氧发酵相当或略高一些,为微生物发酵法生产1,3-丙二醇的工业化提供了简单经济的发酵工艺。但是,微氧发酵的方法对于兼性厌氧微生物来说,促进效应具有局限性,仅对菌体生长阶段具有增益作用。而对于以甘油为底物,发酵生产1,3-丙二醇这一代谢过程而言,是一个严格的还原反应,因此微氧条件并不利于底物甘油的转化及产物1,3-丙二醇的积累。
CN1434122A公开了一种采用两段双底物集成发酵生产1,3-丙二醇的方法,其二级种子培养是以葡萄糖和甘油为混合双底物,将耗氧条件下的二级种子培养和厌氧条件下的甘油厌氧转化集成在同一个发酵罐中进行。该方法能够减少工艺步骤,提高设备的利用率,缩短了工艺周期。虽然空气的通入有利于兼性厌氧菌种生物量的积累,但是底物中引入的葡萄糖,葡萄糖代谢产物会影响到甘油发酵生产1,3-丙二醇的反应,以致影响最终1,3-丙二醇的产率。
CN1955304A公开了一种微生物利用甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的方法,其特征在于通过在发酵培养基中或在菌体生长的指数期添加适量的有机中间代谢成分,实现了1,3-丙二醇发酵过程中底物与产物间理想的通量分布,进而实现高效的1,3-丙二醇发酵。虽然优化培养基中添加营养条件可以对菌体生长及发酵水平起到改善作用,但是很多营养分子的摄入完全取决于生物代谢的需求,诸如TCA循环中的有机中间分子在厌氧途径中需求量并不大,其促进发酵的效果并不明显。
上述方法虽然能够起到简化流程、缩短培养周期等优点,但是以上方法对于促进甘油的转化、提高1,3-丙二醇的生产效率等方面作用效果不明显。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供一种促进微生物转化生产1,3-丙二醇的方法。本发明根据菌体细胞离子通道的特性,解决了发酵体系渗透压过大的问题,能够有效促进甘油转化,大幅提高最终产物中1,3-丙二醇的浓度。
本发明促进微生物转化生产1,3-丙二醇的方法,包括如下内容:
(1)菌种活化:将菌种保藏液与种子培养基按比例混合后进行微氧培养,采用氢氧化钾调控pH为6~8,培养10h~16h得到菌种活化液;
(2)菌种扩大培养:将菌种活化液与种子培养基按比例混合后进行微氧培养,采用氢氧化钾调控pH为6~8,培养10h~16h得到种子液;
(3)发酵培养:以甘油为底物,将种子液和发酵培养基按比例混合,首先进行微氧发酵,发酵时间控制为6h~12h,发酵过程中采用氢氧化钾调控pH为6~8;然后进行厌氧发酵,发酵过程中采用2%~5%氨水调控pH为6~8。
本发明中,氢氧化钾的质量浓度为25%~40%,氨水的质量浓度为2%~5%。
本发明中,步骤(1)菌种保藏液与种子培养基的体积比为1:50~1:100,培养温度为30~40℃,搅拌速度为50~200rpm。
本发明中,步骤(2)菌种活化液与种子培养基的体积比为1:10~1:20,培养温度为30~40℃,搅拌速度为50~200rpm。
本发明中,所述的种子培养基的组成以g/L计为:甘油 40,NH4Cl 2.14,KCl 0.2,NaH2PO4·H2O 1.1,Na2SO4 0.23,MgCl2·6H2O 0.2,柠檬酸 0.34,酵母膏 1,Vc 0.1。优选在种子培养基中加入营养液,营养液的组成以每L计为:FeCl3·6H2O 5.4g,Na2MoO4·2H2O0.005g,ZnCl2·6H2O 0.68g,MnCl2·4H2O 0.17g,H3BO3 0.06g,CoCl2·6H2O 0.47g,CuSO4·5H2O 0.688g,37%HCl 1mL。
本发明中,菌种活化过程与菌种扩大培养过程采用微氧培养,微氧培养采用通入空气的形式,空气通入量为0~0.1vvm。
本发明中,步骤(3)种子液与发酵培养基的体积比为1:5~1:10,培养温度为30~40℃,搅拌速度为200~500rpm。
本发明中,步骤(3)在厌氧发酵前首先进行一段时间的微氧发酵,即采取先微氧发酵、再厌氧发酵的两段控制模式,其中微氧发酵采用通入空气的形式,空气通入量为0~0.1vvm;厌氧发酵采用通入氮气的形式,氮气通入量为0.1~0.6vvm,其中氮气纯度范围为92%~98%。
本发明中,所述发酵培养基组成以g/L计为:甘油 40,NH4Cl 2.67,KCl 0.2,NaH2PO4·H2O 1.38,Na2SO4 0.28,MgCl2·6H2O 0.26,柠檬酸 0.42,酵母膏 2,Vc 0.1。优选在发酵培养基中加入营养液,营养液的组成以每L计为:Na2MoO4·2H2O 0.035g,ZnCl2·6H2O0.07g, H3BO3 0.06g,CoCl2·6H2O 0.2g,CuSO4·5H2O 0.029g,MgSO4·4H2O 0.1g,NiCl2·6H2O 0.025g,37%HCl 0.9mL。
本发明中,以甘油为底物,发酵初始甘油浓度控制在25~45g/L,发酵过程中从厌氧发酵阶段开始采用区间定速流加的形式加入甘油,甘油流加速率为6~12g/(L·h),甘油补加总量为80~120g/L。
本发明中,转化1,3-丙二醇的微生物主要为兼性厌氧菌,如克雷伯杆菌(Klebsiel la pneumoniae)、弗氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)等,优选使用克雷伯杆菌。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
1、厌氧发酵模式下,产能代谢效率较低,为提供足够多的ATP,底物水平的磷酸化非常活跃,因此副产物较多。在以甘油为底物,微生物厌氧转化生产1,3-丙二醇体系中,从乙酰辅酶A到乙酸的代谢过程异常活跃,在提供足够多的ATP的同时,副产乙酸量较高,甘油选择性较差。本发明在厌氧发酵阶段,采用氨水作为pH调节剂,从呼吸链角度,引入一定量铵根离子,一方面优化了还原力配置,使更多的还原力用于甘油还原途径,形成产物1,3-丙二醇;另一方面,铵根离子进入呼吸链直接形成ATP优化了能量构成,有效的抑制了乙酸的代谢过程,降低了副反应产物乙酸的产生。
2、以甘油为底物,经微生物厌氧转化生产1,3-丙二醇过程中,副产有机酸很多,随着发酵周期的延长,过多中和剂的添加,使发酵体系的渗透压加大,影响菌体细胞活性,在发酵周期内降低了生产强度。本发明根据菌体细胞离子通道的特性,结合细胞内环境高钾低钠的特征,在发酵培养基中减少含钾无机盐、无机氮源的加入,并将氢氧化钾、氨水作为pH调节剂,从而减低了无机盐使用量,缓解了发酵体系渗透压过大的问题,有利于稳定细胞活性,提高发酵生产强度。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的效果,但不构成对本发明的限制。
本发明实施例中,以Waters 2695分离系统与Waters 2414示差检测器构成液相分析系统,其中分离柱选用Aminex HPX-87H有机酸和醇分析柱用于酸类和醇类的分离。以琥珀酸、乳酸、甘油、乙酸、1,3-丙二醇、乙醇标准样品建立标准图谱,反应过程中进行产物分析。
本发明实施例中,所用的菌种为公开的克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae),来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种,菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,菌种保藏号:CGMCC No.0798。
本发明实施例中,种子培养基与发酵培养基的基本组成见表1。
表1 种子培养基及发酵培养基的组成
实施例1
(1)菌种活化:取液体保藏的克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)菌种保藏液2mL加入200mL种子培养基中,混合于500mL摇瓶中微氧培养,不通入空气。
培养条件控制为:培养温度为 37℃,摇床转数设为100rpm,采用25%氢氧化钾将pH控制在7.0。
(2) 菌种扩大培养:取菌种活化液60mL加入600mL种子培养基中,混合于1L发酵罐中,进行微氧培养,空气通入量为0.1vvm。
培养条件控制为:培养温度为 37℃,摇床转数设为100rpm,采用25%氢氧化钾将pH控制在7.0。
(3)发酵培养:采用间歇发酵模式,发酵罐体积选择15L,装液体积为7L。具体步骤如下:
a、取660mL种子液加入到6340mL发酵培养基中,混合于15L发酵罐,发酵过程控制培养温度为37℃,搅拌速度为400rpm;
b、发酵开始至8h,采用不通气体的微氧发酵模式,并以30%KOH调节pH为7.0;
c、发酵8h后,采用厌氧发酵模式,通入0.1 vvm氮气,并以5%氨水调节pH为7.0,厌氧过程中以8g/(L·h)加入甘油,共补加12.5h。
发酵36h,经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为68.72g/L,甘油浓度17.66g/L,乙酸浓度17.86g/L。
实施例2
(1)菌种活化:取液体保藏的克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)菌种保藏液2mL加入150mL种子培养基中,混合于250mL摇瓶中微氧培养,空气通入量为0.1vvm。
培养条件控制为:培养温度为 37℃,摇床转数设为100rpm,采用30%氢氧化钾将pH控制在6.5。
(2) 菌种扩大培养:取菌种活化液50mL加入700mL种子培养基中,混合于1L发酵罐中,进行微氧培养,不通入空气。
培养条件控制为:培养温度为 37℃,摇床转数设为100rpm,采用30%氢氧化钾pH控制在6.5。培养过程中保持不通气体的微氧条件。
(3)发酵培养:采用间歇发酵模式,发酵罐体积选择15L,装液体积为7L。具体步骤如下:
a、取660mL种子液加入到6340mL发酵培养基中,混合于15L发酵罐,发酵过程控制培养温度为37℃,搅拌速度为400rpm;
b、发酵开始至10h,采用微氧发酵模式,空气通入量为0.1vvm,并以30%KOH调节pH至6.5;
c、发酵10h后,采用厌氧发酵模式,通入0.2vvm氮气,并以2%氨水调节pH至6.5,厌氧过程中以10g/(L·h)流加甘油,共补加10h。
发酵36h,经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为67.32g/L,甘油浓度23.58g/L,乙酸浓度16.15g/L。
实施例3
(1)菌种活化:取液体保藏的克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)菌种保藏液2mL加入150mL种子培养基中,混合于250mL摇瓶中微氧培养,不通入空气。
培养条件控制为:培养温度为 37℃,摇床转数设为100rpm,采用40%氢氧化钾将pH控制在7.5。
(2) 菌种扩大培养:取菌种活化液50mL加入700mL种子培养基中,混合于1L发酵罐中,进行微氧培养,不通入空气。
培养条件控制为:培养温度为 37℃,摇床转数设为100rpm,采用40%氢氧化钾将pH控制在7.5。
(3)发酵培养:采用间歇发酵模式,发酵罐体积选择15L,装液体积为7L。具体步骤如下:
a、取660mL种子液加入到6340mL发酵培养基中,混合于15L发酵罐,发酵过程控制培养温度为37℃,搅拌速度为400rpm;
b、发酵开始至10h,采用不通气体的微氧发酵模式,并以40%KOH调节pH至7.5;
c、发酵10h后,采用厌氧发酵模式,通入0.1vvm氮气,并以5%氨水调节pH至7.5,厌氧过程中以10g/(L·h)流加甘油,共补加10h。
发酵36h,经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为64.27g/L,甘油浓度14.51g/L,乙酸浓度17.99g/L。
实施例4
处理工艺及操作条件同实施例1,其区别在于在种子培养基中添加0.4%(V/V)营养液Ⅰ,发酵培养基中添加0.5%(V/V)营养液Ⅱ,营养液Ⅰ和营养液Ⅱ的组成如表2所示。
表2 营养液Ⅰ和营养液Ⅱ的组成
发酵36h,经检测最终产物中1,3-丙二醇浓度为73.59g/L,甘油浓度14.53g/L,乙酸浓度18.39g/L。
比较例 1
处理工艺及操作条件同实施例1,其区别在于采用氢氧化钠替代氢氧化钾作为调节剂。发酵36h,最终产物中1,3-丙二醇浓度为60.32g/L,甘油浓度22.22g/L,乙酸浓度19.54g/L。
比较例2
处理工艺及操作条件同实施例1,其区别在于全程采用25%氢氧化钾作为调节剂。发酵36h,最终产物中1,3-丙二醇浓度为59.15g/L,甘油浓度28.12g/L,乙酸浓度18.92g/L。
比较例3
处理工艺及操作条件同实施例1,其区别在于发酵全程采用厌氧发酵模式。发酵36h,最终产物中1,3-丙二醇浓度为67.26g/L,甘油浓度23.68g/L,乙酸浓度21.52g/L。
比较例4
处理工艺及操作条件同实施例1,其区别在于全程以5%氨水作为调节剂。发酵36h,最终产物中1,3-丙二醇浓度为58.56g/L,甘油浓度35.75g/L,乙酸浓度17.56g/L。
比较例5
处理工艺及操作条件同实施例3,其区别在于发酵全程采用不通入空气的微氧发酵模式。发酵36h,最终产物中1,3-丙二醇浓度为56.12g/L,甘油浓度28.63g/L,乙酸浓度20.20g/L。
由比较例1、2、3和实施例1可知,一方面,克雷伯氏菌作为一种典型的兼性厌氧微生物其发酵过程中受能量代谢影响明显,因此厌氧发酵期作为pH调节剂引入的铵根离子能够从呼吸链角度的接入,有效改善相关代谢反应,从提高发酵产物浓度上看取得了明显效果;另一方面,氢氧化钾作为调节剂,从改变体系离子构成的角度,增强了细胞对渗透压的耐受,有利于提高发酵水平。
由比较例4和实施例1可知,氨水碱性较弱,作为pH调节剂使用添加体积较大,发酵体积增加降低了产物浓度,另一方面,体系中钾离子浓度较低,影响了渗透压平衡及跨膜运输效率,从而发酵水平并不高。
由比较例5和实施例3可知,克雷伯氏菌属于典型的兼性厌氧微生物,微氧条件下氧化途径的相关代谢途径被激活,产物1,3-丙二醇的产量较低,因此对于该菌种转化甘油制备1,3-丙二醇的代谢途径来看,厌氧发酵有利于降低副反应,提高产物选择性,提高发酵水平。
Claims (13)
1.一种促进微生物转化生产1,3-丙二醇的方法,其特征在于包括如下内容:
(1)菌种活化:将菌种保藏液与种子培养基按比例混合后进行微氧培养,采用氢氧化钾调控pH为6~8,培养10h~16h得到菌种活化液;
(2)菌种扩大培养:将菌种活化液与种子培养基按比例混合后进行微氧培养,采用氢氧化钾调控pH为6~8,培养10h~16h得到种子液;
(3)发酵培养:以甘油为底物,将种子液和发酵培养基按比例混合,首先进行微氧发酵,发酵时间控制为6h~12h,发酵过程中采用氢氧化钾调控pH为6~8;然后进行厌氧发酵,发酵过程中采用氨水调控pH为6~8。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述氢氧化钾的质量浓度为25%~40%,氨水的质量浓度为2%~5%。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)菌种保藏液与种子培养基的体积比为1:50~1:100,培养温度为30~40℃,搅拌速度为50~200rpm。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(2)菌种活化液与种子培养基的体积比为1:10~1:20,培养温度为30~40℃,搅拌速度为50~200rpm。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述种子培养基的组成以g/L计为:甘油40,NH4Cl 2.14,KCl 0.2,NaH2PO4·H2O 1.1,Na2SO4 0.23,MgCl2·6H2O 0.2,柠檬酸 0.34,酵母膏 1,Vc 0.1。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:在种子培养基中加入营养液,营养液的组成以每L计为:FeCl3·6H2O 5.4g,Na2MoO4·2H2O 0.005g,ZnCl2·6H2O 0.68g,MnCl2·4H2O0.17g,H3BO3 0.06g,CoCl2·6H2O 0.47g,CuSO4·5H2O 0.688g,37%HCl 1mL。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述菌种活化过程与菌种扩大培养过程采用微氧培养,微氧培养采用通入空气的形式,空气通入量为0~0.1vvm。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(3)种子液与发酵培养基的体积比为1:5~1:10,培养温度为30~40℃,搅拌速度为200~500rpm。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(3)微氧发酵采用通入空气的形式,空气通入量为0~0.1vvm;厌氧发酵采用通入氮气的形式,氮气通入量为0.1~0.6vvm。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述发酵培养基组成以g/L计为:甘油40,NH4Cl 2.67,KCl 0.2,NaH2PO4·H2O 1.38,Na2SO4 0.28,MgCl2·6H2O 0.26,柠檬酸0.42,酵母膏 2,Vc 0.1。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于:在发酵培养基中加入营养液,营养液的组成以每L计为:Na2MoO4·2H2O 0.035g,ZnCl2·6H2O 0.07g, H3BO3 0.06g,CoCl2·6H2O0.2g,CuSO4·5H2O 0.029g,MgSO4·4H2O 0.1g,NiCl2·6H2O 0.025g,37%HCl 0.9mL。
12.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:以甘油为底物,发酵初始甘油浓度控制在25~45g/L,发酵过程中从厌氧发酵阶段开始采用区间定速流加的形式加入甘油,甘油流加速率为6~12g/(L·h),甘油补加总量为80~120g/L。
13.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:转化1,3-丙二醇的微生物为克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)或弗氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)。
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