CN107058416A - 一种精制谷氨酸的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸制备技术领域，公开了一种精制谷氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备种子液，步骤2）制备发酵液，步骤3）分离，步骤4）浓缩、结晶。本发明工艺提高了发酵产酸效率，通过分离纯化工艺获得的产品纯度和收率高。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸制备技术领域，具体涉及一种精制谷氨酸的发酵工艺。
背景技术
谷氨酸，是一种酸性氨基酸。分子内含两个羧基，化学名称为α-氨基戊二酸。谷氨酸是里索逊1856年发现的，为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。味精由谷氨酸制备而得。
谷氨酸棒杆菌是微生物工业发酵生产谷氨酸的主要菌株。人们一直通过各种方法改造菌株以提高氨基酸的产量，早期应用最广泛的为各种条件下的诱变育种，而随着氨基酸生物代谢途径的揭秘，有目的的在分子水平上对代谢途径进行改造也渐渐显露其优势，另外，中游的发酵条件优化过程以及下游的回收净化过程也是一个重点。但是，对于氨基酸分泌过程的研究，却起步较晚，而且人们一直把注意力集中在细胞膜氨基酸的转运蛋白上。申请人前期主要研究培养基组分以及菌株配伍方面对谷氨酸发酵效率的影响，取得了一定的效果，参见专利技术“一种新的谷氨酸生产方法”以及“一种谷氨酸高产酸工艺”。
现有技术中谷氨酸的提取方法有低温等电法、等电—离交法。其中，低温等电法是将发酵液加酸调至谷氨酸的等电点，使谷氨酸的溶解度降低，从而沉淀析出，结晶收率通常可以达到75％以上，如果采用低温等电法(10℃)，则收率可达到80％。等电—离交工艺是将发酵液等电结晶后，母液继续用酸调整到pH1.7，然后用强酸性阳离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，总收率可达96％。但是此法酸碱用量大、废水量大，成本较高，而且等电离交工艺产生的废水很难处理，环境污染问题非常严重。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种精制谷氨酸的发酵工艺。
本发明是通过如下方案来实现的：
一种精制谷氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备种子液，步骤2）制备发酵液，步骤3）分离，步骤4）浓缩、结晶。
具体地，所述发酵工艺包括如下步骤：
步骤1）制备种子液：将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13761接种到种子培养基中，在32℃，100rpm摇床培养12h，得到的谷氨酸棒杆菌种子液；
步骤2）制备发酵液：将氨酸棒杆菌种子液以8％接种量接种到发酵罐，发酵时间共为48小时；0-46小时，控制温度为32℃，常压，其中，在第40小时，添加曲拉通X-100；第47-48小时，控制温度为39-40℃，压强为3-3.5个大气压，其中，在第43小时，添加氯化钠；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在4.5；并通过流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0wt％，发酵至48h停止，得发酵液；
步骤3）分离：利用高速碟片分离机对发酵液进行离心，收集上层谷氨酸料液和菌体蛋白沉淀；谷氨酸料液经过超滤膜超滤，收集滤过液；
步骤4）浓缩、结晶：然后浓缩成原体积三分之一的浓缩液；往一级等电罐中流加上述浓缩液，同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5，温度控制在22℃，经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，二级等电点罐pH控制3.3，温度10℃；经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，三级等电点罐pH控制3.2，温度5℃；离心获得结晶的谷氨酸。
优选地，所述种子培养基的组分为(质量百分比)：葡萄糖3％、玉米浆3％、尿素1％，K2HPO40.2％、Na2HPO4 0.2％、硫酸锰0.01％、MgSO40.01％，115℃灭菌15min，调pH为4-4.5。
优选地，所述发酵罐培养基的组分为（质量百分比）：葡萄糖6%，糖蜜3%，玉米浆5%，尿素0.5%，硫酸亚铁0.02%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，pH 4-4.5。
优选地，所述高速碟片机的转速为4000rpm，离心时间为3min。
优选地，所述曲拉通X-100的添加量为1-2μg/mL。
优选地，所述氯化钠的添加量为10-20μg/mL。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明通过提高发酵培养温度，可增加分子扩散的速度，提高了谷氨酸的分泌率；
增加压力对细胞的挤压作用增强, 辅助以适当浓度的盐溶液来改变菌体细胞的渗透压，细胞表面发生轻微变形,细胞膜的通透性增加；
培养过程后期加入曲拉通X-100，干扰细胞壁的合成，改善菌体细胞壁和细胞膜对催化反应中底物和产物的传质限制；
本发明通过添加曲拉通X-100以及氯化钠结合温度压强的改变，实现谷氨酸棒杆菌培养与透性化处理的耦合，可以在不需要对培养好的细胞进行后续透性化处理的情况下减小菌体细胞壁和细胞膜对底物和产物的传质限制，避免后续透性化处理细胞的步骤及相关设备运转的投入；
本发明发酵产率高，通过分离纯化工艺使得谷氨酸纯度为90％以上，收率为95%以上，成品颜色感官好，结晶粒均匀；
本发明采用浓缩等电技术，硫酸的消耗最低，大大降低了成本，提高了工业附加值；常规菌株在发酵生产谷氨酸过程中，需流加氨水控制7左右，而发酵结束时，需向发酵液中投入大量浓硫酸调节3左右，本发明采用低PH值的谷氨酸进行发酵，可减少氨水和硫酸的消耗，降低了成本。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种精制谷氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：
将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13761接种到种子培养基中，在32℃，100rpm摇床培养12h，得到的谷氨酸棒杆菌种子液；所述谷氨酸棒杆菌种子培养基的组分为(以下均为质量百分比)：葡萄糖3％、玉米浆3％、尿素1％，K2HPO40.2％、Na2HPO4 0.2％、硫酸锰0.01％、MgSO40.01％，115℃灭菌15min，调pH为4-4.5；
将种子液以8％接种量接种到发酵罐，发酵时间为48小时；0-46小时，控制温度为32℃，常压，其中，在第40小时，添加曲拉通X-100（Triton X-100），添加量为1μg/ml；第47-48小时，控制温度为39℃，压强为3个大气压，其中，在第43小时，添加氯化钠，添加量为10μg/ml；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在4.5；并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，发酵至48h停止，得发酵液；
其中，发酵罐培养基为（质量百分比）：葡萄糖6%，糖蜜3%，玉米浆5%，尿素0.5%，硫酸亚铁0.02%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，pH 4-4.5；
利用高速碟片分离机将谷氨酸料液和菌体蛋白分离；高速碟片机的转速为4000rpm，时间为3min；谷氨酸料液经过超滤膜超滤（超滤膜截留分子量为300Da，超滤温度为35℃），收集滤过液，然后浓缩成原体积三分之一的浓缩液；往一级等电罐中流加上述浓缩液，同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5，温度控制在22℃，经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，二级等电点罐pH控制3.3，温度10℃；经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，三级等电点罐pH控制3.2，温度5℃；离心获得结晶的谷氨酸。
实施例2
一种精制谷氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：
将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13761接种到种子培养基中，在32℃，100rpm摇床培养12h，得到的谷氨酸棒杆菌种子液；所述谷氨酸棒杆菌种子培养基的组分为(以下均为质量百分比)：葡萄糖3％、玉米浆3％、尿素1％，K2HPO40.2％、Na2HPO4 0.2％、硫酸锰0.01％、MgSO40.01％，115℃灭菌15min，调pH为4-4.5；
将种子液以8％接种量接种到发酵罐，发酵时间为48小时；0-46小时，控制温度为32℃，常压，其中，在第40小时，添加曲拉通X-100（Triton X-100），添加量为1-2μg/ml；第47-48小时，控制温度为40℃，压强为3.5个大气压，其中，在第43小时，添加氯化钠，添加量为20μg/ml；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在4.5；并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，发酵至48h停止，得发酵液；
其中，发酵罐培养基为（质量百分比）：葡萄糖6%，糖蜜3%，玉米浆5%，尿素0.5%，硫酸亚铁0.02%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，pH 4-4.5；
利用高速碟片分离机将谷氨酸料液和菌体蛋白分离；高速碟片机的转速为4000rpm，时间为3min；谷氨酸料液经过超滤膜超滤，收集滤过液，然后浓缩成原体积三分之一的浓缩液；往一级等电罐中流加上述浓缩液，同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5，温度控制在22℃，经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，二级等电点罐pH控制3.3，温度10℃；经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，三级等电点罐pH控制3.2，温度5℃；离心获得结晶的谷氨酸。
实施例3
各因素对谷氨酸发酵产量的影响：
设置对照组，其中，对照组1：不改变温度和压强，维持温度为32℃和常压条件下，其余同实施例1；对照组2：不添加曲拉通X-100和氯化钠，其余同实施例1；试验组为实施例1。各组别发酵液中谷氨酸产量见表1：
表1
| 组别 | 对照组1 | 对照组2 | 试验组 |
| 谷氨酸产量（g/L） | 83.1 | 91.8 | 119.4 |
实施例4
一、压强梯度试验：针对发酵第47-48小时，选择1-6大气压进行测试，其余实验流程同实施例1，具体发酵结果见表2：
表2
| 大气压强度 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 谷氨酸产量（g/L） | 96.5 | 110.1 | 119.4 | 115.6 | 101.4 | 96.3 |
温度梯度试验：针对发酵第47-48小时，选择32-42℃进行测试，其余实验流程同实施例2，具体发酵结果见表3：
表3
| 温度℃ | 32 | 34 | 36 | 38 | 40 | 42 |
| 谷氨酸产量（g/L） | 91.3 | 94.1 | 103.5 | 115.8 | 121.4 | 107.7 |
结论：适当强度的压强可以提高谷氨酸产量，压强过大时，可能会导致菌株活力降低或者死亡，从而导致产酸量下降；适当提高温度可以增加细胞壁的透过性，从而提高谷氨酸产量，温度过高时，可能会导致菌株活力降低或者死亡，从而导致产酸量下降。
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种精制谷氨酸的发酵工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备种子液，步骤2）制备发酵液，步骤3）分离，步骤4）浓缩、结晶。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵工艺包括如下步骤：
步骤1）制备种子液：将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13761接种到种子培养基中，在32℃，100rpm摇床培养12h，得到的谷氨酸棒杆菌种子液；
步骤2）制备发酵液：将氨酸棒杆菌种子液以8％接种量接种到发酵罐，发酵时间共为48小时；第0-46小时，控制温度为32℃，常压，其中，在第40小时，添加曲拉通X-100，在第43小时，添加氯化钠；第47-48小时，控制温度为39-40℃，压强为3-3.5个大气压；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在4.5；并通过流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0wt％，发酵至48h停止，得发酵液；
步骤3）分离：利用高速碟片分离机对发酵液进行离心，收集上层谷氨酸料液和菌体蛋白沉淀；谷氨酸料液经过超滤膜超滤，收集滤过液；
步骤4）浓缩、结晶：将步骤3）所得滤过液浓缩成原体积三分之一的浓缩液；往一级等电罐中流加上述浓缩液，同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5，温度控制在22℃，经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，二级等电点罐pH控制3.3，温度10℃；经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐，同时加入浓硫酸调pH值，其中，三级等电点罐pH控制3.2，温度5℃；离心获得结晶的谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于，所述种子培养基的组分为(质量百分比)：葡萄糖3％、玉米浆3％、尿素1％，K2HPO4 0.2％、Na2HPO4 0.2％、硫酸锰0.01％、MgSO40.01％，115℃灭菌15min，调pH为4-4.5。
4.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵罐培养基的组分为（质量百分比）：葡萄糖6%，糖蜜3%，玉米浆5%，尿素0.5%，硫酸亚铁0.02%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，pH 4-4.5。
5.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于，所述高速碟片机的转速为4000rpm，离心时间为3min。
6.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于，所述曲拉通X-100的添加量为1-2μg/mL。
7.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于，所述氯化钠的添加量为10-20μg/mL。
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| CN107058416B (zh) | 2020-09-11 |
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