CN103992964B - 一种耐高pH值菌种及发酵法生产赖氨酸方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐高PH值菌种及新型发酵法生产赖氨酸方法，耐高PH值菌种，发酵过程不使用硫酸氨作为无机氮源，用氨水或液氨补充发酵液中氮源来合成赖氨酸，在发酵生产赖氨酸的过程中不添加硫酸铵，采用补入氨水或液氨作为氮源，使发酵液中硫酸根离子的浓度大大降低，方便了后续发酵液的处理，不需要离子交换去除硫酸根等离子进行提纯，进从而简化了生产饲料级赖氨酸盐酸盐的工艺，降低生产成本。补入氨水或液氨的方式采用调整发酵液中PH来控制发酵液中无机氮含量，保证培养罐中无机氮含量在合理范围内，同时不再流加硫酸铵，减少发酵液中硫酸根离子等杂质含量，便于提取。

Description

一种耐高pH值菌种及发酵法生产赖氨酸方法

技术领域

本发明属于发酵法生产赖氨酸的方法，尤其涉及一种耐高pH值菌种及发酵法生产赖氨酸方法。

背景技术

由于在食品或饲料中L-赖氨酸含量不足时，会限制其它氨基酸的利用，因此赖氨酸广泛用于食品的强化、动物饲料的添加剂和药用，L-赖氨酸是当前国内外全价配合饲料的主要添加剂，具有提高饲料利用率，促进动物生长和改进肉质的功效。

目前，生产饲料级L-赖氨酸盐酸盐过程中，发酵较多的采用连续发酵培养，在连续发酵培养中主要采用流加硫酸铵的方式提供氮源，保证赖氨酸的合成。硫酸铵中的氮被逐步消耗掉，而硫酸根离子则滞留在发酵液中，随发酵时间的延长，发酵液中硫酸根离子逐渐增加，发酵结束后，发酵液中存在大量硫酸根离子，为提取工段造成一定难度。

传统工艺采用发酵液膜过滤、经强酸性阳离子交换树脂吸附解脱赖氨酸、浓缩、调酸结晶、离心分离干燥等工序生产饲料级赖氨酸盐酸盐。在离交工艺中用硫酸调节物料pH，用氨水进行解脱，同时需要大量纯水用于清洗、洗脱，而且在此过程中产生大量低浓废水、高浓废水，其中，高浓废水中含有大量硫酸铵需要提取回用，生产硫酸铵的过程中产生大量冷凝水，增加了水处理成本；增加了治理负担。

传统赖氨酸发酵过程pH一般控制小于7.2，不低于6.5，优先pH在7.0，此时赖氨酸生产和菌体生长均正常；过高或过低的pH，均会影响或抑制发酵过程赖氨酸生产和菌体生长，使发酵结束过程菌体偏低，发酵赖氨酸产率偏低。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供了一种耐高pH值菌种及发酵法生产赖氨酸方法，本发明提供了一种耐高pH值菌种，发酵过程不使用硫酸氨作为无机氮源，用氨水或液氨补充发酵液中氮源来合成赖氨酸，在发酵生产赖氨酸的过程中不添加硫酸铵，采用补入氨水或液氨作为氮源，使发酵液中硫酸根离子的浓度大大降低，方便了后续发酵液的处理，不需要离子交换去除硫酸根等离子进行提纯，进从而简化了生产饲料级赖氨酸盐酸盐的工艺，降低生产成本。补入氨水或液氨的方式采用调整发酵液中pH来控制发酵液中无机氮含量，保证培养罐中无机氮含量在合理范围内，同时不再流加硫酸铵，减少发酵液中硫酸根离子等杂质含量，便于提取。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种耐高pH值菌种，该菌株为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8184，保藏时间为2013年9月13日。

一种发酵法生产赖氨酸方法，具体包括以下步骤

（1）按常规方法配置生产赖氨酸的种子培养基，按120℃灭菌15-20分钟；将生产赖氨酸的菌种，即耐高pH值菌种接入生产赖氨酸的种子培养基中，在28～37℃下，优选35℃下摇床培养到对数生长期，得到生产赖氨酸的种液；

（2）连续发酵：将步骤（1）制得的生产赖氨酸的种液接入经常规方法灭菌的发酵培养基中，其中，生产赖氨酸的培养基接种量为初始体积的10%～20%，发酵液中初始糖浓度为20克/升～80克/升，连续发酵过程中温度控制在28～37℃下，优选35℃，通过向发酵液中通入无菌空气维持压力在0.02～0.08MP，并开动搅拌维持转速在500～800rpm，使发酵液中溶氧维持在15%～25%，在连续发酵过程中通过流加浓度为500～800克/升的葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度在5克/升～20克/升，同时向发酵液中添加营养物质，营养物质为有机氮源、磷酸、无机盐、维生素等；发酵液pH控制在7.2～7.6内的任意一个值附近。连续发酵时间为45～60hr。

（3）连续发酵结束的培养液，膜过滤后不需要经过树脂进行提纯，直接浓缩、调酸、结晶生产赖氨酸。过滤后发酵液硫酸根离子等阴阳离子杂质较少，可以用超滤膜、脱色等方式去除发酵液中杂质，使发酵液赖氨酸纯度提高到95%以上，然后经过四效浓缩把高纯度赖氨酸浓缩至干物在60～80％左右、用盐酸将浓缩液调节pH至5.0-5.5、结晶直接生产赖氨酸盐酸盐。

所述的pH控制在7.2～7.6内的任意一个值附近波动是7.4。

pH值控制方法：

（1）按照赖氨酸连续发酵中葡萄糖消耗速率和无机氮消耗速率，向培养基中添加浓度为500～800克/升的葡萄糖溶液和氨水或液氨，通过pH在一定范围内波动，使氨水或液氨补入，维持一定的无机氮浓度，维持一定的pH范围；中间过程维持发酵液中葡萄糖浓度在5克/升～20克/升；葡萄糖的消耗降低发酵液pH值，补充氨水或液氨提高发酵液pH值。

（2）向培养基中添加一量的营养物质，营养物质为有机氮源、磷酸、无机盐、维生素等，通过pH在一定范围内波动，使氨水或液氨补入，维持一定的无机氮浓度，维持一定的pH范围；营养物质的流加比例为葡萄糖补入量的1/8-1/3；营养物补加降低发酵液pH值，补充氨水或液氨提高发酵液pH值。

（3）将上述（1）、（2）所述的两种控制方式使培养基pH在7.2～7.6内的任意一个值附近波动。

所述步骤（2）中营养物质为有机氮源、磷酸、无机盐和维生素；

所述有机氮源为玉米浆、酵母粉和蛋白胨；无机盐为氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰；维生素为维生素B1、维生素H和维生素B3。

所述营养物质配方为下述成分，余量为水，

H₃PO₄ 10g/L

MgSO₄ 10g/L

KCL 5g/L

FeSO₄ 0.25g/L

MnSO₄ 0.25g/L

酵母粉 100g/L

玉米浆 20g /L

维生素B₁ 100mg/L

维生素H 80mg/L

维生素B₃ 70mg/L。

赖氨酸发酵过程由于葡萄糖消耗产酸酸性物质，pH会降低；另一方面通过流加一定量的营养物质，营养物质为有机氮源、磷酸、无机盐和维生素，也可使pH降低；为维持一定的pH，会使氨水或液氨自动补入，来提高发酵液pH。这几种方式使发酵液中无机氮维持在一定范围内，使赖氨酸菌种维持正常的代谢。

本发明中的pH值控制可通过市售的pH电极、传感器、及其他相关仪表来完成。

本发明中所述的生产赖氨酸的种子培养基和发酵培养基，可根据现有技术按照生产赖氨酸的不同时期所需种子培养基和发酵培养基，采用常规方法配置。

所述的菌种为一种耐高pH值菌种，该菌株为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，

保藏号为CGMCC No.8184，保藏时间为2013年9月13日。

本发明提供的生产赖氨酸的方法是基于这样的构思：目前在赖氨酸提取工艺中都采用离交树脂处理，在离交工艺中用硫酸调节物料pH，用氨水进行解脱，同时需要大量纯水用于清洗、洗脱，而且在此过程中产生大量低浓废水、高浓废水，其中，高浓废水中含有大量硫酸铵需要重新提取回收，生产硫酸铵的过程中产生大量冷凝水，增加了水处理成本；这就考虑能否不再经过离交工艺，这就要求尽量减少发酵液中的硫酸根离子，在连续发酵中采用氨水或液氨代替硫酸铵作为氮源，能大幅减少硫酸根离子的浓度；考虑到如何自动添加氨水或液氨，一方面赖氨酸发酵过程中pH会下降，会使氨水或液氨自动补入，另一方面可以添加适当的营养物，使pH降低，氨水或液氨补入，另外提高pH也可使氨水或液氨补入；这几个方面结合可以使发酵液中无机氮浓度维持在一定水平，保证了赖氨酸菌种的正常代谢。

本发明的有益效果是：本发明通过筛选得到一种耐高pH值菌种，发酵过程pH控制在7.2～7.6，远高传统赖氨酸发酵pH；传统赖氨酸发酵过程pH一般控制小于7.2，不低于6.5，优先pH在7.0本发明发酵过程不使用硫酸氨作为无机氮源，只使用氨水或液氨作为无机氮源，同时氨水或液氨作为pH调节剂；因为氨水或液氨即要作为无机氮源维持菌体生长需求，同时也要作为pH调节剂，维持pH值；所以过程中必须保证高pH值，来保证无机氮源充足，保证菌体及赖氨酸生产过程无机氮源充足，才能得到高的赖氨酸产率。

同现有技术相比，本发明提供的是在连续发酵过程中补加氨水或液氨，不流加硫酸铵，而使发酵液中不含有硫酸根离子，进而简化赖氨酸提取工艺的方法；本发明是在连续发酵过程中通过改变pH来控制氨水或液氨的补入，维持一定的无机氮浓度，进而保证赖氨酸菌种正常代谢；本发明的优势在于对赖氨酸提取工艺进行了简化。本发明通过在连续发酵中补入氨水或液氨提供氮源，发酵结束后由于发酵液中硫酸根离子较少，可以不用经过离交树脂，经过使用氨水或液氨作为氮源的发酵液经过膜过滤去除菌体、大分子蛋白等杂质，过滤后发酵液不经过离交树脂吸附解脱，直接通过脱色过滤及其他方法去除发酵液中其他离子等杂质，直接经过脱色过滤及其他方法去除发酵液中其他离子等杂质，然后直接通过浓缩、调酸、结晶、重结晶、离心分离、干燥等工艺生成赖氨酸盐酸盐。

具体实施方式

实施例一

菌种使用谷氨酸棒杆菌进行赖氨酸连续发酵生产赖氨酸，所用的培养基如下：

（1）斜面培养基：

蛋白胨12 g/L、酵母粉7 g/L、氯化钠5 g/L、蔗糖20g/L、琼脂20 g/L，培养基用30%氢氧化钾溶液调pH到7.5-8.0，在115℃灭菌20min，制备出高pH斜面培养基。

（2）种子摇瓶培养基：

蛋白胨 10 g/L

酵母粉 5 g/L

氯化钠 5 g/L

葡萄糖 40g/L

硫酸氨 5g/L

尿素 3g/L

磷酸二氢钾 3g/L

FeSO₄ 0.1g/L

MnSO₄ 0.1g/L

维生素B₁ 10mg/L

维生素H 10mg/L

维生素B₃ 20mg/L

用30%氢氧化钾溶液调pH到7.5-8.0，培养基在120℃灭菌15分钟。

（3）产L-赖氨酸的培养基：作为培养基可用含有碳源、氮源、无机盐离子及其他有机成分的普通培养基。碳源可以使用糖如葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖或淀粉水解物；氮源可以使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、尿素等，有机氮源如酵母浸膏、蛋白胨、玉米浆、大豆水解液等，氨水或液氨及是可以的；无机盐离子如硫酸镁、氯化钾、铁离子、锰离子等；有机成分可以引入如酵母粉、蛋白胨等；当使用需特殊物质培养的菌株如营养缺陷性时，可直接将这些物质加入培养基中，或者使用含有这些物质的蛋白水解物、蛋白胨、玉米浆、酵母抽提物等培养基。

培养条件优选在有氧条件下连续发酵培养时间为45～60hr最佳。培养温度优选控在28～37℃下，优选35℃。培养过程pH优选控在6.0～8.0。有机或无机、酸性或碱性物质控制pH。

该发酵培养基通过溶解下述成分（1L）

葡萄糖 50g

KH₂PO₄ 10g

MgSO₄ 1g

FeSO₄ 0.1g

MnSO₄ 0.1g

酵母粉 100g

玉米浆 6g

维生素B₁ 30mg

维生素H 40mg

维生素B₃ 30mg

用氨水或液氨调整pH到6.0,120℃灭菌30分钟。

实施例二

将菌株划线接入斜面培养基，在31.5℃下培养24-32hr。收集平板上菌株并进行扩大培养，筛选出生长较好的菌株作为实验菌株。从生长好的活化斜面上刮取1/4-1环种子，接入500ml液体培养基中，放入摇床培养。在温度35℃、转速180-220r培养条件下培养18-24小时。使摇瓶种子达到对数生长期。取摇瓶种子液按10%的接种量接入含有1L发酵培养基的3L自动发酵罐BIO-110（美国NBS公司）中，发酵罐带有温度、pH、溶氧等自动控制功能。

在发酵过程中发酵温度控制在35℃，罐压控制在0.03Mpa，通过调节通气量和转速控制溶氧在15%～25%。开始阶段pH设定为7.0，发酵过程比较稳定，到6hr开始补加浓度为500～800克/升的葡萄糖溶液，同时检测无机氮指标，发现为0.30g/dl，仍很高，到12hr时，发现无机氮指标为（以铵态氮计）0.22g/dl，开始频繁的调高pH到7.2，并开始添加营养物质，营养物质为有机氮源、磷酸、无机盐、维生素等，到24hr时pH调高到7.6，并进一步提高营养物质的比例；到30hr之后消耗较慢，将pH降到7.3，直到发酵结束。培养45hr，消耗葡萄糖270g，产酸率为80.5g/L，产酸总量为121.5g，糖酸转化率为45.0%。停罐发酵液用盐酸调节pH到5.6左右，再加热到80度左右经过膜过滤，将浓菌体去除掉，清液赖氨酸在78.9g/l，然后用氨基酸脱色树脂进行脱色，发酵液纯度达到95.2%，脱色过滤后的发酵液用蒸发器蒸发，蒸发到物料中赖氨酸浓度达到69.6%，然后将温度降低到45度左右结晶（上下波动不超过2度），物料再通过离心机进行离心分离并用去离子水进行水洗，吸水量为物料体积10%左右，离心后物料通过烘干检测相关指标，赖氨酸主含量为98.61%，水分0.7%，完全达到相关产品指标要求。母液需要重结晶进行提纯。

实施例三

菌种、种子准备及发酵条件同实例二。其中：连续发酵过程中用流加稀盐酸的方法控制pH，初始pH控在7.0，前期无机氮降低先用提高pH的方法，pH最高提到7.3。若耗无机氮消耗较快，pH在7.3时仍不能满足氨氮需要，再流加适量的浓盐酸控制。3hr开始流加营养物，营养物质（营养物质为有机氮源、磷酸、无机盐和维生素）的流加比例为葡萄糖补入量的1/8-1/3。

该营养物质配方通过溶解下述成分（1L）

H₃PO₄ 10g

MgSO₄ 10g

KCL 5 g

FeSO₄ 0.25g

MnSO₄ 0.25g

酵母粉 100g

玉米浆 20g

维生素B₁ 100mg

维生素H 80mg

维生素B₃ 70mg

培养过程中初始利用调高pH来控制，12hr之后用流加洗盐酸来控制，添加稀盐酸能使pH稳定在7.3，且使无机氮维持在0.06g/dl的水平。培养45hr，消耗葡萄糖330g，产酸率为92.5g/L，产酸总量为161.8g，糖酸转化率为49.03%。停罐发酵液用盐酸调节pH到5.6左右，再加热到80度左右经过膜过滤，将浓菌体去除掉，清液赖氨酸在91.2g/l，然后用氨基酸脱色树脂进行脱色，发酵液纯度达到94.9%，脱色过滤后的发酵液用蒸发器蒸发，蒸发到物料中赖氨酸浓度达到71.10%，然后将温度降低到45度左右结晶（上下波动不超过2度），物料通过离心机进行离心分离并用去离子水进行水洗，吸水量为物料体积10%左右，离心后物料通过烘干检测相关指标，赖氨酸主含量为98.53%，水分0.58%，完全达到相关产品指标要求。母液需要重结晶进行提纯。

发酵结束后，发酵液经过膜过滤去除菌体、大分子蛋白等杂质，过滤后发酵液不经过离交树脂吸附解脱，直接通过脱色过滤及其他方法去除发酵液中其他离子等杂质，然后直接通过浓缩、调酸、结晶、重结晶（母液）、离心分离、干燥等工艺生成赖氨酸盐酸盐。

本发明的发酵液膜过滤后不需要经过树脂直接浓缩结晶生产赖氨酸。过滤后发酵液硫酸根离子等阴阳离子杂质较少，可以实验用超滤膜、脱色等方式去除发酵液中杂质，使发酵液赖氨酸纯度提高到95%以上，然后经过浓缩、调酸、结晶等工艺直接生产赖氨酸。

本发明提取工艺中不需要离交工艺，传统工艺经强酸性阳离子交换树脂吸附解脱赖氨酸，在离交工艺中用硫酸调节物料pH，用5%氨水或液氨进行解脱，同时需要大量纯水用于清洗、洗脱，而且在此过程中产生大量低浓废水、高浓废水，其中，高浓废水中含有大量硫酸铵需要提取回用，生产硫酸铵的过程中产生大量冷凝水，增加了水处理成本；而新工艺中发酵液中硫酸离子较少，提取车间接受发酵液后不用硫酸调节pH值，新方法发酵液提取不经过树脂吸附解脱，节省了大量硫酸、氨水或液氨等生产原料，同时节省大量纯水，但需要用活性炭等原料进行脱色，因此其他原料有所增加。从两种工艺对比看新工艺节省大量硫酸及硫酸铵消耗，减少了树脂及设备投入，增加了活性炭过滤等成本，总之，不经离交直接结晶法生产赖氨酸比离交吸附解脱法生产成本下降较多。

Claims (7)

1.一种耐高pH值菌种，该菌种为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8184，保藏时间为2013年9月13日。

2.一种发酵法生产赖氨酸方法，具体包括以下步骤：

（1）将生产赖氨酸的菌种，即权利要求1中所述的耐高pH值谷氨酸棒杆菌接入生产赖氨酸的种子培养基中，摇床培养到对数生长期，得到生产赖氨酸的种子培养液；

（2）连续发酵：将步骤（1）制得的生产赖氨酸的种子培养液接入灭菌的发酵培养基中获得发酵液，其中，生产赖氨酸的种子培养液接种量为发酵培养基的初始体积的10%～20%，发酵培养基中初始糖浓度为20克/升～60克/升，通过向发酵液中通入无菌空气维持罐压0.04～0.08MP，并开动搅拌，使发酵液中溶氧维持在15%～25%；发酵过程使用氨水或液氨将发酵液pH控制在7.2～7.6内的任意一个值；在连续发酵过程中通过流加浓度为500～800克/升的葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度维持在5克/升～20克/升；同时向发酵液中添加营养物质，连续发酵时间为45～60hr；

（3）将连续发酵结束的培养液经膜过滤后浓缩结晶生产赖氨酸。

3.根据权利要求2所述的一种发酵法生产赖氨酸方法，其特征在于：所述步骤（1）整个过程中的温度为28～37℃。

4.根据权利要求2所述的一种发酵法生产赖氨酸方法，其特征在于：所述步骤（2）的连续发酵过程中温度控制在28～37℃。

5.根据权利要求2所述的一种发酵法生产赖氨酸方法，其特征在于：所述步骤（2）中营养物质为有机氮源、磷酸、无机盐和维生素。

6.根据权利要求5所述的一种发酵法生产赖氨酸方法，其特征在于：所述有机氮源为玉米浆和酵母粉；无机盐为氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰；维生素为维生素B1、维生素H和维生素B3。

7.根据权利要求5或6所述的一种发酵法生产赖氨酸方法，其特征在于：所述营养物质配方为下述成分，余量为水，

H₃PO₄ 10g/L

MgSO₄ 10g/L

KCL 5g/L

FeSO₄ 0.25g/L

MnSO₄ 0.25g/L

酵母粉 100g/L

玉米浆 20g /L

维生素B₁ 100mg/L

维生素H 80mg/L

维生素B₃ 70mg/L。