CN112094871A - 一种提高l-异亮氨酸产量的方法 - Google Patents

一种提高l-异亮氨酸产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高L‑异亮氨酸产量的方法，在细胞转型期，通过玉米浆干粉、Trition‑X双调控机制破坏细胞膜的完整性，提高细胞膜通透性，提高糖酸转化率，具体步骤为：发酵初期底物添加充足的玉米浆干粉，提高菌体生物量，中期改变菌体生长状态，抑制菌体生长，添加Trition‑X，促进菌体转型，增强产酸能力，并分批次补加玉米浆干粉，维持细胞活力；所述方法通过控制菌体对玉米浆干粉中生物素的摄入量及Trition‑X对细胞膜的物理破坏，增加细胞膜的通透性，提高胞内胞外物质转运能力，提高糖酸转化率。

Description

一种提高L-异亮氨酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种氨基酸的生产工艺，尤其是一种提高L-异亮氨酸产量的方法。
背景技术
L-异亮氨酸是人体必需氨基酸,同时又是三种支链氨基酸之一,因其特殊的结构和功能,在人类生命代谢中占有特别重要的地位。作为氨基酸原料药中的一种，主要用于复合氨基酸输液、三支链氨基酸输液、氨基酸口服液等，用于治疗肝病、肝昏迷,体弱乏力等疾病,是比较昂贵的氨基酸原料药之一。
日本在L-异亮氨酸产量、品质和技术水平均居世界领先地位，2018年，全球生产L-异亮氨酸的四家主要厂家日本的味之素、协和发酵、田边制药以及德国Degussa，均以发酵方式为主，其中，日本味之素占据了全球医药及食品用氨基酸市场份额的百分之六十。中国L-异亮氨酸发酵产业起步较晚，技术水平落后，糖酸转化率低，发酵副产物较多，后期分离提取困难，因此在国际上行业竞争能力相对较弱，但随着90年代中国氨基酸市场的开放，国内发酵行业迅猛发展，目前中国已经成为了氨基酸发酵产业大国。
微生物要大量积累L-异亮氨酸，必须使代谢调节异常化，这种代谢调节异常化需要通过人为手段改变，为解决L-异亮氨酸发酵中期细胞转型不彻底，解除胞内产物对L-异亮氨酸生产抑制作用的技术问题，选择适当的调控机制提高L-异亮氨酸产量及糖酸转化率具有非常重要的生产实践意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高L-异亮氨酸产量的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种提高L-异亮氨酸产量的方法，在细胞转型期，通过玉米浆干粉、Trition-X(聚乙二醇辛基苯基醚)双调控机制破坏细胞膜的完整性，提高细胞膜通透性，提高糖酸转化率，具体步骤为：发酵初期底物添加充足的玉米浆干粉，提高菌体生物量，中期改变菌体生长状态，抑制菌体生长，添加Trition-X(聚乙二醇辛基苯基醚)，促进菌体转型，增强产酸能力，并分批次补加玉米浆干粉，维持细胞活力。
优选的，上述提高L-异亮氨酸产量的方法，具体步骤如下：
(1)活化培养：从-80℃冰箱中取出谷氨酸棒杆菌保菌管，在斜面传两代，进行活化培养，得到活化菌株；采用的斜面培养基为：蛋白胨5g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉5g/L,玉米浆干粉15g/L，KH2PO41g/L,MgSO40.4g/L，NaCl1g/L,琼脂粉25g/L，赖氨酸1g/L，pH＝6.8～7.0；
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液；采用的种子培养基为：葡萄糖35g/L,MgSO40.7g/L,KH2PO41g/L,(NH4)2SO41.5g/L,酵母浸粉5g/L，玉米浆干粉20g/L,VB10.3mg/L,泡敌0.2g/L,用NaOH调节pH到4.5～5，种子发酵罐培养用氨水调节并维持pH到6.7～7.0；
(3)发酵培养：接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，中间补料，得到发酵液；采用的发酵培养基为：葡萄糖80g/L,MgSO4 0.8g/L,KH2PO4 1.6g/L,(NH4)2SO4 5g/L,,玉米浆干粉10g/L-40g/L,VB1 0.3g/L,豆饼水解液10ml/L,赖氨酸0.2g/L,蛋氨酸0.2g/L，用NaOH调节pH到4.5-5，发酵罐培养用氨水调节并维持pH到6.7-7.0，其中的NH4 +为转氨作用提供帮助。
优选的，上述提高L-异亮氨酸产量的方法，上述步骤(1)、(2)、(3)中玉米浆干粉中含有大量的生物素、小分子肽及其他速效氮源，用玉米浆干粉代替生物素添加到培养基中参与生物素调控，每g玉米浆干粉中含有1.5μg生物素。
优选的，上述提高L-异亮氨酸产量的方法，所述步骤(3)中在发酵16h添加Trition-X(聚乙二醇辛基苯基醚)水溶液，为透明乳状液体状非离子表面活性剂，所述Trition-X水溶液为5％Trition-X的水溶液，添加浓度为0.1-0.5g/L。
优选的，上述提高L-异亮氨酸产量的方法，所述步骤(3)中发酵培养基中玉米浆干粉添加量为10-40g/L，其含有的生物素量为15-60μg/L。
优选的，上述提高L-异亮氨酸产量的方法，所述步骤(3)中中间补料为分批次补加玉米浆干粉，在18、32、42h分别添加10-30g/L玉米浆干粉(其中含有15-40μg/L生物素)，维持细胞的正常活力。
优选的，上述提高L-异亮氨酸产量的方法，所述步骤(3)中发酵罐培养条件：接种量600mL，发酵体积3L,培养温度32℃，pH 6.7-7.0，溶氧30％以上，转速与溶氧联动，发酵时间36-40h。
优选的，上述提高L-异亮氨酸产量的方法，所述步骤(1)、(2)、(3)中玉米浆干粉属于难灭菌物质，需先电磁炉预煮沸40-60min，再用灭菌锅121℃，灭菌20-40min。
优选的，上述提高L-异亮氨酸产量的方法，所述步骤(1)、(2)、(3)中玉米浆干粉灭菌时高倍稀释至100-400g/L。
有益效果：
上述提高L-异亮氨酸产量的方法，通过控制菌体对玉米浆干粉中生物素的摄入量及Trition-X对细胞膜的物理破坏，增加细胞膜的通透性，提高胞内胞外物质转运能力，提高糖酸转化率。
所述提高L-异亮氨酸产量的方法，一方面通过控制合成细胞必要成分的缺失，使细胞膜合成不完整，另一方面引入外源表面活性剂通过机械手段破坏细胞膜，增加细胞膜通透性，从而解除胞内产物抑制及提高糖酸转化率。生物素作为乙酰CoA的辅酶，参与磷脂的合成，同时确定了发酵液中最佳生物素浓度及补料工艺，在中期细胞转型期添加Trition-X(聚乙二醇辛基苯基醚，非离子表面活性剂)加速细胞转型，通过采用含有生物素的玉米浆干粉与Trition-X双因素调控细胞膜的通透性，将L-异亮氨酸的产量提升到39.2g/L，糖酸转化率达到20.6％。
具体实施方式
实施例1
一种发酵生产L-异亮氨酸的方法，具体步骤如下：
(1)活化培养：从-80℃冰箱中取出谷氨酸棒杆菌保菌管(采用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamate)YILM1504，由天津科技大学代谢工程实验室提供)，在斜面传两代，进行活化培养，得到活化菌株，采用的斜面培养基包括：蛋白胨5g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L,玉米浆干粉20g/L，KH2PO41g/L,MgSO40.2g/L，NaCl1g/L,琼脂粉25g/L，赖氨酸1g/L，pH＝6.8～7.0；
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基包括：葡萄糖35g/L,MgSO40.7g/L,KH2PO41g/L,(NH4)2SO41.5g/L,酵母浸粉5g/L，玉米浆干粉20g/L,VB10.3mg/L,泡敌0.2g/L,用NaOH调节pH到4.5～5，种子发酵罐培养用氨水调节并维持pH到6.7～7.0；
(3)发酵培养：接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，中间补料，得到发酵液；采用的发酵培养基包括：葡萄糖80g/L,MgSO4 0.8g/L,KH2PO4 1.6g/L,(NH4)2SO4 5g/L,,玉米浆干粉10g/L,VB1 0.3g/L,豆饼水解液10ml/L,赖氨酸0.2g/L,蛋氨酸0.2g/L，用NaOH调节pH到4.5-5之间，发酵罐培养用氨水调节并维持pH到6.7-7.0之间。在发酵16h添加0.5g/LTrition-X,18、32、42h分别添加10g/L玉米浆。
实施例2
和实施例1的区别仅在于发酵培养基中玉米浆干粉为20g/L，16h添加0.5g/LTrition-X,18、32、42h分别添加10g/L玉米浆。
实施例3
和实施例1的区别仅在于发酵培养基中玉米浆干粉为30g/L，16h添加0.5g/LTrition-X,18、32、42h分别添加10g/L玉米浆。
实施例4
和实施例1的区别仅在于发酵培养基中玉米浆干粉为40g/L，16h添加0.5g/LTrition-X,18、32、42h分别添加10g/L玉米浆。
实施例5
和实施例1的区别仅在于发酵培养基中玉米浆干粉为30g/L，16h添加0.5g/LTrition-X,18、32、42h分别添加20g/L玉米浆。
实施例6
和实施例1的区别仅在于发酵培养基中玉米浆干粉为30g/L，16h添加0.7g/LTrition-X,18、32、42h分别添加20g/L玉米浆。
实施例7
和实施例1的区别仅在于发酵培养基中玉米浆干粉为30g/L，16h添加1g/LTrition-X,18、32、42h分别添加20g/L玉米浆。
实施例8
和实施例1的区别仅在于发酵培养基中玉米浆干粉为30g/L，16h添加1g/LTrition-X,18、32、42h分别添加30g/L玉米浆。
实施例9
和实施例1的区别仅在于发酵培养基中玉米浆干粉为30g/L，不添加Trition-X,18、32、42h分别添加10g/L玉米浆。
表1实施例L-异亮氨酸与糖酸转化率对比指标
Figure BDA0002657556370000051
Figure BDA0002657556370000061
由表1可知，采用生物素与Trition-X双因素调控细胞膜的通透性有利于提高L-异亮氨酸产量及糖酸转化率。其中实施例3效果最好，发酵培养基中玉米浆干粉为30g/L，16h添加0.5g/L Trition-X,18、32、42h分别添加10g/L玉米浆。L-异亮氨酸产量达到了39.2g/L，糖酸转化率为20.6％。这种双因素调控细胞膜的方法，操作简单，能够精准控制细胞膜在结构和功能上的特异性转变时间点及转型时间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于：在细胞转型期，通过玉米浆干粉、Trition-X双调控机制破坏细胞膜的完整性，提高细胞膜通透性，提高糖酸转化率，具体步骤为：发酵初期底物添加充足的玉米浆干粉，提高菌体生物量，中期改变菌体生长状态，抑制菌体生长，添加Trition-X，促进菌体转型，增强产酸能力，并分批次补加玉米浆干粉，维持细胞活力。
2.根据权利要求1所述的提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)活化培养：从-80℃冰箱中取出谷氨酸棒杆菌保菌管，在斜面传两代，进行活化培养，得到活化菌株；采用的斜面培养基为：蛋白胨5g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉5g/L,玉米浆干粉15g/L，KH2PO41 g/L,MgSO40.4 g/L，NaCl1 g/L,琼脂粉25g/L，赖氨酸1g/L，pH＝6.8～7.0；
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液；采用的种子培养基为：葡萄糖35g/L,MgSO40.7 g/L,KH2PO41 g/L,(NH4)2SO41.5 g/L,酵母浸粉5g/L，玉米浆干粉20g/L,VB10.3 mg/L,泡敌0.2g/L,用NaOH调节pH到4.5～5，种子发酵罐培养用氨水调节并维持pH到6.7～7.0；
(3)发酵培养：接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，中间补料，得到发酵液；采用的发酵培养基为：葡萄糖80g/L,MgSO4 0.8g/L,KH2PO4 1.6g/L,(NH4)2SO4 5g/L,,玉米浆干粉10g/L-40g/L,VB1 0.3g/L,豆饼水解液10ml/L,赖氨酸0.2g/L,蛋氨酸0.2g/L，用NaOH调节pH到4.5-5，发酵罐培养用氨水调节并维持pH到6.7-7.0，其中的NH4 +为转氨作用提供帮助。
3.根据权利要求2所述的提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中在发酵16h添加含5％Trition-X的水溶液，添加浓度为0.1-0.5g/L。
4.根据权利要求2所述的提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中发酵培养基中玉米浆干粉添加量为10-40g/L，其含有的生物素量为15-60μg/L。
5.根据权利要求2所述的提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中中间补料为分批次补加玉米浆干粉，在18、32、42h分别添加10-30g/L玉米浆干粉，其中含有15-40μg/L生物素，维持细胞的正常活力。
6.根据权利要求2所述的提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中发酵罐培养条件：接种量600mL，发酵体积3L,培养温度32℃，pH 6.7-7.0，溶氧30％以上，转速与溶氧联动，发酵时间36-40h。
7.根据权利要求2所述的提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)、(3)中玉米浆干粉属于难灭菌物质，需先电磁炉预煮沸40-60min，再用灭菌锅121℃，灭菌20-40min。
8.根据权利要求7所述的提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)、(3)中玉米浆干粉灭菌时高倍稀释至100-400g/L。
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