CN104630301A - 一种发酵生产利普司他汀的方法 - Google Patents

Abstract

一种发酵生产利普司他汀的方法，包括毒三素链霉菌的斜面菌种的制备、摇瓶种子的制备、种子液的制备以及发酵培养，发酵培养50小时后，流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.03-0.2L/h/t。本发明只需在发酵培养50小时后流加亚麻籽油一种物质，比补加亚油酸及亮氨酸混合物和混合脂肪酸与亮氨酸溶液混合物更容易控制和操作。在前期补料发酵的前提下，为进一步提高发酵产量、更彻底的利用培养基，发酵130h之后进行降温调控手段，通过降温推迟菌体衰亡，将发酵周期延长了20-30h，增加产效价时间，并且培养基利用更充分彻底，降低三废处理的压力，更加环保。

Description

一种发酵生产利普司他汀的方法

技术领域

本发明涉及生产利普斯他汀的技术领域，具体涉及一种发酵法生物合成利普斯他汀。

背景技术

利普司他汀(Lipstatin)是由毒三素链霉菌(Streptreptomyces toxytricini)发酵产生的代谢产物，其稳定的氢化产物奥利司他(olistat)可作为脂肪酶抑制剂，抑制肠道内脂肪酶活性，减少脂肪在肠道的分解和吸收，起到减肥作用。

由于化学全合成的方法成本较高，目前主要是由生物发酵法生产，该方法成本相对较低，易于生产。目前有资料报道补加前体工艺包括补加亚油酸和亮氨酸，辛酸等前体物质，可提高效价，但是在随后的研究中发现通过补加亚油酸和亮氨酸等前体物质得到的发酵液中含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀，而其性质与利普斯他汀的性质非常接近，在后续的提纯除杂过程中非常难以除去，而对于用利普斯他汀制备奥利司他来说，除去这种杂质是非常重要的，否则，后续的氢化将被含硫化合物所抑制。随后又有人采用流加混合脂肪酸和亮氨酸溶液来提高效价，但是这种方法不仅需要控制混合脂肪酸和亮氨酸溶液的流加量，还需要控制混合脂肪酸和亮氨酸溶液的比例，并且还要不断的变换流速，这种方式操作复杂，不易控制，一旦其中一步控制不好会严重影响到利普斯他汀的发酵，增加副产物的生成，不仅影响效价而且影响利普斯他汀的纯度。

而且，目前有资料报道生产利普斯他汀的发酵周期大多在170h左右，170h开始菌体出现衰亡，自溶，发酵结束，而在菌体衰亡、自溶的过程中，培养基则无法被充分的利用，造成培养基浪费，增加三废处理的压力。

发明内容

本发明为解决现有技术中发酵水平低、杂质难除纯度低、生产方法操作复杂不易控制的技术问题，提供了一种发酵生产利普斯他汀的方法。

一种发酵生产利普司他汀的方法，包括毒三素链霉菌的斜面菌种的制备、摇瓶种子的制备、种子液的制备以及发酵培养，在发酵培养过程中，发酵培养50小时后，流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.03-0.2L/h/t。

在发酵培养过程中，发酵培养50小时后，流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.04-0.1L/h/t。

一种发酵生产利普斯他汀的方法，它包括以下步骤：

A、斜面菌种的制备：将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度26-28℃,湿度40％-60％，培养5-7天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速200-220rpm,温度26-28℃,培养20-31小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度26-28℃,通气量0.8VVM，罐压0.05-0.06Mpa的条件下培养25-40小时，得种子液；

D、发酵培养：将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，于罐温28℃，空气流量1:1(vvm)，搅拌转速480-510rpm的条件下发酵，得含有利普斯他汀的发酵液。

所述的步骤A中斜面培养基的成分和含量为：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.0-6.8。

所述的步骤B中摇瓶种子培养基的成分和含量为：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.0-7.2。

所述的步骤C中种子培养基的成分和含量为：黄豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.0-7.2。

所述的步骤D中发酵培养基的成分和含量为：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L。

所述的步骤D发酵培养中，发酵130小时后控制罐温为26.5-27.5℃。

所述的步骤D发酵培养中，发酵130小时后控制罐温为27℃。

本发明的有益效果是：本发明只需在发酵培养50小时后流加亚麻籽油一种物质，相较于补加亚油酸及亮氨酸混合物和混合脂肪酸与亮氨酸溶液混合物更容易控制和操作。在前期补料发酵的前提下，为进一步提高发酵产量、更彻底的利用培养基，发酵130h之后进行降温调控手段，将培养温度降低，优选降低至27℃，通过降温推迟菌体衰亡，将发酵周期延长了20-30h，增加产效价时间，并且培养基利用更充分彻底，降低三废处理的压力，通过上述手段，最终效价可达7.9g/L以上。

在发酵过程中，发酵培养基中磷酸二氢钾的加入，参与到菌体繁殖过程、生物的大量繁殖和进行DNA等遗传物质的复制，控制磷元素可以控制发酵罐中菌体量和菌体的代谢状况。从菌体量上来讲，发酵罐中需要控制菌体量，菌体量控制在特定范围内，菌体可进入次级代谢，产生我们需要的终产物即所谓的效价，如果菌体菌量少，则会出现终产物少，甚至不产生终产物，若菌体量过大，则会造成溶氧不足或营养缺乏，导致发酵终止和其他代谢杂质，因而要严格控制菌体量。菌体若处于产终产物阶段，也就是次级代谢旺盛阶段，如果此时给菌体过量的磷元素，菌体则会出现“返青”不产效价，次级代谢状态的菌属于一种类似“亚健康”状态，给了它足够的养料(包括磷元素，或者其他补料用的物质)它会恢复到一个旺盛的阶段，停止了次级代谢，以初级代谢为主。因此发酵培养基中磷酸二氢钾的控制尤为重要。

在发酵过程中，发酵培养基中硫酸镁的加入，可为菌体组织提供硫元素被菌利用，镁离子在生物反应过程中起到将酶激活活化的作用，而菌的发酵产生效价，就是利用生物的代谢途径中各种生物化学反应，产生我们要的物质，生物化学反应是需要各种类型的酶的参与，控制镁离子含量，可以控制控制代谢的时间，将菌体扩大到一个的菌量，再开启它们的次级代谢，这样才能提高终产物的产量，因而发酵培养基中硫酸镁的控制同样重要。硫酸镁和磷酸二氢钾只有同时控制好，才能控制好代谢时间、菌体量和菌体代谢状况，为最终的发酵效价提供基础保障。

本发明选择在发酵50h后流加补入亚麻籽油，是因为补料时间需要与菌体的代谢转化过程相结合，50h时可以获得到足够的菌量，而又不至于此时所产生的菌量过多，此时补入可最大程度的促进发酵，这当然也依赖发酵培养基中磷酸二氢钾和硫酸镁所提供的基础保障。

具体实施方式

本发明为解决现有技术中发酵水平低、杂质难除纯度低、生产方法操作复杂不易控制的技术问题，提供了一种发酵生产利普斯他汀的方法。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1.

A、斜面菌种的制备：按如下比例配置斜面培养基：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.0，备用。将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度26℃,湿度40％，培养5天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.0，备用。将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速200rpm,温度26℃,培养20小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：按如下比例配置种子培养基：豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.0，备用。将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度26℃,通气量0.8VVM，罐压0.05Mpa的条件下培养25小时，得种子液；

D、发酵培养：按如下比例配置发酵培养基：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，备用。将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，发酵过程控制空气流量1:1(vvm)，搅拌转速480rpm，控制罐温28℃，发酵培养50h之后流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.03L/h/t，发酵至172h放罐，得含有利普斯他汀的发酵液。通过HPLC法检测发酵效价为7.9g/L，进一步的分离检测发现通过本发明的方法得到的发酵液中不含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀。

实施例2.

A、斜面菌种的制备：按如下比例配置斜面培养基：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.8，备用。将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度28℃,湿度60％，培养7天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.2，备用。将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速220rpm,温度28℃,培养31小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：按如下比例配置种子培养基：豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.2，备用。将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度28℃,通气量0.8VVM，罐压0.06Mpa的条件下培养40小时，得种子液；

D、发酵培养：按如下比例配置发酵培养基：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，备用。将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，发酵过程控制空气流量1:1(vvm)，搅拌转速510rpm，控制罐温28℃，发酵培养50h之后流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.2L/h/t，发酵至172h放罐，得含有利普斯他汀的发酵液。通过HPLC法检测发酵效价为8.3g/L，进一步的分离检测发现通过本发明的方法得到的发酵液中不含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀。

实施例3.

A、斜面菌种的制备：按如下比例配置斜面培养基：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.1，备用。将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度26.5℃,湿度45，培养6天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.0，备用。将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速205rpm,温度26.5℃,培养23小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：按如下比例配置种子培养基：豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.0，备用。将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度26.5℃,通气量0.8VVM，罐压0.05Mpa的条件下培养27小时，得种子液；

D、发酵培养：按如下比例配置发酵培养基：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，备用。将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，发酵过程控制空气流量1:1(vvm)，搅拌转速490rpm，控制罐温28℃，发酵培养50h之后流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.04L/h/t，发酵至172h放罐，得含有利普斯他汀的发酵液。通过HPLC法检测发酵效价为8.5g/L，进一步的分离检测发现通过本发明的方法得到的发酵液中不含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀。

实施例4.

A、斜面菌种的制备：按如下比例配置斜面培养基：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.2，备用。将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度27.5℃,湿度55％，培养6天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.2，备用。将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速215rpm,温度27.5℃,培养30小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：按如下比例配置种子培养基：豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.2，备用。将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度27.5℃,通气量0.8VVM，罐压0.05Mpa的条件下培养29小时，得种子液；

D、发酵培养：按如下比例配置发酵培养基：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，备用。将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，发酵过程控制空气流量1:1(vvm)，搅拌转速500rpm，控制罐温28℃，发酵培养50h之后流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.1L/h/t，发酵至172h放罐，得含有利普斯他汀的发酵液。通过HPLC法检测发酵效价为8.6g/L，进一步的分离检测发现通过本发明的方法得到的发酵液中不含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀。

实施例5.

A、斜面菌种的制备：按如下比例配置斜面培养基：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.3，备用。将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度27℃,湿度50％，培养7天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.1，备用。将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速210rpm,温度27℃,培养29小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：按如下比例配置种子培养基：豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.1，备用。将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度27℃,通气量0.8VVM，罐压0.06Mpa的条件下培养30小时，得种子液；

D、发酵培养：按如下比例配置发酵培养基：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，备用。将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，发酵过程控制空气流量1:1(vvm)，搅拌转速490rpm，控制罐温28℃，发酵培养50h之后流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.07L/h/t，发酵至172h放罐，得含有利普斯他汀的发酵液。通过HPLC法检测发酵效价为8.4g/L，进一步的分离检测发现通过本发明的方法得到的发酵液中不含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀。

实施例6.

A、斜面菌种的制备：按如下比例配置斜面培养基：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.4，备用。将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度28℃,湿度55％，培养6天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.2，备用。将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速220rpm,温度28℃,培养26小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：按如下比例配置种子培养基：豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.2，备用。将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度28℃,通气量0.8VVM，罐压0.05Mpa的条件下培养35小时，得种子液；

D、发酵培养：按如下比例配置发酵培养基：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，备用。将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，发酵过程控制空气流量1:1(vvm)，搅拌转速500rpm，控制罐温28℃，发酵培养50h之后流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.05L/h/t，发酵至172h放罐，得含有利普斯他汀的发酵液。通过HPLC法检测发酵效价为8.7g/L，进一步的分离检测发现通过本发明的方法得到的发酵液中不含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀。

实施例7.

A、斜面菌种的制备：按如下比例配置斜面培养基：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.5，备用。将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度28℃,湿度40％，培养7天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.2，备用。将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速220rpm,温度28℃,培养28小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：按如下比例配置种子培养基：豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.2，备用。将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度28℃,通气量0.8VVM，罐压0.06Mpa的条件下培养33小时，得种子液；

D、发酵培养：按如下比例配置发酵培养基：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，备用。将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，发酵过程控制空气流量1:1(vvm)，搅拌转速500rpm，控制罐温28℃，发酵培养50h之后流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.05L/h/t，发酵培养130小时后控制罐温在27.5℃，发酵时间延长至181h,放罐，得含有利普斯他汀的发酵液。通过HPLC法检测发酵效价为9.1g/L，进一步的分离检测发现通过本发明的方法得到的发酵液中不含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀。

实施例8.

A、斜面菌种的制备：按如下比例配置斜面培养基：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.6，备用。将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度28℃,湿度60％，培养6天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.2，备用。将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速220rpm,温度28℃,培养25小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：按如下比例配置种子培养基：豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.2，备用。将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度28℃,通气量0.8VVM，罐压0.05Mpa的条件下培养36小时，得种子液；

D、发酵培养：按如下比例配置发酵培养基：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，备用。将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，发酵过程控制空气流量1:1(vvm)，搅拌转速500rpm，控制罐温28℃，发酵培养50h之后流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.05L/h/t，发酵培养130小时后控制罐温在26.5℃，发酵时间延长至189h，放罐，得含有利普斯他汀的发酵液。通过HPLC法检测发酵效价为8.9g/L，进一步的分离检测发现通过本发明的方法得到的发酵液中不含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀。

实施例9.

A、斜面菌种的制备：按如下比例配置斜面培养基：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.8，备用。将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度28℃,湿度50％，培养7天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.2，备用。将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速220rpm,温度28℃,培养29小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：按如下比例配置种子培养基：豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.2，备用。将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度28℃,通气量0.8VVM，罐压0.06Mpa的条件下培养38小时。

D、发酵培养：按如下比例配置发酵培养基：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，备用。将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，发酵过程控制空气流量1:1(vvm)，搅拌转速500rpm，控制罐温28℃，发酵培养50h之后流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.05L/h/t，发酵培养130小时后控制罐温在27℃，发酵时间延长至200h，放罐，得含有利普斯他汀的发酵液。通过HPLC法检测发酵效价为9.3g/L，进一步的分离检测发现通过本发明的方法得到的发酵液中不含有副产物蛋氨酸类似物的利普斯他汀。

Claims (9)

1.一种发酵生产利普司他汀的方法，包括毒三素链霉菌的斜面菌种的制备、摇瓶种子的制备、种子液的制备以及发酵培养，其特征在于：在发酵培养过程中，发酵培养50小时后，流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.03-0.2L/h/t。

2.根据权利要求1所述的一种发酵生产利普斯他汀的方法，其特征在于：在发酵培养过程中，发酵培养50小时后，流加补入亚麻籽油，以发酵罐装料体积计算，亚麻籽油流加速率为0.04-0.1L/h/t。

3.根据权利要求1所述的一种发酵生产利普斯他汀的方法，其特征在于它包括以下步骤：

A、斜面菌种的制备：将砂土孢子接种到斜面培养基上，于温度26-28℃,湿度40％-60％，培养5-7天，得斜面孢子；

B、摇瓶种子的制备：将步骤A培养好的斜面孢子用10mL无菌生理盐水洗下来接种到摇瓶种子培养基中,于转速200-220rpm,温度26-28℃,培养20-31小时，得摇瓶种子；

C、种子液的制备：将步骤B中培养好的摇瓶种子接种到装有灭菌后种子培养基的种子罐中,接种量1％,于温度26-28℃,通气量0.8VVM，罐压0.05-0.06Mpa的条件下培养25-40小时，得种子液；

D、发酵培养：将步骤C培养好的种子液接种到装有灭菌的发酵培养基中，接种量4％，于罐温28℃，空气流量1:1(vvm)，搅拌转速480-510rpm的条件下发酵，得含有利普斯他汀的发酵液。

4.根据权利要求3所述的一种发酵生产利普斯他汀的方法，其特征在于：所述的步骤A中斜面培养基的成分和含量为：可溶性淀粉0.8％,酪蛋白0.05％，氯化钠0.2％,磷酸二氢钾0.2％，pH6.0-6.8。

5.根据权利要求3所述的一种发酵生产利普斯他汀的方法，其特征在于：所述的步骤B中摇瓶种子培养基的成分和含量为：黄豆饼粉16％，甘油15％，亚麻籽油0.3％,硫酸镁1.0％，pH7.0-7.2。

6.根据权利要求3所述的一种发酵生产利普斯他汀的方法，其特征在于：所述的步骤C中种子培养基的成分和含量为：黄豆饼粉18％，甘油14％，亚麻籽油0.2％,硫酸镁1.1％，磷酸二氢钾0.05％，pH7.0-7.2。

7.根据权利要求3所述的一种发酵生产利普斯他汀的方法，其特征在于：所述的步骤D中发酵培养基的成分和含量为：黄豆饼粉70g/L，淀粉30g/L，甘油5g/L，大豆软磷脂50g/L，豆油20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L。

8.根据权利要求3所述的一种发酵生产利普斯他汀的方法，其特征在于：所述的步骤D发酵培养中，发酵130小时后控制罐温为26.5-27.5℃。

9.根据权利要求3所述的一种发酵生产利普斯他汀的方法，其特征在于：所述的步骤D发酵培养中，发酵130小时后控制罐温为27℃。