CN109439703B

CN109439703B - 一种用于苏氨酸发酵工艺的培养基

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Publication number: CN109439703B
Application number: CN201811596556.6A
Authority: CN
Inventors: 王健; 唐永强; 马延和; 李德衡; 刘海涛; 董力青; 李航
Original assignee: Qiqihar Longjiang Fufeng Biotechnology Co ltd; Jilin University; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Qiqihar Longjiang Fufeng Biotechnology Co ltd; Jilin University; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN109439703A

Abstract

本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种用于苏氨酸发酵工艺的培养基，其包括如下组分：葡萄糖，甘油，玉米浆，硫酸铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，七水硫酸镁，七水硫酸亚铁，一水硫酸锰，异亮氨酸，黄腐酸。本发明培养基组分配伍合理，能够提高大肠杆菌的产酸量。

Description

一种用于苏氨酸发酵工艺的培养基

技术领域

本发明属于氨基酸生产领域，具体涉及一种用于苏氨酸发酵工艺的培养基。

背景技术

苏氨酸(Threonine，简写Thr)易溶于水而不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，属于脂肪族氨基酸，味微甜，是构成人类及动植物蛋白质的一种必需氨基酸。苏氨酸作为人体所必需的氨基酸之一，在人们的生活中起着越来越重要的作用。随着养殖业的发展，畜禽饲料需求量的迅速增加，苏氨酸扮演着必须从外界摄取的营养成分的角色越来越受到重视。在医药、食品和饲料等方面都有广泛的应用。苏氨酸属于工业化发酵的产品之一，据资料统计，2017年全球苏氨酸供应量达到 68.5 万吨，同比增长 15.5%，或增长 9.2 万吨，增量的 80%来自中国。2017 年中国苏氨酸的供应量达到 53.5 万吨，同比增长 15.6%，占全球市场的78%。2013 年以来，全球苏氨酸供应量平均复合增长率13.4%，比 2003 年-2013 年间增速下降近一半。2017 年中国苏氨酸生产企业以梅花、阜丰、伊品、成福为主，大成、希杰补充；国际生产企业主要以味之素和 ADM。2017 年中国苏氨酸出口 37.4 万吨，占产量的69.9%，国内供应 16.1 万吨，国内需求 13 万吨。

大肠杆菌工程菌株是微生物工业发酵生产苏氨酸的主要菌株，在发酵产生 L-苏氨酸的同时，还会生成乙酸、丙氨酸、缬氨酸和精氨酸等代谢副产物，在一定程度上影响菌体生长及 L-苏氨酸的合成与积累。其中，乙酸的抑制效果尤为明显，当乙酸积累到一定浓度时，菌体的比生长速率迅速下降，产物合成大大降低，并形成恶性循环，同时外源基因的表达也受到严重影响。如何降低乙酸的含量，从而提高生物量以及苏氨酸产量是我们研究的重点。文献“L-苏氨酸发酵过程中乙酸的控制，发酵科技通讯2012年”在大肠杆菌发酵制备苏氨酸过程中，通过选择合适的发酵条件来控制其副产物乙酸的生成，能够降低乙酸的生成，但是降低幅度降为不明显，不能大幅提高苏氨酸的产量，并没有工业化推广的价值。申请人之前的专利技术“一种超低水份苏氨酸生产方法”记载的培养基：葡萄糖80g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵2g/L，碳酸钙0.75g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，K₂HPO₄0.2g/L，NaCl 0.2g/L，pH值6.5；发酵液中苏氨酸的含量最高可达到10g/100ml，但是菌株在发酵后期死亡率较高，而且葡萄糖消耗量较大，发酵液中苏氨酸产率也有待提升。在此基础上，申请人继续进行改进，提出了一种制取颗粒型苏氨酸的方法，其发酵通过在发酵接种莱茵衣藻，能够利用发酵液中的乙酸作为碳源进行非光和作用，而较难利用甘油作为碳源，从而解除了对大肠杆菌产苏氨酸的抑制作用，还能够进行微量的光合作用释放氧气，供大肠杆菌发酵产苏氨酸来使用；通过添加莱茵衣藻，不但能够提高苏氨酸的产量，并且菌体蛋白产量也相应提高。但是，菌株混合发酵工艺较难控制，发酵成本提高，后期分离产品也存在一定的困难。需要对该方法进行进一步的改进。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷，本发明提出了一种用于苏氨酸发酵工艺的培养基。本发明培养基能够提高苏氨酸产量，降低副产物的生成。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种用于苏氨酸发酵工艺的培养基，其包括如下组分：葡萄糖，甘油，玉米浆，硫酸铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，七水硫酸镁，七水硫酸亚铁，一水硫酸锰，异亮氨酸，黄腐酸。

优选地，所述培养基包括如下组分：

葡萄糖20-30g/L，甘油15-20g/L，玉米浆15-20g/L，硫酸铵1.5-2g/L，磷酸二氢钾0.1-0.2g/L，磷酸氢二钾0.1-0.2g/L，七水硫酸镁0.1-0.2g/L，七水硫酸亚铁 5-10mg/L，一水硫酸锰5-10mg/L，异亮氨酸50-400mg/L，黄腐酸5-40mg/L，pH值5.5-6.0。

优选地，所述培养基由如下组分组成：葡萄糖20-30g/L，甘油15-20g/L，玉米浆15-20g/L，硫酸铵1.5-2g/L，磷酸二氢钾0.1-0.2g/L，磷酸氢二钾0.1-0.2g/L，七水硫酸镁0.1-0.2g/L，七水硫酸亚铁 5-10mg/L，一水硫酸锰5-10mg/L，异亮氨酸50-400mg/L，黄腐酸5-40mg/L，pH值5.5-6.0。

优选地，所述异亮氨酸为200-400mg/L。

优选地，所述黄腐酸10-20mg/L.

优选地，所述pH值为5.5。

本发明研究的出发点以及取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明培养基优化中，发酵碳源选择葡萄糖和甘油，发酵前期，菌体密度低，供氧量充足，大肠杆菌优先利用葡萄糖作为碳源，可以促进菌体增殖和苏氨酸的产生；发酵中后期，葡萄糖浓度降低，此时大肠杆菌利用甘油作为碳源，由于细胞吸收甘油的速率较低，进入糖酵解的碳流下降，从而降低了乙酸的积累量，同时提高了苏氨酸的产量。

草酰乙酸来源于三羧酸循环，草酰乙酸的主要途径是流向谷氨酸合成途径，可通过对该途径的反馈抑制，提高苏氨酸产量；发酵前期，通过调节发酵液的pH偏酸性，有利于谷氨酸的合成，而且使得细胞通透性变差，谷氨酸不会流出到细胞外，有利于快速积累谷氨酸，从而在较短时间内对谷氨酸合成途径产生反馈抑制，使得草酰乙酸较早地流向天冬氨酸途径；但是pH太低，不利于中和乙酸、乳酸等副产物，选择5.5-6为合适。

草酰乙酸经过转氨作用生产天冬氨酸，进而合成苏氨酸，而苏氨酸可以进一步合成异亮氨酸；可以通过在发酵培养基中添加异亮氨酸进行反馈抑制，从而促进苏氨酸积累。

发酵培养基中添加适量黄腐酸，含有大量酚羟基、羰基等基团，电解程度较高，能够促进氨基酸合成过程中利用O₂作为氢受体，进而减少丙酮酸作为氢受体，因此乳酸等副产物生成量减少；发酵过程中加入适量的肌醇，可以强化CO₂ 固定反应, 削弱乙醛酸循环，提高氨基酸的产量。

说明书附图

图1：发酵因素对发酵液中苏氨酸含量的影响；

图2：发酵因素对发酵液中乙酸含量的影响；

图3：发酵因素对发酵液中乳酸含量的影响；

图4：异亮氨酸在培养基中的添加量对发酵液中苏氨酸含量的影响；

图5：黄腐酸在培养基中的添加量对发酵液中苏氨酸含量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种提高苏氨酸产量的方法，其包括如下步骤：

步骤1）制备发酵培养基：葡萄糖25g/L，甘油20g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 5mg/L，一水硫酸锰5mg/L，异亮氨酸200mg/L，黄腐酸10mg/L，pH值5.5；

步骤2）发酵：将大肠杆菌工程菌K12△dapA种子液（种子液的浓度为1×10⁸cfu/mL）按照12%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度30℃，罐压为0.03MPa，通气量为0.4vvm，转速为100rpm，发酵时间为36h，然后添加肌醇100mg/L，继续发酵培养24h，通过流加100g/L的葡萄糖溶液控制含糖量为0.5%，停止发酵，收集发酵液；整个发酵过程中，通过流加30%的氨水控制pH为5.5。

实施例2

一种提高苏氨酸产量的方法，其包括如下步骤：

步骤1）制备发酵培养基：葡萄糖30g/L，甘油15g/L，玉米浆15g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，异亮氨酸300mg/L，黄腐酸20mg/L，pH值5.5；

步骤2）发酵：将大肠杆菌工程菌K12△dapA种子液（种子液的浓度为1×10⁸cfu/mL）按照10-12%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度30℃，罐压为0.04MPa，通气量为0.6vvm，转速为100rpm，发酵时间为32h，然后添加肌醇200mg/L，继续发酵培养28h，通过流加100g/L的葡萄糖溶液控制含糖量为0.4%，停止发酵，收集发酵液；整个发酵过程中，通过流加20-30%的氨水控制pH为6.0。

实施例3

本发明发酵工艺中不同因素对苏氨酸产量、乙酸以及乳酸等副产物含量的影响。

设置组别：

实验组：实施例1；

对照组1：不添加异亮氨酸，其余同实施例1；

对照组2：不添加黄腐酸，其余同实施例1；

对照组3：不添加肌醇，其余同实施例1；

对照组4：将甘油替换为同等质量的葡萄糖，其余同实施例1。

各组别最终发酵液中苏氨酸、乙酸以及乳酸的含量如图1-3所示。通过设置对照组，检测了甘油、黄腐酸、异亮氨酸以及肌醇等发酵因素对苏氨酸、乙酸以及乳酸的影响；通过图1可见，甘油、黄腐酸、异亮氨酸以及肌醇等发酵因素对苏氨酸的产量有正向的影响，其中，肌醇影响最大，黄腐酸和异亮氨酸次之，甘油的影响最小。如图2-3所示，甘油对副产物的影响较大，对照组4不添加甘油，副产物乙酸和乳酸的含量均为最高；而异亮氨酸对副产物乙酸的影响较小，黄腐酸对副产物乳酸的影响较小；综合上述影响因素，对发酵条件进行优化，能够提升苏氨酸的产量，副产物也相应降低。

实施例4

异亮氨酸、黄腐酸在培养基中的添加量对发酵液中苏氨酸含量的影响。

异亮氨酸的添加量分别设置为0,50,100,200,400,800（mg/L）；如图4所示，随着异亮氨酸添加量的增加，对苏氨酸生成异亮氨酸的代谢途径产生一定的反馈作用，导致苏氨酸积累速率加快，当增加到200mg/L的添加量后，增幅放缓，增加到400mg/L后，苏氨酸含量没有明显增加。

黄腐酸的添加量分别设置为0,5,10,20,40,80（mg/L）；如图5所示，随着黄腐酸添加量的增加，促进氨基酸合成过程中利用O₂作为氢受体，进而减少丙酮酸作为氢受体，因此乳酸等副产物生成量减少，苏氨酸相应的产量有所提升，继续增加黄腐酸的产量到20mg/L后，苏氨酸的含量没有明显变化，选择10-20mg/L添加量最为合适。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1. 一种培养基在大肠杆菌发酵生产苏氨酸中的应用，其特征在于，所述培养基由如下组分组成：葡萄糖20-30g/L，甘油15-20g/L，玉米浆15-20g/L，硫酸铵1.5-2g/L，磷酸二氢钾0.1-0.2g/L，磷酸氢二钾0.1-0.2g/L，七水硫酸镁0.1-0.2g/L，七水硫酸亚铁 5-10mg/L，一水硫酸锰5-10mg/L，异亮氨酸50-400mg/L，黄腐酸5-40mg/L，pH值5.5-6.0。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异亮氨酸为200-400mg/L。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄腐酸为10-20mg/L。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述pH值为5.5。