JP6355381B2 - ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、５−アミノレブリン酸生産微生物を用いて高い収率で５−アミノレブリン酸又はその塩を製造する方法に関する。

５−アミノレブリン酸は、テトラピロール化合物（ビタミンＢ_１２、ヘム、クロロフィルなど）を生合成する色素生合成経路の代謝中間体として広く生物圈に存在し、生体内で重要な役割を果たしている。５−アミノレブリン酸は、生体系中で、グリシンとスクシニルＣｏＡから５−アミノレブリン酸合成酵素によって、又はグルタミン酸からグルタミルｔＲＮＡを経て生合成され、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼに続く代謝によりヘムやクロロフィルなどのポルフィリン化合物に変換される。この５−アミノレブリン酸又はその塩は分解性が高く、環境への残留性もないため多くの産業への応用が期待されている（特許文献１、２）。

５−アミノレブリン酸又はその塩の生産方法については、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物を用いる方法は、他の微生物を用いる方法に比べ生産量が多いものとして提案された（特許文献３）。しかし、この方法で用いるロドバクター属の微生物は、著量な色素合成には光照射を必要とする光合成細菌であり、色素の前駆体である５−アミノレブリン酸の生産においても十分な光の照射が求められる。この光照射により高コストとなる問題を解決するために、光照射を必要としない条件下での５−アミノレブリン酸の製造を可能とするロドバクター属の微生物の変異株が取得された（特許文献４）。

さらにこれらの変異株を用いて高い収率で５−アミノレブリン酸を産生できる製造法の検討が成され、酸素制限条件として培養液中の溶存酸素濃度を１ｐｐｍ未満とする条件、培養液中の酸化還元電位を−１８０〜５０ｍＶとする条件、菌呼吸速度を５×１０^−９からＫｒＭ−２×１０^−８〔ｍｏｌ ｏｆ Ｏ_２／ｍＬ・ｍｉｎ・ｃｅｌｌ〕とする条件が見出された（特許文献５）。また、この酸素制限条件を緩和した条件下でも５−アミノレブリン酸を生産するものとしてロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＣＲ−００７２００９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２０として寄託）も取得され（特許文献６）、さらに酸素条件設定方法に関しても酸素移動容量係数ｋ_Ｌａ（ｈ^−１）を好気条件での微生物の呼吸速度ｑＯ_２［（ｇ−Ｏ_２ｃｏｎｓｕｍｅｄ）・（ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ）^−１・ｈ^−１］で除した値による方法が見出されている（特許文献７）。

しかし上記のように培養条件については鋭意研究が成されているが、生産性を向上するための培地組成や添加剤については鉄分量が示されているのみであり（特許文献６）、その他の報告はない。

特開昭６１−５０２８１４号公報 特開平２−１３８２０１号公報 特開平６−１４１８７５号公報 特開平６−１５３９１５号公報 特開平８−１６８３９１号公報 特開平１１−４２０８３号公報 特開２００８−２９２７２号公報

このように、５−アミノレブリン酸又はその塩の種々の製造方法が検討されているが、更なる収率の向上が望まれている。本発明は、５−アミノレブリン酸生産微生物を用いて５−アミノレブリン酸又はその塩を高い収率で製造する方法を提供することを目的とする。

５−アミノレブリン酸生産微生物の培養条件、特に培地成分について種々研究を重ねた結果、酵母エキス等の通常の栄養成分に加えて、乳酸又はその塩を一定量配合した培地で５−アミノレブリン酸生産微生物を培養することにより、５−アミノレブリン酸又はその塩をこれまでの製造方法よりも高い収率で製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
〔１〕酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）及びＰＤＢ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ）から選ばれる１種以上を含む培地を用いて５−アミノレブリン酸生産微生物を培養する方法であって、培地に配合する乳酸又はその塩が培養開始時の培地１Ｌあたりの配合積算量として１〜１，０００ｍｍｏｌであることを特徴とする、５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔２〕乳酸又はその塩を含有する培地のｐＨが４〜９であることを特徴とする、〔１〕に記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔３〕５−アミノレブリン酸生産微生物が光合成細菌であることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔４〕５−アミノレブリン酸生産微生物が、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物であることを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。

本発明の５‐アミノレブリン酸又はその塩の製造方法によれば、乳酸又はその塩を含む培養液を用いて５−アミノレブリン酸生産微生物を培養することにより、５−アミノレブリン酸又はその塩を高い収率で製造することができる。

本発明の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造法に用いる乳酸としては、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、ＤＬ−乳酸のいずれでもよく、その塩としては、乳酸ナトリウム、乳酸カルシウム、乳酸カリウムなどが挙げられる。また、この乳酸又はその塩は、必要に応じて、水などの適切な溶媒にて溶解した溶液として用いることができる。
本発明の５−アミノレブリン酸生産微生物の培養方法に用いる培地において、培地に配合する乳酸又はその塩の培養開始時の培地１Ｌあたり配合積算量は、５−アミノレブリン酸の生産性の点から、１〜１，０００ｍｍｏｌが好ましく、５〜３００ｍｍｏｌがより好ましく、１０〜１００ｍｍｏｌが更に好ましい。
培地には、ｐＨ調整剤として硫酸、塩酸、クエン酸等も用いられるが、乳酸又はその塩を用いた場合に特に５−アミノレブリン酸又はその塩の蓄積量が高くなる。

本発明の製造方法における乳酸又はその塩の培地への配合は、培地の調製時に配合してもよいが、特には培地と別に滅菌処理し、５−アミノレブリン酸生産微生物を培養する際にｐＨ調整剤として配合することが好ましい。
培養にあたっての培養液のｐＨは５−アミノレブリン酸生産微生物が生育する条件でよいが、ｐＨ４〜９が好ましく、ｐＨ５〜８がより好ましく、ｐＨ６〜７が更に好ましい。なお、培養中に５−アミノレブリン酸の生産に適さないｐＨ域に液性が変化した場合には、前記の乳酸又はその塩を添加することにより適切なｐＨ域になるよう液性を調整できるが、更には、ｐＨ調整剤として、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム等のアルカリや塩酸、硫酸、リン酸等の酸も併用できる。

本発明の方法に使用される５‐アミノレブリン酸生産微生物は、５‐アミノレブリン酸を培地中に蓄積する微生物であればよく、例えば、光合成細菌、大腸菌、酵母、コリネ菌、これら微生物の遺伝子組み換え体などが挙げられる。特に、光合成従属栄養細菌が好ましく、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属の微生物、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の微生物が挙げられ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属の微生物が好ましく、更にロドバクター スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）又はその変異株が好ましく、特には、ロドバクター スフェロイデス ＣＲ−００７２００９と命名され、ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２０として寄託された微生物が好ましい。

本発明に用いられる培地は、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）及びＰＤＢ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ）から選ばれる１種以上を含有する。これらの成分のうち、酵母エキス及び乾燥酵母から選ばれる１種以上、特に酵母エキスが好ましい。その含有量は合計で１ｇ／Ｌ以上であるが、より好ましい含有量は、１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、特に５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。

さらに、本発明の方法で培養が行われる培地は、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有するのが好ましい。炭素源としては、グルコース等の糖類、酢酸、リンゴ酸、コハク酸等の酸類などを用いることができる。また、窒素源としては、硫安、塩安、リン安等のアンモニア態窒素化合物、硝酸ナトリウム等の硝酸態窒素化合物等の無機窒素源、尿素、ポリペプトン、酵母エキス等の有機窒素化合物などを用いることができる。

また、本発明の方法で培養が行われる培地には、更に、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アルギニン等のアミノ酸等を適宜添加することができる。

本発明においては、更に、無機塩類等の微量成分、特には、リン化合物、マンガン化合物及び鉄化合物を含有する混合物を１００℃以上で加熱又は０．１ＭＰａ以上で加圧して得られたものを培地に添加するのが、５−アミノレブリン酸又はその塩の生産性を向上させる点で好ましい。リン化合物としては、リン元素を含むものであればよく、好ましくは、リン酸、リン酸塩、ピロリン酸等が挙げられる。より具体的には、リン酸カルシウム（例えば、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、Ｃａ_３（ＰＯ）_２）、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸、リン酸一アンモニウム、リン酸二アンモニウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸鉄、リン酸マンガンが挙げられ、特に好ましくは、リン酸カルシウム、ピロリン酸が挙げられる。

マンガン化合物としては、マンガン元素を含むものであればよく、好ましくは、酸のマンガン塩、マンガンハロゲン化物等が挙げられ、より具体的には、Ｍｎ含有酵母エキス、硫酸マンガン無水和物、硫酸マンガン五水和物、塩化マンガン、硝酸マンガン、炭酸マンガン、二酸化マンガンが挙げられ、特に好ましくは、Ｍｎ含有酵母エキス、硫酸マンガン無水和物、硫酸マンガン五水和物が挙げられる。

鉄化合物としては、鉄元素を含むものであればよく、好ましくは、酸の鉄塩、鉄のハロゲン化物、硫化鉄等が挙げられ、より具体的には、ＥＤＴＡ−鉄、塩化鉄（ＩＩ）又はその水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）又はその水和物、硫化鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、酢酸鉄、臭化鉄、乳酸鉄、硝酸鉄、硫酸鉄、リン酸鉄、クエン酸鉄アンモニウム、シュウ酸鉄、シュウ酸鉄アンモニウムが挙げられ、特に好ましくは、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）が挙げられる。

加熱又は加圧する混合物には、媒体を用いてもよく、その媒体としては、実質的に培地成分を含有しない液体が挙げられ、好ましくは、水である。

上記混合物の加熱は、１００℃以上で行われるが、加熱温度は、１１０〜１３０℃が好ましい。また、上記混合物の加圧は、０．１ＭＰａ以上で行われるが、加圧圧力は、０．１３〜０．２０ＭＰａが好ましい。上記混合物は、加熱し、かつ加圧するのが好ましい。このような加熱及び加圧は、リン化合物、マンガン化合物、及び鉄化合物を混合した後に行う必要があり、混合前に行っても、優れた微生物の増殖促進効果や、アミノ酸生産能や酸化酵素活性といった微生物の活性を十分に向上させる効果が得られない。加熱又は加圧の時間は、１０〜３０分が好ましい。

また本発明の製造方法では、菌体が十分に生育した段階で、グリシン、Ｌ−グルタミン酸、糖類、有機酸などの５−アミノレブリン酸又はその塩の原料やレブリン酸などの５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの阻害剤を添加して５−アミノレブリン酸の生産性を高めることが好ましい。グリシンの添加量は培地全量中の１０〜１０００ｍＭ、特に１０〜４００ｍＭとすることが好ましい。レブリン酸の添加量は培地全量中の０．０１〜２０ｍＭ、特に０．１〜１０ｍＭが好ましい。このグリシンやレブリン酸の過剰な添加は５−アミノレブリン酸又はその塩の生産性を低下させる場合があるので、そのときは菌体生育時間を延長したり、これら添加剤を数回に分けて添加したりすることにより５−アミノレブリン酸又はその塩の生産性の低下を回避できる。培地にグリシン又はレブリン酸を添加することが好ましい。

培養にあたっての培養温度は５−アミノレブリン酸生産微生物が生育する条件でよく、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３５℃がより好ましく、２５〜３０℃が更に好ましい。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示の目的で掲げられものであって、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（製造例１）
培地１（組成は表１に示す）２００ｍＬを２Ｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間滅菌した後、放冷した。これにロドバクター・スフェロイデスＣＲ００７２００９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２０）を植菌後、３２℃、暗所にて２６時間振盪培養した。

２Ｌ容三角フラスコに２００ｍＬの培地１を調製したところへ、製造例で得られた培養物を、初期菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．４となるように植菌し、３２℃、暗所にて２０時間撹拌培養した。
（実施例および比較例）
３Ｌ容の培養槽に１．８Ｌの培地２（組成は表２に示す）を調製したところへ、この培養液を初期菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．４となるように植菌し、２８℃、通気量１．８Ｌ／分、溶存酸素濃度（ＤＯ）の下限値を５％として２４時間撹拌培養した。次いで、グリシンを６５ｍＭ、レブリン酸を５ｍＭになるように添加し、１．９Ｍ硫酸を用いてｐＨ６．４〜６．５に調整し、撹拌回転数を４２０ｒｐｍにして培養を続けた。その後、培養開始４０時間後と培養開始５２時間後にグリシンを６５ｍＭになるように添加し、培養開始６４時間後に培養を止めた。その際、培養開始４０時間後から培養中に生じたｐＨ変化に対し、ｐＨ６．４〜６．５に保つように表３に記載のｐＨ調整剤を添加し連続的にｐＨ調整を行った。培養停止時の５−アミノレブリン酸蓄積量を表３に示す。
なお、比較例１においては、培養開始４０時間後から生じた培養液のｐＨ変化に対してｐＨ調整を行わなかった。

表３から分かるように、培地に配合する酸として乳酸（培養開始時の培地１Ｌあたりの酸の配合積算量は１〜１，０００ｍｍｏｌ）を用いることによって５−アミノレブリン酸蓄積量は向上した。ｐＨ調整しない場合と比較すると、５−アミノレブリン酸蓄積量は最大で４３％向上した。また、他の酸を使用した場合と比較しても、５−アミノレブリン酸蓄積量は約１２％向上した。

Claims (4)

1. 酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）及びＰＤＢ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ）から選ばれる１種以上を含む培地を用いてロドバクター属に属する５−アミノレブリン酸生産微生物を培養することによる５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法であって、培養開始４０時間後以降に乳酸又はその塩を培地に添加してｐＨを５〜８に調整する工程を含み、培地に配合する乳酸又はその塩が培養開始時の培地１Ｌあたりの配合積算量として５〜３００ｍｍｏｌであることを特徴とする、５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
2. 乳酸又はその塩を含有する培地のｐＨが６〜７であることを特徴とする、請求項１に記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
3. 培地に添加する乳酸又はその塩が、培養開始時の培地１Ｌあたりの配合積算量として１０〜１００ｍｍｏｌであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
4. 培地に添加する乳酸又はその塩が、培養開始時の培地１Ｌあたりの配合積算量として７５〜１００ｍｍｏｌであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。