CN103517989B

CN103517989B - 在受控制的氧饱和度下通过发酵生产l-胱氨酸的方法

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Publication number: CN103517989B
Application number: CN201280022801.7A
Authority: CN
Inventors: T·达斯勒; A·罗伊特-迈尔; T·施勒塞尔
Original assignee: Wacker Polymer Systems GmbH and Co KG
Current assignee: Wacker Polymer Systems GmbH and Co KG
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2032-05-04
Also published as: CN103517989A; US20140080186A1; EP2707492A1; DE102011075656A1; JP2014512841A; US9074230B2; EP2707492B1; KR101557566B1; WO2012152664A1; KR20130138848A; JP5840767B2

Abstract

本发明涉及通过在发酵培养基中使微生物菌株发酵生产L-胱氨酸的方法，在该方法中相对于全部半胱氨酸，L-胱氨酸以至少70％的量沉淀，其特征在于，在形成L-胱氨酸期间将发酵培养基的O₂饱和度保持在至少1％且最多40±3％。

Description

在受控制的氧饱和度下通过发酵生产L-胱氨酸的方法

技术领域

本发明涉及通过发酵生产L-胱氨酸的方法。

背景技术

L-胱氨酸是通过使两个L-半胱氨酸分子氧化形成的二硫化物。该反应是可逆的，这意味着L-胱氨酸可以通过还原又转化成为L-半胱氨酸。

氨基酸L-半胱氨酸在经济上具有重要意义。其例如用作食品添加剂（特别是用于焙烤食品业），用作化妆品中的原料，及用作生产药物活性成分的起始产物（特别是N-乙酰基半胱氨酸和S-羧甲基半胱氨酸）。

L-半胱氨酸在所有有机体中在硫代谢中发挥关键作用，并用于合成蛋白质、谷胱甘肽、生物素、硫辛酸、甲硫氨酸及其他含硫的代谢物。此外，L-半胱氨酸用作生物合成辅酶A的前体。L-半胱氨酸的生物合成已在细菌中，特别是在肠杆菌（Enterobacteria）中深入研究，在Kredich（1996,Biosynthesisofcysteine,pp.514-527.InF.C.Neidhardt,R.CurtissIII,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,M.Riley,M.Schaechter,andH.E.Umbarger(ed.),EscherichiacoliandSalmonella:cellularandmolecularbiology,2nded.ASMPress,Washington,D.C.）中有详细描述。

除了通过从诸如毛发、鬃丝、角、蹄和羽毛的含有角蛋白的材料进行提取或者通过前体的酶致转化进行的生物转化生产L-半胱氨酸的传统方法以外，在一些年前还开发了通过发酵生产L-半胱氨酸的方法。例如US6,218,168B1、US5,972,663A、US2004/0038352A1、CA2386539A1、US2009/0053778A1和US2009/0226984A1详细地描述了关于通过使用微生物进行发酵生产L-半胱氨酸的现有技术。在此使用的细菌宿主有机体除其他以外是棒杆菌属（Corynebacterium）的菌株以及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的代表，例如Escherichiacoli或Pantoeaananatis。

除了通过突变和选择获得改善的L-半胱氨酸生产性生物的传统过程以外，还对菌株实施针对性的基因修饰，以实现有效的L-半胱氨酸过度生产。

因此通过插入编码具有降低的L-半胱氨酸反馈抑制的丝氨酸-O-乙酰基移转酶的cysE等位基因，使半胱氨酸产量升高（US6,218,168B1；Nakamorietal.,1998,Appl.Env.Microbiol.64:1607-1611；Takagietal.,1999,FEBSLett.452:323-327）。通过反馈抗性CysE酶，使L-半胱氨酸的直接前体O-乙酰基-L-丝氨酸的形成基本上与细胞中的L-半胱氨酸水平互不影响。

O-乙酰基-L-丝氨酸是由L-丝氨酸和乙酰基-CoA形成的。因此，以足以产生L-半胱氨酸的量提供L-丝氨酸具有重大意义。这可以通过插入编码具有降低的L-丝氨酸反馈抑制能力的3-磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因而实现。由此使L-丝氨酸的前体3-羟基丙酮酸的形成基本上与细胞中的L-丝氨酸水平互不影响。EP0620853、US2005/0009162A1、US2005/009162A2和EP0931833描述了此类SerA酶的例子。

此外还已知通过将编码诸如色氨酸酶TnaA或胱硫醚-β-裂解酶MalY或MetC的L-半胱氨酸降解酶的基因弱化或消灭，可以提高发酵过程中的L-半胱氨酸产率（EP1571223）。

增加将L-半胱氨酸从细胞运输出的量是另一种提高培养基中的产物产率的可能性。这可以通过所谓的外排基因的过度表达而实现。这些基因编码膜结合型蛋白质，该膜结合型蛋白质促进从细胞输出L-半胱氨酸的过程。用于输出L-半胱氨酸的各种不同的外排基因已有描述（US5,972,663A、US2004/0038352A1、US2005/221453、WO2004/113373）。

从细胞输出L-半胱氨酸至发酵培养基具有多个优点：

1）L-半胱氨酸连续地提取自细胞内反应平衡，结果是该氨基酸在细胞内保持在低水平，因此不存在敏感性酶类受到L-半胱氨酸的反馈抑制：

2）在存在氧的情况下将释放至培养基中的L-半胱氨酸氧化成为二硫化物L-胱氨酸，在培养期间氧被引入培养基中（US5,972,663A）：

因为尤其是与L-半胱氨酸相比，L-胱氨酸在中性pH的水溶液中的溶解度仅非常低，所以二硫化物即使在低浓度的情况下也会沉淀并形成白色沉淀物：

通过L-胱氨酸的沉淀，溶解在培养基中的产物的水平降低，从而在各种情况下将（1）和（2）的反应平衡向产物侧推动。

3）与产物在细胞内累积并且必须实施初始细胞裂解的情况相比，在氨基酸可以由发酵培养基直接获得的情况下，产物纯化的技术复杂性明显更低。

兼性厌氧细菌，例如E.coli或P.ananatis，在需氧条件下即在存在氧的情况下更好地生长，因为其通过有氧代谢由糖类如葡糖可以获得的能量多于通过各自的能量来源的发酵（无氧代谢）。

使用E.coli或P.ananatis生产L-半胱氨酸的过程也是在需氧条件下进行的（US2004/0038352A1、US5,972,663A、CA2386539A1、EP1389427、EP2138585）。在详细描述的方法中公开了，对输入培养物中的氧进行调节，从而在发酵期间使发酵液的氧含量为50％。

所述通过发酵生产L-半胱氨酸的方法的缺点是，氨基酸以不同的形式存在于发酵液中。除了在沉淀物中沉淀的L-胱氨酸以外，在培养物上清液中发现有溶解形式的L-胱氨酸以及L-半胱氨酸以及噻唑烷（US6,218,168B1、US5,972,663A、CA2386539A1）。该噻唑烷（2-甲基噻唑烷-2,4-二羧酸）是L-半胱氨酸和丙酮酸的缩合产物，其是在纯化学反应中形成的。

在本发明的范畴内，术语“全部半胱氨酸”是将L-半胱氨酸和由此形成的化合物L-胱氨酸和噻唑烷相结合，其是在发酵期间形成的，并且在培养物上清液及在沉淀物中累积。

在已知的方法中，沉淀的L-胱氨酸的比例在发酵结束时改变。其占全部半胱氨酸的40至66％（US5,972,663A、CA2386539A1），这意味着全部半胱氨酸的剩余34至60％存在于培养物上清液中，即主要是L-半胱氨酸和噻唑烷的形式。该产物异质性阻碍了由发酵液回收和纯化产物。

因此，期望其中最终产物绝大部分仅以一种形式产生的方法。特别有利的是其中L-胱氨酸主要作为产物形成的方法，因为L-胱氨酸由于其在中性pH的含水培养基中的溶解度低，即使在低浓度的情况下也发生沉淀，从而使反应平衡向产物侧移动，这又获得比较高的产物产率。

发明内容

因此，本发明的目的是提供通过在发酵培养基中使微生物菌株发酵生产L-胱氨酸的方法，在该方法中相对于所形成的全部半胱氨酸，L-胱氨酸以至少70％的量沉淀。

该目的是通过如下方法实现的，其特征在于，在形成L-胱氨酸期间将发酵培养基的O₂饱和度保持在至少1％且最多40±3％。

培养基的O₂饱和度定义为溶解氧的量相对于在给定的条件下最大可溶解的氧的量的百分比。

出人意料地表明，在发酵结束时沉淀的L-胱氨酸相对于发酵液中全部半胱氨酸的比例为至少70％（每升沉淀的L-胱氨酸的重量相对于每升全部半胱氨酸的重量的比例），条件是O₂饱和度保持在该低的范围内。因此这一发现是特别令人吃惊的，因为EP1389427公开了实际上可以通过将例如是氧或过氧化氢的形式的氧化剂以增加的量引入培养物中而获得高的L-胱氨酸比例。

因此，根据本发明的方法也是非常有利的，这是因为作为沉淀物存在的L-胱氨酸可以通过简单的倾析步骤从细胞分离出，所以产物的纯化容易进行。

根据本发明的发酵方法的胱氨酸形成阶段由在发酵液中L-胱氨酸可以首次作为沉淀物检测到的时刻开始，并持续直至培养结束。典型地，该阶段在生产发酵罐接种之后约8至10h时开始。

可用于根据本发明的方法的微生物是所有在现有技术中所述的生产半胱氨酸的菌株。例如US6,218,168B1、US5,972,663A、US2004/0038352A1、CA2386539A1、US2009/0053778或EP2138585公开了此类菌株。

优选的微生物是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的代表，更优选为埃希氏菌属（Escherichia）和泛菌属（Pantoea）的代表，特别优选为E.coli和P.ananatis种的菌株。

在这些微生物菌株中，又优选为如下的菌株，其具有L-半胱氨酸反馈抑制与相应的野生型酶相比降低了至少2倍的经修饰的丝氨酸-O-乙酰基移转酶，或者其通过外排基因的过度表达使从细胞输出半胱氨酸的量与野生型细胞相比升高了至少2倍。更优选为如下的微生物菌株，其具有L-半胱氨酸反馈抑制与相应的野生型酶相比降低了至少2倍的丝氨酸-O-乙酰基移转酶，并且通过外排基因的过度表达使从细胞输出半胱氨酸的量与野生型细胞相比升高了至少2倍。例如US6,218,168B1和US5,972,663A公开了此类菌株。特别优选的菌株额外地具有L-丝氨酸反馈抑制与相应的野生型酶相比降低了至少2倍的经修饰的3-磷酸甘油酸脱氢酶（US2005/0009162A1、US2005/009162A2），其中使至少一种L-半胱氨酸降解酶弱化，从而与野生型细胞相比在细胞中仅存在该酶活性的最多50％。

丝氨酸-O-乙酰基移转酶的优选的变异体受到L-半胱氨酸的反馈抑制与相应的野生型酶相比降低了至少5倍，更优选降低了至少10倍，特别降低了至少50倍。

外排基因优选源自以下组中：E.coli的ydeD（参见US5,972,663A）、yfiK（参见US2004/0038352A1）、cydDC（参见WO2004/113373）、bcr（参见US2005/221453）和emrAB（参见US2005/221453）或来自其他微生物的相应的同源基因。同源基因应当理解为该基因的序列对应于相应的E.coli基因的DNA序列的至少80％。

外排基因的过度表达优选使从细胞输出半胱氨酸的量与野生型细胞相比升高了至少5倍，更优选升高了至少10倍，特别优选升高了至少20倍。

3-磷酸甘油酸脱氢酶的优选的变异体受到L-丝氨酸的反馈抑制与相应的野生型酶相比降低了至少5倍，更优选降低了至少10倍，特别优选降低了至少50倍。

L-半胱氨酸降解酶优选源自以下组中：色氨酸酶（TnaA）和胱硫醚-β-裂解酶（MalY，MetC）。

更优选为如下的微生物菌株，其中使这些酶中的至少一种弱化，从而与野生型菌株相比在细胞中仍然仅存在该酶活性的最多10％。特别优选为如下的菌株，其中使这些酶中的至少一种完全灭活。

在生产L-半胱氨酸期间细胞的培养是在需氧生长条件下进行的。可以不同的方式将氧引入培养物中，例如通过利用摇动装置摇动培养容器。若在发酵罐中进行培养，则可以将空气或纯氧或这些气体的混合物吹入培养物中。为了确保将足够的氧供应至细胞，还可以在压力下进行发酵（例如在0.5至1.2巴的超压下），从而提高氧在培养基中的溶解度。在搅拌罐型发酵罐中，引入的氧额外地通过搅拌机在培养基中分散，从而提高细胞对氧的可利用性。

溶解在培养基中的氧优选在发酵期间借助探针连续地进行测量。这例如可以借助光学传感器或化学传感器（Clark电池）进行。将所测的培养基的O₂饱和度连续地调节至预定的名义值。若实际值偏离名义值，则通过自动控制回路调节气体供应量或搅拌速度或这两者，从而使O₂饱和度又恢复至名义值。以此方式，可以在整个发酵过程中使培养物中的氧含量保持在所期望的数值。

在开始发酵之前将氧测量探针在尚未接种的培养基中校准至O₂饱和度的边界值0％和100％。这是适当地在随后的发酵温度下进行的。

在可以将探针校准至0％的O₂饱和度之前，必须首先将全部仍然存在的氧从培养基驱出。这是在对发酵罐中的发酵培养基进行原位灭菌时自动地进行的，或者可以通过在搅拌速度为最大可能的搅拌速度的20％的情况下用纯氮吹洗培养基而进行。将探针校准至100％的O₂饱和度的过程通常是在发酵开始时存在的氧供应条件（初始条件）下进行的，即最大可能的气体供应量的40％及最大可能的搅拌速度的20％。只有在选定条件下氧含量达到恒定值时才将探针校准至100％。

在L-胱氨酸发酵的生产阶段中氧含量必须保持在低于40±3％的O₂饱和度，优选低于30±3％，更优选低于20±3％，特别优选低于10±3％。

优选的碳源是糖、糖醇、有机酸或含糖的植物水解产物。在根据本发明的方法中使用的特别优选的碳源是葡糖、果糖、乳糖、甘油或包含这些化合物中的两种或更多种的混合物。

优选将碳源按计量添加至培养物，从而在L-半胱氨酸生产阶段中使发酵罐中的碳源含量不超过10g/L。最大浓度优选为2g/L，更优选为0.5g/L，特别优选为0.1g/L。

在根据本发明的方法中使用的N源优选为氨、铵盐或蛋白质水解产物。在使用氨作为pH稳定化的修正剂时，在发酵期间规律地补充该N源。

作为其他的培养基添加剂，可以添加元素磷、氯、钠、镁、氮、钾、钙、铁的盐和痕量的（即以μM计的浓度）元素钼、硼、钴、锰、锌和镍的盐。

此外，可以将有机酸（例如乙酸盐、柠檬酸盐）、氨基酸（例如异亮氨酸）和维生素（例如B1、B6）添加至培养基。

作为复合的营养源例如可以使用酵母抽提物、玉米浆、大豆粉或麦芽提取物。

诸如E.coli或P.ananatis的嗜温微生物的孵育温度优选为15至45℃，更优选为30至37℃。

在发酵期间发酵培养基的pH值优选在5.0至8.5的pH范围内，更优选pH值为7.0。

为了生产L-半胱氨酸和L-半胱氨酸衍生物，在发酵期间必须供入硫源。在此情况下，优选使用硫酸盐或硫代硫酸盐。

根据所述方法发酵的微生物在生长阶段之后在分批过程或补料分批过程中历时8至150小时的时间以高效率向发酵培养基中分泌L-半胱氨酸及由其衍生的化合物。

在发酵之后，通过已知的方法，例如使用倾析器，可以将作为沉淀物存在的L-胱氨酸从发酵液的剩余成分分离出。

可以实施以下步骤，以进一步纯化粗制产物：

-用无机酸溶解粗制产物

-通过离心分离或过滤使粗制产物溶液变澄清

-使溶液脱色

-沉淀结晶

例如通过如EP0235908中所述的电化学方法，可以使L-胱氨酸还原成为L-半胱氨酸。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐述本发明。

实施例1：产生半胱氨酸生产菌株

野生型菌株E.coliW3110（ATCC27325）和P.ananatis（ATCC11530）各自利用质粒pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306（在US5,972,663A的实施例2中公开）通过如US5,972,663A中所述的电穿孔进行转化。质粒pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306除了包含复制起点和四环素抗性基因以外，还包含编码具有降低的L-半胱氨酸反馈抑制的丝氨酸-O-乙酰基移转酶的cysEX等位基因以及外排基因ydeD（ORF306），其表达受组成型GAPDH启动子控制。

带有质粒的细胞的选择在包含15mg/L四环素的LB琼脂平板上进行。

在利用QIAprepSpinPlasmidKit（Qiagen有限公司）和酶切分析重新分离质粒之后，将所期望的转化体，即接收质粒pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的细胞分离，并用于发酵，如实施例2中所述。

实施例2：半胱氨酸生产菌株在不同的氧饱和度下的培养

预培养物1（摇动烧瓶）：

将20mL包含15mg/L四环素的LB-培养基在Erlenmeyer烧瓶（100mL）中分别用菌株（E.coliW3110pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306或P.ananatispACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306）接种，并在摇床上孵育7小时（150rpm，30℃）。

预培养物2（摇动烧瓶）：

然后，将预培养物1完全转移至100mL的SM1-培养基中（12g/LK₂HPO₄、3g/LKH₂PO₄、5g/L(NH₄)₂SO₄、0.3g/LMgSO₄×7H₂O、0.015g/LCaCl₂×2H₂O、0.002g/LFeSO₄×7H₂O、1g/L柠檬酸三钠×2H₂O、0.1g/LNaCl、1mL/L由以下物质组成的痕量元素溶液：0.15g/LNa₂MoO₄×2H₂O、2.5g/LH₃BO₃、0.7g/LCoCl₂×6H₂O、0.25g/LCuSO₄×5H₂O、1.6g/LMnCl₂×4H₂O、0.3g/LZnSO₄×7H₂O），其用5g/L葡糖、5mg/L维生素B1和15mg/L四环素补充。将培养物在Erlenmeyer烧瓶（1L）中在30℃下以150rpm摇动17h。在该孵育过程之后，在600nm处的光密度（OD₆₀₀）在3和5之间。

主要培养物（发酵罐）：

在购自SartoriusStedim公司的BIOSTATB型发酵罐中进行发酵。使用总容积为2L的培养容器。发酵培养基（900mL）包含15g/L葡糖、10g/L胰胨（Difco）、5g/L酵母抽提物（Difco）、5g/L(NH₄)₂SO₄、1.5g/LKH₂PO₄、0.5g/LNaCl、0.3g/LMgSO₄×7H₂O、0.015g/LCaCl₂×2H₂O、0.075g/LFeSO₄×7H₂O、1g/L柠檬酸三钠×2H₂O和1mL的痕量元素溶液（见上）、0.005g/L维生素B1和15mg/L四环素。

在开始时通过泵入25％的NH₄OH溶液，将发酵罐中的pH值调节至7.0。在发酵过程中，通过用25％的NH₄OH自动修正，使pH值保持在7.0的数值。将100mL预培养物2泵入发酵容器中以进行接种。因此，起始容积约为1L。培养物在开始时以400rpm进行搅拌，并用2vvm经由无菌过滤器灭菌的压缩空气进行充气。在接种之前在该起始条件下将氧探针校准至100％的饱和度。取决于实验批次，将在发酵期间的O₂饱和度的名义值调节至50±5％、40±5％、30±5％、20±5％或10±5％。在O₂饱和度下降至低于各个名义值之后，启动级联式调节以使O₂饱和度重新恢复至名义值。在此，气体供应量首先连续地增大（至最高5vvm），然后搅拌速度连续地增大（至最高1500rpm）。

在30℃的温度下进行发酵。在2h的发酵时间之后，以无菌的60％硫代硫酸钠×5H₂O原液的形式以每小时1.5mL的流量供入硫源。一旦发酵罐中的葡糖含量由初始的15g/L下降至约2g/L，则连续地按计量添加56％的葡糖溶液。调节进料速率，从而使发酵罐中的葡糖浓度从此以后不超过2g/L。使用购自YSI公司（YellowSprings，Ohio，USA）的葡糖分析仪实施葡糖测定。

发酵时间为48小时。然后，提取样品，各自独立地测定在培养物上清液中（尤其是L-半胱氨酸和噻唑烷）及在沉淀物（L-胱氨酸）中的L-半胱氨酸含量和由其衍生的衍生物的含量（参见表1）。为此目的，各自采用Gaitonde比色试验（Gaitonde,M.K.(1967),Biochem.J.104,627-633）。在此应当注意，在该试验的强烈酸性反应条件下，不仅游离的L-半胱氨酸而且结合在噻唑烷中的L-半胱氨酸一起被记录和量化。溶解在培养物上清液中的L-胱氨酸在Gaitonde试验中在稀释的溶液中在pH为8.0的情况下用二硫苏糖醇（DTT）还原之后同样被检测为L-半胱氨酸。位于沉淀物中的L-胱氨酸必须首先溶解在8％盐酸中，然后可以相同方式量化。

表1：48小时后发酵液中L-半胱氨酸和L-半胱氨酸衍生物的含量

¹：溶解在上清液中的L-半胱氨酸、L-胱氨酸和噻唑烷之和

²：沉淀物中的L-胱氨酸

³：沉淀物中的L-胱氨酸相对于全部半胱氨酸的比例

Claims

1.通过在发酵培养基中使微生物菌株发酵生产L-胱氨酸的方法，其中在生产L-半胱氨酸期间细胞的培养是在需氧生长条件下进行的，在该方法中相对于全部半胱氨酸，L-胱氨酸以至少70％的量沉淀，其特征在于，作为所述微生物菌株使用肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的代表，在形成L-胱氨酸期间将发酵培养基的O₂饱和度保持在至少1％且最多43％。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在形成L-胱氨酸期间将O₂饱和度保持在低于33％。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，在形成L-胱氨酸期间将O₂饱和度保持在低于13％。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述微生物菌株具有L-半胱氨酸反馈抑制与相应的野生型酶相比降低了至少2倍的丝氨酸-O-乙酰基移转酶，或者所述微生物菌株通过外排基因的过度表达使半胱氨酸的输出量与野生型菌株相比升高了至少2倍。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述微生物菌株额外地具有L-丝氨酸反馈抑制与相应的野生型酶相比降低了至少2倍的3-磷酸甘油酸脱氢酶。

6.根据权利要求1至5之一的方法，其特征在于，利用摇动装置摇动培养容器或者吹入空气或纯氧或这些气体的混合物，由此将氧引入发酵培养基中。

7.根据权利要求1至6之一的方法，其特征在于，将碳源按计量添加至发酵培养基，从而使在半胱氨酸生产阶段中发酵罐中的碳源含量不超过10g/L。

8.根据权利要求1至7之一的方法，其特征在于，孵育温度为15至45℃，在发酵期间发酵培养基的pH值是在5.0至8.5的范围内的pH值。

9.根据权利要求1至8之一的方法，其特征在于，在发酵期间送入硫源。