KR20130138848A

KR20130138848A - 조절된 산소 포화도 하의 발효에 의한 ｌ-시스틴의 제조 방법

Info

Publication number: KR20130138848A
Application number: KR1020137030345A
Authority: KR
Inventors: 토비아스 다슬러; 아넬리제 로이터마이어; 토마스 슐뢰서
Original assignee: 와커 헤미 아게
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2013-12-19
Also published as: JP2014512841A; US20140080186A1; WO2012152664A1; CN103517989B; DE102011075656A1; EP2707492A1; KR101557566B1; JP5840767B2; EP2707492B1; US9074230B2; CN103517989A

Abstract

본 발명은 발효 배지에서 미생물 균주를 발효시킴으로써 L-시스틴을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에서 L-시스틴은 총 시스테인에 대해 70% 이상의 양으로 침전되며, L-시스틴 형성 중 발효 배지의 O₂ 포화도는 1% 이상 및 최대 40 ± 3%로 유지된다.

Description

조절된 산소 포화도 하의 발효에 의한 Ｌ-시스틴의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING L-CYSTINE BY FERMENTATION UNDER CONTROLLED OXYGEN SATURATION}

본 발명은 발효에 의한 L-시스틴의 제조 방법에 관한 것이다.

L-시스틴은 2 개의 L-시스테인 분자의 산화에 의해 형성되는 디설파이드이다. 이 반응은 가역적이며, 이는 L-시스틴이 환원에 의해 L-시스테인으로 재변환될 수 있다는 것을 의미한다.

아미노산 L-시스테인은 경제적으로 중요하다. 이것은 예를 들어, 식품 첨가제로(특히 베이커리 산업에서), 화장품의 공급 원료로, 및 또한 활성 약학 성분 제조를 위한 출발 생성물로(특히 N-아세틸시스테인 및 S-카복시메틸시스테인) 사용된다.

L-시스테인은 모든 유기체들의 황 대사에서 주요한 역할을 하고, 단백질, 글루타티온, 바이오틴, 리포산, 메티오닌 및 다른 황 함유 대사물의 합성에 사용된다. 추가로, L-시스테인은 보조효소 A의 생합성을 위한 전구체 역할을 한다. L-시스테인의 생합성은 박테리아, 특히 장내 세균에서 심도있게 연구되었으며, 문헌[Kredich (1996, Biosynthesis of cysteine, p. 514-527. In F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C.)]에 상세히 기술되어 있다.

모발, 강모, 뿔, 발굽 및 깃털과 같은 케라틴 함유 물질로부터의 추출에 의한 또는 전구체의 효소 전환에 의한 생체 변환에 의한 L-시스테인의 고전적인 제조 외에, 발효에 의한 L-시스테인의 제조 방법이 또한 몇 년 전에 개발되었다. 미생물을 사용하는 발효에 의한 L-시스테인의 제조에 관한 종래 기술은 예를 들어 US6218168B1, US5972663A, US2004/0038352A1, CA2386539A1, US2009/0053778A1 및 US2009/0226984A1에 상세히 기술되어 있다. 여기서 사용된 박테리아 숙주 유기체는, 그 중에서도, 코리네박테리아(Corynebacterium) 속의 균주 및 또한 장내세균과의 대표적 균주, 예컨대 대장균(Escherichia coli) 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)이다.

돌연변이 및 선별에 의해 향상된 L-시스테인 생산자(producers)를 얻는 고전적인 방법 외에, 효과적인 L-시스테인 과생성(overproduction)을 달성하기 위해 균주에 대한 특정 유전자 변형이 또한 수행된다.

L-시스테인에 의한 피드백 억제가 감소된 세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제를 코딩하는 cysE 대립유전자의 삽입은 따라서 시스테인 제조를 증가시킨다(US6218168B1; Nakamori et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611; Takagi et al., 1999, FEBS Lett. 452: 323-327). 피드백 내성 CysE 효소를 사용함으로써, L-시스테인의 직접적인 전구체인 O-아세틸-L-세린의 형성은, 세포에서의 L-시스테인 수준으로부터 크게 디커플링(decoupled)된다.

O-아세틸-L-세린은 L-세린 및 아세틸-CoA로부터 형성된다. 따라서, L-시스테인 제조를 위해 충분한 양의 L-세린을 제공하는 것이 가장 중요하다. 이것은 L-세린에 의한 피드백 억제에 대해 감소된 능력을 갖는 3-포스포글리세레이트 탈수소효소를 코딩하는 serA 대립유전자의 삽입에 의해 달성될 수 있다. 이 때문에 L-세린의 전구체인 3-히드록시피루베이트의 형성은, 세포에서의 L-시스테인 수준으로부터 크게 디커플링된다. 이러한 SerA 효소의 예는 EP0620853, US 2005/0009162 A1, US2005009162A2 및 EP0931833에 기술되어 있다.

추가로, 발효에서의 L-시스테인 수율은 L-시스테인 분해 효소, 예컨대 트립토파네이즈 TnaA 또는 시스타티오닌-β-리아제 MalY 또는 MetC를 코딩하는 유전자를 약화시키거나 파괴함으로써 증가될 수 있음이 공지되어 있다(EP1571223).

세포 외부로의 L-시스테인 운송의 증가는 배지에서의 생성물 수율 증가에 대한 추가적인 가능성이다. 이것은 소위 방출 유전자(efflux genes)의 과발현에 의해 달성될 수 있다. 이 유전자는 세포로부터 L-시스테인의 유출(export)을 매개하는 막 결합 단백질을 코딩한다. L-시스테인 유출을 위한 다양한 방출 유전자가 기술되었다(US5972663A, US2004/0038352A1, US2005221453, WO2004113373).

세포로부터 발효 배지 내로의 L-시스테인 유출은 몇 가지 장점을 가진다:

1) L-시스테인은 세포 내 반응 평형으로부터 지속적으로 추출되어 그 결과 이 아미노산이 세포에서 낮은 수준으로 유지되도록 하며 이로써 L-시스테인에 의한 감수성 효소의 피드백 억제가 존재하지 않는다:

(1) L-시스테인 (세포 내)

L-시스테인 (배지)

2) 배지 내로 방출된 L-시스테인이 배양 중에 배지 내로 도입되는 산소의 존재 하에 디설파이드 L-시스틴으로 산화된다(US5972663A):

(2) 2 L-시스테인 + 1/2 O₂

L-시스틴 + H₂O

특히 L-시스테인과 비교하여, 중성 pH에서 수용액 중 L-시스틴의 용해도가 매우 낮기 때문에, 디설파이드는 낮은 농도에서도 침전되고 백색 침전물을 형성한다:

(3) L-시스틴 (용해됨)

L-시스틴 (침전물)

L-시스틴의 침전을 통해, 배지에 용해된 생성물의 수준은 감소되며, 이에 의해 각 경우 (1) 및 (2)의 반응 평형은 또한 생성물 쪽으로 기운다.

3) 생성물의 정제에 대한 기술적 노력은, 아미노산을 발효 배지로부터 직접적으로 얻을 수 있는 경우 생성물이 세포 내에 축적되고 초기 세포 용해가 수행되어야 하는 것보다 상당히 낮다.

통성 혐기성 박테리아, 예컨대 대장균(E. coli) 또는 P. 아나나티스(P. ananatis)는, 호기성 조건 하, 즉 산소의 존재 하에 더 우수하게 자라는데, 이는 이들이 탄수화물, 예컨대 글루코오스로부터 각 에너지원의 발효(혐기성 대사)에 의해서보다 호기성 대사에 의해 더 많은 에너지를 얻을 수 있기 때문이다.

대장균 또는 P. 아나나티스를 사용하는 L-시스테인 제조는 또한 호기성 조건 하에 수행된다(US2004/0038352A1, US5972663A, CA2386539A1, EP1389427, EP2138585). 이는 배양물 내로의 산소 주입이 배양 브로스가 발효 중에 50%의 산소 함량을 갖도록 조정되는 것이 더욱 상세히 기술된 방법에 개시되어 있다.

발효에 의해 L-시스테인을 제조하도록 기술된 방법의 단점은 아미노산이 배양 브로스에서 다양한 형태로 존재한다는 점이다. 침전물 중 침전된 L-시스틴 외에, 용해된 형태의 L-시스틴 및 또한 L-시스테인 및 또한 티아졸리딘이 배양 상청액에서 발견된다(US6218168B1, US5972663A, CA2386539A1). 이 티아졸리딘(2-메틸티아졸리딘-2,4-디카르복시산)은 순수하게 화학 반응에서 형성된 L-시스테인 및 피루베이트의 축합 생성물이다.

본 발명의 내용에서 용어 "총 시스테인"은 배양 상청액에서 및 침전물에서 발효 및 축적 중에 형성되는, L-시스테인 및 이로부터 형성된 L-시스틴 및 티아졸리딘 화합물을 겸비한다.

공지된 방법에서, 침전된 L-시스틴의 비율은 발효 종료시 달라진다. 이것은 총 시스테인의 40-66%이며(US5972663A, CA2386539A1), 이는 나머지 총 시스테인의 34-60%가 배양 상청액에 존재하며, 즉 압도적으로 L-시스테인 및 티아졸리딘 형태로 존재함을 의미한다. 이 생성물 이질성(heterogeneity)은 배양 브로스로부터 생성물의 회수 및 정제를 저해한다.

따라서 최종 생성물이 대부분 단 하나의 형태로 발생하는 방법이 바람직하다. L-시스틴이 pH 중성 수성 배지 중의 이의 낮은 용해도로 인해 낮은 농도에서도 침전하며, 이에 의해 반응 평형은 생성물 쪽으로 이동하고, 그 결과 비교적 높은 생성물 수율을 유도하기 때문에, L-시스틴이 압도적으로 생성물로 형성되는 방법이 특히 바람직하다.

따라서 본 발명의 목적은 발효 배지에서 미생물 균주를 발효시킴으로써 L-시스틴을 제조하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법에서 L-시스틴은 형성된 총 시스테인에 대해 70% 이상의 양으로 침전된다.

상기 목적은 L-시스틴 형성 중 발효 배지의 O₂ 포화도가 1% 이상 및 최대 40 ± 3%로 유지되는 방법에 의해 달성된다.

배지의 O₂ 포화도는 명시된 조건 하의 최대 가용성 산소량의 퍼센티지로서의 용해된 산소량의 비율로 정의된다.

놀랍게도, O₂ 포화도가 이 낮은 범위에 유지되는 경우, 발효 종료시 배양 브로스 중 총 시스테인의 비율로서의 침전된 L-시스틴은 70% 이상(총 시스테인의 리터당 중량에 대한 침전된 L-시스틴의 리터당 중량)인 것으로 나타났다. 이 발견은, 특히 EP1389427에서 높은 L-시스틴 비율이 산화제를, 예를 들어 산소 또는 과산화수소 형태로, 배양액 내로 증가된 양으로 도입함으로써 실제로 달성될 수 있다는 것이 개시되었기 때문에 매우 놀라운 일이다.

본 발명에 따른 방법은 또한, 침전물로 존재하는 L-시스틴이 간단한 디캔팅 단계에 의해 세포로부터 분리될 수 있는 것과 같이 생성물의 정제가 용이하게 달성될 수 있기 때문에 매우 유리하다.

본 발명에 따른 발효 방법의 시스틴 형성 단계는 L-시스틴이 처음으로 배양 브로스에서 침전물로 검출될 수 있는 시점으로부터 시작하고 배양 종료시까지 지속된다. 통상적으로, 이 단계는 생산 발효기의 접종 약 8-10 시간 후에 시작한다.

본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 미생물은 종래 기술에 기술된 모든 시스테인 생성 균주이다. 이러한 균주들은, 예를 들어, US6218168B1, US5972663A, US2004/0038352A1, CA2386539A1, US2009/0053778 또는 EP2138585에 개시되어 있다.

바람직한 미생물은 장내 세균과의 대표적 균주, 더욱 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia) 및 판토에아(Pantoea) 속의 대표적 균주, 특히 바람직하게는 대장균 및 P. 아나나티스 종의 균주이다.

이 미생물 균주들 중에서, 결과적으로 L-시스테인에 의한 피드백 억제가 상응하는 야생형 효소에 비해 2 배 이상으로 감소된 변형된 세린 O-아세틸트랜스퍼라아제를 가지거나, 또는 세포로부터의 시스테인 유출이 야생형 세포에 비해 방출 유전자의 과발현에 의해 2 배 이상으로 증가된 균주가 바람직하다. L-시스테인에 의한 피드백 억제가 상응하는 야생형 효소에 비해 2 배 이상으로 감소된 세린 O-아세틸트랜스퍼라아제를 가지고 동시에 세포로부터의 시스테인 유출이 야생형 세포에 비해 방출 유전자의 과발현에 의해 2 배 이상으로 증가된 미생물 균주가 특히 바람직하다. 이러한 균주들은, 예를 들어, US6218168B1 및 US5972663A에 공지되어 있다. 특히 바람직한 균주들은 L-세린에 의한 피드백 억제가 상응하는 야생형 효소에 비해 2 배 이상으로 감소된 변형된 3-포스포글리세레이트 탈수소효소를 추가로 갖는 것들이고(US 2005/0009162A1, US2005009162A2) 여기서 1 이상의 L-시스테인 분해 효소는 야생형 세포에 비해 이 효소 활성의 최대 50%만이 세포에 존재하는 한 약해진다.

세린 O-아세틸트랜스퍼라아제의 바람직한 변형예는 L-시스테인에 의한 피드백 억제가 상응하는 야생형 효소에 비해 5 배 이상으로, 더욱 바람직하게는 10 배 이상으로, 특히 바람직하게는 50 배 이상으로 감소된다.

방출 유전자는 바람직하게는 대장균의 ydeD(US5972663A 참조), yfiK(US2004/0038352A1 참조), cydDC(WO2004113373 참조), bcr(US2005221453 참조) 및 emrAB(US2005221453 참조) 군 또는 또 다른 미생물로부터의 상응하는 상동유전자로부터 유래한다. 상동 유전자는 이 유전자의 서열이 상응하는 대장균 유전자의 DNA 서열에 80% 이상의 수준으로 일치함을 의미하는 것으로 이해된다.

방출 유전자의 과발현은 바람직하게는 세포로부터의 시스테인 유출이 야생형 세포에 비해 5 배 이상으로, 더욱 바람직하게는 10 배 이상으로, 특히 바람직하게는 20 배 이상으로 증가되도록 한다.

3-포스포글리세레이트 탈수소효소의 바람직한 변형예는 L-세린에 의한 피드백 억제가 상응하는 야생형 효소에 비해 5 배 이상으로, 더욱 바람직하게는 10 배 이상으로, 특히 바람직하게는 50 배 이상으로 감소된다.

L-시스테인 분해 효소는 바람직하게는 트립토파네이즈(TnaA) 및 시스타티오닌-β-리아제(MalY, MetC)의 군으로부터 유래한다.

이 효소들 중 1 이상이 야생형 균주에 비해 최대 10%의 효소 활성만이 세포에 여전히 존재하는 한 약화되는 것인 미생물 균주가 특히 바람직하다. 이 효소들 중 1 이상이 완전히 비활성화된 균주가 매우 특히 바람직하다.

L-시스테인 제조 중의 세포 배양은 호기성 성장 조건 하에 수행된다. 산소는 배양물 내로 다양한 방식으로, 예를 들어 진탕기를 사용하여 배양 용기를 진탕시킴으로써 도입될 수 있다. 배양이 발효기에서 수행되는 경우, 공기 또는 순수한 산소 또는 이 기체들의 혼합물을 배양물 내로 불어넣을 수 있다. 세포로의 충분한 산소 공급을 보장하기 위해, 발효는 또한 압력 하에(예를 들어 0.5-1.2 bar 초과압에서) 수행될 수 있으며, 이에 의해 배지에서의 산소 용해도가 증가한다. 교반 탱크 발효기에서, 도입된 산소는 배지에서 교반기로 추가로 분산되며, 이로써 세포로의 산소의 가용성을 불안정하게 만든다.

배지에 용해된 산소는 바람직하게는 프로브를 사용하여 발효 중에 지속적으로 측정된다. 이것은, 예를 들어, 광학 센서 또는 화학 센서(클라크 전지(Clark cell))로 수행될 수 있다. 배지의 측정된 O₂ 포화도는 미리 결정된 공칭값(nominal value)으로 지속적으로 조정된다. 실제 값이 공칭값으로부터 벗어나는 경우, 이 때 기체 공급 또는 교반 속도, 또는 이 둘 모두는, 자동식 조절 회로에 의해 조정되어 O₂ 포화도가 공칭값으로 다시 회복되도록 한다. 이러한 방식으로, 산소 함량은 바람직한 값으로 전체 발효 기간에 걸쳐 배양물에서 유지될 수 있다.

산소 측정 프로브는 아직 비접종된 배지에서 0% 및 100% O₂ 포화도의 극한값(limiting value)으로 발효 시작 전에 보정된다. 이것은 편의상 후속 발효 온도에서 수행된다.

프로브가 0% O₂ 포화도로 보정될 수 있기 전에, 아직 존재하는 산소 전체는 먼저 배지로부터 배출되어야 한다. 이것은 발효기에서 발효 배지의 계 내(in situ) 멸균 중에 자동적으로 수행되거나 최대 가능 교반 속도의 20%의 교반 속도에서 순수한 질소로 배지를 퍼지(purging)시킴으로써 수행될 수 있다. 100% O₂ 포화도로의 프로브의 보정은 일반적으로 발효의 시작시 존재하는 산소 공급 조건(초기 조건) 하에, 즉 최대 가능 기체 공급의 40% 및 최대 가능 교반 속도의 20%로 수행된다. 100%로의 프로브의 보정은 산소 함량이 선택된 조건 하에 일정한 값에 도달한 경우에만 수행된다.

L-시스틴 발효의 제조 단계 중의 산소 함량은 40 ± 3% 미만, 바람직하게는 30 ± 3% 미만, 더욱 바람직하게는 20 ± 3% 미만, 특히 바람직하게는 10 ± 3% 미만의 O₂ 포화도를 유지해야 한다.

바람직한 탄소 원료는 당, 당 알코올, 유기 산(organic acids) 또는 당 함유 식물 가수분해물이다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 특히 바람직한 탄소 원료는 글루코오스, 프럭토오스, 락토오스, 글리세롤 또는 이 화합물들 중 2 이상을 포함하는 혼합물이다.

탄소 원료는 바람직하게는 L-시스테인 제조 단계 중 발효기에서의 탄소 원료의 수준이 10 g/l을 초과하지 않도록 배양물에 첨가된다. 2 g/l, 더욱 바람직하게는 0.5 g/l, 특히 바람직하게는 0.1 g/l의 최대 농도가 바람직하다.

본 발명에 따른 방법에 사용된 N 원료는 바람직하게는 암모니아, 암모늄 염 또는 단백질 가수분해물이다. pH 안정화를 위한 보정 수단으로 암모니아를 사용하는 경우, 이 N 원료는 발효 중에 정기적으로 보충된다.

원소 인, 염소, 나트륨, 마그네슘, 질소, 칼륨, 칼슘, 철의 염 및, 미량으로(즉 μM 농도로), 원소 몰리브덴, 붕소, 코발트, 망간, 아연 및 니켈의 염이 추가 배지 첨가제로 첨가될 수 있다.

추가로, 유기 산(예를 들어 아세테이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어 이소류신) 및 비타민(예를 들어 B1, B6)이 배지에 첨가될 수 있다.

사용되는 복합 영양분 원료는 예를 들어 효모 추출물, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 대두 분말(soy flour) 또는 맥아 추출물(malt extract)을 포함할 수 있다.

중온 미생물, 예컨대 대장균 또는 P. 아나나티스의 인큐베이션 온도는 바람직하게는 15 - 45℃, 특히 바람직하게는 30 - 37℃이다.

발효 중 발효 배지의 pH는 바람직하게는 pH 5.0 내지 8.5 범위이고 특히 바람직하게는 pH 7.0이다.

L-시스테인 및 L-시스테인 유도체 제조를 위해, 황 원료는 반드시 발효 중에 공급되어야 한다. 이 경우, 술페이트 또는 티오술페이트를 사용하는 것이 바람직하다.

기술된 방법에 따라 발효된 미생물은, 성장 단계에 이은 배치식(batch) 또는 유가식(fed batch) 공정에서, 8 내지 150 시간에 걸쳐 L-시스테인 및 이로부터 유래한 화합물을 높은 효율로 발효 배지 내로 분비한다.

발효 후에, 침전물로 존재하는 L-시스틴은 공지된 방법으로, 예를 들어, 디캔터(decanter)를 사용하여 배양 브로스의 남은 구성 성분으로부터 분리될 수 있다.

하기 단계들이 미정제(crude) 생성물의 추가 정제를 위해 수행될 수 있다:

- 무기 산을 사용한 미정제 생성물의 용해

- 원심분리 또는 여과에 의한 미정제 생성물 용액의 정화

- 용액의 변색(discoloration)

- 침전 결정

L-시스틴의 L-시스테인으로의 환원은, 예를 들어, EP0235908에 기술된 전기화학 공정으로 수행될 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 추가로 예시한다.

실시예 1: 시스테인 생산 균주의 생성

야생형 균주 대장균 W3110(ATCC 27325) 및 P. 아나나티스(ATCC 11530)를 각 경우 US5972663A에 기술된 바와 같이 전기 천공법으로 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306(US5972663A의 실시예 2에 개시됨)으로 형질전환시켰다. 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306는, 복제 원점 및 테트라사이클린 내성 유전자 외에, 또한 감소된 L-시스테인에 의한 피드백 억제를 갖는 세린 O-아세틸트랜스퍼라아제를 코딩하는 cysEX 대립유전자 및 또한 구성성(constitutive) GAPDH 프로모터에 의해 발현이 조절되는 방출 유전자 ydeD(ORF306)를 포함한다. 플라스미드 보유 세포의 선별은 15 mg/l 테트라사이클린을 함유하는 LB 아가 플레이트에서 수행하였다. QIAprep 스핀 플라스미드 키트(Qiagen GmbH사제)를 사용하는 추가 플라스미드 단리 및 제약 분석(restriction analysis) 후에, 원하는 형질전환체, 즉 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306를 흡수한 세포를 단리시키고 실시예 2에 기술된 바와 같이 발효에 사용하였다.

실시예 2: 상이한 산소 포화도에서의 시스테인 생산 균주의 배양

예비배양 1 (플라스크 진탕):

15 mg/l 테트라사이클린을 함유하는 20 mL의 LB-배지에 각각의 균주(대장균 W3110 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306 또는 P. 아나나티스 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306)를 삼각 플라스크(100 ml)에서 접종하고 진탕기(shaker)에서 몇 시간 동안 인큐베이트시켰다(150 rpm, 30℃).

예비배양 2 (플라스크 진탕):

후속으로, 예비배양 1을 5 g/l 글루코오스, 5 mg/l 비타민 B1 및 15 mg/l 테트라사이클린으로 보충된 100 mL의 SM1-배지(12 g/l K₂HPO₄, 3 g/l KH₂PO₄, 5 g/l (NH₄)₂SO₄, 0.3 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 0.015 g/l CaCl₂ x 2 H₂O, 0.002 g/l FeSO₄ x 7 H₂O, 1 g/l Na₃ 시트레이트 x 2 H₂O, 0.1 g/l NaCl, 0.15 g/l Na₂MoO₄ x 2H₂O로 이루어진 1 ml/l 미량 원소 용액, 2.5 g/l H₃BO₃, 0.7 g/l CoCl₂ x 6 H₂O, 0.25 g/l CuSO₄ x 5 H₂O, 1.6 g/l MnCl₂ x 4 H₂O, 0.3 g/l ZnSO₄ x 7 H₂O) 내로 완전히 옮겼다. 배양물을 150 rpm로 17 시간 동안 30℃에서 삼각 플라스크(1 l)에서 진탕시켰다. 이 인큐베이션에 이어, 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)는 3 내지 5이었다.

본 배양(발효기):

발효를 Sartorius Stedim사의 타입 BIOSTAT B의 발효기에서 수행하였다. 2 l의 총 부피를 갖는 배양 용기를 사용하였다. 발효 배지(900 ml)는 15 g/l 글루코오스, 10 g/l 트립톤(tryptone)(Difco사제), 5 g/l 효모 추출물(Difco사제), 5 g/l (NH₄)₂SO₄, 1.5 g/l KH₂PO₄, 0.5 g/l NaCl, 0.3 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 0.015 g/l CaCl₂ x 2 H₂O, 0.075 g/l FeSO₄ x 7 H₂O, 1 g/l Na₃ 시트레이트 x 2 H₂O 및 1 mL의 미량 원소 용액(상기 참조), 0.005 g/l 비타민 B1 및 15 mg/l 테트라사이클린을 포함한다.

발효기에서의 pH를 25% NH₄OH 용액에서의 펌핑으로 시작시 7.0로 조정하였다. 발효 중에, pH를 25% NH₄OH를 사용하여 자동식 보정으로 7.0으로 유지하였다. 접종을 위해, 100 mL의 예비배양 2를 발효 용기 내로 펌핑시켰다. 이로 인해 출발 부피는 약 1 l였다. 배양물을 시작시에 400 rpm으로 교반하고 살균 필터를 통해 멸균된 압축 공기로 2 vvm에서 가스시켰다(gassed). 산소 프로브를 접종 전에 이 출발 조건 하에 100% 포화도로 보정하였다. 발효 중의 O₂ 포화도에 대한 공칭값을 - 실험 배치(batch)에 따라 - 50 ± 5%, 40 ± 5%, 30 ± 5%, 20 ± 5% 또는 10 ± 5%로 조정하였다. 각 공칭값 미만으로 O₂ 포화도가 떨어지면, 조절 연쇄작용(cascade)이 시작되어 O₂ 포화도를 다시 공칭값으로 회복시켰다. 처음에 기체 공급을 지속적으로 증가시키고(최대 5 vvm) 이후 교반 속도를 지속적으로 증가시켰다(최대 1500 rpm).

발효를 30℃의 온도에서 수행하였다. 2 시간의 발효 시간 후에, 황 원료의 공급을 시간당 1.5 ml의 속도로 살균 60% 나트륨 티오술페이트 x 5 H₂O 원액(stock solution)의 형태로 수행하였다. 발효기 중 글루코오스 함량이 초기 15 g/l 로부터 약 2 g/l로 하락하고 나면, 56% 글루코오스 용액을 지속적으로 첨가하였다. 공급 속도를 조정하여 이 시점으로부터 발효기 중 글루코오스 농도가 2 g/l를 초과하지 않도록 하였다. 글루코오스 측정은 YSI(미국 오하이오 주 옐로우 스프링스 소재)사제 글루코오스 분석기를 사용하여 수행하였다.

발효 시간은 48 시간이었다. 그 후에, 샘플을 꺼내고, 배양 상청액(특히 L-시스테인 및 티아졸리딘)에서의, 및 침전물(L-시스틴)에서의, L-시스테인 함량, 및 이로부터 유래한 유도체의 함량을 각각 독립적으로 측정하였다(표 1 참조). 이 목적을 위하여, 각 경우 가이톤데(Gaitonde)의 비색(colorimetric) 시험을 사용하였다(Gaitonde, M. K. (1967), biochem. J. 104, 627-633). 여기서, 시험의 강산성 반응 조건 하에, 자유 L-시스테인뿐만 아니라, 티아졸리딘에 결합한 L-시스테인이 또한 함께 기록되고 정량된다는 점을 유의해야 한다. 또한 pH 8.0의 희석 용액 중 디티오트레이톨(DTT)로의 환원에 이은 L-시스테인과 같이, 배양 상청액에 용해된 L-시스틴을 가이톤데 시험에서 검출하였다. 침전물에 존재하는 L-시스틴은 동일한 방식으로 정량될 수 있기 전에 먼저 8% 염산에 용해되어야한다.

48 시간 후 배양 브로스 중의 L-시스테인 및 L-시스테인 유도체의 함량
	대장균			P.아나나티스
공칭 O₂ 포화도 [%]	시스테인 함량 [g/l] 48 h 후		시스틴의 비율 [%]³	시스테인 함량 [g/l] 48 h 후		시스틴의 비율[%]³
	상청액¹	침전물²		상청액¹	침전물²
50 ± 3 (비교예)	6.3	11.0	63.6	3.8	8.2	68.3
40 ± 3	5.1	12.3	70.7	3.7	9.1	71.1
30 ± 3	4.1	14.7	78.2	3.3	10.5	76.1
20 ± 3	2.7	16.4	85.9	2.6	12.8	83.1
10 ± 3	1.9	17.9	90.4	1.3	14.1	91.6

¹: 상청액에 용해된 L-시스테인, L-시스틴 및 티아졸리딘의 합

²: 침전물 내 L-시스틴

³: 총 시스테인의 비율인 침전물 내 L-시스틴

Claims

발효 배지에서 미생물 균주를 발효시킴으로써 L-시스틴을 제조하는 방법으로서, 상기 방법에서 L-시스틴은 총 시스테인에 대해 70% 이상의 양으로 침전되며, L-시스틴 형성 중 발효 배지의 O₂ 포화도는 1% 이상 및 최대 40 ± 3%로 유지되는 것인 방법.
제1항에 있어서, L-시스틴 형성 중의 O₂ 포화도는 30 ± 3% 미만, 더욱 바람직하게는 20 ± 3% 미만, 특히 바람직하게는 10 ± 3% 미만으로 유지되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 사용된 미생물 균주는 장내 세균과의 대표적 균주, 더욱 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia) 및 판토에아(Pantoea) 속의 대표적 균주, 특히 바람직하게는 대장균(E. coli) 및 P. 아나나티스(P. ananatis) 종의 균주인 방법.
제3항에 있어서, 미생물 균주는 상응하는 L-시스테인에 의한 피드백 억제가 야생형 효소에 비해 2 배 이상으로 감소된 세린 O-아세틸트랜스퍼라아제를 가지거나, 또는 상기 미생물 균주는 시스테인 유출(export)이 야생형 균주에 비해 방출 유전자(efflux genes)의 과발현에 의해 2 배 이상으로 증가된 것인 방법.
제4항에 있어서, 미생물 균주는 L-세린에 의한 피드백 억제가 상응하는 야생형 효소에 비해 2 배 이상으로 감소된 3-포스포글리세레이트 탈수소효소를 추가로 가지는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 산소는 진탕기를 사용하여 배양 용기를 진탕시킴으로써 또는 공기 또는 순수한 산소 또는 이 기체들의 혼합물을 불어넣음으로써 발효 배지 내로 도입되는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 탄소 원료는 시스테인 제조 단계 중 발효기에서의 탄소 원료의 수준이 10 g/l을 초과하지 않도록 발효 배지에 첨가되는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인큐베이션 온도는 15 - 45℃, 특히 바람직하게는 30 - 37℃이고, 발효 중의 발효 배지의 pH는 pH 5.0 내지 8.5 범위이고, 특히 바람직하게는 pH 7.0인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 황 원료, 바람직하게는 술페이트 또는 티오술페이트는 발효 중에 공급되는 방법.