JP2023532871A - 改良されたシステイン産生株 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｌ－システインの発酵生産に適した微生物株であって、ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの相対酵素活性が不活性化されているか、または野生型酵素の比活性と比較して低下しており、かつＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスが、野生型酵素活性を有する微生物株と比較して増大した量のＬ－システインを形成し、前記酵素活性をコードする遺伝子がｐｐｓＡによって特定される微生物株に関する。本発明はまた、それらの微生物細胞を用いたＬ－システインを製造する方法に関する。
Description
本発明は、Ｌ－システインの発酵生産に適した微生物株であって、ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの相対酵素活性が不活性化されているか、野生型酵素の比活性と比較して低下しており、かつＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの野生型酵素活性を有する微生物株と比較して、増大した量のＬ－システインを形成し、前記酵素活性をコードする遺伝子がｐｐｓＡによって特定されることを特徴とする微生物株に関する。さらに、本発明は、これらの微生物細胞を用いたＬ－システインの製造方法を提供する。
システイン、略してＣｙｓまたはＣは、側鎖－ＣＨ２－ＳＨを有するα－アミノ酸である。天然に存在するエナンチオマー形態はＬ－システインであり、これだけがタンパクを形成するアミノ酸であるため、本発明の文脈においてシステインという用語が記述子なしで用いられる場合、Ｌ－システインが意味される。スルフヒドリル基の酸化により、２つのシステイン残基が一緒になってジスルフィド結合を形成し、結果としてシスチンが形成されるが、これには同じ記述が適用され、すなわち、記述子が存在しない場合、本発明においてはＬ－エナンチオマー（またはＬ－シスチン、または（Ｒ，Ｒ）－３，３’－ジチオビス（２－アミノプロピオン酸））が意味される。Ｌ－システインは、アミノ酸メチオニンから形成されるため、ヒトにとって準必須アミノ酸である。
すべての生物において、システインは硫黄代謝において重要な位置を占めており、タンパク質、グルタチオン、ビオチン、リポ酸、チアミン、タウリン、メチオニンおよびその他の硫黄含有代謝産物の合成に用いられる。さらに、Ｌ－システインは補酵素Ａの生合成の前駆体として機能する。
システインの生合成は、細菌、特に腸内細菌においｔ詳細に研究されている。システイン生合成の概要は、Wada and Takagi, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 73: 48-54に見出すことができる。
アミノ酸Ｌ－システインは経済的に重要である。アミノ酸Ｌ－システインは、例えば、食品添加剤（特に、製パン工業において）、化粧品の原材料として、医薬品有効成分の製造のための出発原料として（特に、Ｎ－アセチルシステインおよびＳ－カルボキシメチルシステイン）用いられる。
毛、剛毛、角質、蹄および羽毛等のケラチン含有材料からの抽出による、または前駆体の酵素変換による生体内変化によるシステインの古典的な調製に加えて、システインの発酵生産のプロセスも存在する。微生物を用いたシステインの発酵生産に関する先行技術は、例えば、ＥＰ０８５８５１０Ｂ１、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１、ＥＰ１３８２６８４Ｂ１、ＥＰ１２２０９４０Ｂ２、ＥＰ１７６９０８０Ｂ１およびＥＰ２１３８５８５Ｂ１に開示される。用いられる細菌宿主生物としては、コリネバクテリウム属の株、および、例えば、エシェリヒア・コリまたはパントエア・アナナティス等の腸内細菌科のメンバーが挙げられる。
微生物株におけるシステイン産生を改善するために、様々な方法が利用可能である。突然変異および選抜により改善されたシステイン産生体を得る古典的なアプローチに加えて、株はシステインの効果的な過剰生産を達成するために特別に遺伝子改変もされている。
例えば、システインによるフィードバック阻害が低減したセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ対立遺伝子の導入により、システイン産生の増大がもたらされた（ＥＰ０８５８５１０Ｂ１；Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611）。フィードバック耐性のＣｙｓＥ酵素により、システインの直接の前駆体であるＯ－アセチル－Ｌ－セリンの形成が、細胞内のシステインレベルから大幅に切り離された。
Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンは、Ｌ－セリンおよびアセチル－ＣｏＡから形成される。したがって、システインの産生に十分な量のＬ－セリンを提供することが非常に重要である。これは、Ｌ－セリンによるフィードバック阻害能が低下した３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｓｅｒＡ対立遺伝子を導入することによって達成することができる。その結果、Ｌ－セリンの生合成前駆体である３－ヒドロキシピルビン酸塩の形成が、細胞内のＬ－セリンレベルから大幅に切り離される。このようなＳｅｒＡ酵素の例は、ＥＰ０６２０８５３Ｂ１およびＥＰ１４９６１１１Ｂ１に記載されている。あるいは、Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-4184には、酵素活性を調節解除するためのｓｅｒＡ遺伝子への改変が開示されている。
発酵におけるシステイン収量は、例えば、トリプトファナーゼＴｎａＡまたはシスタチオニンβ－リアーゼＭａｌＹもしくはＭｅｔＣ（ＥＰ１５７１２２３Ｂ１）等のシステイン分解酵素をコードする遺伝子を減弱化または破壊することによって増大され得ることが知られている。
細胞外へのシステインの輸送を増大させることは、培地中の生成物収量を増大させる別の方法である。これは、いわゆる流出遺伝子を過剰発現させることによって達成することができる。前記遺伝子は、細胞外へのシステインの輸送を媒介する膜結合タンパク質をコードする。
システイン輸出のための様々な流出遺伝子が記載されている（ＥＰ０８８５９６２Ｂ１、ＥＰ１３８２６８４Ｂ１）。細胞から発酵培地へのシステインの輸出には、いくつかの利点がある：
１）Ｌ－システインが細胞内反応平衡から継続的に引き出され、その結果、細胞内の該アミノ酸のレベルが低く維持され、Ｌ－システインによる感受性酵素のフィードバック阻害が停止する：
（１）Ｌ－システイン（細胞内） ＜－＞ Ｌ－システイン（培地）。
１）Ｌ－システインが細胞内反応平衡から継続的に引き出され、その結果、細胞内の該アミノ酸のレベルが低く維持され、Ｌ－システインによる感受性酵素のフィードバック阻害が停止する：
（１）Ｌ－システイン（細胞内） ＜－＞ Ｌ－システイン（培地）。
２）培地に分泌されたＬ－システインは、培養中に培地に導入される酸素の存在下で酸化されてジスルフィドＬ－シスチンを形成する（ＥＰ０８８５９６２Ｂ１）：
（２）２Ｌ－システイン＋１／２Ｏ２ －＞ Ｌ－シスチン＋Ｈ２Ｏ。
（２）２Ｌ－システイン＋１／２Ｏ２ －＞ Ｌ－シスチン＋Ｈ２Ｏ。
中性ｐＨでの水溶液中のＬ－シスチンの溶解度はシステインと比較して非常に低いため、ジスルフィドはすでに低濃度で沈殿し、白色の沈殿物を形成する：
（３）Ｌ－シスチン（溶解） －＞ Ｌ－シスチン（沈殿）
（３）Ｌ－シスチン（溶解） －＞ Ｌ－シスチン（沈殿）
Ｌ－シスチンの沈殿は、培地中に溶解する生成物のレベルを低下させ、それによって（１）および（２）の反応平衡も生成物側に移動する。
３）生成物が細胞内に蓄積し、細胞破壊が最初に必要とされる場合よりも、アミノ酸が発酵培地から直接得られる場合の方が、生成物の精製は大幅に複雑ではない。
システイン産生株の遺伝子改変に加えて、発酵プロセスの最適化、すなわち細胞の培養方法も、効率的な産生プロセスの開発において重要な役割を果たす。例えば、炭素およびエネルギー源の性質および計測、温度、酸素の供給（ＥＰ２７０７４９２Ｂ１）、ｐＨおよび培養培地の組成等の様々な培養パラメーターが、システインの発酵生産における生成物収量および／または生成物スペクトルに影響を及ぼし得る。
原料およびエネルギーのコストが絶えず増大しているため、プロセスの経済的実行可能性を改善するために、システイン産生における生成物収率を増大させる必要性が常にある。
本発明の目的は、システインの発酵生産のための微生物株を提供することであり、これにより、先行技術から既知の株と比較して、発酵においてＬ－システインまたはＬ－シスチンのより高い収量を達成することができる。
この目的は、Ｌ－システインの発酵生産に適した微生物株によって達成され、該微生物株は、ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの相対酵素活性が不活性化されているか、または野生型酵素の比活性と比較して低下しており、かつＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの野生型酵素活性を有する微生物株と比較して、増大した量のＬ－システインを形成し、前記酵素活性をコードする遺伝子がｐｐｓＡによって特定されることによって特徴付けられる。
ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの酵素活性は、式：
（４）ホスホエノールピルビン酸塩＋リン酸塩＋ＡＭＰ ＜－＞ ピルビン酸塩＋Ｈ２Ｏ＋ＡＴＰ
（ＡＭＰ：アデノシン一リン酸、ＡＴＰ：アデノシン三リン酸）
の可逆反応によりホスホエノールピルビン酸塩からピルビン酸塩を生成できると定義される。
（４）ホスホエノールピルビン酸塩＋リン酸塩＋ＡＭＰ ＜－＞ ピルビン酸塩＋Ｈ２Ｏ＋ＡＴＰ
（ＡＭＰ：アデノシン一リン酸、ＡＴＰ：アデノシン三リン酸）
の可逆反応によりホスホエノールピルビン酸塩からピルビン酸塩を生成できると定義される。
したがって、この酵素活性は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＰＥＰシンターゼ、ＥＣ２．７．９．２）または同義にピルビン酸－Ｈ２Ｏジキナーゼとも呼ばれる。このタンパク質をコードする遺伝子は、本発明の文脈においてｐｐｓＡと略される。
酵素活性の検出（酵素アッセイ、ＰＥＰシンターゼアッセイ）：
微生物株のＰＥＰシンターゼ活性は、液体培地中の培養物から細胞をペレット化し、該細胞を洗浄し、例えばＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（商標）５Ｇ細胞ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を用いて細胞抽出物を調製することによって決定することができる。抽出物のタンパク質含有量は、“Ｑｕｂｉｔ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ”（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって決定することができる。
微生物株のＰＥＰシンターゼ活性は、液体培地中の培養物から細胞をペレット化し、該細胞を洗浄し、例えばＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（商標）５Ｇ細胞ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を用いて細胞抽出物を調製することによって決定することができる。抽出物のタンパク質含有量は、“Ｑｕｂｉｔ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ”（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって決定することができる。
ＰＥＰシンターゼ酵素活性は、例えば“Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ”（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて、式（４）に従ってピルビン酸塩とＡＴＰとの反応からのリン酸の化学量論的生成によって測定することができる。あるいは、ＡＭＰまたはホスホエノールピルビン酸塩の化学量論的生成、またはピルビン酸塩またはＡＴＰの化学量論的消費も決定することができる（式４を参照されたい）。ピルビン酸塩のＡＴＰ依存的消費を介してＰＥＰシンターゼ酵素活性を決定するためのアッセイは、例えば、Berman and Cohn, J. Biol. Chem. (1970) 245: 5309-5318に記載されている。同様に、Berman and Cohn, J. Biol. Chem. (1970) 245: 5309-5318には、ホスホエノールピルビン酸塩のＡＴＰ依存的形成のアッセイが記載されている。
特定の酵素活性は、さらなる精製または処理が行われない細胞抽出物の総タンパク質１ｍｇに基づく酵素活性に基づいて計算される（Ｕ／ｍｇタンパク質）。異なるＰＥＰシンターゼ酵素を比較するには、細胞抽出物を同じ方法で調製する必要があることに注意すべきである。すでに述べたように、細胞抽出物は、例えば、ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（商標）５Ｇ細胞ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を用いて調製することができる。
あるいは、異なる酵素は、同じ方法でそれぞれ精製された１ｍｇの酵素の比活性に基づいて比較することもできる（Ｕ／ｍｇ精製タンパク質）。ＰＥＰシンターゼを精製し、精製されたタンパク質の比活性を測定する方法は、例えば、Berman and Cohn, J. Biol. Chem. (1970) 245: 5309-5318に記載されている。
相対酵素活性は、ＰＥＰシンターゼをコードする遺伝子との関係で、Ｗｔ対立遺伝子を有する微生物株のＰＥＰシンターゼアッセイで決定された特定の酵素活性を１００％に設定することによって決定することができる。サンプルの特定の酵素活性についてのＰＥＰシンターゼアッセイで測定された値は、Ｗｔ酵素を含む当該株に対するパーセンテージとして特定される。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、ｃｄｓまたはコード配列と同義）は、開始コドンで始まり停止コドンで終わり、かつタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの領域を指す。ＯＲＦは、コード領域または構造遺伝子とも呼ばれる。
遺伝子とは、生物学的に活性なＲＮＡを生成するためのすべての基本情報を含むＤＮＡのセクションを指す。遺伝子には、転写によって一本鎖ＲＮＡコピーが生成されるＤＮＡのセクションと、そのコピープロセスの調節に関与する発現シグナルが含まれる。発現シグナルは、例えば、少なくとも１つのプロモーター、転写開始点、翻訳開始点、およびリボソーム結合部位を含む。さらに、ターミネーターおよび１つ以上のオペレーターが発現シグナルであり得る。
本発明の文脈において、タンパク質、例えばＰｐｓＡは大文字で始まるのに対し、該タンパク質をコードする配列（ｃｄｓ）は小文字で特定される（例えばｐｐｓＡ）。
したがって、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｐｓＡは、ヌクレオチド３３３～２７１１からの配列番号１で特定されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｐｐｓＡ遺伝子のｃｄｓを指す。Ｅ．ｃｏｌｉのＰｐｓＡは、前記ｃｄｓ（Ｅ．ｃｏｌｉのｐｐｓＡ）によってコードされるタンパク質であり、配列番号２で特定される。タンパク質は、ホスホエノールピルビン酸塩シンターゼである。
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｐｐｓＡは、ヌクレオチド４１７～２８０１からの配列番号３で特定されるように、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ由来のｐｐｓＡ遺伝子のｃｄｓを指す。Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのＰｐｓＡは、前記ｃｄｓ（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｐｐｓＡ）によってコードされるタンパク質であり、配列番号４で特定される。
略語ＷＴ（Ｗｔ）は野生型を指す。野生型遺伝子とは、進化によって自然に発生し、野生型ゲノム中に存在する遺伝子の形態を指す。Ｗｔ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ等のデータベースにおいて公開されている。
対立遺伝子は、突然変異によって、すなわちＤＮＡのヌクレオチド配列の変化によって相互に変換され得る遺伝子の状態を定義する。微生物中に天然に存在する遺伝子は野生型対立遺伝子と呼ばれ、それに由来する変異体は遺伝子の突然変異対立遺伝子と呼ばれる。
相同遺伝子または相同配列は、前記遺伝子のＤＮＡ配列またはＤＮＡの部分が少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、特に好ましくは少なくとも９５％同一であることを意味すると理解されるべきである。
ＤＮＡの同一性の程度は、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/に見いだされるｂｌａｓｔｎアルゴリズムに基づく“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｌａｓｔ”プログラムによって決定される。デフォルトのパラメーターは、２つ以上のヌクレオチド配列のアラインメントのアルゴリズムパラメーターとして用いられる。デフォルトの一般パラメーターは：Ｍａｘ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＝１００；Ｓｈｏｒｔ ｑｕｅｒｉｅｓ＝“Ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｄｊｕｓｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔ ｉｎｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”；Ｅｘｐｅｃｔ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１０；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝２８；Ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｄｊｕｓｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔ ｉｎｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＝０である。対応するデフォルトのスコアリングパラメーターは：Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ＝１、－２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ＝Ｌｉｎｅａｒである。
タンパク質の配列は、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/の“ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌａｓｔ”プログラムを用いて比較される。このプログラムは、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いている。デフォルトのパラメーターは、２つ以上のタンパク質配列のアラインメントのアルゴリズムパラメーターとして用いられる。デフォルトの一般パラメーターは：Ｍａｘ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＝１００；Ｓｈｏｒｔ ｑｕｅｒｉｅｓ＝“Ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｄｊｕｓｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔ ｉｎｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”；Ｅｘｐｅｃｔ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１０；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝３；Ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｄｊｕｓｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔ ｉｎｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＝０である。デフォルトのスコアリングパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ＝Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１ Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ：１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ＝Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔである。
本発明の微生物において、ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの相対酵素活性は不活性化されているか、または野生型酵素の比活性と比較して好ましくは少なくとも１０％、特に好ましくは少なくとも２５％、特に好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％低下している。少なくとも１０％（または２５％／６０％／７０％）低下したｐｐｓＡ遺伝子によってコードされる酵素の酵素活性は、最大９０％（または７５％／４０％／３０％）の残存活性とも呼ばれる。
好ましい実施形態において、微生物株は、ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの酵素活性をもはや有していない、すなわちＫＥＧＧデータベースの番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの相対酵素活性が野生型酵素の比活性と比較して１００％低下していることにより特徴付けられる。
本発明の文脈において、「（対応する）野生型酵素との比較で／との比較において／と比較して」とは、微生物由来の遺伝子の非変異型によって、すなわち進化によって自然に生じ、前記微生物の野生型ゲノムに存在する遺伝子によってコードされるタンパク質の活性との比較であることを意味する。
Ｌ－システインの発酵生産に適した微生物株には、システイン、シスチンまたはそれらに由来する誘導体の合成をもたらす調節解除された生合成代謝経路（同種または異種）を含むすべての微生物が包含される。このような菌株は、例えば、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１、ＥＰ１３８２６８４Ｂ１、ＥＰ１２２０９４０Ｂ２、ＥＰ１７６９０８０Ｂ１およびＥＰ２１３８５８５Ｂ１に記載されている。
Ｌ－システインの発酵生産に適した微生物は、好ましくは、以下の改変の１つを有することを特徴とする。
ａ）微生物株は、対応する野生型酵素と比較して、Ｌ－セリンによるフィードバック阻害が少なくとも２倍低下した改変３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）によって区別される（例えば、ＥＰ１９５０２８７Ｂ１に記載されている）。
ａ）微生物株は、対応する野生型酵素と比較して、Ｌ－セリンによるフィードバック阻害が少なくとも２倍低下した改変３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）によって区別される（例えば、ＥＰ１９５０２８７Ｂ１に記載されている）。
対応する野生型酵素と比較して、３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）の特に好ましい変異体は、Ｌ－セリンによるフィードバック阻害が少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、より好ましい実施形態においては少なくとも５０倍低下している。
ｂ）微生物株は、対応する野生型酵素と比較して、システインによるフィードバック阻害が少なくとも２倍低下したセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ）を含む（例えば、ＥＰ０８５８５１０Ｂ１またはNakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611に記載されている）。
対応する野生型酵素と比較して、セリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ）の特に好ましい変異体は、システインによるフィードバック阻害が少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、より好ましい実施形態においては少なくとも５０倍低下している。
ｃ）微生物株は、対応する野生型細胞と比較して、流出遺伝子の過剰発現に起因して細胞外へのシステインの輸送が少なくとも２倍増大している。
野生型細胞と比較して、流出遺伝子の過剰発現は、細胞外へのシステインの輸送を好ましくは少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも２０倍増大させる。
流出遺伝子は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来のｙｄｅＤ（ＥＰ０８８５９６２Ｂ１を参照されたい）、ｙｆｉＫ（ＥＰ１３８２６８４Ｂ１を参照されたい）、ｃｙｄＤＣ（ＷＯ２００４／１１３３７３Ａ１を参照されたい）、ｂｃｒ（ＵＳ２００５－２２１４５３ＡＡを参照されたい）およびｅｍｒＡＢ（ＵＳ２００５－２２１４５３ＡＡを参照されたい）からなる群に由来するか、または異なる微生物由来の対応する相同遺伝子に由来する。
そのような株は、例えば、ＥＰ０８５８５１０Ｂ１およびＥＰ０８８５９６２Ｂ１において知られている。
さらに、Ｌ－システインの発酵生産に適した微生物株は、好ましくは、野生型細胞と比較して少なくとも１種のシステイン分解酵素が、細胞がその酵素活性の最大５０％しか含まない程度まで減弱化されていることを特徴とする。システイン分解酵素は、好ましくはトリプトファナーゼ（ＴｎａＡ）およびシスタチオニンβリアーゼ（ＭａｌＹ、ＭｅｔＣ）からなる群に由来する。
前のパラグラフに記載されているＬ－システインの発酵生産に適した微生物株は、システイン代謝に関して調節解除されておらず、ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの野生型酵素活性を有する微生物株と比較して増大した量のＬ－システインを形成するように、それらのシステイン代謝に関して調節解除されている。システイン代謝に関して調節解除されておらず、ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの野生型酵素活性を有する微生物株の細胞においては、培養物中のＬ－システインの量は約０ｇ／ｌであり（表２を参照されたい）、増大した量とは、培養２４時間後の培養物中で測定されるＬ－システインが０．０５ｇ／ｌを超える量であることを意味する。
微生物株は、該微生物株が腸内細菌科またはコリネバクテリア科の株、特に好ましくは腸内細菌科の株であることを特徴とする。このような株は、とりわけＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（ブラウンシュヴァイク）から市販されている。
好ましくは、微生物株は、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティスおよびコリネバクテリウム・グルタミカムからなる群から、特に好ましくはエシェリヒア・コリおよびパントエア・アナナティスからなる群から選択される。特に好ましくは、微生物株は、エシェリヒア・コリ種の株である。
特に好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ株はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、特に好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０から選択される。このような株は、とりわけＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（ブラウンシュヴァイク）から市販されており、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０ ＤＳＭ ５９１１（ｉｄ． ＡＴＣＣ２７３２５）およびパントエア・アナナティスＤＳＭ３００７０（ｉｄ． ＡＴＣＣ１１５３０）が挙げられる。ＰｐｓＡは、好ましくは配列番号２を有するＥ．ｃｏｌｉ由来のＰｐｓＡであるか、または配列番号４を有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ由来のＰｐｓＡである。
好ましくは、微生物株は、ｐｐｓＡ遺伝子に少なくとも１つの変異を含むことを特徴とする。同時に、株はまた、この好ましい実施形態において、野生型細胞と比較して増大した量のＬ－システインを形成する。好ましくは、ｐｐｓＡ遺伝子における遺伝的改変は、該遺伝子によって発現されるタンパク質において、野生型酵素の比活性と比較してＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの相対酵素活性の低下を引き起こすか、またはそのような酵素活性を有さないようにする。
さらに、本発明の産生株は、システイン産生をさらに改善するためにさらに最適化することができる。
最適化は、例えば、産生特性を改善するのに適した１種以上の遺伝子を追加的に発現させることによって、遺伝的に達成することができる。前記遺伝子は、別個の遺伝子構築物として、または発現単位として（いわゆるオペロンとして）組み合わせて、既知の方法により産生株において発現させることができる。
さらに、産生株は、ｐｐｓＡ遺伝子に加えて、その遺伝子産物がシステイン産生に悪影響を及ぼすさらに別の遺伝子を不活性化することによって、産生株を最適化することができる。
しかしながら、最適化はまた、既知の方法により、変異誘発および改善されたシステイン産生を有する株の選択によって可能である。
本発明の文脈において、ｐｐｓＡ遺伝子における遺伝子改変は、
ａ）ｐｐｓＡ遺伝子のコード配列が部分的または完全に欠失している、
ｂ）ｐｐｓＡ遺伝子のコード配列が１つ以上の挿入または５’および／または３’伸長によって改変されている、
ｃ）ｐｐｓＡ構造遺伝子が１つ以上の突然変異、特に点突然変異を含み、その結果、発現されたホスホエノールピルビン酸シンターゼの酵素活性が減弱化するか、または完全に不活性化される、
ｄ）ｐｐｓＡ構造遺伝子に、ｐｐｓＡ発現の強力な減弱化または完全に不活性化、またはｍＲＮＡの安定性の低下をもたらす１つ以上の突然変異、特に点突然変異が含まれている、または
ｅ）ｐｐｓＡ遺伝子の発現またはｐｐｓＡ ｍＲＮＡの翻訳が、５’および／または３’非コードｐｐｓＡ配列（プロモーター、５’－ＵＴＲ、シャイン－ダルガルノ配列および／またはターミネーター）の遺伝的改変に起因して減弱化または完全に不活性化され、
当該配列によって発現されるタンパク質は、野生型酵素の比活性と比較して相対的ＰＥＰシンターゼ酵素活性が低下していることを意味するものとして定義される。
ａ）ｐｐｓＡ遺伝子のコード配列が部分的または完全に欠失している、
ｂ）ｐｐｓＡ遺伝子のコード配列が１つ以上の挿入または５’および／または３’伸長によって改変されている、
ｃ）ｐｐｓＡ構造遺伝子が１つ以上の突然変異、特に点突然変異を含み、その結果、発現されたホスホエノールピルビン酸シンターゼの酵素活性が減弱化するか、または完全に不活性化される、
ｄ）ｐｐｓＡ構造遺伝子に、ｐｐｓＡ発現の強力な減弱化または完全に不活性化、またはｍＲＮＡの安定性の低下をもたらす１つ以上の突然変異、特に点突然変異が含まれている、または
ｅ）ｐｐｓＡ遺伝子の発現またはｐｐｓＡ ｍＲＮＡの翻訳が、５’および／または３’非コードｐｐｓＡ配列（プロモーター、５’－ＵＴＲ、シャイン－ダルガルノ配列および／またはターミネーター）の遺伝的改変に起因して減弱化または完全に不活性化され、
当該配列によって発現されるタンパク質は、野生型酵素の比活性と比較して相対的ＰＥＰシンターゼ酵素活性が低下していることを意味するものとして定義される。
本発明の文脈において、ａ）～ｅ）に列挙されたｐｐｓＡ遺伝子における遺伝的改変の任意の組み合わせも可能である。したがって、要約すると、本発明の文脈において、より少ないＰｐｓＡタンパク質が形成されるか、または全く形成されず、および／または発現されたＰｐｓＡタンパク質がより活性が低くまたは不活性であることが可能である。
別のアプローチでは、当業者に知られているいわゆる「アンチセンスＲＮＡ」戦略によって、遺伝子転写のレベルでｐｐｓＡ酵素活性を減弱化または完全に不活性化することも可能である。ｐｐｓＡ酵素活性は、化学的阻害剤またはタンパク質阻害剤である阻害剤を添加することによって減弱化または完全に不活性化されることも考えられる。
好ましくは、本発明の株におけるｐｐｓＡ遺伝子の改変は、ｐｐｓＡ構造遺伝子の完全または部分的な欠失、酵素活性の減弱化または酵素の不活性化を引き起こす方法によるｐｐｓＡ構造遺伝子の変異、またはｐｐｓＡ構造遺伝子および／またはｐｐｓＡ遺伝子の発現または翻訳の減弱化または完全な抑制、またはｐｐｓＡ ｍＲＮＡの安定性の低下を引き起こす方法により発現を調節し、かつ５’および３’側に存在するその非転写または非翻訳遺伝子領域の変異を含む。
特に好ましくは、本発明の株におけるｐｐｓＡ遺伝子の不活性化は、ｐｐｓＡ ｃｄｓ（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｐｓＡ ｃｄｓの場合、配列番号１のヌクレオチド３３３～２７１１、またはＰ．ａｎａｎａｔｉｓのｐｐｓＡ ｃｄｓの場合、配列番号３のヌクレオチド４１７～２８０１）の完全または部分的な欠失、または酵素活性の減弱化もしくは酵素の不活性化またはｍＲＮＡの安定性の低下を引き起こす方法によるｐｐｓＡ構造遺伝子の変異のいずれかによって引き起こされる。
好ましい実施形態において、微生物株は、上述した変異遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来のｐｐｓＡ遺伝子、パントエア・アナナティス由来のｐｐｓＡ遺伝子およびそれらの遺伝子に相同な遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｐｐｓＡ遺伝子は、遺伝子ＩＤ９４６２０９としてＮＣＢＩ遺伝子データベースのエントリーに開示されており、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ由来のｐｐｓＡ遺伝子は、遺伝子ＩＤ１１７９６８８９としえＮＣＢＩ遺伝子データベースのエントリーに開示されている。「相同遺伝子」とう用語には、上述した定義が適用される。特に好ましくは、変異ｐｐｓＡ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｐｐｓＡ遺伝子である。さらに好ましい実施形態において、ｃｄｓは、配列番号１のヌクレオチド３３３～２７１１（配列番号２を有するタンパク質をコードする）に開示されるＥ．ｃｏｌｉ由来のｐｐｓＡ遺伝子のｃｄｓであるか、または配列番号３のヌクレオチド４１７～２８０１（配列番号４を有するタンパク質をコードする）に開示されるパントエア・アナナティス由来のｐｐｓＡ遺伝子のｃｄｓである。
好ましい実施形態において、微生物株は、ｐｐｓＡ遺伝子のコードＤＮＡ配列が配列番号５であるか、またはその相同配列、特に好ましくは配列番号５であることを特徴とする。「相同配列」という用語には、上述した定義が適用される。
この場合、配列番号１で特定されるＤＮＡ配列中の変異は、配列番号６に開示されるようなアミノ酸配列を有するｐｐｓＡ－ＭＨＩタンパク質をコードする配列番号５で示されるＤＨＡ配列を有するｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子にしたがって、配列番号２で特定されるＷＴタンパク質配列中の３つのアミノ酸の変異、すなわち１２６位のバリンのメチオニンへの変異（Ｖ１２６Ｍ）、４２７位のアルギニンのヒスチジンへの変異（Ｒ４２７Ｈ）、および４３４位のバリンのイソロイシンへの変異した（Ｖ４３４Ｉ）をもたらす。
ｐｐｓＡ遺伝子を不活性化および突然変異させるための様々な方法が当業者に知られている。最も単純な場合、親株を既知の方法（例えば、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン等の突然変異誘発化学物質により化学的に、またはＵＶ照射により物理的に）により突然変異誘発に供することができ、突然変異はゲノムＤＮＡにランダムに生成され、次いで、例えば変異体がそれぞれ単一化された後、酵素活性に基づく呈色反応がないことによって、または正常に機能しないｐｐｓＡ遺伝子の検出を介する遺伝的手段によって、生成された多数の変異体から目的のｐｐｓＡ変異体が選択される。
複雑な突然変異誘発およびｐｐｓＡ突然変異体の選択とは対照的に、ｐｐｓＡ遺伝子は、例えば相同組換えの既知のメカニズムによって、比較的簡単な方法で標的不活性化を受けることができる。相同組換えによる標的遺伝子の不活性化のためのクローニング系は当業者に知られており、市販されており、例えば、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ社のＲｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）技術によるユーザーマニュアル「Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit」に開示されている（「Red（登録商標）/ET（登録商標）Recombination, Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red（登録商標）/ET（登録商標） Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, June 2012」およびその中の引用文献を参照されたい。）。
先行技術によれば、ｐｐｓＡ遺伝子または該遺伝子の一部を単離し、外来ＤＮＡをｐｐｓＡ遺伝子にクローニングして、それによりｐｐｓＡ遺伝子のタンパク質定義オープンリーディングフレームを中断することができる。したがって、ｐｐｓＡ遺伝子の標的不活性化に適したＤＮＡ構築物は、ゲノムｐｐｓＡ遺伝子に相同なＤＮＡの５’セクション、それに続く外来ＤＮＡを含む遺伝子セグメント、およびそれに続くゲノムｐｐｓＡ遺伝子に相同なＤＮＡの３’セクションからなり得る。
したがって、ｐｐｓＡ遺伝子における相同組換えの可能性のある領域は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする領域だけでなく含むことができる。可能な領域はまた、ｐｐｓＡ遺伝子に隣接するＤＮＡ配列、すなわちコード領域の開始前の５’領域（遺伝子転写プロモーター、例えば配列番号１のヌクレオチド１～３３２、または配列番号３のヌクレオチド１～４１６）およびコード領域の末端の後の３’領域（遺伝子転写ターミネーター、例えば、配列番号１のヌクレオチド２７１２～３０００、または配列番号３のヌクレオチド２８０２～３０６２）を含むことができ、相同組換えによるその改変は、コード領域の改変と同様に、ｐｐｓＡ遺伝子の不活性化をもたらし得る。
外来ＤＮＡは、好ましくは選択マーカー発現カセットである。それは、実際の選択マーカー遺伝子に機能的に連結された遺伝子転写プロモーターからなり、任意に遺伝子転写ターミネーターが続く。この場合、選択マーカーは、ｐｐｓＡ遺伝子の５’および３’に隣接する相同配列も含む。
好ましくは、選択マーカーは、それぞれが少なくとも３０ヌクレオチド、特に好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有するｐｐｓＡ遺伝子の５’および３’に隣接する相同配列を含む。
ｐｐｓＡ遺伝子を不活性化するためのＤＮＡ構築物は、５’末端から始まり、ｐｐｓＡ遺伝子に相同な配列からなり、その後に、例えば抗生物質耐性遺伝子のクラスから選択される選択マーカーの発現カセットが続き、ｐｐｓＡ遺伝子に相同なさらなる配列が続く。
好ましい実施形態において、ｐｐｓＡ遺伝子を不活性化するためのＤＮＡ構築物は、５’末端から始まり、少なくとも３０ヌクレオチドの長さ、特に好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの長さのｐｐｓＡ遺伝子に相同な配列、それに続く抗生物質耐性遺伝子のクラスから選択された選択マーカーの発現カセット、およびそれに続く少なくとも３０ヌクレオチドの長さ、特に好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの長さのｐｐｓＡ遺伝子と相同なさらなる配列を含む。
選択マーカー遺伝子は、一般的に遺伝子であり、その遺伝子産物は、元の親株が増殖できない選択的条件下で親株が増殖することを可能にする。
好ましい選択マーカー遺伝子は、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子の群から選択される。他の好ましい選択マーカー遺伝子は、上述した選択マーカー遺伝子の発現による代謝欠陥の修正の結果として、代謝欠陥（例えば、アミノ酸栄養要求性）を有する親株が選択条件下で増殖することを可能にする。最後に、別の可能性は選択マーカー遺伝子であり、その遺伝子産物は親株にとって本質的に有毒な化合物を化学的に変化させ、その化合物を不活性化する（例えば、多くの微生物にとって有毒な化合物アセトアミドを毒性のない生成物である酢酸塩およびアンモニアに分解する酵素アセトアミダーゼの遺伝子）。
選択マーカー遺伝子のうち、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子が特に好ましい。テトラサイクリン耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子が特に好ましい。
標的遺伝子の不活性化に加えて、ゲノムから選択マーカーを除去し、それによって二重および多重の突然変異体を生成することを可能にする選択肢を提供する相同組換えに基づくシステムも存在する。このようなシステムは、例えば、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ社のＲｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）技術による「Ｑｕｉｃｋ ａｎｄ Ｅａｓｙ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ」として市販されている、いわゆるＬａｍｂｄａ Ｒｅｄ技術である（「Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red（登録商標）/ET（登録商標） Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, June 2012」およびその中の引用文献を参照されたい。）。
不活性化ｐｐｓＡ遺伝子を有する本発明の株の例は、実施例に開示されているＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ株およびＰ．ａｎａｎａｔｉｓ－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎ株である。いずれの株も相同組換えによりｐｐｓＡ遺伝子が不活性化されていることを特徴とする。
相同組換えに基づく標的遺伝子不活性化のための別のそのようなシステムは、当業者に公知であり、実施例３に記載されており、Ｌａｍｄａ Ｒｅｄ組換えと対抗選択スクリーニングとの組み合わせに基づく、遺伝子不活性化または遺伝子改変のための方法である。上述したシステムは、例えば、Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245に記載されている。ＤＮＡ構築物は、例えば、５’末端から始まり、ｐｐｓＡ遺伝子に相同な配列、それに続くａ）抗生物質耐性遺伝子のクラスから選択される選択マーカーの発現カセットおよびｂ）酵素レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子の発現カセットからなる任意の順序の２つの発現カセット、ならびに最後に続くｐｐｓＡ遺伝子と相同なさらなる配列からなるｐｐｓＡ遺伝子の不活性化に用いられる。
第一の工程においては、ＤＮＡ構築物を産生株に形質転換し、抗生物質耐性クローンが単離される。得られたクローンは、共に組み込まれたｓａｃＢ遺伝子によってスクロースで増殖できないという事実によって区別される。２つのマーカー遺伝子は、対抗選択の原理によって除去することができ、第二の工程において、適切なＤＮＡフラグメントが相同組換えによって２つのマーカー遺伝子に置換される。次いで、この工程で得られるクローンは、スクロースで増殖する能力を回復し、次いで抗生物質に対する感受性も回復する。この方法は、実施例３において、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子（配列番号１）を、以下に記載する三重突然変異体ｐｐｓＡ －ＭＨＩ（配列番号５）と交換するために用いられる。
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩは、ｐｐｓＡ遺伝子のコード配列の変異によりＰｐｓＡ酵素活性が減弱化した本発明の株の例として実施例に開示されている。Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩには、ＰｐｓＡ三重変異体ＰｐｓＡ－Ｖ１２６Ｍ－Ｒ４２７Ｈ－Ｖ４３４Ｉ（ｐｐｓＡ－ＭＨＩ）のｃｄｓが含まれている。ｐｐｓＡ－ＭＨＩの変異遺伝子のｃｄｓは、配列番号５のＤＮＡ配列に対応し、配列番号６の配列を有するＰｐｓＡタンパク質をコードする。ＰｐｓＡ－ＭＨＩは、配列番号２で特定されるＷＴ配列と比較して、配列番号６の配列を有するタンパク質がアミノ酸配列に以下の変更を含むことを特徴とする：１２６位のバリンがメチオニンに変異し（Ｖ１２６Ｍ）、４２７位のアルギニンがヒスチジンに変異し（Ｒ４２７Ｈ）、４３４位のバリンがイソロイシンに変異している（Ｖ４３４Ｉ）。
これらの突然変異のために、ＰｐｓＡ－ＭＨＩタンパク質は、特定の野生型酵素活性と比較して２６．８％の相対酵素活性しか有していなかった（実施例５の表１を参照されたい）。
Ｅ．ｃｏｌｉのｐｐｓＡ遺伝子の場合、ｃｄｓにおける変異の少なくとも１つが、配列番号２のアミノ酸配列における以下の変更の少なくとも１つをもたらすことが好ましい：１２６位のバリン、４２７位のアルギニンおよび／または４３４位のバリンの変更であって、これら３つのアミノ酸は他のいずれのアミノ酸とも交換することができる。
配列番号２で特定されるＷＴタンパク質のアミノ酸配列中の３つのアミノ酸の同時突然変異をもたらす突然変異が特に好ましい。
本発明によるｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子の突然変異は、既知の方法で、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔのユーザーマニュアルに開示されているように、市販のクローニングキットを用いたいわゆる「部位特異的」な突然変異誘発によりｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子に導入される。あるいは、本発明によるｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子は、ＤＮＡ合成によって既知の方法で生成することもできる。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｐｓＡ－ＭＨＩ三重突然変異等の、酵素活性の減弱化を引き起こす方法によるｐｐｓＡ構造遺伝子の変異により特徴付けられる本発明の株は、実施例に開示されているように、上述したＬａｍｂｄａ Ｒｅｄ組換えと遺伝子改変のための対立選択スクリーニングとを組み合わせて用いることによって作製することができる（例えば、Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245を参照されたい）。
特に好ましい株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ΔｐｐｓＡ（実施例１に記載される）およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｐｐｓＡ－ＭＨＩ（実施例３に記載される）である。
本発明はさらに、本発明の微生物細胞を用いることを特徴とする、Ｌ－システインを産生するための発酵プロセスを提供する。
形成される本発明による方法の一次生成物はＬ－システインであり、これから化合物Ｌ－シスチンおよびチアゾリジンを形成することができる。Ｌ－シスチンおよびチアゾリジンは発酵中に形成され、培養上清および沈殿物の両方に蓄積する。チアゾリジンは、２－メチル－２，４－チアゾリジンジカルボン酸であり、システインとシステイン生成の副生成物として形成される可能性のあるピルビン酸との付加物である（ＥＰ０８８５９６２Ｂ１）。
本発明の文脈において、総システインの収量は、生成されるシステイン、シスチンおよびチアゾリジンの合計として定義される。これは、実施例７に記載されるように、全培養物から決定される。例えば、Gaitonde (Gaitonde, M. K. (1967) Biochem. J. 104, 627-633)による比色アッセイを用いて定量化することができる。
先行技術には、ホスホエノールピルビン酸シンターゼの酵素活性を減弱化または不活性化することによって、アミノ酸、特にシステインの産生を改善できるプロセスまたは産生株を開示されていない。
本願の実施例に示されるように、システイン産生に適した微生物株におけるｐｐｓＡの酵素活性の減弱化または不活性化は、発酵プロセスにおける総システインの収量、すなわち生成されるシステイン、シスチンおよびチアゾリジンの合計を有意に増大させる。これは、従来技術からは完全に予想外であった。
対応する野生型株と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のｐｐｓＡ突然変異体の発酵において有意に高いシステイン収量が達成されたことは驚くべきことであった。先行技術に反して、また当業者にとって予想外なことに、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の減弱化または不活性化により、改善されたシステイン産生株がもたらされた。
システイン産生株を改善するためのこの新規かつ独創的な手段は、実施例６の表２および表３に要約される結果によって確認され、エシェリヒア・コリにおけるｐｐｓＡ遺伝子の不活性化または酵素活性が減弱されたＰｐｓＡ酵素をもたらす変異ｐｐｓＡ遺伝子、ならびにパントエア・アナナティスにおけるｐｐｓＡ遺伝子の不活性化はすでに振盪フラスコでの培養においてシステイン収量の改善をもたらしている。
したがって、当業者にとって、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の減弱化または不活性化は、他のシステイン産生株におけるシステイン産生を改善するための新規の有用な手段でもある。
したがって、システイン産生に適した本発明の微生物株においては、産生株のｐｐｓＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性が減弱化されるかまたは完全に阻害され、同時にシステイン産生が増大する。実施例７は、Ｗｔ酵素の代わりに、システイン産生が可能であり、ＰｐｓＡの酵素活性が低下したｐｐｓＡ突然変異体ｐｐｓＡ－ＭＨＩをコードする株が、発酵において、ｐｐｓＡのＷＴ遺伝子を含む株よりも有意に高いシステイン収量を達成することを実証する。
問題の発酵プロセスにおいて、形成されるのは、本発明の産生株のバイオマスだけでなく、システインおよびその酸化生成物のシスチンである。バイオマスおよびシステインの形成は一時的に相関するか、またはバイオマスおよびシステインは相互に分離された方法で経時的に形成される。培養は、当業者によく知られている方法で行われる。この目的のために、培養は、振盪フラスコ（実験室規模）で、または発酵（生産規模）で行うことができる。
１Ｌを超える発酵容積での発酵による生産規模のプロセスが好ましく、１０Ｌを超える生産規模が好ましく、１０００Ｌを超える生産規模が特に好ましく、１００００Ｌを超える発酵容量が特に好ましい。
培地は、微生物培養の実践から当業者によく知られている。それらは通常、炭素源、窒素源、およびビタミン、塩、微量元素等の添加物、および細胞増殖とシステイン産生とを最適化する硫黄源で構成される。
炭素源は、産生株がシステイン生成物を形成するために用いることができるものである。炭素源としては、例えばグルコース、マンノース、フルクトースまたはガラクトース等のＣ６糖（ヘキソース）、および例えばキシロース、アラビノースまたはリボース等のＣ５糖（ペントース）を含む単糖のすべての形態が包含される。
しかしながら、本発明の製造方法は、二糖類、特にスクロース、ラクトース、マルトースまたはセロビオースの形態のすべての炭素源も包含する。
さらに、本発明の製造方法は、例えば、マルトデキストリン、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン等の高級糖類、グリコシドまたは２つを超える糖単位を有する炭水化物、または加水分解によってそれらから（酵素的にまたは化学的に）放出されるモノマーもしくはオリゴマーの形態のすべての炭素源も包含する。高級炭素源の加水分解は、本発明の製造方法の上流で行うことができ、または本発明の製造方法の途中にｉｎ ｓｉｔｕで行うことができる。
糖または炭水化物以外の他の使用可能な炭素源は、酢酸（またはそれに由来する酢酸塩）、エタノール、グリセロール、クエン酸（およびその塩）またはピルビン酸（およびその塩）である。しかしながら、二酸化炭素または一酸化炭素等のガス状の炭素源も考えられる。
本発明の製造方法に関連する炭素源は、単離された純粋な物質、または経済効率を高めるために、加水分解物としての植物原材料の化学的または酵素的な消化によって得ることができる、さらなる精製を伴わない個々の炭素源の混合物の両方を包含する。これらには、例えば、デンプンの加水分解物（グルコース単糖）、サトウダイコンの加水分解物（グルコース、フルクトースおよびアラビノース単糖）、サトウキビの加水分解物（スクロース二糖）、ペクチンの加水分解物（ガラクツロン酸単糖）またはリグノセルロースの加水分解物（セルロース、キシロース、アラビノース、マンノースからのグルコース単糖、およびヘミセルロースからのガラクトース単糖、および非炭水化物リグニン）が包含される。さらに、野菜原材料の消化による廃棄物、例えば糖蜜（サトウダイコン）およびバガス（サトウキビ）も炭素源として用いることができる。
産生株を培養するための好ましい炭素源は、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、キシロース、アラビノース、およびデンプン、リグノセルロース、サトウキビまたはサトウダイコンから得ることができる植物加水分解物である。
特に好ましい炭素源は、単離された形態または植物加水分解物の成分としてのグルコースおよびスクロースである。
特に好ましい炭素源はグルコースである。
窒素源は、生産株がバイオマスを形成するために用いることができるものである。これらには、ＮＨ４ＯＨとしての気体状または水溶液中のアンモニア、または例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウム等のその塩が包含される。さらに、適切な窒素源は、例えばＫＮＯ３、ＮａＮＯ３、硝酸アンモニウム、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｍｇ（ＮＯ３）２等の既知の硝酸塩、および例えば尿素等の他の窒素源である。窒素源には、例えば、酵母エキス、プロテオースペプトン、麦芽エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー（液体またはいわゆるＣＳＤとして乾燥されたもの）、ならびにＮＺアミンおよび酵母窒素塩基等のアミノ酸の複雑な混合物も包含される。
システインおよびシステイン誘導体の効率的な生産には、バッチ形式での１回の添加または連続供給のいずれかによる硫黄源の計量添加が必要である。連続的な計量添加は、純粋な供給溶液として、または例えばグルコース等のさらなる供給成分との混合物として行うことができる。
適切な硫黄源は、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、チオ硫酸塩または硫化物の塩であり、所定の安定性でそれぞれの酸を用いることも考えられる。
好ましい硫黄源は、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩および硫化物の塩である。
特に好ましい硫黄源は、硫酸塩およびチオ硫酸塩である。
特に好ましいものは、例えばチオ硫酸ナトリウムおよびチオ硫酸アンモニウム等のチオ硫酸塩である。
培養は、生産株のスターター培養物を培地に接種し、次いで栄養源をさらに供給することなく細胞を増殖させることを含む、いわゆるバッチモードで行うことができる。
培養は、栄養源（供給物）の消費を補うために、バッチモードでの生育の初期段階の後に栄養源（供給物）を追加供給することを含む、いわゆるフェドバッチモードで行うこともできる。供給物は、炭素源、窒素源、硫黄源、生産に重要な１種以上のビタミンまたは微量元素、またはこれらの組み合わせから構成され得る。供給物成分は、混合物として一緒に計量することもでき、または個々の供給物セクションに別々に計量することもできる。さらに、システイン産生を特異的に増大させる添加物と同様に、他の培地成分も供給物に添加することができる。供給物は、連続的または部分的に（不連続的に）、あるいは連続的および不連続的な供給物の組み合わせで供給することができる。フェドバッチモードでの培養が好ましい。
供給物中の好ましい炭素源は、グルコース、スクロース、およびグルコース含有またはスクロース含有植物加水分解物、および任意の混合比の好ましい炭素源の混合物である。
供給物中の特に好ましい炭素源はグルコースである。
好ましくは、培養物の炭素源は、生産段階における発酵槽中の炭素源の量が１０ｇ／Ｌを超えないように計量される。最大濃度が２ｇ／Ｌであることが好ましく、最大濃度が０．５ｇ／Ｌであることが特に好ましく、最大濃度が０．１ｇ／Ｌであることがとりわけ好ましい。
供給物中の好ましい窒素源は、ＮＨ４ＯＨとしての気体状または水溶液中のアンモニア、ならびにその塩である硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよび塩化アンモニウム、さらに尿素、ＫＮＯ３、ＮａＮＯ３および硝酸アンモニウム、酵母。エキス、プロテオースペプトン、麦芽エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ＮＺアミンおよび酵母窒素塩基である。
供給物中の特に好ましい窒素源は、アンモニアまたはアンモニウム塩、尿素、酵母エキス、大豆ペプトン、麦芽エキスまたはコーンスティープリカー（液体または乾燥形態）である。
供給物中の好ましい硫黄源は、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩および硫化物の塩である。
供給物中の特に好ましい硫黄源は、硫酸塩およびチオ硫酸塩である。
供給物中の硫黄源として特に好ましいのは、例えば、チオ硫酸ナトリウムおよびチオ硫酸アンモニウム等のチオ硫酸塩である。
さらなる培地添加物として、リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄の元素の塩、および微量（つまり、μＭ濃度）のモリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛、銅、ニッケルの元素の塩を添加することができる。さらに、有機酸（例えば、酢酸、クエン酸）、アミノ酸（例えば、イソロイシン）およびビタミン（例えば、ビタミンＢ１、ビタミンＢ６）を培地に添加することができる。
培養は、産生株の増殖およびシステイン産生を促進するｐＨおよび温度条件下で行われる。有用なｐＨの範囲は、ｐＨ５～ｐＨ９までの範囲である。ｐＨ５．５～ｐＨ８までのｐＨ範囲が好ましい。ｐＨ６．０～ｐＨ７．５までのｐＨ範囲が特に好ましい。
産生株の増殖に好ましい温度範囲は２０℃～４０℃である。温度範囲は、特に好ましくは２５℃～３７℃であり、とりわけ好ましくは２８℃～３４℃である。
産生株の増殖は、任意に酸素を供給せずに（嫌気性培養）、または酸素を供給して（好気性培養）行うことができる。酸素を用いた好気性培養が好ましい。
システイン生産のための本発明の株の好気性培養の場合、少なくとも１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも２０％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは少なくとも３０％（ｖ／ｖ）の飽和が酸素含有量に設定される。従来技術によれば、培養中の酸素飽和度は、ガス供給および撹拌速度の組み合わせによって自動的に調節される。
酸素の供給は、圧縮空気または純粋な酸素の導入によって確保される。圧縮空気の導入による好気性培養が好ましい。好気性培養における圧縮空気の供給の有用な範囲は、０．０５ｖｖｍ～１０ｖｖｍ（ｖｖｍ：１分あたりの発酵容積１リットルあたりの圧縮空気のリットルで指定される発酵バッチへの圧縮空気の導入）である。０．２ｖｖｍ～８ｖｖｍの圧縮空気の導入が好ましく、０．４～６ｖｖｍの圧縮空気の導入が特に好ましく、０．８～５ｖｖｍの圧縮空気の導入がとりわけ好ましい。
最大撹拌速度は２５００ｒｐｍであり、好ましくは２０００ｒｐｍ、特に好ましくは１８００ｒｐｍである。
培養時間は１０～２００時間である。２０～１２０時間の培養時間が好ましい。３０～１００時間の培養時間が特に好ましい。
上述した方法によって得られる培養バッチは、培養上清中に溶解した形で、または沈殿したシスチンとして酸化された形でシステインを含む。培養バッチに含まれるシステインまたはシスチンは、さらなる精製（work-up）をすることなくそのままさらに用いられるか、または培養バッチから分離することができる。
好ましくは、この方法は、形成されたシステインが単離されることを特徴とする。システインおよびシスチンの単離には、遠心分離、デカンテーション、鉱酸による粗生成物の溶解、濾過、抽出、クロマトグラフィーもしくは結晶化、または沈殿を含む既知のプロセス工程を利用することができる。前記プロセス工程は、所望の純度でシステインを単離するために、任意の形態で組み合わせることができる。望ましい純度は、その後の使用に依存する。
精製によって得られたシスチンは、さらなる使用のためにシステインに還元することができる。電気化学的プロセスにおいてＬ－シスチンをＬ－システインに還元するプロセスは、ＥＰ０２３５９０８に開示されている。
分光測光法、ＮＭＲ、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、質量分析、重量測定またはこれらの分析方法の組み合わせを含む、システインまたはシスチン生成物の純度を特定、定量化および決定するための様々な分析方法を利用することができる。
本発明はまた、化合物の発酵生産のための改良された微生物株を生産するために用いることができ、その生合成は３－ホスホグリセレートから始まり、Ｌ－セリンを介してＬ－システインおよびＬ－シスチンに至る。これはまた、ホスホセリン、Ｏ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルセリンおよびチアゾリジン、Ｌ－システインとピルビン酸との縮合生成物を含む、Ｌ－セリンおよびＬ－システインの誘導体の発酵生産のための微生物株を包含する。
図は、実施例で用いられるプラスミドを示す。
図１は、実施例１および実施例２で用いられる３．４ｋｂのベクターｐＫＤ１３を示す。
図２は、実施例１および実施例３で用いられる６．３ｋｂのベクターｐＫＤ４６を示す。
図３は、実施例３で用いられる５ｋｂのベクターｐＫａｎ－ＳａｃＢを示す。
図４は、実施例４で用いられる４．２ｋｂのベクターｐＡＣＹＣ１８４を示す。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
実施例１：エシェリヒア・コリにおけるｐｐｓＡ欠失突然変異体の作製
遺伝子単離および株開発に用いた親株は、エシェリヒア・コリＫ１２ Ｗ３１１０（ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ社から株番号ＤＳＭ５９１１として市販されている）であった。
遺伝子単離および株開発に用いた親株は、エシェリヒア・コリＫ１２ Ｗ３１１０（ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ社から株番号ＤＳＭ５９１１として市販されている）であった。
遺伝子不活性化の対象を、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｐｐｓＡ遺伝子のコード配列とした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２由来のｐｐｓＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４６２０９）のＤＮＡ配列は、配列番号１に開示されている。ヌクレオチド３３３～２７１１（Ｅ．ｃｏｌｉのｐｐｓＡとして同定されている）は、配列番号２に開示されるアミノ酸配列を有するホスホエノールピルビン酸シンターゼタンパク質をコードする（Ｅ．ｃｏｌｉのＰｐｓＡ）。
Ｅ．ｃｏｌｉのｐｐｓＡは、以下に詳述するように、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ社のＲｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）を用いて不活性化した（「Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit」のユーザーマニュアルに記載されており、「Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red（登録商標）/ET（登録商標） Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, June 2012」およびその中の引用文献、例えばDatsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000): 6640-6645を参照されたい）。この目的のために、プラスミドｐＫＤ１３、ｐＫＤ４６およびｐＣＰ２０が用いられた：
－３．４ｋｂのプラスミドｐＫＤ１３（図１）は、アクセション番号ＡＹ０４８７４４．１で「ＧｅｎＢａｎｋ」の遺伝子データベースに開示されている。
－６．３ｋｂのプラスミドｐＫＤ４６（図２）は、アクセション番号ＡＹ０４８７４６．１で「ＧｅｎＢａｎｋ」の遺伝子データベースに開示されている。
－９．４ｋｂのプラスミドｐＣＰ２０は、Cherepanov and Wackernagel, Gene 158 (1995): 9-14に開示されている。
－３．４ｋｂのプラスミドｐＫＤ１３（図１）は、アクセション番号ＡＹ０４８７４４．１で「ＧｅｎＢａｎｋ」の遺伝子データベースに開示されている。
－６．３ｋｂのプラスミドｐＫＤ４６（図２）は、アクセション番号ＡＹ０４８７４６．１で「ＧｅｎＢａｎｋ」の遺伝子データベースに開示されている。
－９．４ｋｂのプラスミドｐＣＰ２０は、Cherepanov and Wackernagel, Gene 158 (1995): 9-14に開示されている。
Ｌａｍｂｄａ Ｒｅｄシステムを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のｐｐｓＡ遺伝子を不活性化するために、以下の手順を行った：
１．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０をプラスミドｐＫＤ４６（いわゆる「Ｒｅｄリコンビナーゼ」プラスミド、図２）で形質転換し、アンピシリン耐性クローンを単離した（Ｗ３１１０×ｐＫＤ４６と呼ぶ）。
２．その不活性化に適したｐｐｓＡ特異的ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＫＤ１３のＤＮＡ（図１）、ならびにプライマーｐｐｓ－５ｆ（配列番号７）およびｐｐｓ－６ｒ（配列番号８）を用いたＰＣＲ反応（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）社）を用いて製造した。
プライマーｐｐｓ－５ｆはｐｐｓＡ遺伝子の５’領域からの３０ヌクレオチド（ｎｔ）（配列番号１のｎｔ３３３～３６２）を含み、それにプラスミドｐＫＤ１３に特異的な２０ｎｔ（図１で「ｐｒ－１」と呼ばれる）が結合している。
プライマーｐｐｓ－６ｒはｐｐｓＡ遺伝子の３’領域からの３０ｎｔ（配列番号１のｎｔ２６８２～２７１１、逆相補型）を含み、それにプラスミドｐＫＤ１３に特異的な２０ｎｔ（図１で「ｐｒ－２」と呼ばれる）が結合している。
プライマーｐｐｓ－５ｆおよびｐｐｓ－６ｒを用いて、プラスミドｐＫＤ１３のＤＮＡにより、５’末端および３’末端の両方に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０由来のｐｐｓＡ遺伝子に特異的なＤＮＡの３０ｎｔセクションを含む１．４ｋｂのＰＣＲ産物が製造された。さらに、ＰＣＲ産物は、ｐＫＤ１３に含まれるカナマイシン耐性遺伝子の発現カセット、カナマイシン発現カセットの５’および３’末端に隣接する、いわゆる「ＦＲＴダイレクトリピート」（図１において「ＦＲＴ１」および「ＦＲＴ２」と呼ばれる）、抗生物質マーカーであるカナマイシンを除去するための後の作業工程において「ＦＬＰリコンビナーゼ」（プラスミドｐＣＰ２０に含まれる）の認識配列として用いられるＤＮＡの短いセクションを含んでいた。
３．１．４ｋｂのＰＣＲ産物を単離し、当業者によく知られており、メチル化ＤＮＡのみを切断する制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで処理して、残留ｐＫＤ１３プラスミドＤＮＡを除去した。ＰＣＲ反応からの非メチル化ＤＮＡは分解されなかった。
４．ｐｐｓＡ遺伝子に特異的で、カナマイシン耐性遺伝子の発現カセットを含む１．４ｋｂのＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＫＤ４６に形質転換し、カナマイシン耐性クローンを３０℃のＬＢｋａｎプレート上で分離した。ＬＢｋａｎプレートには、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）、１．５％の寒天、および１５ｍｇ／Ｌのカナマイシンが含まれていた。
５．得られたカナマイシン耐性クローンのうち１０個をＬＢｋａｎプレートで精製し（すなわち、特異化によるクローンの単離）、ＰＣＲ反応でチェックして、カナマイシン耐性カセットがｐｐｓＡ遺伝子に正しく組み込まれているかどうかを確認した。
ＰＣＲ反応（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）社）に用いたゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、Ｌｂｋａｎ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）中のＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のカナマイシン耐性クローンの培養物中の細胞から単離した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０野生型株のゲノムＤＮＡをコントロールとして用いた。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、ｐｐｓ－７ｆ（配列番号：９）およびｐｐｓ－８ｒ（配列番号：１０）であった。プライマーｐｐｓ－７ｆは、配列番号１からのｎｔ１６７～１８８を含み、プライマーｐｐｓ－８ｒは配列番号１からのｎｔ２７７９～２８００を逆相補型で含んでいた。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０野生型ＤＮＡは、完全な遺伝子で予想されるように、ＰＣＲ反応で２６３０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成した。対照的に、研究中のカナマイシン耐性クローンは、１．４ｋｂのＰＣＲ産物が、プライマーｐｐｓ－５ｆおよびｐｐｓ－６ｒによって定義される部位でｐｐｓＡ遺伝子に組み込まれた場合に予想されるように、ＰＣＲ反応で約１６６０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成した。この結果から、カナマイシン耐性遺伝子がｐｐｓＡ遺伝子座に首尾よく組み込まれ、ｐｐｓＡ遺伝子が不活性化されたことが示された。不活性化されたｐｐｓＡ遺伝子を含むクローンを選抜し、Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎと命名した。
６．カナマイシン選択マーカーを除去するために、Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎをプラスミドｐＣＰ２０で形質転換し、３０℃で形質転換体を選抜した。９．４ｋｂのベクターｐＣＰ２０は、Cherepanov and Wackernagel (1995), Gene 158: 9-14に開示されている。ＦＬＰリコンビナーゼの遺伝子はベクターｐＣＰ２０上に存在している。ＦＬＰリコンビナーゼは、カナマイシン耐性遺伝子の発現カセットに隣接するＦＲＴ配列を認識し、カナマイシン発現カセットの除去をもたらす。この目的のために、３０℃で得られたクローンを３７℃でインキュベートした。これらの条件下で、ＦＬＰリコンビナーゼの発現が誘導され、ｐＣＰ２０ベクターの複製が抑制された。
この工程の結果、ｐｐｓＡ遺伝子が不活性化され、カナマイシンに対する感受性が回復したクローンが得られた（いわゆる抗生物質選択マーカーの「治癒（curing）」）。ΔｐｐｓＡ突然変異体のゲノムからカナマイシンカセットを除去することにより、二重または多重の突然変異体を生成するためのさらに変異を導入することができる。
Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎはｐＣＰ２０プラスミドによる処理後にカナマイシン感受性を回復した。これは以下のように確認された：
－ＬＢプレートおよびＬＢｋａｎプレートにプレーティングすることにより：
ＬＢプレート上での増殖は陽性であったのに対し、ＬＢｋａｎプレート上での増殖は観察されなくなり、これはゲノムからのカナマイシンカセットの除去に成功したことを示唆するものである。
－ＬＢプレートおよびＬＢｋａｎプレートにプレーティングすることにより：
ＬＢプレート上での増殖は陽性であったのに対し、ＬＢｋａｎプレート上での増殖は観察されなくなり、これはゲノムからのカナマイシンカセットの除去に成功したことを示唆するものである。
ＰＣＲ反応により：
この目的のために、カナマイシン感受性クローンからゲノムＤＮＡを単離し（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）、プライマーｐｐｓ－７ｆ（配列番号９）およびｐｐｓ－８ｒ（配列番号１０）を用いたＰＣＲ反応（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）社）において用いられた。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０野生型ＤＮＡは、ＰＣＲ反応において約２６３０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成し、これは完全な遺伝子について予想されたとおりであった。対照的に、カナマイシン感受性クローンは、ＰＣＲ反応において約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを生じ、これは相同組換え後に残る不活性化ｐｐｓＡ遺伝子の５’および３’フラグメントの予想サイズに対応していた。
この目的のために、カナマイシン感受性クローンからゲノムＤＮＡを単離し（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）、プライマーｐｐｓ－７ｆ（配列番号９）およびｐｐｓ－８ｒ（配列番号１０）を用いたＰＣＲ反応（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）社）において用いられた。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０野生型ＤＮＡは、ＰＣＲ反応において約２６３０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成し、これは完全な遺伝子について予想されたとおりであった。対照的に、カナマイシン感受性クローンは、ＰＣＲ反応において約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを生じ、これは相同組換え後に残る不活性化ｐｐｓＡ遺伝子の５’および３’フラグメントの予想サイズに対応していた。
この工程から分離された株を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡと命名した。この株は、不活性化されたｐｐｓＡ遺伝子を含み、抗生物質カナマイシンに対する感受性を回復したという事実によって識別される。
実施例２：パントエア・アナナティスにおけるｐｐｓＡ欠失突然変異体の作製
遺伝子単離および株開発に用いられた親株はパントエア・アナナティス（ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ社から株番号ＤＳＭ３００７０として市販されている）であった。
遺伝子単離および株開発に用いられた親株はパントエア・アナナティス（ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ社から株番号ＤＳＭ３００７０として市販されている）であった。
遺伝子不活性化の対象を、パントエア・アナナティス由来のｐｐｓＡ遺伝子とした。Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｐｐｓＡ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤ：３１５１０６５５）は、配列番号３に開示されている。ヌクレオチド４１７～２８０１（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｐｐｓＡとして同定されている）は、配列番号４に開示されるアミノ酸配列を有するホスホエノールピルビン酸シンターゼタンパク質をコードする（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのＰｐｓＡ）。
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｐｐｓＡ遺伝子は、以下に詳述するように、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ社のＲｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）を用いて不活性化した（「Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit」のユーザーマニュアルに記載されており、「Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red（登録商標）/ET（登録商標）Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, June 2012」およびその中の引用文献、例えばDatsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000): 6640-6645を参照されたい）。この目的のために、プラスミドｐＫＤ１３およびｐＲｅｄＥＴが用いられた：
－３．４ｋｂのプラスミドｐＫＤ１３（図１）は、アクセション番号ＡＹ０４８７４４．１で「ＧｅｎＢａｎｋ」の遺伝子データベースに開示されている。
－市販の９．３ｋｂのプラスミドｐＲｅｄＥＴは、「Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit」のユーザーマニュアルに記載されており、「Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red（登録商標）/ET（登録商標）Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, June 2012」を参照されたい。
－３．４ｋｂのプラスミドｐＫＤ１３（図１）は、アクセション番号ＡＹ０４８７４４．１で「ＧｅｎＢａｎｋ」の遺伝子データベースに開示されている。
－市販の９．３ｋｂのプラスミドｐＲｅｄＥＴは、「Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit」のユーザーマニュアルに記載されており、「Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red（登録商標）/ET（登録商標）Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, June 2012」を参照されたい。
Ｌａｍｂｄａ Ｒｅｄシステムを用いてＰ．ａｎａｎａｔｉｓのｐｐｓＡ遺伝子を不活性化するために、次の手順を行った：
１．Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓをプラスミドｐＲｅｄＥＴ（いわゆる「Ｒｅｄリコンビナーゼ」プラスミド）で形質転換し、テトラサイクリン耐性クローンを単離した（Ｐ．アナナティス×ｐＲｅｄＥＴと呼ぶ）。
２．その不活性化に適したｐｐｓＡ特異的ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＫＤ１３のＤＮＡ（図１）、ならびにプライマーｐｐｓａｐａ－３ｆ（配列番号１１）およびｐｐｓａｐａ－４ｒ（配列番号１２）を用いたＰＣＲ反応（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）社）を用いて製造した。
プライマーｐｐｓａｐａ－３ｆは、ｐｐｓＡ遺伝子の５’領域からの４９ｎｔ（配列番号３のｎｔ４１７～４６５）を含み、それにプラスミドｐＫＤ１３に特異的な２０ｎｔ（図１で「ｐｒ－１」と呼ばれる）が結合している。
プライマーｐｐｓａｐａ－４ｒは、ｐｐｓＡ遺伝子の３’領域からの４９ｎｔ（配列番号３のｎｔ２７５３～２８０１、逆相補型）を含み、それにプラスミドｐＫＤ１３に特異的な２０ｎｔ（図１で「ｐｒ－２」と呼ばれる）が結合している。
プライマーｐｐｓａｐａ－３ｆおよびｐｐｓａｐａ－４ｒを用いて、プラスミドｐＫＤ１３のＤＮＡにより、５’末端および３’末端の両方に、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ由来のｐｐｓＡ遺伝子に特異的なＤＮＡ４９ｎｔセクションを含む１．４ｋｂのＰＣＲ産物が製造された。さらに、ＰＣＲ産物は、ｐＫＤ１３に含まれるカナマイシン耐性遺伝子の発現カセット、カナマイシン発現カセットの５’および３’末端に隣接する、いわゆる「ＦＲＴダイレクトリピート」（図１において「ＦＲＴ１」および「ＦＲＴ１」と呼ばれる）、必要に応じて、ｐｐｓＡ欠失突然変異体において抗生物質マーカーであるカナマイシンの除去を可能にするＤＮＡの短いセクションを含んでいた。
３．１．４ｋｂのＰＣＲ産物を単離し、当業者によく知られており、メチル化ＤＮＡのみを切断する制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで処理して、残留ｐＫＤ１３プラスミドＤＮＡを除去した。ＰＣＲ反応からの非メチル化ＤＮＡは分解されなかった。
４．ｐｐｓＡ遺伝子に特異的で、カナマイシン耐性遺伝子の発現カセットを含む１．４ｋｂのＰＣＲ産物をＰ．ａｎａｎａｔｉｓ×ｐＲｅｄＥＴに形質転換し、カナマイシン耐性クローンを３０℃のＬＢｋａｎプレート上で分離した。ＬＢｋａｎプレートには、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）、１．５％の寒天、および１５ｍｇ／Ｌのカナマイシンが含まれていた。
５．カナマイシン耐性クローンをＬＢｋａｎプレートで精製し（すなわち、特異化によるクローンの単離）、ＰＣＲ反応でチェックして、カナマイシン耐性カセットがｐｐｓＡ遺伝子に正しく組み込まれているかどうかを確認した。
ＰＣＲ反応（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）社）に用いたゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、Ｌｂｋａｎ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）中のＰ．ａｎａｎａｔｉｓのカナマイシン耐性クローンの培養物中の細胞から単離した。Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ野生型株のゲノムＤＮＡをコントロールとして用いた。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、ｐｐｓａｐａ－１ｆ（配列番号１３）およびｐｐｓａｐａ－２ｒ（配列番号１４）であった。プライマーｐｐｓａｐａ－１ｆは配列番号３のｎｔ２８１～３０２を含み、プライマーｐｐｓａｐａ－２ｒは配列番号３のｎｔ２９０１～２９２２を逆相補型で含んでいた。
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ野生型ＤＮＡは、完全な遺伝子で予想されるように、ＰＣＲ反応で２６４０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成した。対照的に、研究中のカナマイシン耐性クローンは、約１．４ｋｂのＰＣＲ産物が、プライマーｐｐｓａｐａ－３ｆ（配列番号１１）およびｐｐｓａｐａ－４ｒ（配列番号１２）によって定義される部位でｐｐｓＡ遺伝子に組み込まれた場合に予想されるように、ＰＣＲ反応で１６７０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成した。この結果から、カナマイシン耐性遺伝子がｐｐｓＡ遺伝子座に首尾よく組み込まれ、ｐｐｓＡ遺伝子が不活性化されたことが示された。不活性化されたｐｐｓＡ遺伝子を含むクローンを選抜し、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎと命名した。
実施例３：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩの作製
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩを、ｐｐｓＡ構造遺伝子の変異により酵素活性の減弱化を引き起こすことを特徴とし、当業者に知られているＬａｍｂｄａ Ｒｅｄ組換えと、遺伝的改変の対抗選択スクリーニングとの組み合わせを用いて作製した（例えば、Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245を参照されたい）。遺伝子ｐｐｓＡ－ＭＨＩのＤＮＡ配列は、配列番号５（ｐｐｓＡ－ＭＨＩ）に開示され、配列番号６（ＰｐｓＡ－ＭＨＩ）で特定される配列を有するタンパク質をコードする。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩを、ｐｐｓＡ構造遺伝子の変異により酵素活性の減弱化を引き起こすことを特徴とし、当業者に知られているＬａｍｂｄａ Ｒｅｄ組換えと、遺伝的改変の対抗選択スクリーニングとの組み合わせを用いて作製した（例えば、Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245を参照されたい）。遺伝子ｐｐｓＡ－ＭＨＩのＤＮＡ配列は、配列番号５（ｐｐｓＡ－ＭＨＩ）に開示され、配列番号６（ＰｐｓＡ－ＭＨＩ）で特定される配列を有するタンパク質をコードする。
手順は以下のとおりである：
１．ｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子の一部（配列番号１のｎｔ１６７～ｎｔ２８００）、すなわちｃｄｓならびに５’および３’隣接配列を含む２．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ｐｐｓ－７ｆ（配列番号９）およびｐｐｓ－８ｒ（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡから単離した。
１．ｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子の一部（配列番号１のｎｔ１６７～ｎｔ２８００）、すなわちｃｄｓならびに５’および３’隣接配列を含む２．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ｐｐｓ－７ｆ（配列番号９）およびｐｐｓ－８ｒ（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡから単離した。
２．「部位特異的」突然変異誘発によってｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子に突然変異を連続的に導入することにより、ｐｐｓＡＷＴ遺伝子からｐｐｓＡ－ＭＨＩを得た。これは、ユーザーマニュアルの指示に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ社の市販のクローニングキット「ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を用いて行った。
３．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子をｐｐｓＡ－ＭＨＩに交換するために、まず、プライマーｐｐｓ－９ｆ（配列番号１５）およびｐｐｓ－１０ｒ（配列番号１６）を用いたＰＣＲによるプラスミドｐＫａｎ－ＳａｃＢ（図３）からの３．２ｋｂ のＫａｎ－ｓａｃＢカセットの単離を行った。
プラスミドｐＫａｎ－ｓａｃＢには、カナマイシン（Ｋａｎ）耐性遺伝子および酵素レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子の両方の発現カセットが含まれていた。
プライマーｐｐｓ－９ｆは、ｐｐｓＡ遺伝子の開始ＡＴＧ（配列番号１のｎｔ３３３～３６２）から始まる３０ｎｔを含み、それにプラスミドｐＫａｎ－ＳａｃＢに特異的な２０ｎｔ（図３で「ｐｒ－ｆ」と呼ばれる）が結合している。
プライマーｐｐｓ－１０ｒは、ｐｐｓＡ遺伝子の終止コドンから３０ｎｔ（配列番号１のｎｔ２６８２～２７１１、逆相補型）を含み、それにプラスミドｐＫａｎ－ＳａｃＢに特異的な２１ｎｔ（図３で「ｐｒ－ｒ」と呼ばれる）が結合している。
４．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＫＤ４６（その産生については、実施例１を参照されたい）をｐｐｓＡ特異的３．２ｋｂ ＰＣＲ産物で形質転換し、カナマイシン耐性クローンを単離した。
５．クローンをＬＢＳＣプレート（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、７％のスクロース、１．５％の寒天、および１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）に播種した。
組み込まれたｓａｃＢ遺伝子を含むクローンは、スクロースから毒性のレバンを生成し、これが増殖阻害をもたらした。そのようなクローンを選択し、ＰＣＲ反応でチェックして、Ｋａｎ－ｓａｃＢカセットがｐｐｓＡ遺伝子に正しく組み込まれているかどうかを決定した。ＰＣＲ反応（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）社）に用いたゲノムＤＮＡを、予めＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、Ｌｂｋａｎ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）中のＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のカナマイシン耐性クローンの培養物中の細胞から単離した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０野生型株のゲノムＤＮＡをコントロールとして用いた。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、ｐｐｓ－７ｆ（配列番号：９）およびｐｐｓ－８ｒ（配列番号：１０）であった。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０野生型ＤＮＡは、完全な遺伝子で予想されるように、ＰＣＲ反応で２６３０ｎｔのＤＮＡフラグメントを生成した。対照的に、カナマイシン耐性クローンは、３．２ｋｂのＰＣＲ産物が、プライマーｐｐｓ－９ｆ（配列番号１５）およびｐｐｓ－１０ｒ（配列番号１６）によって定義される部位でｐｐｓＡ遺伝子に組み込まれた場合に予想されるように、ＰＣＲ反応で約３４００ｎｔのＤＮＡフラグメントを生成した。この結果から、Ｋａｎ－ｓａｃＢカセットがｐｐｓＡ遺伝子座に首尾よく組み込まれ、ｐｐｓＡ遺伝子が不活性化されたことが示されした。組み込まれたＫａｎ－ｓａｃＢカセットを含むクローンを選抜し、Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎ－ｓａｃＢ×ｐＫＤ４６と命名した。
６．次の工程において、Ｋａｎ－ｓａｃＢカセットをｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子と交換した。この目的のために、プライマーｐｐｓ－１１ｆ（配列番号：１７）およびｐｐｓ－１２ｒ（配列番号１８）を用いたＰＣＲ反応（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）社）において、工程２からのｐｐｓＡ－ＭＨＩ ＤＮＡフラグメントから２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅された。プライマーｐｐｓ－１１ｆは配列番号１のｎｔ３００～３１９を含み、プライマーｐｐｓ－１２ｒは配列番号１のｎｔ２７４３～２７６３を逆相補型で含んでいた。
７．２．５ｋｂのｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎ－ｓａｃＢ×ｐＫＤ４６に形質転換し、クローンをカナマイシンを含まないＬＢＳプレート（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、７％スクロース、１．５％の寒天）で選抜した。活性なｓａｃＢ遺伝子を含まないクローンのみがＬＢＳプレートで増殖した。
これらのクローンをＬＢｋａｎプレート上に播種して、活性Ｋａｎ遺伝子を含まず、その増殖がカナマイシンの存在下で阻害されたクローンを選抜した。
スクロースの存在下で正の増殖を示し、カナマイシンの存在下で負の増殖を示すクローンを選抜し、ＰＣＲ反応でチェックして、ＫａｎｓａｃＢカセットがｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子によって正しく置換されたかどうかを決定した。
ゲノムＤＮＡを、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）中の培養物の細胞からＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて得た。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０野生型株のゲノムＤＮＡをコントロールとして用いた。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、ｐｐｓ－７ｆ（配列番号９）およびｐｐｓ－８ｒ（配列番号１０）であった。予想サイズが２６３０ｎｔのＰＣＲ産物を、ＤＮＡシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）によって分析した。正しく組み込まれたｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子を含むクローンは、配列番号６からの配列に対応するタンパク質をコードする、配列番号５に開示されるＤＮＡ配列を生成した。突然変異Ｖ１２６Ｍ、Ｒ４２７ＨおよびＶ４３４Ｉを含む正しいｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子を含むクローンを選抜し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩと命名した。
実施例４：システイン産生株の生成
用いたシステイン特異的産生プラスミドは、親ベクターｐＡＣＹＣ１８４（図４）に由来するプラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６－ｓｅｒＡ３１７であった。ｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６－ｓｅｒＡ３１７は、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１に開示されるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の誘導体である。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６は、複製起点およびテトラサイクリン耐性遺伝子（親ベクターｐＡＣＹＣ１８４）だけでなく、システインによるフィードバック阻害が低下したセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥＸ対立遺伝子、およびその発現が構成的ＧＡＰＤＨプロモーターによって制御される流出遺伝子ｙｄｅＤ（ＯＲＦ３０６）も含んでいる。
用いたシステイン特異的産生プラスミドは、親ベクターｐＡＣＹＣ１８４（図４）に由来するプラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６－ｓｅｒＡ３１７であった。ｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６－ｓｅｒＡ３１７は、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１に開示されるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の誘導体である。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６は、複製起点およびテトラサイクリン耐性遺伝子（親ベクターｐＡＣＹＣ１８４）だけでなく、システインによるフィードバック阻害が低下したセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥＸ対立遺伝子、およびその発現が構成的ＧＡＰＤＨプロモーターによって制御される流出遺伝子ｙｄｅＤ（ＯＲＦ３０６）も含んでいる。
さらに、ｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６－ｓｅｒＡ３１７は、ｙｄｅＤ（ＯＲＦ３０６）流出遺伝子の後にクローニングされ、ＳｅｒＡタンパク質（全長：４１０アミノ酸）のＮ末端の３１７アミノ酸をコードするｓｅｒＡ３１７遺伝子フラグメントをさらに含む。Ｅ．ｃｏｌｉのｓｅｒＡ遺伝子は、「ＧｅｎＢａｎｋ」の遺伝子データベースに遺伝子ＩＤ９４５２５８として開示されている。ｓｅｒＡ３１７は、Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-418に開示されており、その中で「ＮＳＤ：３１７」と呼ばれ、３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼのセリンフィードバック耐性変異体をコードする。ｓｅｒＡ３１７の発現は、ｓｅｒＡプロモーターによって制御される。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ株、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ株、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓおよびＰ．ａｎａｎａｔｉｓ－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎ株を、それぞれプラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６－ｓｅｒＡ３１７（以下の実施例においてｐＣＹＳと呼ばれる）で形質転換した。形質転換は、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１に記載されているように、エレクトロポレーションによって先行技術に従って行った。
ＬＢｔｅｔ寒天プレート（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．５％の寒天、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン）上で、プラスミドを有する形質転換体を選抜した。選抜された形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）によるプラスミド単離および制限分析により、形質転換ｐＣＹＳプラスミドについてチェックした。正しく組み込まれたプラスミドｐＣＹＳを含む形質転換体を培養して、ｐｐｓＡ酵素活性をチェックし（実施例５）、システイン産生を決定した（実施例６および実施例７）。
実施例５：ｐｐｓＡ酵素活性の測定
産生プラスミドｐＣＹＳ（実施例４）でそれぞれ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０、Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩのｐｐｓＡ酵素活性を決定した。５０ｍｌのＳＭ１培地（その組成については、実施例６を参照されたい）中の３種の株の振盪フラスコ培養からの細胞を、１０分間の遠心分離によってペレット化し、１０ｍｌの０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで１回洗浄した。細胞ペレットを１０ｍｌのアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１０ｍＭのＭｇＣｌ２）に取り、細胞抽出物を調製した。
産生プラスミドｐＣＹＳ（実施例４）でそれぞれ形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０、Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩのｐｐｓＡ酵素活性を決定した。５０ｍｌのＳＭ１培地（その組成については、実施例６を参照されたい）中の３種の株の振盪フラスコ培養からの細胞を、１０分間の遠心分離によってペレット化し、１０ｍｌの０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで１回洗浄した。細胞ペレットを１０ｍｌのアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１０ｍＭのＭｇＣｌ２）に取り、細胞抽出物を調製した。
細胞ホモジナイザーＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（商標）５Ｇを用いた。この目的のために、２×１ｍｌの細胞懸濁液を、製造業者によって事前に作製され、ガラスビーズ（「Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｂ」）を含む１．５ｍｌチューブ中で破砕した（３×２０秒、６０００ｒｐｍの振盪周波数でインターバル間の各時間に３０秒間の休止）。得られたホモジネートを遠心分離し、活性を決定するための細胞抽出物として上清を用いた。
抽出物のタンパク質含有量を、製造業者の説明書に従って、「Ｑｕｂｉｔ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」を用いて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＱｕｂｉｔ ３．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによって測定した。
ｐｐｓＡ酵素活性を測定するために、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈｉ社のリン酸検出キット「Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」（カタログ番号ＭＡＫ３０７）を製造元の説明書に従って用いた。その原理は、ｐｐｓＡ酵素活性による平衡反応（４）におけるＡＴＰによるピルビン酸の変換によるホスホエノールピルビン酸の形成である。これは、活性を決定するために用いられるリン酸塩の化学量論量を生成する。
－このアッセイには、１ｍｌのアッセイバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１０ｍＭのＭｇＣｌ２）中の１００μｇの細胞抽出物、４ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および４ｍＭのＡＴＰが含まれていた。
－様々なアッセイを３０℃でインキュベートした。
－インキュベーション開始から０分、１０分、２０分、３０分および６０分後に、それぞれのアッセイから５０μｌを取り出し、７５０μｌのＨ２Ｏに添加し、最後に「Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」の試薬２００μｌと混合した。
－３０分間のインキュベーション後、形成されたリン酸の量を、リン酸標準曲線を用いて、製造元の指示に従って、６２０ｎｍでの吸光度を測定することにより測光的に測定した。最後に、Ｕ／ｍｌ（１Ｕ＝μｍｏｌ基質ターンオーバー／分）抽出物中のｐｐｓＡ酵素活性を、それぞれのアッセイからのサンプリング時間に基づいて、リン酸の測定量から決定した。特異的なｐｐｓＡ酵素活性を、ｐｐｓＡ酵素活性を細胞抽出物の総タンパク質１ｍｇに基づいて計算した（Ｕ／ｍｇタンパク質）。
－このアッセイには、１ｍｌのアッセイバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１０ｍＭのＭｇＣｌ２）中の１００μｇの細胞抽出物、４ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および４ｍＭのＡＴＰが含まれていた。
－様々なアッセイを３０℃でインキュベートした。
－インキュベーション開始から０分、１０分、２０分、３０分および６０分後に、それぞれのアッセイから５０μｌを取り出し、７５０μｌのＨ２Ｏに添加し、最後に「Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」の試薬２００μｌと混合した。
－３０分間のインキュベーション後、形成されたリン酸の量を、リン酸標準曲線を用いて、製造元の指示に従って、６２０ｎｍでの吸光度を測定することにより測光的に測定した。最後に、Ｕ／ｍｌ（１Ｕ＝μｍｏｌ基質ターンオーバー／分）抽出物中のｐｐｓＡ酵素活性を、それぞれのアッセイからのサンプリング時間に基づいて、リン酸の測定量から決定した。特異的なｐｐｓＡ酵素活性を、ｐｐｓＡ酵素活性を細胞抽出物の総タンパク質１ｍｇに基づいて計算した（Ｕ／ｍｇタンパク質）。
実施例６：振盪フラスコにおけるシステイン生産
振盪フラスコで培養するための前培養として、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンをさらに含む３ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）にそれぞれの株を接種し、３０℃、１３５ｒｐｍのシェーカーで１６時間インキュベートした。研究した株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩであり、第２の実験においては、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓおよびＰ．ａｎａｎａｔｉｓ－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎであり、それぞれ産生プラスミドｐＣＹＳ（例４）で形質転換されていた。
振盪フラスコで培養するための前培養として、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンをさらに含む３ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）にそれぞれの株を接種し、３０℃、１３５ｒｐｍのシェーカーで１６時間インキュベートした。研究した株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｗ３１１０－ΔｐｐｓＡ、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩであり、第２の実験においては、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓおよびＰ．ａｎａｎａｔｉｓ－ΔｐｐｓＡ：：ｋａｎであり、それぞれ産生プラスミドｐＣＹＳ（例４）で形質転換されていた。
本培養：その後、それぞれの前培養の一部を、１５ｇ／Ｌのグルコース、５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１および１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む３０ｍｌのＳＭ１培地を含む３００ｍｌ三角フラスコ（バッフル付き）に移した。
ＳＭ１培地の組成：１２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／ＬのＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ３ｘ２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＮａＣｌ；１ｍｌ／Ｌの微量元素溶液。
微量元素溶液の組成：０．１５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、２．５ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４ｘ５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＣｌ１２ｘ４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ。
本培養物を、０．０２５／ｍｌの初期細胞密度ＯＤ６００／ｍｌ（６００ｎｍで測定された本培養物の光学密度）を確立するのに十分な前培養物で接種した。これから始めて、３０ｍｌバッチ全体を３０℃、１３５ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
２４時間後、サンプルを採取し、細胞密度ＯＤ６００／ｍｌおよび培養上清中の総システイン含有量を決定し、Ｇａｉｔｏｎｄｅによる比色アッセイ（Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633）によりシステインの定量を行った。非常に酸性の反応条件下では、このアッセイは、システインと、システインとピルビン酸の縮合生成物である２－メチルチアゾリジン－２，４－ジカルボン酸（チアゾリジン）とが区別されないことに留意する必要があり、これについてはＥＰ０８８５９６２Ｂ１に記載されている。式（２）に従って２つのシステイン分子の酸化によって形成されるＬ－シスチンは、同様に、ｐＨ８．０の希釈溶液中でジチオスレイトールによる還元によるアッセイでシステインとして検出される。結果を、言及されたＥ．ｃｏｌｉ株については表２に、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ株については表３に示す。
実施例７：発酵槽におけるシステイン生産
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＣＹＳ、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣＹＳおよびＷ３１１０－ΔｐｐｓＡ×ｐＣＹＳを生産規模のフェドバッチ発酵で比較した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＣＹＳ、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣＹＳおよびＷ３１１０－ΔｐｐｓＡ×ｐＣＹＳを生産規模のフェドバッチ発酵で比較した。
前培養１：
１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む２０ｍｌのＬＢ培地に、１００ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内のそれぞれの株を接種し、シェーカー（１５０ｒｐｍ、３０℃）で７時間インキュベートした。
１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む２０ｍｌのＬＢ培地に、１００ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内のそれぞれの株を接種し、シェーカー（１５０ｒｐｍ、３０℃）で７時間インキュベートした。
前培養２：
その後、前培養物１全体を、５ｇ／Ｌのグルコース、５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１および１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを添加した１００ｍｌのＳＭ１培地に移した（ＳＭ１培地の組成については、実施例６を参照されたい）。
その後、前培養物１全体を、５ｇ／Ｌのグルコース、５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１および１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを添加した１００ｍｌのＳＭ１培地に移した（ＳＭ１培地の組成については、実施例６を参照されたい）。
培養物をＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（容量１Ｌ）中で、３０℃で１７時間、１５０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）で振盪した。このインキュベーション後、細胞密度ＯＤ６００／ｍｌは３～５の間であった。
主培地：
発酵は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社の「ＤＡＳＧＩＰ（登録商標） Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」発酵槽中で行った。総容量１．８Ｌの培養容器を用いた。発酵培地（９００ｍｌ）には、１５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、５ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、０．０７５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ３ｘ２Ｈ２Ｏおよび１ｍｌの微量元素溶液（実施例６を参照されたい）、０．００５ｇ／ＬのビタミンＢ１および１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンが含まれていた。
発酵は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社の「ＤＡＳＧＩＰ（登録商標） Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」発酵槽中で行った。総容量１．８Ｌの培養容器を用いた。発酵培地（９００ｍｌ）には、１５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、５ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、０．０７５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ３ｘ２Ｈ２Ｏおよび１ｍｌの微量元素溶液（実施例６を参照されたい）、０．００５ｇ／ＬのビタミンＢ１および１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンが含まれていた。
発酵槽内のｐＨは、２５％のＮＨ４ＯＨ溶液をポンピングすることによって最初に６．５に調整された。発酵中、２５％のＮＨ４ＯＨによる自動補正によりｐＨを６．５に維持した。接種のために、１００ｍｌの前培養物２を発酵容器にポンプで注入した。したがって、最初の体積は約１Ｌであった。培養物を最初に４００ｒｐｍで撹拌し、無菌フィルターを介して２ｖｖｍ（１分当たりの培地の体積当たりの空気の体積）の通気速度で滅菌した圧縮空気で通気した。これらの開始条件下で、接種前に酸素プローブを１００％飽和に較正した。
発酵中のＯ２飽和度の目標値を３０％に設定した。Ｏ２飽和度が目標値を下回った後、Ｏ２飽和度を目標値に戻すために調整カスケードを開始した。このために、最初にガス供給を連続的に増大させ（最大５ｖｖｍまで）、次いで撹拌速度を連続的に増大させた（最大１５００ｒｐｍまで）。
発酵を３０℃で行った。２時間の発酵時間の後、チオ硫酸ナトリウム×５Ｈ２Ｏの滅菌６０％（ｗ／ｖ）ストック溶液の形態の硫黄源を、１時間あたり１．５ｍｌの速度で供給した。
発酵槽内のグルコース含有量が最初の１５ｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌに低下すると、５６％（ｗ／ｗ）のグルコース溶液を連続的に計量供給した。それ以降、発酵槽内のグルコース濃度が２ｇ／Ｌを超えないように供給速度を調整した。グルコースは、ＹＳＩ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ社、オハイオ州、米国）のグルコース分析装置を用いて測定した。
発酵時間は４８時間とした。その後、サンプルを発酵バッチから取り出し、培養上清（主にＬ－システインおよびチアゾリジン）および沈殿物（Ｌ－シスチン）中のＬ－システインおよびそれに由来する誘導体の含有量を別々に測定した。この目的のために、いずれの場合もＧａｉｔｏｎｄｅによる比色アッセイ（Gaitonde, M.K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633）を行った。沈殿物中に存在するＬ－シスチンは、同じ方法で定量する前に、まず８％（ｖ／ｖ）塩酸に溶解する必要があった。最後に、システインの総量を、ペレット中および上清中のシステインの合計として決定した。
表４に要約されるように、研究された株の細胞密度ＯＤ６００／ｍｌは同等であったが、コントロール株Ｗ３１１０×ｐＣＹＳについてはいくらか高かった。対照的に、システインの生産量（ｇ／Ｌ）は、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣＹＳおよびＷ３１１０－ΔｐｐｓＡ×ｐＣＹＳの両方で、野生型ｐｐｓＡ遺伝子を含むコントロール株Ｗ３１１０×ｐＣＹＳよりも有意に高かった（約３倍）。
制御された発酵条件かでは、ｐｐｓＡ酵素活性に関する活性の減弱化または不活性化がシステイン生産の有意な改善につながり、したがって株を改善するための適切な手段であるという結果が生産規模において示され、この結果は従来説明されていたものではなく、先行技術を考慮しても当業者にとって予想外である。
図中で用いられる略語：
ｂｌａ：アンピシリン（β－ラクタマーゼ）に対する耐性を付与する遺伝子
ｒｒｎＢ ｔｅｒｍ：転写のためのｒｒｎＢターミネーター
ｋａｎＲ：カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子
ＯＲＩ：複製起点
ｐｒ－１：プライマーの結合部位１
ｐｒ－２：プライマーの結合部位２
ＦＲＴ１：ＦＬＰリコンビナーゼの認識配列１
ＦＲＴ２：ＦＬＰリコンビナーゼの認識配列２
ａｒａＣ：ａｒａＣ遺伝子（リプレッサー遺伝子）
Ｐ ａｒａＣ：ａｒａＣ遺伝子のプロモーター
Ｐ ａｒａＢ：ａｒａＢ遺伝子のプロモーター
Ｇａｍ：λファージのＧａｍ組換え遺伝子
Ｂｅｔ：λファージのＢｅｔ組換え遺伝子
Ｅｘｏ：λファージのＥｘｏ組換え遺伝子
ＯＲＩ１０１：温度に感受性の複製起点
ＲｅｐＡ：プラスミド複製タンパク質Ａの遺伝子
ｓａｃＢ：レバンスクラーゼ遺伝子
ｐｒ－ｆ：プライマーの結合部位ｆ（フォワード）
ｐｒ－ｒ：プライマーの結合部位ｒ（リバース）
ＯｒｉＣ：複製起点Ｃ
ＩＨＦ：ＤＮＡ結合タンパク質ＩＨＦ（「組み込み宿主因子」）の結合部位
ＣａｍＲ：クロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子
ＴｅｔＲ：テトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子
Ｐ１５Ａ ＯＲＩ：複製起点
ｂｌａ：アンピシリン（β－ラクタマーゼ）に対する耐性を付与する遺伝子
ｒｒｎＢ ｔｅｒｍ：転写のためのｒｒｎＢターミネーター
ｋａｎＲ：カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子
ＯＲＩ：複製起点
ｐｒ－１：プライマーの結合部位１
ｐｒ－２：プライマーの結合部位２
ＦＲＴ１：ＦＬＰリコンビナーゼの認識配列１
ＦＲＴ２：ＦＬＰリコンビナーゼの認識配列２
ａｒａＣ：ａｒａＣ遺伝子（リプレッサー遺伝子）
Ｐ ａｒａＣ：ａｒａＣ遺伝子のプロモーター
Ｐ ａｒａＢ：ａｒａＢ遺伝子のプロモーター
Ｇａｍ：λファージのＧａｍ組換え遺伝子
Ｂｅｔ：λファージのＢｅｔ組換え遺伝子
Ｅｘｏ：λファージのＥｘｏ組換え遺伝子
ＯＲＩ１０１：温度に感受性の複製起点
ＲｅｐＡ：プラスミド複製タンパク質Ａの遺伝子
ｓａｃＢ：レバンスクラーゼ遺伝子
ｐｒ－ｆ：プライマーの結合部位ｆ（フォワード）
ｐｒ－ｒ：プライマーの結合部位ｒ（リバース）
ＯｒｉＣ：複製起点Ｃ
ＩＨＦ：ＤＮＡ結合タンパク質ＩＨＦ（「組み込み宿主因子」）の結合部位
ＣａｍＲ：クロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子
ＴｅｔＲ：テトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子
Ｐ１５Ａ ＯＲＩ：複製起点
Claims (12)
- Ｌ－システインの発酵生産に適した微生物株であって、
－ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの相対酵素活性が不活性化されているか、または野生型酵素の比活性と比較して低下しており、かつ
－ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの野生型酵素活性を有する微生物株と比較して、増大した量のＬ－システインを形成し、
前記酵素活性をコードする遺伝子がｐｐｓＡによって特定される、前記微生物株。 - 前記微生物株が、腸内細菌科またはコリネバクテリア科の株である、請求項１に記載の微生物株。
- 前記微生物株が、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）およびコリネバクテリウム・グルタミカム。（Corynebacterium glutamicum）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の微生物株。
- 前記微生物株が、エシェリヒア・コリおよびパントエア・アナナティスからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の微生物株。
- 前記微生物株が、エシェリヒア・コリ種の株である、請求項１～４のいずれか一項に記載の微生物株。
- 前記ｐｐｓＡ遺伝子に少なくとも１つの変異を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の微生物株。
- 前記変異遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来のｐｐｓＡ遺伝子、パントエア・アナナティス由来のｐｐｓＡ遺伝子、およびこれらの遺伝子に相同な遺伝子からなる群から選択される、請求項６に記載の微生物株。
- 前記ｐｐｓＡ遺伝子のコードＤＮＡ配列が配列番号５である、請求項６または７に記載の微生物株。
- 前記菌株において、前記ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの相対酵素活性が、前記野生型酵素の比活性と比較して少なくとも２５％低下している、請求項１～８のいずれか一項に記載の微生物株。
- 前記菌株において、前記ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの相対酵素活性が、前記野生型酵素の比活性と比較して少なくとも７０％低下している、請求項１～８のいずれか一項に記載の微生物株。
- 前記ＫＥＧＧデータベースにおける番号ＥＣ２．７．９．２によって特定される酵素クラスの酵素活性を有さない、請求項１～８のいずれか一項に記載の微生物株。
- 請求項１～１１のいずれか一項に記載の微生物株が用いられる、システインを生産するための発酵プロセス。
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